CN102304503A - 一种用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种以醋酸纤维素和聚四氟乙烯膜为材料制备了醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜，采用吸附-交联相结合的固定化方法，用该复合膜来固定化脂肪酶。研究了温度、吸附时间、酶液浓度、交联时间和交联剂浓度等不同固定化条件对脂肪酶固定化效率和催化效果的影响，并对固定化酶膜的酶学性质进行了讨论。通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释利用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶的优势。根据本发明中复合膜的吸附特性固定化脂肪酶，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收和产品的生产，最终得到的固定化酶活为17.2U/cm2，明显高于文献中单膜法固定化脂肪酶的活力。
Description
技术领域：
本发明涉及一种固定化脂肪酶的方法。
背景技术：
脂肪酶是一类特殊的酰基水解酶，在动植物各种组织及许多微生物中普遍存在，是人类最早研究的酶类之一。它的天然底物是油脂，具有对油-水界面的亲和力，能催化酯水解或醇解、酯合成、酯交换、多肽合成等反应，在制药、试剂、食品加工、生物能源等方面有着很大的应用潜力。但脂肪酶是水溶性的，不易回收重复使用，粉末状脂肪酶分散于有机溶剂中容易失活，于酶的固定化有利于酶的分散、回收和再利用，减少了酶的损耗和残余酶产生的再次污染。科学家们一直对酶的固定化技术进行研究，但迄今为止，几乎没有一种固定化技术能普遍适用于每一种酶，所以要根据酶的应用目的和特性，来选择其固定化方法。目前已建立的固定化方法一般可分为：包埋法、吸附法、交联法及共价偶联法等。
从20世纪50年代膜分离技术进入工业化以来，经过几十年的发展，它已广泛渗透到化工、冶金、环保、生物工程等领域。分离膜不仅能对气体、有机物、各类生物制剂等进行有效的分离、浓缩、纯化，而且还能作为固定化酶的载体，实现酶的膜固定化。固定化酶膜可将酶的催化特性和膜的分离、载体和分隔功能等结合起来，从而构成酶膜生物反应器，具有其他载体不可比拟的优点。近年来酶的膜固定化技术己经成为研究的热点领域。醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜具有一定的吸附性、化学稳定性好、疏水性、机械性能优异等优点，根据复合膜的吸附特性固定化脂肪酶，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收和产品的生产。
发明内容
本发明是针对单膜法固定化脂肪酶效果不理想的问题，而提出的用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜来进行固定化脂肪酶的方法。用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶的方法通过以下步骤实现：一、复合膜的制备。二、脂肪酶的固定化。三、酶活力的测定。四、固定化条件的优化。五、固定化酶酶学性质的讨论。六、通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释利用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶的优势。
利用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶中，酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜具有一定的吸附性、化学稳定性好、疏水性、机械性能优异等优点，根据复合膜的吸附特性固定化脂肪酶，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收，最终得到的固定化酶活为17.2U/cm2，明显高于文献中单膜法固定化脂肪酶的活力。
具体实施方式
具体实施方式一：用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶的方法通过以下步骤实现：一、复合膜的制备：将15g醋酸纤维素60℃下溶于85g二甲基甲酰胺中得到铸膜液。将聚四氟乙烯膜先用0.1mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的HCl溶液清洗，然后用去离子水清洗，真空干燥后，平铺在洁净的玻璃板上。将醋酸纤维素铸膜液用特制的刮刀涂在聚四氟乙烯膜表面，控制厚度，在室温下挥发适当的时间完成干相转换后，浸入去离子水完成湿相转换。12h后用去离子水清洗，自然干燥待用；二、脂肪酶的固定化：取若干份1cm2的醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜于三角瓶中，分别加入一定量的酶液和pH7.5的磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲液，恒温搅拌吸附一定时间(25℃，170r/min)。再加入一定量戊二醛进行交联反应，反应结束后取出酶膜，用去离子水冲洗，放于干燥处待其风干后测定酶活。三、酶活力的测定：采用橄榄油乳化法；四、固定化条件的优化：分别在温度5～35℃，吸附时间0.5～3h，酶液浓度0.005～0.03g/mL，交联时间1～6h，交联剂浓度0.05～0.3％的条件下，通过测定固定化酶活力得到最佳的固定化条件。五、固定化酶酶学性质的讨论：在温度15～55℃，pH 5.5～9.5范围内，通过测定固定化酶和游离酶的活力，得出固定化酶的最适温度，最适PH值。并通过5～12次重复使用固定化酶水解橄榄油来讨论固定化酶的使用稳定性。六、通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释利用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶的优势。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在温度20～30℃的条件下进行脂肪酶的吸附固定。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在温度5～35℃的条件下，吸附固定2～3h。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在温度5～35℃，吸附时间0.5～3h，的条件下，添加浓度为0.015～0.025g/mL的酶液。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在温度5～35℃，吸附时间0.5～3h，酶液浓度0.005～0.03g/mL的条件下，与戊二醛交联2～4h。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在温度5～35℃，吸附时间0.5～3h，酶液浓度0.005～0.03g/mL，与戊二醛交联1～6h的条件下，添加浓度为0.15％～0.25％的交联剂。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤五中将固定化酶与游离酶在温度25～45℃条件下，比较固定化酶与游离酶的最适温度。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤五中将固定化酶与游离酶在pH7～9.5条件下，比较固定化酶与游离酶的最适pH值。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤五中将固定化酶重复使用10次来水解橄榄油，得到固定化酶的相对酶活力为原酶活的55.5％。其它步骤与具体实施方式一相同。
Claims (9)
1.一种用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶的方法，其特征在于用复合膜来固定化脂肪酶的方法通过以下步骤实现：一、复合膜的制备：将15g醋酸纤维素60℃下溶于85g二甲基甲酰胺中得到铸膜液。将聚四氟乙烯膜先用0.1mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的HCl溶液清洗，然后用去离子水清洗，真空干燥后，平铺在洁净的玻璃板上。将醋酸纤维素铸膜液用特制的刮刀涂在聚四氟乙烯膜表面，控制厚度，在室温下挥发适当的时间完成干相转换后，浸入去离子水完成湿相转换。12h后用去离子水清洗，自然干燥待用；二、脂肪酶的固定化：取若干份1cm2的醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜于三角瓶中，分别加入一定量的酶液和pH 7.5的磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲液，恒温搅拌吸附一定时间(25℃，170r/min)。再加入一定量戊二醛进行交联反应，反应结束后取出酶膜，用去离子水冲洗，放于干燥处待其风干后测定酶活。三、酶活力的测定：采用橄榄油乳化法；四、固定化条件的优化：分别在温度5～35℃，吸附时间0.5～3h，酶液浓度0.005～0.03g/mL，交联时间1～6h，交联剂浓度0.05～0.3％的条件下，通过测定固定化酶活力得到最佳的固定化条件。五、固定化酶酶学性质的讨论：在温度15～55℃，pH 5.5～9.5范围内，通过测定固定化酶和游离酶的活力，得出固定化酶的最适温度，最适pH值。并通过重复使用固定化酶水解橄榄油来讨论固定化酶的使用稳定性。六、通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释利用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶的优势。
2.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在温度20～30℃的条件下进行脂肪酶的吸附固定。
3.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在温度5～35℃的条件下，吸附固定2～3h。
4.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在温度5～35℃，吸附时间0.5～3h，的条件下，添加浓度为0.015～0.025g/mL的酶液。
5.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在温度5～35℃，吸附时间0.5～3h，酶液浓度0.005～0.03g/mL的条件下，与戊二醛交联2～4h。
6.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶，其特征在于步骤四中将醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜与酶液在温度5～35℃，吸附时间0.5～3h，酶液浓度0.005～0.03g/mL，与戊二醛交联1～6h的条件下，添加浓度为0.15％～0.25％的交联剂。
7.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶，其特征在于步骤五中将固定化酶与游离酶在温度25～45℃条件下，比较固定化酶与游离酶的最适温度。
8.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶，其特征在于步骤五中固定化酶与游离酶在pH7～9.5条件下，比较固定化酶与游离酶的最适pH值。
9.根据权利要求1所述的用醋酸纤维素/聚四氟乙烯复合膜固定化脂肪酶，其特征在于步骤五中将固定化酶重复使用10次来水解橄榄油，得到固定化酶的相对酶活力为原酶活的55.5％。
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