CN107034207A - 基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜制备方法及应用 - Google Patents

基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物无机杂化技术领域，尤其涉及一种基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜制备方法及应用。首先将铜箔裁剪成块状，分别用HCl溶液、去离子水和乙醇清洗，然后依次浸泡在(NH4)2S2O8和Na2HPO4的水溶液中，惰性气体保护下40℃烘干2 h后制得固定化漆酶载体；将所述载体浸泡在漆酶溶液中6～24h，用去离子水清洗表面，于30℃下真空干燥后即得。还公开了将所制得的基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜应用于染料废水脱色等环境污染控制问题上。本发明制备方法较为简洁，制得成品比游离漆酶活性得到增强，对抗pH和温度变化影响的稳定性增强，重复使用性好且可操作性强，为漆酶及其他蛋白固化提供新的思路，对蛋白固化及环境控制、医疗等应用有推进作用。

Description

基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物无机杂化技术领域，涉及生物无机杂化膜，尤其涉及一种基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜制备方法及应用。
背景技术
漆酶是一种结合多个铜离子的蛋白质，广泛存在于植物、真菌体内，可利用分子氧为电子受体将其还原成水，因此本质上是一种环保型酵素。漆酶具有较低的底物专一性和较高的催化活性，广泛应用于废水处理、芳香化合物转化、生物传感器、造纸、环境监测、制药、食品等方面。但是，当漆酶离开生物体相对稳定的环境后就变得极其脆弱，大大地缩短了其在常温下的保存时间。同时，在高温、强碱强酸或者其他特殊环境下很容易失活变性，并且由于漆酶在反应体系中不容易被回收，导致酶不能有效的循环利用，增加了应用成本，这些缺点使得漆酶在工业大规模应用中受到限制。尽管漆酶在应用中会受环境所影响，但是其广泛的应用前景仍然促使国内外科学家在化学、生物、医药等多领域对漆酶展开深入的研究工作。
漆酶的固定化，可以增强漆酶的稳定性和便于回收重复性使用。目前，固定化漆酶的技术主要分为以下两大类：化学方法（共价偶联法和交联法）和物理方法（物理吸附和包埋法）。化学方法主要通过化学反应生成化学键将漆酶固定在载体材料上。这种方法设计程度高，化学键保证了漆酶和载体之间稳定的连接，但化学连接反应过程中可能会对漆酶的活性造成较大的损伤，以及制备过程比较复杂。物理吸附和包埋法固定漆酶具有吸附条件温和、制备过程简单、载体可重复使用等优点。但是这种方法固定的漆酶负载量低、结构不够稳定、损漏多，并且酶活性受周围环境的温度、pH等因素影响较大。
过去的数十年间，固定化酶技术的研究受到广大研究者的青睐和快速发展。同时，大量的工作用来研究制备一种整体的载体，无论是在批次还是连续操作反应中具有能够很容易被分离，快速的停止反应，机械稳定性好和适用于各种实际应用等优点。本发明提供了一种基于预处理的铜箔材料作为漆酶固定载体，该材料是一种很有发展前途的污水处理材料，具有潜在的经济和社会效益。
发明内容
本发明的目的是为了解决漆酶固定化，公开了基于铜箔作为载体来固定化漆酶的制备方法。
技术方案
基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜制备方法，首先将铜箔裁剪成块状，分别用HCl溶液、去离子水和乙醇清洗，然后依次浸泡在 (NH4)2S2O8和Na2HPO4 的水溶液中，惰性气体保护下40℃烘干2 h后制得固定化漆酶载体；将所述载体浸泡在漆酶溶液中6～24h，用去离子水清洗表面，于30℃下真空干燥后即制得杂化酶成品膜。
本发明所述的基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜制备方法，包括如下步骤：
a) 铜箔载体制备：将厚度0.1 mm的铜箔裁剪成块状，用HCl溶液在超声下清洗15 min，再用去离子水和乙醇各清洗3～5min，然后室温下将所处理的铜箔浸泡在分别含有 (NH4)2S2O8和Na2HPO4 的水溶液中1～12 h，取出，去离子水清洗，在惰性气体保护下40℃烘干2 h后制得固定化漆酶载体；
b)漆酶的固定：用缓冲溶液配制漆酶溶液，在室温下磁力搅拌5～10min，然后将固定化漆酶载体浸泡在漆酶溶液中6～24h，用去离子水清洗载体表面未固定的漆酶后，于30℃下真空干燥后即制得杂化酶成品膜。
进一步的，本发明所述的基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜制备方法，制备步骤a)中，所述铜箔裁剪成长和宽为30×20 mm大小的块状；所述HCl溶液摩尔浓度为2～8 mol/L，优选3 mol/L；所述 (NH4)2S2O8摩尔浓度为0.1～1.0 mol/L，优选0.2 mol/L；所述Na2HPO4摩尔浓度为0.4～1.5 mol/L，优选1.0 mol/L；所述(NH4)2S2O8和Na2HPO4的体积比为1:1，(NH4)2S2O8和Na2HPO4的体积和占溶液总体积的20～60%，优选40%；所述的惰性气体为氮气。
进一步的，本发明所述的基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜制备方法，步骤b)中所述的缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，摩尔浓度为0.005～0.1 mol/L，pH值为5～8，优选摩尔浓度0.01 mol/L，pH为7.4；漆酶浓度为0.1～1.0 mg/mL，优选0.5 mg/mL。
依据本发明所述方法制备的铜箔载体，以铜箔作为载体的前驱体，漆酶在预处理后的铜箔表面进行杂化自组装，铜箔表面碱式磷酸铜呈纳米花状，铜箔表面的漆酶-磷酸铜杂化微球是由纳米片互相交错组装而成的微球。所述铜箔表面碱式磷酸铜纳米花直径在10-30μm，由纳米片组成；所述杂化微球直径在4-8μm，由纳米片相互交错组成。相比于游离漆酶，所述固定化的漆酶活性得到增强，对抗pH和温度变化影响的稳定性增强，重复使用性好且可操作性强，固定化漆酶在储存7d和循环使用5次之后均能在3h内分别达到92%和89%高的脱色效率，显著高于同条件下游离酶的32%和36%，因此漆酶的使用效率明显提高，且该固定化漆酶具有良好的储存稳定性。可应用于染料废水脱色等环境污染控制问题上。
本发明对刚果红（Congo red）染料进行了脱色实验。
刚果红染料溶液脱色实验
刚果红染料溶液脱色和脱色效率计算步骤如下：室温环境下，将两片所制备的漆酶固定化成品膜放到40 mL的刚果红染料水溶液中（10 mg/L，pH 7.3），3ｈ后取8mL刚果红溶液，10000 rpm/min离心取上清液，用紫外可见分光光度计测定497 nm处的吸光强度，刚果红的消光系数为ɛ = 2.70×105 M-1 cm-1，根据标准曲线转化为浓度，再按公式（1）计算脱色效率，D%。
(1)
式中的C 0和C t分别为刚过红溶液的初始和在时间t（h）时的浓度。
有益效果
本发明公开了一种基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜制备方法，所制得的固定化酶成品相比游离漆酶活性得到增强，对抗pH和温度变化影响的稳定性增强，重复使用性好且可操作性强，对刚果红染料脱色效率显著提升。（1）铜箔表面碱式磷酸铜纳米花为漆酶-磷酸铜杂化组装提供Cu2+源，碱式磷酸铜纳米花状结构能够提供与漆酶蛋白较大的接触面积；铜箔具有资源丰富，环境友好，成本低，物化性质稳定等优点；整体结构使得制备过程简单，避免繁琐的化学合成步骤；（2）漆酶-磷酸铜杂化微球是通过铜离子和氨基基团之间的配位作用与载体结合，整体结构稳定；杂化微球是由纳米片组装而成，具有高的比表面积，降低了传质阻力，提高了脱色效率；（3）固定化的漆酶适应温度范和pH的范围明显大于游离漆酶，具有良好的环境抵抗能力；（4）以铜箔为整体结构的功能性杂化膜材料，为漆酶以及其他蛋白固定化提供一个新的思路，对蛋白固定化以及在环境控制，医疗等实际应用中具有重要的推进作用。
附图说明
图1 表面生长碱式磷酸铜纳米花的铜箔载体SEM图。
图2 载体表面固定化的漆酶磷酸铜杂化微球SEM图。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进行详细说明，以使本领域技术人员更好地理解本发明，但本发明并不局限于以下实例。
实施例1
a) 铜箔载体制备：将铜箔（厚度0.1 mm）裁剪成长和宽分别为30和20 mm大小的块状，用2 mol/L 的HCl在超声下清洗15 min再用去离子水和乙醇各清洗3 min；接着将所处理的铜箔浸泡在分别含有2 mL的(NH4)2S2O8（0.1 mol/L）和Na2HPO4（0.4 mol/L）的20 mL的水溶液中1 h，取出，去离子水清洗，在氮气保护下40℃烘干2 h后制得固定化漆酶载体。
b)漆酶的固定：用磷酸缓冲溶液为溶剂（0.005 mol/L, pH 5）配制浓度为0.1 mg/mL的漆酶溶液20 mL，在室温下磁力搅拌6min；然后将步骤a)中所制备的载体浸泡在上述漆酶溶液中6 h，去离子水清洗载体表面没有固定的漆酶，30℃下真空干燥即制得杂化酶成品膜。
所制得的杂化成品膜对刚过红的脱色效率达到85%。
实施例2
a) 铜箔载体制备：将铜箔（厚度0.1 mm）裁剪成长和宽分别为30和20 mm大小的块状，用5 mol/L 的HCl在超声下清洗15 min再用去离子水和乙醇各清洗3 min；接着将所处理的铜箔浸泡在分别含有3 mL的(NH4)2S2O8（0.3 mol/L）和Na2HPO4（0.6 mol/L）的20 mL的水溶液中3 h，取出，去离子水清洗，在氮气保护下40℃烘干2 h后制得固定化漆酶载体；
b)漆酶的固定：用磷酸缓冲溶液为溶剂（0.05 mol/L, pH 6）配制浓度为0.2 mg/mL的漆酶溶液20 mL，在室温下磁力搅拌7min，然后将步骤a)中所制备的载体浸泡在上述漆酶溶液中18 h，去离子水清洗载体表面没有固定的漆酶，30℃下真空干燥即制得杂化酶成品膜。
所制得的杂化成品膜对刚过红的脱色效率达到88%。
实施例3
a) 铜箔载体制备：将铜箔（厚度0.1 mm）裁剪成长和宽分别为30和20 mm大小的块状，用6 mol/L HCl在超声下清洗15 min再用去离子水和乙醇各清洗4 min；接着将所处理的铜箔浸泡在分别含有4.5 mL的(NH4)2S2O8（0.6 mol/L）和Na2HPO4（0.7 mol/L）的20 mL的水溶液中5 h，取出，去离子水清洗，在氮气保护下40℃烘干2 h后制得固定化漆酶载体。
b)漆酶的固定：用磷酸缓冲溶液为溶剂（0.08 mol/L, pH 6.5）配制浓度为0.4mg/mL的漆酶溶液20 mL，在室温下磁力搅拌8min；然后将步骤a)中所制备的载体浸泡在上述漆酶溶液中16 h，去离子水清洗载体表面没有固定的漆酶，30℃下真空干燥即制得杂化酶成品膜。
所制得的杂化成品膜对刚过红的脱色效率达到81%。
实施例4
a) 铜箔载体制备：将铜箔（厚度0.1 mm）裁剪成长和宽分别为30和20 mm大小的块状，用3 mol/L的HCl在超声下清洗15 min再用去离子水和乙醇各清洗3 min；接着将所处理的铜箔浸泡在分别含有4 mL的(NH4)2S2O8（0.2 mol/L）和Na2HPO4（1.0 mol/L）的20 mL的水溶液中12 h，取出，去离子水清洗，在氮气保护下40℃烘干2 h后制得固定化漆酶载体。
b)漆酶的固定：用磷酸缓冲溶液为溶剂（0.01 mol/L, pH 7.4）配制浓度为0.5mg/mL的漆酶溶液20 mL，在室温下磁力搅拌5min；然后将步骤a)中所制备的载体浸泡在上述漆酶溶液中12 h，去离子水清洗载体表面没有固定的漆酶，30℃下真空干燥即制得杂化酶成品膜。
所制得的杂化成品膜对刚过红的脱色效率达到96%。
实施例5
a) 铜箔载体制备：将铜箔（厚度0.1 mm）裁剪成长和宽分别为30和20 mm大小的块状，用8 mol/L 的HCl在超声下清洗15 min再用去离子水和乙醇各清洗5 min；接着将所处理的铜箔浸泡在分别含有6 mL的(NH4)2S2O8（1.0 mol/L）和Na2HPO4（1.5 mol/L）的20 mL的水溶液中9 h，取出，去离子水清洗，在氮气保护下40℃烘干2 h后制得固定化漆酶载体。
b)漆酶的固定：用磷酸缓冲溶液为溶剂（0.1 mol/L, pH 8）配制浓度为1.0 mg/mL的漆酶溶液20 mL，在室温下磁力搅拌10min，然后将步骤a)中所制备的载体浸泡在上述漆酶溶液中24 h，去离子水清洗载体表面没有固定的漆酶，30℃下真空干燥即制得杂化酶成品膜。
所制得的杂化成品膜对刚过红的脱色效率达到91%。
结果表明，本发明制得的基于铜箔载体固定化漆酶材料，具有环境友好，成本低，结构稳定。将该材料对含刚果红染料进行了脱色实验，具有较高的脱色效率，其操作简单、脱色效率高，具有一定的实用价值。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a) 铜箔载体制备：将厚度0.1 mm的铜箔裁剪成块状，用HCl溶液在超声下清洗15 min，再用去离子水和乙醇各清洗3～5min，然后室温下将所处理的铜箔浸泡在分别含有 (NH4)2S2O8和Na2HPO4 的水溶液中1～12 h，取出，去离子水清洗，在惰性气体保护下40℃烘干2 h后制得固定化漆酶载体；
b) 漆酶的固定：用缓冲溶液配制漆酶溶液，在室温下磁力搅拌5～10min，然后将固定化漆酶载体浸泡在漆酶溶液中6～24h，用去离子水清洗载体表面未固定的漆酶后，于30℃下真空干燥后即制得杂化酶成品膜。
2.根据权利要求1所述基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜制备方法，其特征在于：所述制备步骤a)中，所述铜箔裁剪成长和宽为30×20 mm大小的块状；所述HCl溶液摩尔浓度为2～8 mol/L，所述 (NH4)2S2O8摩尔浓度为0.1～1.0 mol/L，所述Na2HPO4摩尔浓度为0.4～1.5 mol/L，所述(NH4)2S2O8和Na2HPO4的体积比为1:1，(NH4)2S2O8和Na2HPO4的体积和占溶液总体积的20～60%，所述的惰性气体为氮气。
3.根据权利要求1所述基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜制备方法，其特征在于：所述步骤b)中所述的缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，摩尔浓度为0.005～0.1 mol/L，pH值为5～8，漆酶浓度为0.1～1.0 mg/mL。
4.根据权利要求1所述基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜制备方法，其特征在于：所述制备步骤a)中，所述HCl溶液摩尔浓度为3 mol/L，所述 (NH4)2S2O8摩尔浓度为0.12mol/L，所述Na2HPO4摩尔浓度为1.0 mol/L，所述 (NH4)2S2O8和Na2HPO4的体积和占溶液总体积的40%。
5.根据权利要求1所述基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜制备方法，其特征在于：所述步骤b)中所述缓冲溶液摩尔浓度为0.01 mol/L，pH值为7.4，漆酶浓度为0.5mg/mL。
6.根据权利要求1-5任一所述方法制得的基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜。
7.根据权利要求6所述的基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜，其特征在于：以铜箔作为载体的前驱体，漆酶在预处理后的铜箔表面进行杂化自组装，铜箔表面碱式磷酸铜呈纳米花状，铜箔表面的漆酶-磷酸铜杂化微球是由纳米片互相交错组装而成的微球。
8.根据权利要求7所述的基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜，其特征在于：所述铜箔表面碱式磷酸铜纳米花直径在10-30μm，由纳米片组成；所述杂化微球直径在4-8μm，由纳米片相互交错组成。
9.一种如权利要求6-8任一所述基于铜箔载体固定漆酶的生物无机杂化膜的应用，其特征在于：将其应用于染料废水脱色处理。
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