CN108998438A - 一种新型7-aca固定化酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型7‑ACA固定化酶I及其制备方法,属于药物合成的技术领域,本发明的制备方法也涉及到全新的树脂中间体II,技术路线新颖,操作简便,与现有技术相比,本发明具有如下优点:1)定点固定;2)酶活保持得很好;3)固定化收率高,而且生产成本较低,分离纯化容易,更适合工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,更具体的说,本发明涉及一种新型的7-ACA固定化酶及其制备方法。
背景技术
游离酶需在温和的条件下使用,在强酸碱性、高温、高离子浓度等条件下酶的稳定性较差,易变性失活,同时游离酶不能够重复使用,难以分离,纯化成本高,限制了其在工业上的应用。通过固定化技术将酶与相应载体结合可克服游离酶的一般缺点。
大部分酶固定化后稳定性提高:热稳定性方面,能提高最适温度,一般是10℃以上;对有机溶剂的稳定性及酶抑制剂的稳定性提高;pH稳定性方面也明显优于游离酶。
固定化酶容易与底物或产物分离,降低分离成本;可以在较长时间内、反复分批或连续反应;稳定性较好;可组合进行多酶反应。反应完毕可以通过过滤等常规手段与产品分离,大大降低产品的下游处理成本,而且可以高效应用于各种类型的反应器,实现生产连续化和自动化,提升反应效率。另外,由于固定化酶的可重复使用特性,生产成本大幅下降,解决了酶催化应用过程中面临的最大障碍。
固定化酶的方法可分为下列三大类:载体结合法、交联法、包埋法。
其中,将酶与水不溶性载体结合形成固定化酶的方法称为载体结合法。根据结合的形式不同,又分为:⑴物理吸附法;⑵离子结合法;⑶共价结合法。使酶与载体通过物理吸附形成结合的称为物理吸附法,但其缺点是载体与酶的结合力弱,酶易脱落,半衰期短。通过形成离子键固定化酶的称为离子结合法,缺点是受电解质浓度影响极大,也易脱落。而利用酶与载体形成共价键固定酶的方法称为共价结合法,此法载体与酶结合牢固、半衰期长,是比较理想的固定化方法。
交联法:利用双功能基团试剂制备固定化酶的方法。常用的试剂有戊二醛、碳化二亚胺、重氮联苯胺和马来酸酐共聚物等。
将酶包裹于凝胶或聚合物半透膜或微胶囊中的方法叫包埋法。该法条件温和,酶不参与反应,活力回收较高。但是,包埋法受限于底物和产物分子体积。
不管是共价结合法还是交联法,载体的活化基团大多是与酶蛋白的裸露氨基发生反应,形成共价键的反应剧烈,常常引起酶蛋白高级结构发生变化。同时,除蛋白质N末端上α-氨基外,Tyr、His、赖氨酸上ε-氨基也多数时候也能与活化载体偶联;Arg胍基,Trp吲哚基可能也会参与反应,从而没有选择性。在多数情况下,比活力低于天然酶。例如羧甲基纤维素固定的胰蛋白酶活力仅为原酶的30%(水解酪蛋白),这主要是固定化使酶活动空间、底物、产物扩散受限所致。
CN105087537公开了一种7-ACA固定化酶的制备工艺,在磷酸缓冲液中游离的CPC酰化酶蛋白中的氨基打开大孔环氧树脂的环氧键,从而通过共价连接方式制备得到7-ACA固定化酶。但如前所述,固定酶时,必须尽量保证其活性部位的氨基酸残基不发生变化、避免导致酶蛋白高级结构破坏的操作(如高温、强酸,强碱等)。而传统的固定化方法很难做到。因此,迫切需要找到一种定点固定化技术,将酶蛋白的非活性部位的侧链功能基团与载体共价连接,从而获得活力较高的固定化酶。
传统的羧基树脂可以通过活化后与游离酶的氨基发生缩合,如下所示,从而将游离酶做成固定化酶。
此外经过检索可知还有多篇文献描述了固定化酶的制备,但这些方法均存在选择性不好,成本相对较高,路线长,纯化困难等缺点。因此开发一条生产成本较低的,分离纯化更容易的路线是必要的。本发明正好提供了一种定点固定化CPC酰化酶的制备技术。
本发明提供了一种利用传统固定化酶中常用的羧基树脂,通过引入一个含叠氮基的连接子后,该叠氮基与含炔基的CPC酰化酶通过点击反应共价连接制备7-ACA固定化酶。
发明内容
为了解决现有技术中的上述技术问题,本发明的目的在于提供一种新型的7-ACA固定化酶及其制备方法,7-ACA固定化酶的结构如式I所示。
本发明提供了一种从化合物1制备叠氮连接子7,羧基树脂8活化后与连接子7缩合得到叠氮基树脂II,最后带炔基的CPC酰化酶与叠氮基树脂通过点击反应制备得到7-ACA固定化酶,见合成路线1。
本发明路线中最大的特点是羧基树脂与游离的CPC酰化酶是通过点击反应连接的,这种连接方式是专一的,不但保持了游离酶的活性,还能高效的固定在树脂上。如前所述,传统的羧基树脂是与游离酶的氨基通过缩合反应固定的,但酶蛋白中一般不止一个氨基,且这些氨基可能位于酶的活性中心,因此这种连接的专一性不强,酶活部分丢失。
在本发明的另一方面,提供了一种用来制备7-ACA固定化酶的叠氮基树脂10,其具有式II所示的结构:
在本发明的另一方面,还提供了一种制备上述树脂10的方法,包括:羧基树脂8活化得到活化树脂9,然后与片段7缩合得到叠氮基树脂II。
在本发明的另一方面,还提供了一种制备7-ACA固定化酶的方法,包括:叠氮基树脂II与带炔基的CPC酰化酶通过点击反应制备得到7-ACA固定化酶。
该反应在铜催化下反应,所述的铜包括但不仅限于碘化亚铜、溴化亚铜、氯化亚铜、硫酸铜、醋酸铜。该反应也可加入抗坏血酸钠。
医药化学领域的普通技术人员应当知道这些常见的化合物的结构及英文缩写,例如:二环己基碳二亚胺(DCC),头孢菌素C (CPC),7-氨基头孢烷酸(7-ACA)、乙酸乙酯(EA),PE(石油醚),二氯甲烷(DCM),N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI),三乙胺(Et3N或TEA)、二异丙基乙胺(DIPEA)、醋酸(AcOH)、THF(四氢呋喃)、叔丁基(tBu)等等。
与现有技术相比,本发明提供的制备7-ACA固定化酶的方法具有如下优点:1)定点固定;2)酶活保持得很好;3)固定化收率高。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的详细说明,并且所述实施例的目的在于说明而非限定。
实施例1
6-(甲氧羰基)尼古丁酸(式2化合物)的制备
将吡啶二酸(25.2g,150.6mmol)和300ml甲醇加入反应瓶中,然后加入浓硫酸(9.0g,91.8mmol),加热回流2小时,冷却到室温,倒入1500ml 水中,析出固体,过滤,水洗,干燥得11.2g白色固体2,收率41.1%。1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 9.21 (1H, s), 8.55 (1H, J =8.0Hz, d), 8.25 (1H, J = 8.0Hz, d), 4.02 (3H, s).
实施例2
5-((2-((叔丁氧羰基)氨基)乙基)氨基甲酰)吡啶甲酸甲酯(式3化合物)的制备
将2(10g,55mmol)和200ml DCM加入反应瓶中,然后加入NHS(9.5g,83mmol)和EDCI(13.3g,55mmol),室温搅拌,反应2-3小时。后处理:加入2%的稀盐酸200ml,分液,有机相水洗,无水硫酸钠干燥,浓缩得白色固体15g,直接用于下一步反应。
将所得活化酯和200ml二氯甲烷加入反应瓶中,然后加入30ml DIPEA和9.68gBOC-1,2-乙二胺,室温搅拌,反应1-2小时。后处理:加入2M碳酸钠溶液200ml,分液,浓缩,得16g白色固体。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 9.20 (1H, s), 8.20 (1H, J = 8.0Hz, d),8.09 (1H, J = 8.0Hz, d), 4.04 (3H, s), 3.60 (2H, J = 7.6Hz, t), 3.43 (2H, J =7.6Hz, t), 1.42 (9H, s);ESI-MS m/z 324.4 (M + H)+。
实施例3
(2-(6-(羟甲基)尼古丁酰胺)乙基)氨基甲酸叔丁酯(式4化合物)的制备
50ml单口瓶中加入化合物4a(1.0g,2.3mmol)以及溶剂甲醇(10ml),搅拌溶解后加入催化剂雷尼镍(0.3g),氢气球压力下(0.1MPa)室温反应过夜。过滤,滤液浓缩干得还原产物5a(0.88g,收率94.6%),直接用于下一步反应。
将3(15.7g,48.6mmol)和200mlTHF加入反应瓶中,室温下缓慢加入硼氢化钠(1.51g,48.6mmol)的甲醇(100ml)溶液,然后加热到65度,反应2-3小时。后处理:浓缩反应液,然后硅胶柱纯化得到11g化合物4。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8.90 (1H, s),8.58 (1H, brs), 8.19 (1H, J = 8.0Hz, d), 7.56 (1H, J = 8.0Hz, d), 5.52 (1H, J= 12.0Hz, t), 4.61 (2H, J = 4.0Hz, d), 3.33-3.29 (2H, m), 3.14-3.11 (2H, m),1.37 (9H, s);ESI-MS m/z 296.2 (M + H)+。
实施例4
(5-((2-((叔丁氧羰基)氨基)乙基)氨基甲酰)吡啶-2-位)甲基 4-甲基苯磺酸酯(式5化合物)的制备
将4(13.2g,45mmol),DCM、TsCl、TEA加入反应瓶中,室温搅拌,反应2-4小时,反应完毕,浓缩除去溶剂,过硅胶柱纯化得到18g化合物5。ESI-MS m/z 450.4 (M + H)+。
实施例5
(2-(6-(叠氮甲基)尼古丁酰胺)乙基)氨基甲酸叔丁酯(式6化合物)的制备
将中间体5加入THF和叠氮化钠室温搅拌,反应24小时,后处理:EA萃取,浓缩,无水硫酸钠干燥,硅胶柱纯化。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 9.03 (1H, s), 8.19 (1H, J =8.0Hz, d), 7.57 (1H, brs), 7.42 (1H, J = 8.0Hz, d), 5.01 (1H, brs), 4.56 (2H,s), 3.60-3.57 (2H, m), 3.42-3.40 (2H, m), 1.43 (9H, s);ESI-MS m/z 321.3 (M +H)+。
实施例6
N-(2-氨基乙基)-6-(叠氮甲基)尼古丁酰胺(式7化合物)的制备
将化合物D(7.5g),甲醇(10ml)和氯化氢/二氧六环(15ml,4M)加入反应瓶中,室温搅拌,反应2-4小时。反应完毕,直接浓缩得到5.1g化合物7,收率99.6%。ESI-MS m/z 221.4 (M+ H)+。
实施例7
叠氮基树脂II的制备
将羧基树脂8(10g)和100ml DMF加入反应瓶中,然后加入NHS(5g)和DCC(4g),室温搅拌,反应过夜。过滤,DCM洗涤得到活化树脂9。然后加入2倍过量的化合物7,THF/水= 50/50ml,室温搅拌过夜。过滤,DCM洗涤得到叠氮基树脂II。通过红外谱检测可知,叠氮基已经连接到了树脂上,2105cm-1处叠氮基特征峰比较明显。
实施例8
7-ACA固定化酶I的制备
将叠氮基树脂II(10g),炔基CPC游离酶(2g),抗坏血酸钠(1.5g),硫酸铜晶体(2.0g),磷酸缓冲液水(1000ml)加入反应瓶中,室温搅拌过夜。过滤,磷酸缓冲液洗涤即得7-ACA固定化酶。I在茚三酮显紫色,而II不显紫色,说明树脂上连接上了氨基酸蛋白;此外II的红外图谱也显示树脂II中叠氮基特征峰消失。
实施例9
7-ACA固定化酶I的酶活测定
按照传统的固定化酶活测定方法,测得式I的7-ACA固定化酶活力为100-300u/g。
实施例10
利用7-ACA固定化酶I制备7-ACA
将式I所示的7-ACA固定化酶(酶活200u/g,10g)装入反应器,加入用去离子水配置好的CPC溶液,开启搅拌,控制温度15度,滴加氨水调节反应液的pH值为8.0-8.5。至反应速度为初始速度的2以下,结束反应;过滤得到7-ACA固定化酶I,重复使用;滤液降温并调节pH至5.5后结晶,过滤,干燥得到7-ACA纯品。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (6)
1.一种7-ACA固定化酶I,其特征在于,
该化合物具有式I所示的结构。
2.一种如权利要求1所述7-ACA固定化酶I的制备方法,包括:利用式II树脂
与带炔基的CPC酰化酶通过点击反应制备得到7-ACA固定化酶;
该反应在铜催化下反应,所述的铜包括但不仅限于碘化亚铜、溴化亚铜、氯化亚铜、硫酸铜、醋酸铜;
该反应也可加入抗坏血酸钠。
3.一种用来制备7-ACA固定化酶I的叠氮基树脂II,其特征在于,
该化合物具有式II所示的结构。
4.一种如权利要求3所述叠氮基树脂II的制备方法,其特征在于,
通过羧基树脂8活化得到活化树脂9,然后与片段7缩合得到叠氮基树脂II。
5.如权利要求1所述的7-ACA固定化酶I,其特征在于其酶活力为100-300u/g。
6.如权利要求1所述的7-ACA固定化酶I在催化CPC制备7-ACA中的用途,其特征在于,将式I所示的7-ACA固定化酶I,装入反应器,加入用去离子水配置好的CPC溶液,开启搅拌,控制温度10-35度,滴加氨水调节反应液的pH值为8.0-9.0,至反应速度为初始速度的2以下或反应至CPC残留效价<200u/mL,结束反应;过滤;滤液降温并调节pH至5-6后结晶,过滤,干燥得到7-ACA纯品。
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