CN107254014A - 一种复合固定化酶载体材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合固定化酶载体材料及其制备方法和应用，该载体材料是将UiO‑66‑NH₂与3‑溴丙炔反应引入炔基后，再与端基为叠氮的聚甲基丙烯酸叔丁酯发生点击化学反应，然后水解，得到的粒径为280～320nm的纳米颗粒。本发明通过羧基与氨基间的静电吸附作用将果胶酶固定在该载体材料上，提高了果胶酶稳定性的同时又大大增加了可与果胶酶结合的活性位点，果胶酶的吸附量高，最高达到了89.7％，该固定化果胶酶有着较好的pH、温度和储存稳定性以及较好的重复使用性，重复使用8次后的相对酶活力仍为81％，在固定化酶领域有着巨大的应用前景。

Description

一种复合固定化酶载体材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于固定化酶技术领域，具体涉及一种复合固定化酶载体材料及其制备方法和应用。

背景技术

固定化酶因比游离酶具有较好的温度和pH稳定性、可重复使用性以及催化产物易分离等优点，已被广泛应用于化学、医药、食品等众多领域。固定化酶载体材料的选择是决定酶能否成功固定化以及固定化酶活力高低的重要因素。理想的载体材料应具备良好的机械强度、化学稳定性、热稳定性及对酶的高度亲和性，并能保持较高的酶活性等。固定化酶的载体材料已从最初的天然高分子材料发展到合成高分子材料、无机材料，以及现在的复合材料等。

金属-有机骨架(MOFs)材料是一种新型的有机-无机杂化多孔材料，由金属离子或金属簇通过共价键与有机配体连接而成，具有比表面积大、孔隙率高、热稳定性好、可后功能化修饰等优点，是理想的固定化酶载体之一。

目前，MOFs材料固定化酶的方法多采用截留法与交联法。截留法是将酶截留在MOFs材料的孔道中。即将酶悬浮在溶液中，通过加入MOFs材料，酶被截留在孔道中。截留法是一种最简单的方法，也不会改变酶的结构。然而研究发现，目前报道的大多数MOFs材料孔径尺寸虽然可调，但一般为微孔结构(孔径2nm左右)，因此酶分子的尺寸对负载起到关键性作用，多数MOFs材料由于孔径比较小而只能负载分子直径较小的酶分子，这就限制了截留法的应用。交联法是使用交联剂(一般是戊二醛)，通过与酶蛋白上的官能团形成共价键的方式，将酶固定在载体上，交联法虽然使酶与载体形成的作用更强，结合得更牢固，但是会出现酶活力下降的现象。

也有少量的研究采用后合成修饰方法，使MOFs材料表面带有可与酶反应的功能基团来达到固定化酶的目的，但所引入的功能基团并不多，最终导致只有少量的酶通过物理吸附或者共价键结合在MOFs材料的表面，酶的固载量并未有大幅度的提高。

如何选择理想的固定化酶载体，使其在提高酶稳定性的同时，又大量引入可与酶结合的活性位点，是现在固定化酶技术要解决的关键问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种富含大量活性位点的高分子材料与金属-有机骨架材料的复合固定化酶载体材料及其制备方法和应用。

解决上述技术问题所采用的复合固定化酶载体材料是将UiO-66-NH₂与3-溴丙炔反应引入炔基后，再与式I所示的端基为叠氮的聚甲基丙烯酸叔丁酯发生点击化学反应，然后水解，得到的粒径为280～320nm的纳米颗粒。

式I中n表示甲基丙烯酸叔丁酯结构单元的聚合度，n的取值优选80～100。

上述的复合固定化酶载体材料合成路线和具体制备方法如下：

1、在惰性气体保护下，以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，将UiO-66-NH₂与3-溴丙炔、碳酸钾按摩尔比为1:(6～8):(10～12)，60～80℃反应24～36小时，得到炔基修饰的UiO-66-NH₂。

2、以CuBr为催化剂、五甲基二乙烯三胺(PMDETA)为配体、丁酮和异丙醇体积比为1:1的混合液为溶剂，将甲基丙烯酸叔丁酯在2-叠氮乙基-2-溴-甲基丙酯引发下进行原子转移自由基聚合反应，得到端基为叠氮的聚甲基丙烯酸叔丁酯(N₃-PtBMA)。

3、以五水硫酸铜和抗坏血酸钠为催化体系，将炔基修饰的UiO-66-NH₂和N₃-PtBMA发生点击化学反应，所得产物(PtBMA@UiO-66-NH₂)用三氟乙酸(TFA)水解，得到复合固定化酶载体材料(PMAA@UiO-66-NH₂)。

上述步骤2中，优选2-叠氮乙基-2-溴-甲基丙酯、甲基丙烯酸叔丁酯、CuBr、五甲基二乙烯三胺的摩尔比为1:(100～120):(1～2):(1～2)。

上述步骤2中，进一步优选原子转移自由基聚合反应的温度为50～70℃、时间为6～12小时。

上述步骤3中，优选炔基修饰的UiO-66-NH₂与端基为叠氮的聚甲基丙烯酸叔丁酯、五水硫酸铜、抗坏血酸钠的摩尔比为1:(7.2～9):6:12，端基为叠氮的聚甲基丙烯酸叔丁酯与三氟乙酸摩尔比为1:5～10。

上述步骤3中，进一步优选点击化学反应的温度为常温、时间为48～72小时。

本发明复合固定化酶载体材料在固定果胶酶中的用途，具体使用方法为：将果胶酶加入pH值为4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，配制成8～12U/mL的果胶酶溶液，然后向果胶酶溶液中加入复合固定化酶载体材料，室温反应60～120分钟，离心，用缓冲液洗涤，得到固定化果胶酶。

本发明的有益效果如下：

本发明的复合固定化酶载体材料制备方法简单，其具有高稳定性、丰富的表面官能团等特点。本发明通过羧基与氨基间的静电吸附作用将果胶酶固定在该载体材料上，提高了果胶酶稳定性的同时又大大增加了可与果胶酶结合的活性位点，果胶酶的吸附量高，最高达到了89.7％，该固定化果胶酶有着较好的pH、温度和储存稳定性以及较好的重复使用性，重复使用8次后的相对酶活力仍为81％，在固定化酶领域有着巨大的应用前景。本发明复合固定化酶载体材料还可用于固定其他酶。

附图说明

图1是UiO-66-NH₂(a)、炔基修饰的UiO-66-NH₂(b)、PtBMA@UiO-66-NH₂(c)、PMAA@UiO-66-NH₂(d)的PXRD谱图。

图2是UiO-66-NH₂(a)、炔基修饰的UiO-66-NH₂(b)、PtBMA@UiO-66-NH₂(c)、PMAA@UiO-66-NH₂(d)的红外光谱图。

图3是N₃-PtBMA的核磁氢谱图。

图4是UiO-66-NH₂的TEM图。

图5是PMAA@UiO-66-NH₂的TEM图。

图6是游离果胶酶和实施例1中载体材料固定化果胶酶的pH稳定性。

图7是游离果胶酶和实施例1中载体材料固定化果胶酶的温度稳定性。

图8是游离果胶酶和实施例1中载体材料固定化果胶酶的储存稳定性。

图9是实施例1中载体材料固定化果胶酶的重复使用性。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

1、将0.5g(0.285mmol)UiO-66-NH₂固体溶于20mL DMF中，加入0.13mL(1.71mmol)3-溴丙炔和0.4g(2.91mmol)碳酸钾，在氮气氛围下70℃反应24小时，反应结束后，依次用DMF、去离子水和无水乙醇各洗涤3次，室温真空干燥，得到炔基修饰的UiO-66-NH₂。

2、将0.11g(0.5mmol)2-叠氮乙基-2-溴-甲基丙酯、7.1g(50mmol)tBMA和0.0865g(0.5mmol)PMDETA溶解于5mL无水丁酮和异丙醇体积比为1:1的混合液中，连续冻融脱气两次后加入0.0715g(0.5mmol)CuBr，再冻融脱气一次，然后在60℃氮气氛围下反应12小时，反应结束后，冷却至室温，用四氢呋喃稀释后过中性氧化铝柱，将洗脱液通过旋转蒸发仪除去大部分溶剂，然后在甲醇和水体积比为7:3的混合溶剂中沉淀，过滤，室温真空干燥，得到白色固体N₃-PtBMA。

3、将0.0396g(0.02mmol)炔基修饰的UiO-66-NH₂、1.82g(0.15mmol)N₃-PtBMA分散于水和DMF体积比为1:1的混合溶剂中，然后加入0.03g(0.12mmol)五水硫酸铜和0.047g(0.24mmol)抗坏血酸钠，室温反应48小时，离心分离，沉淀依次用DMF、去离子水和无水乙醇洗涤后，室温真空干燥，得到PtBMA@UiO-66-NH₂。将所得PtBMA@UiO-66-NH₂加入到10mL含0.09mL(1.2mmol)三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，室温反应24小时，离心分离，沉淀依次用四氢呋喃、去离子水洗涤后，室温真空干燥，得到PMAA@UiO-66-NH₂，即复合固定化酶载体材料。

发明人采用粉末X-射线衍射仪、红外光谱仪、核磁共振仪、凝胶渗透色谱仪、透射电子显微镜对所得样品进行表征，结果见图1-6。由图1可见，与UiO-66-NH₂相比，炔基修饰的UiO-66-NH₂、PtBMA@UiO-66-NH₂、PMAA@UiO-66-NH₂各个峰位置及强度几乎完全相同，这说明接枝聚合物以后，UiO-66-NH₂的晶体结构保持不变，即UiO-66-NH₂作为载体骨架材料具有良好的稳定性。在图2中，与曲线a对比，曲线b中2117cm^-1处为炔基的伸缩振动峰，表明UiO-66-NH₂炔基化成功；曲线c中2117cm^-1处炔基的伸缩振动峰消失，且1391cm^-1处出现一个宽峰，表明PtBMA成功接枝在了UiO-66-NH₂表面；曲线d中1391cm^-1中宽峰消失，表明水解反应成功。由图3可见，δ＝1.34处为上述步骤2制备的白色固体N₃-PtBMA中叔丁基的峰，表明原子转移自由基聚合反应成功。经凝胶渗透色谱测试，上述步骤2制备的白色固体N₃-PtBMA中甲基丙烯酸叔丁酯结构单元的聚合度为84，PDI为1.045。图4和图5可以看出，形成了明显的核壳结构，证明PMAA成功接枝在了UiO-66-NH₂表面。

实施例2

实施例1的复合固定化酶载体材料在固定果胶酶中的应用，具体方法如下：

将果胶酶加入pH值为4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，配制成10U/mL的果胶酶溶液，然后向25mL果胶酶溶液中加入10mg复合固定化酶载体材料，室温反应120分钟，在4000rpm下离心5分钟，沉淀用pH＝4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤，得到固定化果胶酶，于4℃保存。

为了确定本发明复合固定化酶载体材料固定果胶酶的最佳工艺条件，发明人进行了大量的实验室研究试验，具体试验情况如下：

1、固定化时间对果胶酶活力和吸附量的影响

以PMAA@UiO-66-NH₂为载体固定化果胶酶，固定化时间分别为15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟，其他步骤与实施例2相同。采用紫外-可见分光光度计测试不同固定化时间对应体系的吸光度，并根据下述公式(1)和(2)分别计算酶活力和酶吸附量，结果见表1。

其中：A—样品液的OD₅₂₀值；A₀—対照液的OD₅₂₀值；V—反应液体积25mL；t—反应时间，单位分钟；K—常数，由标准曲线得出，数值上等于OD₅₂₀为1时所相当的D-半乳糖醛酸的微克数；稀释倍数＝25倍。

表1不同固定化时间下果胶酶的酶活力和吸附量

表1结果显示，在120分钟时，酶活力和吸附量达到最大，分别为1.215U/mg和448.5mg/g。随固定化时间的继续增加，酶活力下降，酶吸附量保持不变，因此选取120分钟为最佳固定化时间。

2、酶浓度对果胶酶活力和吸附量的影响

以PMAA@UiO-66-NH₂为载体固定化果胶酶，固定化实验分为7组，各组果胶酶浓度为2U/mL、4U/mL、6U/mL、8U/mL、10U/mL、12U/mL，其他步骤与实施例2相同。采用紫外-可见分光光度计测试不同果胶酶浓度对应体系的吸光度，根据上述公式(1)和(2)分别计算酶活力和酶吸附量，结果见表2。

表2不同酶浓度下果胶酶的酶活力和吸附量

表2结果显示，在果胶酶浓度为2～10U/mL时，酶活力随果胶酶浓度的增加而增加，载体材料的吸附量也增加，当果胶酶浓度大于10U/mL时，酶活力显著下降，而吸附量继续增加。综合酶活力和吸附量考虑，本发明选取10U/mL作为果胶酶溶液的最佳浓度。

3、pH值对果胶酶活力和吸附量的影响

以PMAA@UiO-66-NH₂为载体固定化果胶酶，固定化实验分为7组，各组pH值为2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他步骤与实施例2相同。采用紫外-可见分光光度计测试不同pH值对应体系的吸光度，根据上述公式(1)和(2)分别计算酶活力和酶吸附量，结果见表3。

表3不同pH值下果胶酶的酶活力和吸附量

由表3结果可知，随pH值的增加，酶活力和吸附量均是先增加后减小，酶活力在pH＝6.0时达最大值1.205U/mg，酶吸附量在pH＝4.0时达最大值447mg/g。综合两者结果，本发明选择固定化酶的最适pH值为4.0。

4、温度对果胶酶活力和吸附量的影响

以PMAA@UiO-66-NH₂为载体固定化果胶酶，固定化实验分为7组，各组温度为10℃、20℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃，其他步骤与实施例2相同。采用紫外-可见分光光度计测试不同温度对应体系的吸光度，根据上述公式(1)和(2)分别计算酶活力和酶吸附量，结果见表4。

表4不同温度下果胶酶的酶活力和吸附量

由表4结果可知，果胶酶在低温下具有较高的活性，并且在25℃具有最大值，然后随温度的升高，酶活力显著降低；当反应温度低于50℃时，酶吸附量随温度的升高而增高，当反应温度继续增大时，酶吸附量急剧下降。综合酶活力和酶吸附量，本发明选择固定化酶的最适温度为25℃。

综合以上结果可知，果胶酶浓度为10U/mL，体系pH为4.0，25℃下固定120分钟的条件为最佳。在此条件下，最高酶活力为1.215U/mg，酶的最大吸附量为448.5mg/g。

为了确定本发明的有益效果，发明人对游离果胶酶以及实施例2中固定化果胶酶的性能进行了测试，具体如下：

1、游离果胶酶和固定化果胶酶的pH稳定性

向相同体积、不同pH值(pH值分别为2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中加入果胶，使果胶最终浓度为10U/mL，再分别加入等量酶活的固定化果胶酶或游离果胶酶，40℃振荡反应30分钟，测定游离果胶酶和固定化果胶酶在不同pH条件下的酶活力。以酶活力最高值为100％，计算不同pH条件下的相对酶活力，结果如图6所示。

从图6可以看出，在pH为2.2～7.0变化时，游离果胶酶和固定化果胶酶相对活性变化趋势相似，最大酶活力均出现在pH＝4.0，虽然固定化果胶酶与游离果胶酶相比，在pH＝4.0条件下酶活性稍微降低，但其可以在较宽的pH范围内保持相对稳定且较高的酶活性。

2、游离果胶酶和固定化果胶酶的温度稳定性

向相同体积、pH均为4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中加入果胶，使果胶最终浓度为10U/mL，再分别加入等量酶活的固定化果胶酶或游离果胶酶，将上述反应液分别在20℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下振荡反应30分钟，测定游离果胶酶和固定化果胶酶在不同温度下的酶活力。以酶活力最高值为100％，计算不同温度条件下的相对酶活力，结果如图7所示。

由图7可见，游离果胶酶和固定化果胶酶的最大酶活性均出现在50℃，低于50℃时，游离果胶酶和固定化果胶酶都是随着温度升高酶活力增加，高于50℃后酶活力不断降低。在70℃时，游离果胶酶酶活力只有最高酶活力的61％，而固定化果胶酶在70℃时仍能保持80％的酶活力。与游离果胶酶相比，虽然固定化果胶酶在50℃的活性相对较低，但其酶活性相对稳定，受温度的变化影响较小。

3、游离果胶酶和固定化果胶酶的储存稳定性

将固定化果胶酶和游离果胶酶置于4℃冰箱贮存，在一定的时间间隔内，测定酶活力。以初始酶活力为100％，计算固定化果胶酶和游离果胶酶经不同储存时间后的残余酶活力，测定结果如图8所示。

由图8可见，游离果胶酶和固定化果胶酶的活性半衰期分别在14天和27天。由此可见，固定化果胶酶在储存稳定性方面较游离果胶酶有着显著的提高，特别是有着更长的活性持续时间。

4、固定化果胶酶的重复使用性

向pH＝4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中加入果胶，使果胶最终浓度为10U/mL，配制成果胶溶液；将10mg固定化果胶酶加入到25mL果胶溶液中，40℃反应30分钟后，4000rpm下离心5分钟，沉淀用pH＝4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤后再加入到新的果胶溶液中，重复上述步骤，在520nm处测定每次反应的酶活性。结果见图9。

由图9可见，随着重复使用次数的增加，固定化果胶酶的相对活性逐渐降低，但是重复使用8次后，酶的相对活性仍保留81％，说明固定化果胶酶有着较好的重复使用性。

Claims (10)

1.一种复合固定化酶载体材料，其特征在于：该载体材料是将UiO-66-NH₂与3-溴丙炔反应引入炔基后，再与式I所示的端基为叠氮的聚甲基丙烯酸叔丁酯发生点击化学反应，然后水解，得到的粒径为280～320nm的纳米颗粒；

式I中n表示甲基丙烯酸叔丁酯结构单元的聚合度。

2.根据权利要求1所述的复合固定化酶载体材料，其特征在于：所述n的取值为80～100。

3.一种权利要求1所述的复合固定化酶载体材料的制备方法，其特征在于它由下述步骤组成：

(1)在惰性气体保护下，以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，将UiO-66-NH₂与3-溴丙炔、碳酸钾按摩尔比为1:(6～8):(10～12)，60～80℃反应24～36小时，得到炔基修饰的UiO-66-NH₂；

(2)以CuBr为催化剂、五甲基二乙烯三胺为配体、丁酮和异丙醇体积比为1:1的混合液为溶剂，将甲基丙烯酸叔丁酯在2-叠氮乙基-2-溴-甲基丙酯引发下进行原子转移自由基聚合反应，得到端基为叠氮的聚甲基丙烯酸叔丁酯；

(3)以五水硫酸铜和抗坏血酸钠为催化体系，将炔基修饰的UiO-66-NH₂和端基为叠氮的聚甲基丙烯酸叔丁酯发生点击化学反应，所得产物用三氟乙酸水解，得到复合固定化酶载体材料。

4.根据权利要求3所述的复合固定化酶载体材料的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述2-叠氮乙基-2-溴-甲基丙酯、甲基丙烯酸叔丁酯、CuBr、五甲基二乙烯三胺的摩尔比为1:(100～120):(1～2):(1～2)。

5.根据权利要求4所述的复合固定化酶载体材料的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述原子转移自由基聚合反应的温度为50～70℃、时间为6～12小时。

6.根据权利要求3所述的复合固定化酶载体材料的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述炔基修饰的UiO-66-NH₂与端基为叠氮的聚甲基丙烯酸叔丁酯、五水硫酸铜、抗坏血酸钠的摩尔比为1:(7.2～9):6:12。

7.根据权利要求6所述的复合固定化酶载体材料的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述点击化学反应的温度为常温、时间为48～72小时。

8.根据权利要求3所述的复合固定化酶载体材料的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述端基为叠氮的聚甲基丙烯酸叔丁酯与三氟乙酸摩尔比为1:5～10。

9.权利要求1所述的复合固定化酶载体材料在固定果胶酶中的用途。

10.根据权利要求9所述的复合固定化酶载体材料在固定果胶酶中的用途，其特征在于：将果胶酶加入pH值为4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，配制成8～12U/mL的果胶酶溶液，然后向果胶酶溶液中加入复合固定化酶载体材料，室温反应60～120分钟，离心，用缓冲液洗涤，得到固定化果胶酶。