CN103502218A - 用于缀合生物分子的化合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于修饰生物分子的低铜点击化学、1.3-偶极环加成反应和Staudinger连接反应。还提供涉及低铜点击化学、1.3-偶极环加成反应和Staudinger连接反应的组合物、方法和试剂盒。

Description

用于缀合生物分子的化合物和方法
相关申请
本申请要求2011年3月4日提交的美国临时申请第61/449,396号和2011年11月10日提交的美国临时申请第61/558,148号的优先权，所述文献的公开内容通过引用的方式完整并入本文。
发明领域
本发明涉及用于缀合生物分子的点击化学、1.3-两极环加成反应和Staudinger连接反应。
背景
对生物分子如多核苷酸、蛋白质、脂类等的缀合可以用于生物分子的检测、分离和/或鉴定。作为将两个分子连接在一起的稳健和特异性方法，K.Barry Sharpless开发了点击化学。参见，例如，Kolb等人,Angew.Chemie Intern.40(11):2004-21(2001)。为了高效进行，经典的点击反应一般需要Cu(I)离子。然而，Cu(I)离子能够对细胞和生物分子产生有害作用。因此，减少点击反应中所用的Cu(I)离子的量和/或可及性可能有益于缀合生物分子。
概述
在一个方面，本发明提供下式的化合物：
Figure BDA00003765945200021
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
R1、R2、R3和R4独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或者选自R1、R2、R3和R4的两个取代基，其中所述至少两个取代基的每一个取代基处在不同的碳原子上，共同形成稠合部分，所述稠合部分选自环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且全部的剩余取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或者剩余取代基中的至少两个共同形成稠合部分，所述稠合部分选自环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且任何剩余的取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
R5和R6独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；
选自R1、R2、R3、R4、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外荧光团结合的报告分子、载体分子、固相、治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L独立地是单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z独立地是单一的共价键或Z是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-10个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、碳-氧键和碳-硫键的任何组合组成，所述组合处于直链或支链烷基或杂烷基链的形式；并且
G选自叠氮化物反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄(handle)。
在一些实施方案中，该化合物具有式(I)。在这些实施方案的一些中，该化合物具有下式：
Figure BDA00003765945200051
在其他实施方案中，该化合物具有下式：
Figure BDA00003765945200052
其中
R2、R3、R4和R7至R12独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或者选自R2、R3、R4和R7至R12的两个取代基，其中所述两个取代基处在不同的碳原子上，共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且全部的剩余取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或剩余取代基中的两个也共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且剩余取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或R7至R12，其中所述两个取代基处于相同的碳原子上，共同形成选自烷基或杂烷基的螺环部分，所述螺环部分进一步任选地用卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基取代；
选自R1、R2、R3、R4、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外荧光团结合的报告分子、载体分子、固相、治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L独立地是单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；并且
G是选自叠氮化物反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
在一些实施方案中，式(I)、(II)或(III)的化合物选自：
Figure BDA00003765945200071
Figure BDA00003765945200081
Figure BDA00003765945200091
在另一个方面，本发明提供下式的化合物：
Figure BDA00003765945200092
其中：
R1、R2、R3和R4独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或选自R1、R2、R3和R4的两个取代基共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且剩余的两个取代基也共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，或剩余两个取代基独立地选自：氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
R5和R6独立地选自氢、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基、烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或
选自R1、R2、R3、R4、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外荧光团结合的报告分子、载体分子、固相或治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L独立地是单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
A是碳，并且R5和R6独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次，或者A、R5和R6不存在；
B选自O、S和NR7，其中R7选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基以及X-L，其中：
X选自任选地与一个或多个额外荧光团结合的报告分子、载体分子、固相、治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L独立地是单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是独立单一的共价键或Z是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-10个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、碳-氧键和碳-硫键的任何组合组成，所述组合为直链或支链烷基或杂烷基的形式；并且
G是选自叠氮化物反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
在另一个方面，本发明提供下式的化合物：
Figure BDA00003765945200131
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
R1、R2、R3和R4独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基、烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；
R5和R6独立地选自氢、-SO3X、羧酸、羧酸盐、CN、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基、烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或选自R1、R2、R3和R4的两个取代基，其中所述两个取代基处在不同的碳原子上，共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且剩余的取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或
选自R1、R2、R3、R4、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外荧光团结合的报告分子、载体分子、固相或治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
B、C、D和E选自O、S和N，其中N进一步由R7、R8或R9取代，其中R7、R8或R9选自氢、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、取代的杂芳基和X-L，其中：
X选自任选地与一个或多个额外荧光团结合的报告分子、载体分子、固相或治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是独立单一的共价键或Z是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-10个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键，碳-氮键、碳-氧键和碳-硫键的任何组合组成，所述组合为具有1-10个原子的链长度的直链或支链烷基或杂烷基的形式，或不存在；并且
G是选自叠氮化物反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
在一些实施方案中，该化合物具有式(VI)，并且R1、R2、R3和R4独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基，烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或R1与R2、R2与R3、R3与R4共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且R5和R6独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基。
一个实施方案是化合物：
Figure BDA00003765945200171
在另一个方面，本发明提供下式的化合物：
Figure BDA00003765945200181
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
R1、R2和R3独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基、烷基和芳基任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；
R5和R6独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基、烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或
选自R1、R2、R3、R5和R6的两个取代基，其中所述两个取代基处于不同的碳原子，共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且剩余的取代基选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
选自R1、R2、R3、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外荧光团结合的报告分子、载体分子、固相或治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是独立单一的共价键或Z是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-10个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键，碳-氮键、碳-氧键和碳-硫键的任何组合组成，所述组合为具有1-10个原子的链长度的直链或支链烷基或杂烷基的形式，或不存在；并且
G是选自叠氮化物反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
在另一个方面，本发明提供下式的化合物：
Figure BDA00003765945200201
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
R1和R2独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基，芳基和烷基、取代的芳基烷基，和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基、烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基，和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；
R5和R6独立地选自氢、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或
选自R1、R2、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外荧光团结合的报告分子、载体分子、固相或治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是独立单一的共价键或Z是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-10个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键，碳-氮键、碳-氧键和碳-硫键的任何组合组成，所述组合为具有1-10个原子的链长度的直链或支链烷基或杂烷基的形式，或不存在；并且
G是选自叠氮化物反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
在另一个方面，本发明提供下式的化合物：
Figure BDA00003765945200221
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
m和n是1和4之间的整数；
B是O或S，并且R3和R4不存在，或N和R3或R4不存在；
R7选自氢、烷基、杂烷基、取代的烷基和取代的杂烷基；
R1、R2、R3、R4、每个R′和每个R″独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或者选自R1、R2、R3、R4、R′和R″的两个取代基，其中所述两个取代基处在不同的碳原子上，共同形成稠合部分，所述稠合部分选自环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、取代的杂芳基，并且全部的剩余取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或者剩余取代基中的两个也共同形成稠合部分，所述稠合部分选自环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且剩余的取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
其中，R5和R6独立地选自氢、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或
选自R1、R2、R3、R4、R5、R6、R′和R″的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外荧光团结合的报告分子、载体分子、固相或治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是独立单一的共价键或Z是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-10个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键，碳-氮键、碳-氧键和碳-硫键的任何组合组成，所述组合为具有1-10个原子的链长度的直链或支链烷基或杂烷基的形式，或不存在；并且
G是选自叠氮化物反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物的一些实施方案中，除一个R取代基之外，全部R取代基均是H。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物的一些实施方案中，L是具有0至15个原子的链长度的烷基。在这些实施方案的某些中，L是具有0至5个原子的链长度的烷基。在其他实施方案中，L是-NH-(CH2)n-NH-C(O)-，其中n是1至12。在其他实施方案中，该化合物是：
Figure BDA00003765945200251
在式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物的一些实施方案中，报告分子包括发色团、荧光团、荧光蛋白、磷光染料、叠层染料、粒子、半抗原、酶或放射性同位素。在这些实施方案的某些中，荧光团是呫吨、香豆素、花青、芘、噁嗪、borapolyazaindacene或carbopyranine。在其他实施方案中，酶是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或β-内酰胺酶。在其他实施方案中，粒子是半导体纳米晶体。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物的一些实施方案中，载体分子是氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组合体、酪胺、合成聚合物、聚合物微粒子、生物细胞、细胞组分、离子螯合部分、酶底物或病毒。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物的一些实施方案中，载体分子是抗体、抗体片段、抗原、抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、葡聚糖、IgG结合蛋白、荧光蛋白、琼脂糖或非生物微粒子。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物的一些实施方案中，固体支持物是气凝胶、水凝胶、树脂、珠、生物芯片、微流体芯片、硅芯片、多孔板、膜、传导性金属、非传导性金属、玻璃、或磁性支持物。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物的一些实施方案中，固体支持物是硅胶、聚合物膜、粒子、衍生化的塑料薄膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、氧化铝凝胶、多糖、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、多元醇、琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、淀粉、菲柯尔(FICOLL)、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊糖、硝酸纤维素、重氮纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、尼龙、胶乳珠、磁珠、顺磁珠、超顺磁珠或淀粉。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物的一些实施方案中，治疗性分子是紫杉酚、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮（dihydroxy anthracin dione）、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、或其类似物或同系物。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物的一些实施方案中，治疗性分子是抗代谢物、烷基化剂、蒽环类、抗生素或抗有丝分裂药。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物的一些实施方案中，治疗性分子是相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、白喉毒素、肿瘤坏死因子、γ-干扰素、α-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、白介素-1、白介素-2、白介素-6、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子或粒细胞集落刺激因子。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物的一些实施方案中，G是炔反应基。在这些实施方案的一些中，炔反应基是叠氮化物。
在式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物的一些实施方案中，G是叠氮化物反应基。在这些实施方案的一些中，叠氮化物反应基是末端炔。
在另一个方面，本发明提供一种修饰生物分子的方法，所述方法包括步骤：在溶液中使包含叠氮化物反应性部分的生物分子与式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物反应，其中所述治疗性分子是抗代谢物、烷基化剂、蒽环类、抗生素或抗有丝分裂药，以提供修饰的生物分子。
在一些实施方案中，叠氮化物活性部分包括末端炔、活化炔或三芳基膦。
在另一个方面，本发明提供一种修饰生物分子的方法，所述方法包括步骤：在溶液中使包含炔反应性部分的生物分子与式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物反应，其中G是炔反应性部分，以提供修饰的生物分子。
在一些实施方案中，炔反应性部分包含叠氮化物。
在一些实施方案中，所述生物分子是核酸、寡核苷酸、蛋白质、肽、糖、多糖、糖蛋白、脂质、激素、药物或前药。
在一些实施方案中，该溶液还包含铜离子。在这些实施方案的一些中，该溶液还包含至少一种还原剂。在这些实施方案的一些中，至少一种还原剂是抗坏血酸、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、TCP(2,4,6-三氯苯酚)、NADH、NADPH、硫代硫酸盐、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、半胱氨酸、金属铜、醌、氢醌、维生素K1、Fe2+、Co2+或施加的电势。在这些实施方案的一些中，至少一种还原剂是抗坏血酸。
在这些实施方案的一些中，该溶液还包含铜螯合剂。在这些实施方案的一些中，这种铜螯合剂是铜I螯合剂。在这些实施方案的一些中，这种铜螯合剂I是下式的化合物：
Figure BDA00003765945200291
其中X、Y和Z各自独立地具有下式：
Figure BDA00003765945200292
其中：
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、烷氧基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基、烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；并且
B、C、D和E是C或N；并且
L1、L2和L3是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-5个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键和磷-氮键的任何组合构成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基和取代的杂环烷基。
在这些实施方案的一些中，选自X、Y和Z的至少一个取代基的R1、R2、R3、R4和R5各自是H。在这些实施方案的某些中，X、Y和Z的每一者的R1、R2、R3、R4和R5各自是H。
在这些实施方案的一些中，L1、L2和L3各自是具有1-5个原子的链长度的烷基。
在这些实施方案的一些中，L1、L2和L3各自是-CH2CH2-。
在其他实施方案中，这种铜螯合剂是N,N,N′,N′-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)、EDTA、新亚铜试剂、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)、吡啶-2,6-二甲酸(PDA)、S-羧甲基-L-半胱氨酸(SCMC)、1,10菲咯啉或其衍生物、曲恩汀、谷胱甘肽、组氨酸、多组氨酸、三(羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)或四乙撑多胺(TEPA)。
在其他实施方案中，这种铜螯合剂是1,10菲咯啉、红菲绕啉二磺酸(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸)或浴酮灵二磺酸(2,9-二甲基4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸盐)。
在另一个方面，提供一种试剂盒，其包含式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物。
在一些实施方案中，该试剂盒还包含铜离子源。
在一些实施方案中，该试剂盒还包含至少一种还原剂。在这些实施方案的一些中，至少一种还原剂是抗坏血酸、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、TCP(2,4,6-三氯苯酚)、NADH、NADPH、硫代硫酸盐、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、半胱氨酸、金属铜、醌、氢醌、维生素K1、Fe2+、Co2+或施加的电势。在其他实施方案中，至少一种还原剂是抗坏血酸。
在一些实施方案中，该试剂盒还包含铜螯合剂。在这些实施方案的一些中，这种铜螯合剂是铜I螯合剂。在这些实施方案的一些中，这种铜螯合剂I是下式的化合物：
Figure BDA00003765945200311
其中X、Y和Z各自独立地具有下式：
Figure BDA00003765945200312
其中：
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基羧酰胺基、烷基芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；并且
B、C、D和E是C或N；并且
L1、L2和L3是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-5个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基和取代的杂环烷基。
在这些实施方案的一些中，选自X、Y和Z的至少一种取代基的R1、R2、R3、R4和R5各自是H。在这些实施方案的一些中，X、Y和Z的每一个的R1、R2、R3、R4和R5各自是H。
在这些实施方案的一些中，L1、L2和L3各自是具有1-5个原子的链长度的烷基。在这些实施方案的一些中，L1、L2和L3各自是-CH2CH2-。
在其他实施方案中，这种铜螯合剂是N,N,N′,N′-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)、EDTA、新亚铜试剂、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)、吡啶-2,6-二羧酸(PDA)、S-羧甲基-L-半胱氨酸(SCMC)、1,10菲咯啉或其衍生物、曲恩汀、谷胱甘肽、组氨酸、多组氨酸、三(羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)或四乙撑多胺(TEPA)。
在其他实施方案中，这种铜螯合剂是1,10菲咯啉、红菲绕啉二磺酸(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸)或浴酮灵二磺酸(2,9-二甲基4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸盐)。
在另一个方面，本发明提供选自以下的化合物：
Figure BDA00003765945200331
在另一个方面，本发明提供一种组合物，其包含式(I)、(II)、(III)、(IV)、(XIII)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(XIV)、(IX)、(X)、(XI)或(XII)的化合物；和式(XV)的铜螯合剂I。
附图简述
图1显示用于(A)合成(2-(6-(叠氮甲基)烟酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(6)和(B)化合物(6)的荧光标记的反应方案，如实施例1中所述。
图2显示用于合成(2-(6-((丙-2-炔-1-基氧基)甲基)烟酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(12)和化合物(12)的荧光标记的反应方案，如实施例1中所述。
图3显示在各种浓度的Cu下，试剂(A)QSY pAzide和OregonGreen
Figure BDA00003765945200351
炔之间，和(B)QSY Azide和Oregon Green
Figure BDA00003765945200352
炔之间点击反应的速率，如实施例2中所述。
图4显示增加Cu2+浓度和在铜螯合剂THPTA存在下增加Cu2+浓度对Oregon Green
Figure BDA00003765945200353
炔和QSY Azide或QSY pAzide之间点击反应的影响，如实施例2中所述。
图5显示在(A)125μM Cu或(B)31μM Cu存在下，在具有（4:1(THPTA:Cu)比率）或没有THPTA的情况下，香豆素-炔(16)和各种叠氮化物之间点击反应的结果，如实施例4中所述。
图6显示在(A)各种浓度的Cu(II)，和(B)伴以抗坏血酸钠的各种浓度的Cu(II)存在下GFP的稳定性，如实施例5中所述。
图7显示(A)在Cu(II)存在时在具有或没有抗坏血酸的情况下和在具有或没有THPTA的情况下GFP的稳定性，和(B)在(A)所示的相同浓度下Oregon Green
Figure BDA00003765945200361
炔和QSY叠氮化物之间点击反应的速率，如实施例5中所述。
图8显示在GPF存在下，存在AF647-吡啶甲基叠氮化物或AF647叠氮化物时，以THPTA或不以THPTA作为配体的情况下，用EU对RNA进行点击标记，如实施例6中所述。
图9显示在GPF存在下，存在AF647-吡啶甲基叠氮化物或AF647叠氮化物时，以THPTA作为配体，在不同的Cu:THPTA摩尔比情况下，用EU对RNA的点击标记，如实施例6中所述。
图10显示在存在2mM铜时GFP稳定性和点击反应进展的图示，如实施例6中所述。
图11显示在具有（不同Cu:THPTA摩尔比）或没有THPTA的情况下点击反应速率的图示，如实施例6中所述。
图12显示在存在200μM铜时GFP稳定性和点击反应进展的图示。
图13显示在GPF存在下，存在THPTA时，用AF647-吡啶甲基叠氮化物或AF647叠氮化物对HPG进行的点击标记，如实施例7中所述。
图14显示在GPF存在下，以THPTA作为配体，伴以各种Cu:THPTA摩尔比时，用AF647-吡啶甲基叠氮化物或AF647叠氮化物对HPG进行的点击标记，如实施例7中所述。
图15显示存在2mM铜时GFP稳定性和与HPG的点击反应的进展的图示，如实施例7中所述。
图16显示在GPF存在下，伴以THPTA，鬼笔环肽染色后，用AF647-吡啶甲基叠氮化物对HPG进行的点击标记，如实施例8中所述。
图17显示在GPF存在下，以THPTA作为配体，在各种Cu:THPTA摩尔比时，用AF647-吡啶甲基叠氮化物或AF647叠氮化物对HPG进行的点击标记，如实施例8中所述。
图18显示采用GalNAz标记的单克隆抗TSH的SDS-PAGE凝胶，所述单克隆抗TSH与DIBO发生点击反应或与THPTA/吡啶甲基发生点击反应，其中，在后一种情况下，THPTA在Cu浓度方面发生变动。
图19显示携带羧酸酯末端的吡啶甲基叠氮化物衍生物连接到活哺乳动物细胞表面上表达的重组蛋白，如实施例10中所述。
图20显示W37VLplA-催化吡啶甲基叠氮化物(5-(6-(叠氮甲基)烟酰氨基)戊酸)与LAP肽连接的HPLC分析，如实施例10中所述。
图21显示螯合作用辅助的铜(I)催化的叠氮化物-炔环加成反应，用于将Alexa Fluor
Figure BDA00003765945200371
647添加到活HEK细胞中的神经元表面蛋白上。显示阴性对照，同时省略ATP(第二列)或野生型LplA替代W37VLplA(第三列)。H2B-YFP是核定位的YFP转染标记，如实施例10中所述。
图22显示螯合作用辅助的铜(I)催化的叠氮化物-炔环加成反应，用于将Alexa Fluor647添加到活海马神经元中的神经配蛋白-1上，如实施例10中所述。
发明详述
本发明可用于体内和体外生物分子研究。
本发明提供了标记、检测、分离和/或分析借助接合化学柄所修饰的生物分子的组合物、方法和试剂盒。
定义和缩写
在详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于特定的组成或方法步骤，因为这些可以变动。必须指出，非上下文另外清楚地说明，否则如本说明书及所附权利要求书中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指称。因此，例如，对“一种配体”的指称包括多种配体；对“一种抗体”的指称包括包括多种抗体等。
本发明的某些化合物可以按非溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。通常，溶剂化形式等同于非溶剂化形式并且涵盖于本发明的范围内。本发明的某些化合物可以按多种结晶形式或无定形形式存在。通常，全部物理形式对于本发明构思的用途是等同的并且意在属于本发明的范围内。
本发明的某些化合物拥有非对称碳原子(光学中心)或双键；消旋物、非对映异构体、几何异构体和单一异构体都包括在本发明的范围内。
本文所述的化合物可以作为单一异构体(例如，对映异构体、顺-反、位置、非对映异构体)或作为异构体的混合物制备。在一个优选实施方案中，将化合物制备为基本上单一的异构体。制备基本上异构体纯的化合物的方法是本领域已知的。例如，可以通过使用对映异构体纯的合成中间体结合下述反应制备对映异构体富集的混合物和纯的对映异构体化合物，所述反应或保持手性中心处的立体化学不改变或导致其完全反转。可选地，可以将终产物或沿合成途径的中间体拆分成单一立体异构体。用于反转或保持特定立体中心不改变的技术，和用于拆分立体异构体混合物的那些技术是本领域熟知的，并且为特定情况选择适宜的方法完全处于本领域技术人员的能力范围内。通常参见Furniss等人(编著)VOGEL′S ENCYCLOPEDIA OFPRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY第5版，LONGMAN SCIENTIFIC ANDTECHNICAL LTD.，ESSEX，1991，第809-816页；和HELLER，ACC.CHEM.RES.23:128(1990)。
本文中公开的化合物也可以在构成这类化合物的一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位素。例如，可以用放射性同位素(例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C))放射标记这些化合物。本发明化合物的全部同位素变体，无论是否具有放射性，均意在包括在本发明的范围内。
其中公开的化合物包括共轭的环系统，共振稳定作用可以允许形式电荷分布遍及整个分子。尽管可以将特定电荷描述为定位于在特定环系统或特定杂原子上，然而，通常理解，可以绘制可比的共振结构，其中电荷可以在形式上定位在化合物的轮替部分上。
具有形式电荷的所选化合物可以在不用适当的生物相容性反离子的情况下显示。这种反离子起到平衡化合物上存在的正电荷或负电荷的作用。如本文所用，生物相容性的物质在使用时没有毒性，并且不对生物分子产生明显有害的作用。带负电荷的反离子的例子包括尤其是氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、磷酸盐、高氯酸盐、四氟硼酸盐、四芳基硼化物(tetraarylboride)、硝酸盐和芳族或脂族羧酸的阴离子。优选的反离子可以包括氯化物、碘化物、高氯酸盐和各种磺酸盐。带正电荷的反离子的例子包括尤其是碱金属或碱土金属离子、铵或烷基铵离子。
除非另外声明，否则术语“烷基”，自身或作为另一种取代基的部分，意指直链或支链或环状烃基或其组合，其可以是完全饱和、单不饱和或多不饱和的并且可以包括二价(“链烯基”)和多价基，具有所指定的碳原子数目(即C1-C10意指1个至10个碳)。饱和烃基的例子包括但不限于多种基团，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔-丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体等。不饱和烷基是具有一个或多个双键或叁键的基团。不饱和烷基的例子包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和更高级的同系物和异构体。除非另外指出，否则术语“烷基”也意在包括烷基的衍生物，如下文定义的那些，包括杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基和取代的杂环烷基。限于烃基的烷基称作“同烷基(homoalkyl)”。
在一些实施方案中，烷基含有1至25个碳、1至20个碳(即，C1至C20烷基)、1至15个碳(即，C1至C15烷基)、1至10个碳(即，C1至C10烷基)或之间1至8个碳(即，C1至C8烷基)。具有8个或更少碳原子的直链、支链或环状烃链也可以在本文中称作“低级烷基”。此外，如本文所用，术语“烷基”还可以在烃链片段的一个或多个碳原子处包括一个或多个取代。
如本文所用的术语“羧基烷基”指包含至少一个-COOH取代基的直链或支链烷基，包括环烷基。术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫基”(或硫代烷氧基)以它们的常规含义使用，并且指分别借助氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分连接的杂烷基。
非另外声明，否则术语“酰基”或“烷酰基”，本身或与另一个术语组合，意指稳定的直链或支链或环状烷基或其组合，酰基处在烷基的至少一个末端上。“酰基”是通过从羧酸移除-OH部分的源自羧酸的基团。
术语“氨基”或“胺基团”指基团-NR′R″，其中R′和R″独立地选自氢、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基。在伯胺基中，R′和R″均是氢，而在仲胺基中，R′或R″中二者之一为氢，但是并非二者均为氢。在叔胺基中，R′和R″均不是氢。取代胺是一种胺基，其中R′和/或R″是除氢之外的基团。此外，术语“胺”和“氨基”可以包括质子化和季铵化形式的氮，包含基团-NRR′R″及其生物相容的阴离子反离子。
如本文所用，术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)、硅(Si)和硒(Se)。
除非另外声明，术语“杂烷基”本身或与另一个术语组合，意指直链或支链或环状含碳的基团或其组合，所述基团由所述数目的碳原子和至少一个选自O、N、Si、P、S和Se的杂原子组成并且其中所述氮、磷、硫和硒原子任选地氧化，并且氮杂原子任选地季铵化。O、N、P、S、Si和Se可以位于杂烷基的任何内部位置或该烷基与分子的其余部分连接的位置处。例子包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2,-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3和-CH=CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”本身或作为另一个取代基的部分，意指源自杂烷基的二价基团，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基，杂原子也可以占据任一个链末端或两个链末端(例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基，亚烷基氨基，亚烷基二氨基等)。再进一步，对于亚烷基和杂亚烷基连接基，书写连接基化学式方向不提示连接基的取向。例如，式-C(O)2R′-同时代表-C(O)2R′-和-R′C(O)2-。
除非另外声明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其他术语组合，分别表示环状形式的“烷基”和“杂烷基”。此外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环与分子的其余部分连接的位置。环烷基的例子包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的例子包括但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)，1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另外声明，否则术语“芳基”意指多不饱和的芳族部分，所述芳族部分可以是单个环或多个环(优选地1至3个环)，这些环稠合在一起或共价连接。在一些实施方案中，芳基含有20个或更少的碳原子，例如，苯基、萘基、联苯基和蒽基。芳基的一个或多个碳原子也可以被以下基团取代、例如、烷基；芳基；杂芳基；卤素；硝基；氰基；羟基、烷氧基或芳氧基；硫代或巯基、烷基硫基或芳基硫代；氨基、烷氨基、芳氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、或芳烷基氨基；氨基羰基、烷氨基羰基、芳氨基羰基、二烷基氨基羰基、二芳氨基羰基、或芳烷基氨基羰基；羧基、或烷基氧基羰基或芳氧基羰基；醛；芳基羰基或烷基羰基；亚氨基、或芳基亚氨基或烷基亚氨基；磺基；烷基羰基或烷基羰基；磺基；烷基磺酰基或芳基磺酰基；肟基(hydroximinyl)、或芳基肟基(aryloximinyl)或烷基肟基(alkoximinyl)。此外，芳基的两个或更多个烷基或杂烷基取代基可以合并以形成稠合的芳基-烷基或芳基-杂烷基环系统(例如，四氢萘基)。包含杂环基的取代基(例如，杂芳氧基和杂芳烷基硫基)通过类似于上文所述术语来定义。
术语“杂芳基”指含有1至4个选自N、O、S和Se的杂原子的芳基(或环)，其中所述氮、硫和硒原子任选氧化，并且氮原子任选地季铵化。杂芳基可以经杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、四唑基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、2,3-二氢苯并[1,4]二喔星-6-基、苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基和6-喹啉基。芳基和杂芳基环系统的取代基选自下文描述的可接受取代基的群组。
为简便，与其他术语(例如，芳氧基、芳基硫代、芳基烷基)组合使用时，术语“芳基”包括如上文定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”意指包括其中芳基与烷基(例如，苄基、苯乙基、吡啶甲基等)连接的那些基团，其中所述烷基包括其中碳原子(例如，亚甲基)已经例如由氧原子替换的那些烷基(例如，苯氧甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等)。
以上术语的每一个(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”、“杂芳基”、等。)均包括所指示基团的取代和未取代的形式。下文提供每种类型基团的非限制的示例取代基。
烷基和杂烷基的取代基(包括经常称作亚烷基、链烯基、杂亚烷基、杂链烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)一般地称作“烷基取代基”，并且它们可以是选自以下的多种基团的一种或多种，但不限于此：-OR′、=O、=NR′、=N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)=NR″′、-NR-C(NR′R″)=NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2，在数目上范围从0至(2m′+1)，其中m′是这类基团中碳原子的总数。R′、R″、R″′和R″″各自优选地独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基，例如，以1-3个卤素取代的芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。当化合物包括多于一个R基团时，则例如，独立地选择每一个R基团，对于R′、R″、R″′和R″″基团各自而言，当存在多于一个的这些基团时，也是如此。当R′和R″与相同的氮原子连接时，它们可以与氮原子组合以形成5元、6元或7元环。例如，-NR′R″意在包括，但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上文对取代基的讨论中，本领域技术人员将理解，术语“烷基”意在包括这些基团，所述基团包含与除氢基团之外的基团如卤代烷基(例如，-CF3和-CHCF3)和酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)结合的碳原子。
与针对烷基描述的取代基相似，将芳基和杂芳基的取代基一般地称作“芳基取代基”。这些取代基选自例如卤素、-OR′、=O、=NR′、=N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)=NR″′、-NR-C(NR′R″)=NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，个数范围为从零至芳环系统上开放价的总数；并且其中R′、R″、R″′和R″″优选地独立选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。当化合物包括多于一个R基团时，则例如，独立地选择每一个R基团，对于R′、R″、R″和R″″基团各自而言，当存在多于一个的这些基团时，也是如此。在随后的方案中，符号X代表如上文所述的“R”。
在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-T-C(O)-(CRR′)q-U-的取代基替代，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR′-或单键，并且q是0至3的整数。可选地，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被式-A-(CH2)r-B-的取代基替代，其中A和B独立地是-CRR′-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR′-或单键，并且r是1至4的整数。如此形成的新环的单键之一可以任选地替换为双键。可选地，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地替换为式式-(CRR′)s-X-(CR″R″′)d-的取代基，其中s和d独立地是0至3的整数，X是-O-、-NR′-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR′-。取代基R、R′、R″和R″′优选地独立地选自氢或取代或未取代的(C1-C6)烷基。
如本文所用，术语“链长度”指两个取代基之间碳和/或杂原子的最小数目。作为非限制性例子，在分子X-(CH2)3-CH(CH2CH3)-NH-Y中的X和Y之间的链长度是5。
如本文所用，术语“活化炔”指与另一个分子上的叠氮化物选择性反应以在活化炔基和炔反应基之间形成共价化学键的环辛炔。活化炔包括但不限于环辛炔和二氟环辛炔，例如，在Agard等人,J.Am.Chem.Soc.，2004，126(46):15046-15047中所描述的；二苯并环辛炔，例如，在Boon等人,WO2009/067663A1(2009)中描述的；和氮杂-二苯并环辛炔，例如，在Debets等人,Chem.Comm.，2010，46:97-99中描述的。上文描述的这些二苯并环辛炔(包括氮杂-二苯并环辛炔)在本文统称为环辛炔基团。
如本文所用，术语“亲和力”指两个分子(如抗体和抗原)或带正电荷部分和带负电荷部分的结合相互作用的强度。对于二价分子如抗体，一般将亲和力定义为对抗原的一个结合结构域，例如抗原的一个Fab片段的结合强度。该抗原的两个结合结构域的结合强度称作“亲和力”。如本文所用的“高亲和力”指与抗体结合的配体，所述抗体具有大于104M-1、一般105-1011M-1的亲和力常数(Ka)；如通过抑制ELISA所测定，或通过可比较技术例如斯卡查德图或使用Kd/解离常数(其是Ka的倒数)所测定的等同亲和力。
如本文所用，术语“炔反应性”指与另一个分子上的炔(如末端炔或活化炔)选择性反应以在炔修饰基团和炔反应基之间形成共价化学键的化学部分。炔反应基的例子包括但不限于叠氮化物和硝酮。“炔反应性”也可以指含有与炔基选择性反应的化学部分的分子。
如本文所用，术语“抗体”指与某些物质(例如抗原和免疫原)非共价结合以形成抗体-抗体复合物的免疫球蛋白(Ig)超家族的蛋白质。抗体可以是多克隆或单克隆。抗体也可以是嵌合、人源化或人抗体。可以理解，如本文所用的术语“抗体”在其范围内部包括源自常规使用的任何动物或源自人类的各种类别或亚类的免疫球蛋白的任一种。
如本文所用，术语“抗体片段”指保留完整抗体的主要选择性结合特征的抗体片段。非限制的示例的抗体片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv和单链Fv(scFv)。其他非限制的示例的抗体片段包括(i)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(ii)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,Nature341，544(1989))；和(iii)分离的CDR区。此外，可以使用重组技术产生保留抗原识别特征的任意片段。
如本文所用，术语“抗原”指与抗体选择性结合的一种或多种分子。抗原可以包括任何类型的分子，例如，蛋白质、寡核苷酸、多糖或小分子。在一些实施方案中，抗原包含多于一个分子，如例如，异二聚体受体、与其配体结合的受体、或包含蛋白质和小分子或寡核苷酸的复合物。在一些实施方案中，靶是抗原。
如本文所用，术语“水溶液”指至少50%为水的溶液。在一些实施方案中，水溶液保留水的溶液特征。
如本文所用，术语“叠氮化物反应性”指与另一个分子上的叠氮化物选择性反应以在叠氮基修饰的基团和叠氮基反应基之间形成共价化学键的化学部分。叠氮化物-反应性基团的例子括但不限于，炔，其包括但不限于末端炔和活化炔；和膦，其包括但不限于三芳基膦。“叠氮化物反应性”也可以指含有与叠氮基选择性反应的化学部分的分子。
如本文所用，术语“生物分子”指可以在活生物(包括分离的细胞)中发现的蛋白质、肽、氨基酸、糖蛋白、核酸、核苷酸、核苷、寡核苷酸、糖、低聚糖、脂类、激素、蛋白聚糖、糖、多肽、多核苷酸、多糖、药物、前药等。生物分子不需要是天然存在的分子，但是可以是已经例如直接、通过转基因方法或其他方式导入活生物或活生物祖先中的分子。
如本文所用，术语“载体分子”指与本发明化合物共价结合并且向该化合物或向与之缀合的生物分子赋予希望的特性的生物部分或非生物部分。非限制性的示例的这类希望的性质包括结合特性，例如，与另一个部分(例如，结合对子的成员)特异性结合的能力；增加半衰期；增加溶解度；和指引化合物至细胞或生物中的特定位置。这类部分包括但不限于氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质装配物、合成聚合物、聚合物微粒子、生物细胞、病毒和其组合。
如本文所用，术语“化学柄”指能够发生点击反应、1,3-偶极环加成反应和/或Staudinger连接反应的官能团。非限制的示例的化学柄包括炔活性部分，如叠氮化物；和叠氮活性部分，如炔，包括但不限于末端炔及活化炔；以及膦，包括但不限于三芳基膦；等。
如本文所用，术语“互补性化学柄”指能够与指定化学柄状物发生点击反应、1,3-偶极环加成反应和/或Staudinger连接反应的官能团。例如，对于叠氮化物化学柄，互补性化学柄包括但不限于炔，如末端炔和活化炔，和膦如三芳基膦。
如本文所用，术语“点击化学”和“点击反应”指铜离子催化的在叠氮化物和末端炔之间形成1,2,3-三唑的1,3-偶极环加成反应。
如本文所用，术语“1,3-偶极环加成反应”指在叠氮化物和炔之间形成1,2,3-三唑的反应。
如本文所用，术语“铜离子源”指Cu(I)离子的任何来源，无论Cu(I)离子的形成是否涉及其他试剂，如还原剂。非限制的示例的铜离子源包括铜盐，如Cu(NO3)2Cu(OAc)2或CuSO4；铜卤化物，如CuBr和CuI；和含铜金属，如铜丝。
如本文所用，术语“铜离子螯合剂”和“铜螯合剂”指与Cu(I)离子结合并使其稳定的部分。本文中讨论了非限制的示例的铜螯合剂。
如本文所用，术语“卤素”指选自F、Cl、Br和I的原子。
如本文所用，术语“接头”或“L”指合并1-30个选自C、N、O、S、P、Si和Se的非氢原子的单个共价键或一系列稳定共价键。示例的连接元(linking member)包括这些部分，其包括-C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、-O-等。在一些实施方案中，接头具有1-30个原子或1-25个原子、或1-20个原子、或1-15个原子、或1-10个原子、或1-5个原子的链长度。“可裂解接头”是一种接头，其具有可以在特定反应条件下或在特定分子或酶存在的情况下断裂的一个或多个共价键，从而在可裂解接头的一侧上的部分不再与所述可裂解接头的另一侧上的部分共价结合。术语“可裂解基团”指一种部分，所述部分允许通过裂解将释放的部分与缀合物的剩余部分连接的键来使缀合物的部分(例如，报告分子、载体分子或固相支持物)从该缀合物的剩余部分释放。这类裂解(对于可裂解接头和可裂解基团)在本质上是化学性，或是酶促介导的。示例的酶促可裂解接头和基团包括天然氨基酸和以天然氨基酸结尾的肽序列。除酶促可裂解接头和基团之外，在本发明的范围内还包括因酶之外的试剂的作用而裂解的一个或多个位点。示例的非酶促裂解剂包括但不限于酸、碱基、光(例如，硝基苄基衍生物、苯甲酰甲基，苯偶姻酯)和热。许多可裂解基团是本领域已知的。见例如，Jung等人,Biochem.Biophys.Acta，761:152-162(1983)；Joshi等人,J.Biol.Chem.，265:14518-14525(1990)；Zarling等人,J.Immunol.，124:913-920(1980)；Bouizar等人,Eur.J.Biochem.，155:141-147(1986)；Park等人,J.Biol.Chem.，261:205-210(1986)；Browning等人,J.Immunol.，143:1859-1867(1989)。另外，类型广泛的可裂解双官能(同型和异型双官能的)间隔臂是可商业获得的。一种示例的可裂解接头或基团（一种酯）可以被试剂例如氢氧化钠裂解，产生含有羧酸盐的产物和含有羟基的产物。
如本文所用，术语“低铜”指小于1毫摩尔的铜浓度。
如本文所用的术语“修饰的生物分子”指已经通过共价连接至少一种化学柄被修饰的生物分子。可以在体外或在体内修饰生物分子。
如本文所用的术语“膦反应性”指经Staudinger连接反应与另一个分子上的膦基团(包括但不限于三芳基膦基)选择性反应以形成共价化学键的化学部分。膦反应基的例子包括但不限于叠氮化物。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中在一般的意义上用来指任意长度的氨基酸残基的聚合物。术语“肽”在本文中用来指具有少于100个氨基酸残基、一般少于10个氨基酸残基的多肽。多肽，蛋白质或肽中的氨基酸残基可以是天然存在的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基。
如本文所用，术语“还原剂”指能够使Cu(II)还原成至Cu(I)的试剂。非限制的示例的还原剂包括抗坏血酸、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、NADH、NADPH、硫代硫酸盐、金属铜、氢醌、维生素K1、谷胱甘肽、半胱氨酸、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇和施加的电势。可以充当还原剂的非限制的示例的金属包括Al、Be、Co、Cr、Fe、Mg、Mn、Ni、Zn、Au、Ag、Hg、Cd、Zr、Ru、Fe、Co、Pt、Pd、Ni、Rh和W。
术语“报告分子”指直接或间接可检测的部分。在一些实施方案中并且作为非限制性例子，报告分子可以例如因其光谱特性而是直接可检测的。在一些实施方案中并且作为非限制性例子，报告分子可以例如因其酶活性而间接可检测的，其中所述酶活性产生直接可检测的信号。这类报告分子包括但不限于放射标记物；颜料、染料和其他色原体；自旋标记物；荧光标记物(即，荧光团如香豆素类、花青类、苯并呋喃类、喹啉类、喹唑啉酮类、吲哚类、氮茚类、borapolyazaindacene和呫吨类，包括荧光素、罗丹明和对甲氨基酚)；化学发光物质，其中通过对物质的化学修饰生成可检测信号；含金属的物质；酶，其中酶活性产生信号(例如，通过从底物形成可检测产物；可以与另一种分子选择性结合的半抗原(例如，与抗体结合的抗原；或与抗生物素蛋白和链霉亲和素结合的生物素)。许多报告分子是本领域已知的，其中一些例如在上文的RichardP.Haugland，Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes和Research Products(第9版，CD-ROM，2002年9月)中描述。
如本文所用，术语“固相支持物”指一种材料，所述材料在所选的溶剂体系中基本上不可溶或可以从该材料可溶解于其中的所选溶剂体系轻易分离(例如，通过沉淀)。可用于实施本发明的固相支持物可以包括被活化或能够被活化从而本文所述的一种或多种化合物将与该固相支持物结合的群组。
如本文所用，术语“[生物分子]的结构完整性不降低”或“保留[生物分子]的结构完整性”意指：1)通过凝胶电泳和检测(如染色)分析时，相对于源自相同量的经电泳移动的未标记生物分子的相应条带或点，源自所分析的标记的生物分子，源自标记的生物分子的条带或点在强度方面降低不超过20%，和优选地降低不超过10%；或2)通过凝胶电泳分析时，未观察到源自标记的生物分子条带或点比源自相同量的经电泳位移的未标记生物分子的相应条带或点明显更不清晰，其中“明显更不清晰”(同义于“明显更弥散的”)意指可检测条带或点在凝胶上比相应的未标记生物分子占据至少5%、优选地10%、优选地20%的更多面积。用于标记的生物分子的结构完整性的其他可重复试验包括而不限于检测释放的氨基酸或肽或质谱法。
术语“治疗性分子”指可以用来治疗和/或减轻受试者中病状和/或症状，和/或可以用来在体外影响细胞内的生物学过程的分子。治疗性分子包括但不限于抗代谢物、烷基化剂、蒽环类、抗生素和抗有丝分裂药。非限制的示例性治疗性分子包括紫杉酚、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、白喉毒素、肿瘤坏死因子、γ-干扰素、α-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、白介素-1、白介素-2、白介素-6、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、或粒细胞集落刺激因子、及其类似物或同系物。
本发明提供涉及修饰的生物分子和式(I)至(XIII)任一者的化合物的低铜点击反应、1,3-偶极环加成反应和Staudinger连接反应。在一些实施方案中，修饰的生物分子包含叠氮化物部分并且式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含末端炔。在一些实施方案中，修饰的生物分子包含炔(如末端炔或活化炔)或膦(如三芳基膦)，并且式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含叠氮化物部分。
因此，本文中提供用于标记、检测、分离和/或分析生物分子的化合物、组合物、方法和试剂盒。在一些实施方案中，提出了包含叠氮化物部分或炔部分的新化合物。在一些实施方案中，提供了使用点击反应、1,3-偶极环加成反应或Staudinger连接反应，将这些新化合物共价连接至修饰的生物分子的方法。在一些此类实施方案中，该方法包括标记、检测、分离和/或分析所述生物分子。
点击化学
叠氮化物和末端炔可以在室温发生Cu(I)催化的叠氮化物-炔环加成反应(CuAAC)。这类Cu(I)催化的叠氮化物-炔环加成反应，有时称作点击化学，一般导致1,2,3-三唑的形成。各种示例性点击反应是本领域已知的，并且例如在美国申请公开第2005/0222427号中描述。
点击反应可以在多种水溶液包括但不限于水以及水和各种可溶混性或部分可溶混性有机溶剂的混合物中进行。非限制的这类有机溶剂包括醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、叔-丁醇(tBuOH)和丙酮。
在一些实施方案中，点击反应中作为催化剂使用的铜是Cu(I)离子。示例的Cu(I)离子源包括但不限于亚铜卤化物，如溴化亚铜或碘化亚铜。在一些实施方案中，点击反应在Cu(II)离子和使Cu(II)原位还原成Cu(I)的还原剂存在下实施。示例的Cu(II)离子源包括但不限于Cu(NO3)2、Cu(OAc)2和CuSO4。非限制的示例的还原剂包括抗坏血酸、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、NADH、NADPH、硫代硫酸盐、金属铜、氢醌、维生素K1、谷胱甘肽、半胱氨酸、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、Fe2+、Co2+和施加的电势。在一些实施方案中，还原剂是选自Al、Be、Co、Cr、Fe、Mg、Mn、Ni、Zn、Au、Ag、Hg、Cd、Zr、Ru、Fe、Co、Pt、Pd、Ni、Rh和W的金属。
在一些实施方案中，在点击反应中以微摩尔至毫摩尔范围包含还原剂。在一些实施方案中，还原剂的浓度是在100μM和100mM之间、10μM和10mM之间或1μM和1mM之间。
在一些实施方案中，点击反应包括使Cu(I)离子稳定的螯合剂。本文中描述非限制性的示例的这类螯合剂。
在一些实施方案中，在点击反应中包含至少一种铜螯合剂。在一些此类实施方案中，在Cu(II)来源已经与还原剂接触后添加铜螯合剂。在一些此类实施方案中，在Cu(II)来源与还原剂接触的同时添加铜螯合剂。在一些实施方案中，将铜螯合剂添加至含有一种或两种点击反应物的溶液(即，具有含有叠氮化物的反应物和含有炔的反应物中一者或两者的溶液)和含有Cu(II)来源的溶液，并且随后添加还原剂以启动点击反应。
在一些实施方案中，点击反应包含式(I)至(XIII)中任一者的化合物和修饰的生物分子。在一些此类实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含末端炔并且修饰的生物分子包含叠氮化物。在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含叠氮化物并且修饰的生物分子包含末端炔。在一些实施方案中，点击反应还进一步包含Cu(I)离子。在一些实施方案中，点击反应还进一步包含Cu(II)离子和至少一种还原剂。在一些实施方案中，点击反应还进一步包含铜螯合剂。
活化的炔化学(1,3-偶极环加成反应)
在一些情况下，当使用活化炔时，叠氮化物和炔可以发生无催化剂的1,3-偶极环加成反应。在一些实施方案中，可以通过环应变，如仅作为例子，8元环结构，包括其上附着有的吸电子基团的7至10元环结构，使炔活化。在一些实施方案中，可以通过添加路易斯酸，如仅作为例子，Au(I)或Au(III)，使炔活化。非限制的示例的活化炔包括环辛炔和二氟环辛炔，例如其在Agard等人,J.Am.Chem.Soc.，2004，126(46):15046-15047中描述；二苯并环辛炔，例如其在Boon等人,WO2009/067663A1(2009)中描述；和氮杂-二苯并环辛炔，例如其在Debets等人,Chem.Comm.，2010，46:97-99中描述。
一般，与荧光团或抗体缀合的活化炔在室温在1至12个小时内经历环加成反应以形成叠氮化物。该反应可以在有机溶剂或水性溶剂，缓冲液如PBS、TRIS或缓冲液和有机溶剂的混合物中进行。
在本文所述的方法的一些实施方案中，修饰的生物分子包含活化炔并且式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含叠氮化物。
Staudinger连接反应
在Staudinger连接反应中，叠氮化物与包含亲电阱(一般是甲基酯)的三芳基膦反应。在形成氮杂-内鎓盐(aza-ylide)中间体后，该中间体重排以产生具有酰胺键的连接的产物和氧化膦。这类连接反应例如在美国申请公开第2006/0276658号中描述。在一些实施方案中，膦包含酰基，如酯、硫酯或N-酰基咪唑(即膦酯、膦硫代酯、膦咪唑)以捕获氮杂-内鎓盐中间体并且在水解时形成酰胺键。在一些实施方案中，膦可以是二芳基膦或三芳基膦以稳定膦。本文所述的Staudinger连接方法中使用的膦包括但不限于环状或非环、卤代、双磷或聚合膦。
用于Staudinger连接反应的一般程序如下(J.Am.Chem.Soc.2002，124，14893-14902)：将细胞制成丸(3500转/分钟，3分钟)并用200μL标记缓冲液(PBS中的1%FBS，pH7.4)洗涤两次。在第二次洗涤后，一般将细胞重悬于中50μL体积的标记缓冲液和50μL在溶液(PBS中的0.5mM，pH7.4)中的2。在室温孵育1小时后，将细胞制成丸(3500转/分钟，3分钟)并用冰冷的标记缓冲液洗涤3次，将细胞制丸，并用200μL冰冷的标记缓冲液洗涤3次，并且随后稀释成400μL体积用于流式细胞计量术分析。
在本文所述的方法的一些实施方案中，修饰的生物分子包含膦并且式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含叠氮化物。
用于缀合生物分子的化合物
在一些实施方案中，本发明提供具有下式的化合物：
Figure BDA00003765945200561
Figure BDA00003765945200571
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
R1、R2、R3和R4独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或者选自R1、R2、R3和R4的两个取代基，其中所述至少两个取代基的每一个处在不同的碳原子上，共同形成稠合部分，所述稠合部分选自环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、取代的杂芳基，并且全部的剩余取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或者剩余取代基中的至少两个共同形成稠合部分，所述稠合部分选自环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且任何剩余的取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
R5和R6独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；
选自R1、R2、R3、R4、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外荧光团结合的报告分子、载体分子、固相、治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是独立单一的共价键或Z是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-10个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、碳-氧键和碳-硫键的任何组合组成，所述组合为直链或支链烷基或杂烷基链的形式；
G是选自叠氮反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
在一些实施方案中，该化合物具有下式：
Figure BDA00003765945200591
在一些实施方案中，该化合物具有下式：
Figure BDA00003765945200592
其中
R2、R3、R4和R7至R12独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或选自R2、R3、R4和R7至R12的两个取代基，其中所述两个取代基处在不同的碳原子上，共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且全部的剩余取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或剩余取代基中的两者也共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且剩余的取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基。
在一些实施方案中，本发明提供具有下式的化合物：
Figure BDA00003765945200601
其中：
R1、R2、R3和R4独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或选自R1、R2、R3和R4的两个取代基共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且剩余的两个取代基也共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，或者剩余的两个取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
选自R1、R2、R3、R4、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自报告分子、载体分子、固相或治疗性分子；并且L是具有0-20个原子的链长度的选自以下的基团：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
A是碳，并且R5和R6独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或A、R5和R6不存在；
B选自O、S和NR7，其中R7选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是具有1-10个原子的链长度的直链或支链烷基或杂烷基，或不存在；并且
G选自叠氮反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
在一些实施方案中，本发明提供具有下式的化合物：
Figure BDA00003765945200621
Figure BDA00003765945200631
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
R1、R2、R5和R6独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或选自R1、R2、R5和R6的两个取代基，其中所述两个取代基处在不同的碳原子上，共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且剩余的取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；选自R1、R2、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自报告分子、载体分子、固相或治疗性分子；并且
L是具有0-20个原子的链长度的选自以下的基团：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
B选自O、S和NR3，其中R3选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是具有1-10个原子的链长度的直链或支链烷基或杂烷基，或不存在；并且
G是选自叠氮化物反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
在一些实施方案中，当化合物具有式(VI)时，R1、R2、R5和R6独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或R1和R2共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且R5和R6独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基。
在一些实施方案中，本发明提供具有下式的化合物：
Figure BDA00003765945200641
Figure BDA00003765945200651
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
R1、R2、R3、R5和R6独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或选自R1、R2、R3、R5和R6的两个取代基，其中所述两个取代基处在不同的碳原子上，共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且剩余的取代基选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
选自R1、R2、R3、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自报告分子、载体分子、固相或治疗性分子；并且
L是具有0-20个原子的链长度的选自以下的基团：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是具有1-10个原子的链长度的直链或支链烷基或杂烷基，或不存在；并且
G选自叠氮化物反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
在一些实施方案中，本发明提供具有下式的化合物：
Figure BDA00003765945200661
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
R1、R2、R5和R6独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
选自R1、R2、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自报告分子、载体分子、固相或治疗性分子；并且
L是具有0-20个原子的链长度的选自以下的基团：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是具有1-10个原子的链长度的直链或支链烷基或杂烷基，或不存在；并且
G是选自叠氮化物反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
在一些实施方案中，本发明提供具有下式的化合物：
Figure BDA00003765945200671
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
m和n是4和8之间的整数；
R7选自氢、烷基、杂烷基、取代的烷基和取代的杂烷基；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、每个R′和每个R”独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或选自R1、R2、R3、R4、R5、R6、R′和R″的两个取代基，其中所述两个取代基处在不同的碳原子上，共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且全部的剩余取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或剩余取代基中的两者也共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且剩余的取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
选自R1、R2、R3、R4、R5、R6、R′和R″的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自报告分子、载体分子、固相或治疗性分子；并且
L是具有0-20个原子的链长度的选自以下的基团：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是具有1-10个原子的链长度的直链或支链烷基或杂烷基，或不存在；并且
G是选自叠氮化物反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
在式(I)至(XIII)的化合物的一些实施方案中，R取代基之一包含X-L-，并且剩余的R取代基各自是H。在式(I)至(XIII)的化合物的一些实施方案中，L是具有0至15个原子、0至10个原子、或0至5个原子的链长度的烷基。在式(I)至(XIII)的化合物的一些实施方案中，L是-NH-(CH2)n-NH-C(O)-，其中n是1至12。在一些实施方案中，n是1至10、1至8或1至5。
在式(I)至(XIII)的化合物的一些实施方案中，G是叠氮化物或末端炔。在一些实施方案中，当点击反应中待使用式(I)至(XIII)中任一者的化合物时，G是叠氮化物或末端炔。在一些实施方案中，当采用活化炔的1,3-偶极环加成反应中待使用式(I)至(XIII)中任一者的化合物时，G是叠氮化物。在一些实施方案中，当Staudinger连接反应中待使用式(I)至(XIII)中任一者的化合物时，G是叠氮化物。
在一些实施方案中，报告分子包括发色团、荧光团、荧光蛋白、磷光染料、叠层染料、粒子、半抗原、酶或放射性同位素。在一些实施方案中，荧光团是呫吨、香豆素、花青、芘、噁嗪、borapolyazaindacene或carbopyranine。在一些实施方案中，酶是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或β-内酰胺酶。在一些实施方案中，粒子是半导体纳米晶体。
在一些实施方案中，载体分子是氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组合体、酪胺、合成聚合物、聚合物微粒子、生物细胞、细胞组分、离子螯合部分、酶底物或病毒。在一些实施方案中，载体分子是抗体、抗体片段、抗原、抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、葡聚糖、IgG结合蛋白、荧光蛋白、琼脂糖或非生物微粒子。
在一些实施方案中，固相支持物是气凝胶、水凝胶、树脂、珠、生物芯片、微流体芯片、硅芯片、多孔板、膜、传导性金属、非传导性金属、玻璃、或磁性支持物。在一些实施方案中，固相支持物是硅胶、聚合物膜、粒子、衍生化塑料薄膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、氧化铝凝胶、多糖、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酰胺、多元醇、琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、淀粉、FICOLL、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊糖、硝酸纤维素、重氮纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、尼龙、胶乳珠、磁珠、顺磁珠、超顺磁珠或淀粉。
在一些实施方案中，治疗性分子是紫杉酚、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、或其类似物或同系物。在一些实施方案中，治疗性分子是抗代谢物、烷基化剂、蒽环类、抗生素或抗有丝分裂药。在一些实施方案中，治疗性分子是相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、白喉毒素、肿瘤坏死因子、γ-干扰素、α-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、白介素-1、白介素-2、白介素-6、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子或粒细胞集落刺激因子。
可以例如，使用图1和图2中所示和实施例1中描述的示例性反应方案制备本发明的化合物。
报告分子
在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含报告分子。在本文提供的方法和组合物中使用的报告分子包括任何直接或间接可检测的报告分子，所述报告分子可以作为式(I)至(XIII)中任一者的化合物的取代基共价连接。
本文所述的方法和组合物中所用的报告分子包括但不限于发色团、荧光团、荧光蛋白、磷光染料、叠层染料、粒子、半抗原、酶或放射性同位素。在一些实施方案中，报告分子是荧光团、荧光蛋白、半抗原或酶。
荧光团是在大于280nm的波长处显示吸收最大值并且在包含该荧光团的式(I)至(XIII)中任一者的化合物与修饰的生物分子反应后与该生物分子共价连接时保留其光谱特性的任何化学部分。荧光团包括但不限于芘；蒽；萘；吖啶；茋；吲哚和苯并吲哚；噁唑和苯并噁唑；噻唑和苯并噻唑；4-氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)；花青；羰花青；羰苯乙烯基(carbostyryl)；卟啉；水杨酸酯；邻氨基苯甲酸酯；薁；苝；吡啶；喹啉；borapolyazaindacene；呫吨(包括但不限于荧光素(如苯并或二苯并荧光素、半萘并荧光素(seminaphthofluorescein)或萘并荧光素)、对甲氨基酚(如eminaphthorhodafluors)和罗丹明)；噁嗪和苯并噁嗪(包括但不限于试卤灵、氨基噁嗪酮、二氨基噁嗪和它们的苯并取代的类似物)；卡巴嗪；次联苯甲酮(phenalenone)；香豆素；苯并呋喃；苯并次联苯甲酮；carbopyranine、半导体纳米晶体；和前述任一者的衍生物。
在一些实施方案中，报告分子选自呫吨(包括但不限于磺化呫吨、氟化呫吨、对甲氨基酚、罗丹明、荧光素和其衍生物)、香豆素(包括但不限于磺化香豆素和氟化香豆素)、花青(包括但不限于磺化花青)、芘、噁嗪、borapolyazaindacene、carbopyranine、和半导体纳米晶体。
在一些实施方案中，报告分子是作为式(I)至(XIII)中任一者的化合物的取代基，经呫吨的9-位置处的单一共价键结合的呫吨。在一些实施方案中，呫吨选自经9-位连接的3H-呫吨-6-醇-3酮，经9-位连接的6-氨基-3H-呫吨-3-酮，和经9-位连接的6-氨基-3H-呫吨-3-亚胺。
本领域技术人员可以根据特定应用选择有待作为式(I)至(XIII)中任一者的化合物的取代基被包含的荧光团。可以用于检测修饰的生物分子的荧光团的物理特性包括但不限于光谱特征(吸收、发射、和斯托克斯频移)、荧光强度、寿命、偏振性和光漂白速率及其组合。在多种实施方案中，一种或多种物理特性可以用来区分一种荧光团与另一种荧光团，并因此允许多路分析。在一些实施方案中，这种荧光团在大于480nm的波长、在488nm至514nm之间的波长(特别适合由氩离子激光激发源的输出造成的激发)或在546nm附近的波长(特别适合由汞弧灯造成的激发)下具有吸收最大值。
许多荧光团也可以充当发色团并且因此所述的荧光团也可以用作本文所述的方法和组合中的发色团报告分子。
在一些实施方案中，报告分子是酶。在一些实施方案中，酶是希望的标记物，因为它可以放大可检测的信号，因此增加分析灵敏度。在一些实施方案中，酶本身不是直接可检测的，但是当酶与适宜的底物接触，从而转化的底物生成例如荧光、比色或发光信号时，酶的活性可以用来生成可检测信号。各种底物是本领域已知的，其中一些在上文的Molecular Probes Handbook中描述。
在一些实施方案中，当酶报告分子是氧化还原酶如(仅作为例子)辣根过氧化物酶时，合适的底物包括但不限于3,3′-二氨基联苯胺(DAB)或3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、2,2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺(OPD)、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)、邻联茴香胺、5-氨基水杨酸、4-氯-1-萘酚、4-羟基-3-甲氧基苯乙酸、还原的吩噁嗪和还原的苯并噻嗪，包括Amplex
Figure BDA00003765945200721
红色剂和其变体(美国专利第4,384,042号)、Amplex超红和其变体(WO05/042504)，还原的二氢呫吨类，包括二氢荧光素，和二氢罗丹明，包括二氢罗丹明123。可以随本文所述的酶报告分子一起使用的过氧化物酶底物还包括但不限于酪胺(tyramide)(美国专利第5,196,306；5,583,001和5,731,158号)，所述酪胺在酶的作用之前是固有可检测的，但是在称作酪胺信号放大(TSA)的方法中因过氧化物酶的作用而“固定就位”。在多种实施方案中，可以使用这类底物，例如，以便标记作为细胞、组织或阵列的样品中的靶，以便通过显微术、流式细胞计量术、光学扫描和荧光测定法进行这些靶的后续检测。
在一些实施方案中，当酶报告分子是磷酸酶如(仅作为例子)酸性磷酸酶或碱性磷酸酶时，合适的底物包括但不限于5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)、6-氯-3-吲哚基磷酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯、磷酸对硝基苯酯和磷酸邻硝基苯酯。非限制的荧光底物包括但不限于磷酸4-甲基伞形酯、6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素基磷酸酯(DiFMUP，美国专利第5,830,912号)、二磷酸荧光素、3-O-甲基荧光素磷酸酯、磷酸试卤灵、9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(DDAO磷酸酯)、ELF97、ELF39和相关的磷酸酯(美国专利第5,316,906和5,443,986号)。
在一些实施方案中，当酶报告分子是糖苷酶如(仅作为例子)β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶或β-葡糖苷酶时，合适的底物包括但不限于5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)和相似吲哚基半乳糖苷、葡糖苷和葡糖苷酸、邻硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、对硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷、试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二半乳糖苷(FDG)、荧光素二葡糖苷酸和它们的结构性变体、4-甲基伞形酮β-D-吡喃半乳糖苷、羧基伞形酮β-D-吡喃半乳糖苷，和氟化的香豆素β-D-吡喃半乳糖苷。
酶报告分子也包括但不限于水解酶如胆碱酯酶和肽酶、氧化酶如葡萄糖氧化酶和细胞色素氧化酶以及还原酶，它们的合适底物是已知的。额外的非限制的示例的酶报告分子包括萤光素酶和水母发光蛋白。此外，磷酸酶、糖苷酶和氧化酶的产生化学发光的底物如含有稳定的二氧杂环丁烷(dioxetane)、鲁米诺、异鲁米诺和吖啶(acridinium)酯的那些也可以与本文所述的酶报告分子一起使用。
在一些实施方案中，报告分子是半抗原。非限制的示例的半抗原包括激素、天然存在的和合成的药物、污染物、变应原、影响因子分子、生长因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、氨基酸、肽、化学中间体、核苷酸、生物素等。在一些实施方案中，半抗原不是直接可检测的，但是它能与可检测的另一种分子结合。作为非限制性例子，半抗原可以是一种抗原，该抗原可以被所述抗原特异的抗体所结合，其中所述抗体包含可检测标记物，或其中所述抗体可以被包含可检测标记物的第二抗体结合。
在一些实施方案中，报告分子是荧光蛋白。非限制的示例的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)和藻胆蛋白和其衍生物。在一些实施方案中，荧光蛋白与荧光团结合使用，以便从荧光蛋白吸收光谱获得较大的斯托克斯频移。在一些实施方案中，荧光蛋白和荧光团充当能量转移对子，其中所述荧光蛋白在该荧光团吸收的波长处发射并且所述荧光团随后在远离本来仅可用所述荧光蛋白获得的该荧光蛋白的发射波长的波长处发射。在一些此类实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含荧光蛋白作为一种取代基并且包含荧光团作为另一种取代基。在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物同时包含荧光蛋白和荧光团作为单一取代基，其中所述荧光蛋白和荧光团彼此通过接头连接。非限制的示例的荧光蛋白/荧光团对子包括藻胆蛋白和磺基罗丹明荧光团、磺化的花青荧光团或磺化的呫吨荧光团。在一些实施方案中，荧光团作为能量供体发挥作用并且荧光蛋白作为能量接受体发挥作用。可以用作报告分子的非限制的示例的放射性同位素包括例如，这些化合物可以用放射性同位素(例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C))、硫-35(35S)等进行放射标记。本发明化合物的全部同位素变种，无论是否具有放射性，均意在包括在本发明的范围内。
连接报告分子作为式(I)至(XIII)的化合物的取代基的方法是本领域已知的。非限制的示例的方法包括图1和2中显示的方法，其中包含N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯的报告分子与在至少一个取代基上携带伯胺的式(I)至(XIII)中任一者的化合物的前体反应。也可以使用SDP酯、TFP、PFP、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯和马来酰亚胺替代NHS酯。
载体分子
在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含载体分子作为取代基。
载体分子包括但不限于抗原、类固醇、维生素、药物、半抗原、代谢物、毒素、环境污染物、氨基酸、肽、蛋白质、核酸、核酸聚合物、糖、脂类和聚合物。在一些实施方案中，载体分子包括氨基酸、肽、蛋白质、抗体或其片段、抗原、抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、葡聚糖、IgG结合蛋白(如蛋白A或蛋白G)、琼脂糖、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组合体、合成聚合物、非生物微粒子(如聚合物微粒子)、离子螯合部分、酶底物、生物细胞、细胞组分、病毒、或其组合。
在一些实施方案中，当载体分子是酶底物时，酶底物选自氨基酸、肽、糖、醇、链烷酸、4-胍基苯甲酸、核酸、脂质、硫酸酯、磷酸酯、-CH2OCO-烷基、及其组合。在某些实施方案中，这类酶底物可以由酶裂解，所述酶选自肽酶、磷酸酶、糖苷酶、脱烷基酶、酯酶、胍基苯甲酸酯酶(guanidinobenzotase)、硫酸酯酶、脂肪酶、过氧化物酶、组蛋白脱乙酰基酶、核酸外切酶、还原酶、神经节苷脂内切糖苷酶(endoglycoceramidase)和核酸内切酶。
在一些实施方案中，当载体分子包含氨基酸、肽或蛋白质时，该载体分子选自神经肽、细胞因子、毒素、蛋白酶底物和蛋白激酶底物。在一些实施方案中，载体是作为细胞器定位肽发挥作用的肽，即，这样的肽，所述肽发挥作用借助细胞转运机制，将缀合的化合物靶向定位于特定细胞亚结构内部，包括但不限于核定位信号序列。
在一些实施方案中，载体分子是选自酶、抗体、凝集素、糖蛋白、组蛋白、白蛋白、脂蛋白、蛋白A、蛋白G、藻胆蛋白或其他荧光蛋白、激素、毒素和生长因子的蛋白质。在一些实施方案中，载体分子是选自抗体、抗体片段、抗生物素蛋白、链霉亲和素、毒素、凝集素或生长因子的蛋白质。在一些实施方案中，载体分子包含半抗原例如生物素、洋地黄毒苷或荧光团。
在一些实施方案中，载体分子包含核酸碱基、核苷、核苷酸或核酸聚合物、肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)、单股或多股、天然或合成的DNA或RNA寡核苷酸，或DNA/RNA杂合体，任选地含有用于连接荧光团或其他配体的额外接头或间隔团。在一些实施方案中，核酸载体分子(包括但不限于LNA、PNA、DNA和RNA)包含少于50个核苷酸或少于25个核苷酸。
在一些实施方案中，载体分子包含糖或多元醇，包括多糖，如葡聚糖、FICOLL、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊糖、淀粉、琼脂糖和纤维素，或聚合物如聚(乙二醇)。在一些实施方案中，载体分子包含葡聚糖、琼脂糖或FICOLL。
在一些实施方案中，载体分子包含脂质，所述脂质包括但不限于糖脂、磷脂和鞘脂。在一些实施方案中，这类脂类含有6-25个碳。在一些实施方案中，载体分子包括脂质小泡，如脂质体，或是脂蛋白。在一些实施方案中，一些亲脂性取代基可用于促进缀合的分子转运至细胞或细胞器中。
在一些实施方案中，载体分子是细胞、细胞片段或亚细胞粒子，包括病毒粒子、细菌粒子、病毒组分、生物细胞(如动物细胞、植物细胞、细菌或酵母)、或细胞组分。这类细胞组分的非限制性例子包括溶酶体、内体、细胞质、胞核、组蛋白、线粒体、高尔基体、内质网和液泡。
在一些实施方案中，载体分子包含特异性结合对子成员。在一些此类实施方案中，可以使用包含可检测标记物的互补特异性结合对子成员检测载体分子的存在，并因此检测与通过式(I)至(XIII)中任一者的化合物与之缀合的生物分子。表2中阐述了非限制性示例的结合对子。
表2：示例性的特异性结合对子
Figure BDA00003765945200771
Figure BDA00003765945200781
*IgG是免疫球蛋白
和cRNA是用于杂交的互补链
在一些实施方案中，载体分子是抗体结合部分，如，但不限于抗Fc、抗-Fc同种型、抗J链、抗κ轻链、抗λ轻链或单链片段可变蛋白、抗FcFab片段；或非抗体肽或蛋白，如，但不限于可溶性Fc受体、蛋白G、蛋白A、蛋白L、凝集素、或其片段。
连接作为式(I)至(XIII)的化合物的取代基的载体分子的方法是本领域已知的。作为例子，非限制的示例性方法包括酰胺、硫代酰胺、醚、硫醚、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、硫氢基、氨基等。
固相支持物
在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含固相支持物作为取代基。
众多固相支持物是本领域已知的并且可以在一些实施方案中用作式(I)至(XIII)中任一者的化合物的取代基。非限制的示例的固相支持物包括固体和半固体基质，如气凝胶和水凝胶、树脂、珠、生物芯片(包括薄膜包覆的生物芯片)、微流体芯片、硅芯片、多孔板(也称作微量滴定平板或微量培养板)、膜、传导性和非传导性金属、玻璃(包括显微镜载玻片)和磁性支持物。固相支持物的其他非限制性例子包括硅胶、聚合物膜、粒子、衍生化塑料薄膜、衍生化玻璃、衍生化二氧化硅、玻璃珠、棉花、塑料珠、氧化铝凝胶、多糖如琼脂糖、聚(丙烯酸酯)、聚苯乙烯、聚(丙烯酸酰胺)、多元醇、琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、淀粉、FICOLL、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊糖、硝酸纤维素、重氮纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯(包括聚(乙二醇))、尼龙、胶乳珠、磁珠、顺磁珠、超顺磁珠、淀粉等。在一些实施方案中，用于本文所述的方法和组合物中的固相支持物基本上不溶于液相。
在一些实施方案中，固相支持物可以包含反应性官能团，包括但不限于羟基、羧基、氨基、巯基、醛，卤素、硝基、氰基、酰氨基、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、异氰酸酯、砜、磺酸酯、磺酰胺、亚砜、叠氮化物、炔或膦，其中这类官能团用来将固相支持物共价地连接至式(I)至(XIII)中任一者的化合物的前体。
可以基于所需的用途选择在本文所述的方法和组合物中使用的合适固相支持物。仅以举例方式，在需要形成酰胺键以便将式(I)至(XIII)中任一者的化合物的前体连接至固相支持物，则可以使用在肽合成中通常使用的树脂，如聚苯乙烯、POLYHIPETM树脂、聚酰胺树脂、用聚乙二醇接枝的聚苯乙烯树脂，聚二甲基-丙烯酰胺树脂或PEGA珠。在一些实施方案中，将式(I)至(XIII)化合物的前体以阵列格式沉积到固相支持物上。在一些情况下，通过支持物表面和输送机构(如针或毛细管)之间的直接表面接触或通过利用压电形式和其他形式的推进力将液体从微型喷嘴转移至固体表面的喷墨技术，实现这类沉积。
修饰的生物分子
对生物分子修饰以并入化学柄允许借助后续的点击反应化学地连接另一个部分(如报告分子或固相支持物)。在一些实施方案中，修饰的生物分子的化学柄选自叠氮化物、炔(如末端炔或活化炔)和膦。在一些实施方案中，在体内修饰生物分子，例如，利用细胞的生物合成途径，例如，蛋白质的糖基化、DNA复制或RNA转录。在一些实施方案中，通过细胞与修饰特定生物分子或特定类别的生物分子的试剂接触，在体内修饰生物分子。在一些实施方案中，使用修饰生物分子的试剂，在体外修饰生物分子。
用于体内修饰生物分子的各种方法和试剂是本领域已知的。例如，在一些实施方案中，可以通过使细胞与包含化学柄的非天然聚糖接触在体内修饰糖蛋白。非天然聚糖由该细胞用来使糖蛋白糖基化，导致化学柄与这类糖蛋白共价连接。可以用来以化学柄修饰糖蛋白的非限制的示例性非天然聚糖包括四乙酰化N-叠氮基乙酰葡糖胺、四乙酰化N-叠氮基乙酰半乳糖胺、四乙酰化N-叠氮基乙酰甘露糖胺和四乙酰岩藻糖炔。
在一些实施方案中，可以通过掺入包含化学柄的非天然氨基酸来修饰蛋白质。这种修饰可以在体内在蛋白质合成期间，或在体外蛋白质翻译系统中进行。可以用来以化学柄修饰蛋白质的非限制的示例性非天然氨基酸包括但不限于4-叠氮基-L-苯丙氨酸、L-叠氮基高丙氨酸和L-高炔丙基甘氨酸。
在一些实施方案中，可以例如通过使细胞与法呢基醇叠氮化物或香叶基香叶基醇叠氮化物接触来修饰异戊二烯化(prenylate)蛋白质。
在一些实施方案中，可以在蛋白质的脂肪酸酰化期间例如，通过使细胞与包含化学柄的非天然脂肪酸接触来修饰蛋白质。可以用于以化学柄修饰蛋白质的非限制的示例性非天然脂肪酸包括但不限于棕榈酸叠氮化物、肉豆蔻酸叠氮化物和例如在国际申请第PCT/US10/61768号中描述的脂肪酸类似物。
在一些实施方案中，可以使用包含化学柄的各种非天然核苷三磷酸在体内或体外修饰DNA。在一些实施方案中，在复制期间通过DNA聚合酶掺入非天然核苷，修饰DNA。在一些实施方案中，在凋亡期间通过由末端转核苷酸酶掺入非天然核苷，修饰DNA。非限制性的示例的这类非天然核苷三磷酸包括C-8-炔-dUTP和/或C8-炔-dCTP。在掺入后，DNA包含一个或多个共价连接的炔基。在一些实施方案中，可以在DNA化学合成期间使用例如包含化学柄的亚磷酰胺来修饰DNA。
在一些实施方案中，可以使用包含化学柄的各种非天然核苷三磷酸在体内或体外修饰RNA。在一些实施方案中，在复制期间通过由RNA聚合酶掺入非天然核苷，修饰RNA。非限制性的示例的这类非天然核苷三磷酸包括C-8-炔-UTP和/或C8-炔-CTP。在掺入后，RNA包含一个或多个共价连接的炔基。在一些实施方案中，可以在RNA化学合成期间使用例如包含化学柄的亚磷酰胺来修饰RNA。
在一些实施方案中，可以使用经生物分子上的特定基团共价连接化学柄的试剂，在体外修饰生物分子。例如，在一些实施方案中，可以使用试剂如NHS-叠氮化物，NHS-膦和磺基NHS-膦修饰包含伯胺(-NH2)的生物分子，也可以使用SDP-叠氮化物、TFP-叠氮化物、PFP-叠氮化物，氨基甲酸酯叠氮化物、硫代氨基甲酸酯-叠氮化物和马来酰亚胺叠氮化物代替NHS-叠氮化物。
铜离子源
在一些实施方案中，点击反应包含提供Cu(I)离子的铜离子源。在一些实施方案中，铜离子源在还原剂存在下提供Cu(I)离子。在一些此类实施方案中，铜离子源提供Cu(II)离子，所述Cu(II)离子在还原剂存在下还原成Cu(I)离子。产生Cu(I)离子的非限制示例的铜离子源包括CuBr、CuI、六氟磷酸四(乙腈)Cu(I)、四氟硼酸四(乙腈)Cu(I)、三氟甲磺酸四(乙腈)Cu(I)、CuCN、丁基硫醇Cu(I)、硫代苯酚Cu(I)、三氟甲磺酸Cu(I)。在一些实施方案中，点击反应中以0.01mM和10mM之间、0.01mM和5mM之间、0.05mM和5mM之间、0.1mM和5mM之间、0.5mM和5mM之间、0.5mM和4mM之间或0.5mM和3mM之间的浓度包含产生Cu(I)离子的铜离子源。产生Cu(II)离子的非限制性示例的铜离子源包括Cu(NO3)2、Cu(OAc)2或CuSO4、金属的Cu和金属Cu连同超声波处理。在一些实施方案中，点击反应中以0.01mM和10mM之间、0.01mM和5mM之间、0.05mM和5mM之间、0.1mM和5mM之间、0.5mM和5mM之间、0.5mM和4mM之间或0.5mM和3mM之间的浓度包含产生Cu(II)离子的铜离子源。
在一些实施方案中，铜离子源是含铜金属，如铜线。
可以用来将Cu(II)离子还原成Cu(I)离子的非限制的示例性还原剂包括抗坏血酸、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、NADH、NADPH、硫代硫酸盐、金属铜、氢醌、维生素K1、谷胱甘肽、半胱氨酸、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇。可以充当还原剂的非限制性示例的金属包括Al、Be、Co、Cr、Fe(包括Fe2+)、Mg、Mn、Ni、Zn、Au、Ag、Hg、Cd、Zr、Ru、Fe、Co(包括Co2+)、Pt、Pd、Ni、Rh和W。在一些实施方案中，点击反应中以1微摩尔至5摩尔的浓度包含还原剂。
在一些实施方案中，还原剂是施加的电势。在这种情况下，使用配体如TBTA、THPTA、苯并咪唑、BCS等，并且使用工作电极和参比电极的组合将-30至-300mV的电势施加在一个双区室液槽中。可以使用标准缓冲液(HEPES，Tris等)，并且可以在反应过程期间施加该电势。对于进一步细节和实验信息，参见ChemBioChem2008,9,1481-1486。
铜离子螯合剂
不限于任何具体的机制，已知铜可以促进生物分子(如蛋白质和核酸)的裂解。在点击反应中添加铜螯合剂可以减少铜的有害作用，由此保存护生物分子的结构完整性。
在一些实施方案中，点击反应包含铜螯合剂。在一些实施方案中，铜螯合剂使Cu(I)离子稳定，对抗氧化、沉淀和/或歧化。通过包含铜螯合剂，在一些实施方案中，较低浓度的铜离子可以在点击反应中用来实现如螯合剂不存在时较高浓度铜离子存在下所获得的相同效率。
非限制的示例的铜离子螯合剂包括式(V)的化合物：
Figure BDA00003765945200831
其中X、Y和Z各自独立地具有下式：
Figure BDA00003765945200841
其中：
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、烷氧基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的烷氧基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；和
L1、L2和L3独立地选自具有1-5个原子的链长度的烷基、杂烷基、取代的烷基和取代的杂烷基。
在一些实施方案中，选自X、Y和Z的至少一种取代基的R1、R2、R3、R4和R5各自是H。在一些实施方案中，L1、L2和L3各自是具有1-5个原子的链长度的烷基。在一些实施方案中，L1、L2和L3各自是-CH2CH2-。
非限制性示例性铜离子螯合剂也包括含有1,10菲咯啉的铜(I)螯合剂，例如，红菲绕啉二磺酸(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸)和浴酮灵二磺酸(BCS；2,9-二甲基4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸盐)。非限制的示例的螯合剂也包括三(羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA；见，例如，Jentzsch等人,Inorganic Chemistry，48(2):9593-9595(2009))和美国公开第US2010/0197871号中描述的Cu(I)螯合剂，所述文献的公开内容通过引用方式并入本文。非限制的示例性螯合剂也包括N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)、吡啶-2,6-二羧酸(PDA)、S-羧甲基-L-半胱氨酸(SCMC)、曲恩汀、四乙撑多胺(TEPA)、N,N,N′,N′-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)、EDTA、新亚铜试剂(neocuproine)、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)、吡啶-2,6-二羧酸(PDA)、S-羧甲基-L-半胱氨酸(SCMC)、三-(苄基-三唑基甲基)胺(TBTA)和其衍生物。在一些实施方案中，使用组氨酸作为螯合剂。在一些实施方案中，使用谷胱甘肽作为螯合剂和还原剂。
在一些实施方案中，相对于点击反应中的铜浓度，点击反应中以1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1或大于10:1的摩尔比包含铜螯合剂，如式(V)的化合物。即，在一些实施方案中，如果点击反应中以2mM浓度包含铜，则可以在点击反应中以2mM(1:1)、4mM(2:1)、6mM(3:1)等浓度包含铜螯合剂，如式(V)的化合物。在一些实施方案中，在点击反应中铜螯合剂(如式(V)化合物)的浓度在1μM和100mM之间、10μM和10mM之间、50μM和10mM之间或1mM和10mM之间。
组合物
在一些实施方案中，提供组合物。在一些实施方案中，组合物包含式(I)至(XIII)中任一者的化合物。在一些实施方案中，组合物包含式(I)至(XIII)中任一者的化合物和修饰的生物分子。在一些此类实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含叠氮化物，并且生物分子包含炔，如末端炔或活化炔，或膦，如三芳基膦。在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含炔并且生物分子包含叠氮化物。
在一些实施方案中，组合物包含式(I)至(XIII)中任一者的第一化合物和式(I)至(XIII)中任一者的第二化合物，其中式(I)至(XIII)的第一和第二化合物可彼此区分。例如，在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的第一化合物包含第一报告分子并且式(I)至(XIII)中任一者的第二化合物包含第二报告分子，其中所述第一和第二报告分子在可检测方式上不同。在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的第一化合物包含炔并且式(I)至(XIII)中任一者的第二化合物包含叠氮化物。在一些此类实施方案中，该组合物包含了包含炔反应基的第一生物分子和包含叠氮化物反应基的第二生物分子。在一些实施方案中，组合物包含3、4、5或更多种式(I)至(XIII)的化合物。在一些此类实施方案中，组合物中的式(I)至(XIII)的化合物可以各自独立地检测。即，在一些实施方案中，两种或更多种化合物包含可检测方式不同的报告分子和/或可以在检测之前相互分离等。
在一些实施方案中，组合物还包含铜离子源和/或还原剂和/或铜离子螯合剂。在一些此类实施方案中，铜离子螯合剂是式(V)化合物。
可以在本文所述的组合物中包含各种缓冲剂，包括无机和有机缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂是两性离子的缓冲剂。示例性缓冲剂包括磷酸盐(例如，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)、琥珀酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、马来酸盐、二甲胂酸盐、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)、2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、哌嗪-N,N′-2-乙磺酸(PIPES)、2-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、N,N-双(羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)、N-三(羟甲基)-2-乙磺酸(TES)、N-2-羟乙基-哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、3-(N-三(羟甲基)甲氨基)-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、3-(N,N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)氨基]-1-丙磺酸(TAPS)、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、TRIS-乙酸盐-EDTA(TAE)、甘氨酸、双[2-羟乙基]亚氨基三[羟甲基]甲烷(BisTris)、及其组合。在一些实施方案中，组合物还包含乙二胺四乙酸(EDTA)。
在一些实施方案中，此类缓冲剂在组合物中的浓度在0.1mM和1M之间、10mM和1M之间、20mM和500mM之间、50mM和300mM之间、0.1mM和50mM之间和0.5mM和20mM之间。
本领域技术人员可以根据预期的应用选择合适的组合物pH。为了保留生物分子的结构完整性，在一些实施方案中，将pH维持在生理范围内，例如约6.5和8之间。在一些实施方案中，组合物具有在25℃下在5和9之间、在25℃下在6和8.5之间、在25℃下在6和8之间、在25℃下在6.5和8之间或在25℃下在6.5和7.5之间的pH。
在一些实施方案中，组合物包含一种或多种非离子型去垢剂。这类非离子型去垢剂的非限制性例子包括聚氧亚烷基二醇（polyoxyalkylene diols）、脂肪醇的醚(如醇乙氧基化物)、烷基苯酚乙氧基化物、环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物、脂肪酸的聚氧乙烯酯、烷基酚表面活性剂、醇乙氧基化物的聚氧乙烯硫醇类似物、烷基胺的聚氧乙烯加合物、聚氧乙烯烷基酰胺、脱水山梨糖醇酯和醇酚乙氧基化物。脱水山梨糖醇酯的非限制性例子包括聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(TWEEN20)、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(TWEEN40)、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(TWEEN60)和聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(TWEEN80)。在一些实施方案中，此类非离子型去垢剂在组合物中的浓度在0.005和0.5%之间、0.01和0.4%之间、0.01和0.3%之间、0.01和0.2%、或0.01和0.2%之间。
修饰的生物分子的缀合
在多种实施方案中，本文所述的修饰的生物分子可以通过以下方式连接到选自报告分子、载体分子、固相和治疗性分子的至少一个部分上：利用点击反应、1,3-偶极环加成反应或Staudinger连接反应使修饰的生物分子与式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合。在一些实施方案中，反应在室温在水溶液中实施。
在一些实施方案中，点击反应在铜如Cu(I)离子存在下实施。在一些实施方案中，点击反应在还原剂存在下实施。在一些实施方案中，点击反应在铜螯合剂存在下实施。在一些实施方案中，所产生的缀合的产物在含水环境中稳定达足够的时间以允许操作、定量和/或检测该生物分子。
在一些实施方案中，修饰的生物分子包含叠氮化物部分。在一些此类实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物在取代基G处包含末端炔。在一些实施方案中，修饰的生物分子包含炔部分，如末端炔或活化炔。在一些此类实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物在取代基G处包含叠氮化物。在一些实施方案中，修饰的生物分子包含膦部分，如三芳基膦。在一些此类实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物在取代基G处包含叠氮化物。
在一些实施方案中，点击反应、1,3-偶极环加成反应或Staudinger连接反应在细胞中、在细胞裂解物中、在包含分离的修饰生物分子的溶液中或用固定在固相支持物上的修饰的生物分子实施。
在一些实施方案中，修饰的生物分子包含多于一个类型的化学柄。作为非限制性例子，在一些实施方案中，修饰的生物分子包含叠氮化物和炔，如末端炔或活化炔。在一些此类实施方案中，利用点击化学，修饰的生物分子可以与包含末端炔的式(I)至(XIII)中任一者的化合物和/或包含叠氮化物的式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合。在一些实施方案中，修饰的生物分子可以利用点击化学与包含叠氮化物的式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合，并且可以利用Staudinger连接反应与包含膦的另一种化合物缀合，或，利用1,3-偶极环加成反应与包含炔如末端炔或活化炔的另一种化合物缀合。可选地，在一些实施方案中，都利用点击化学，修饰的生物分子可以与包含末端炔的式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合并且可以与包含叠氮化物的另一种化合物缀合。化学柄和缀合试剂的众多组合是可能的，并且可以由本领域技术人员根据预期的应用选择。
在一些实施方案中，一种方法包括两个或更多个缀合反应。在一些此类实施方案中，两个或更多个缀合反应利用相同的反应化学发生(即，利用点击化学、1,3-偶极环加成反应或Staudinger连接反应发生两个或更多个缀合反应)。作为非限制性例子，第一修饰的生物分子包含叠氮化物并且第二修饰的生物分子包含炔。可以使用点击化学，同时或依次地缀合两种修饰的生物分子。在一些此类实施方案中，使修饰的生物分子与包含炔的式(I)至(XIII)中任一者的第一化合物和包含叠氮化物的式(I)至(XIII)中任一者的第二化合物接触。包含叠氮化物的第一生物分子将与包含炔的式(I)至(XIII)中任一者的第一化合物缀合，并且包含炔的第二生物分子将与包含叠氮化物的式(I)至(XIII)中任一者的第二化合物缀合。在一些实施方案中，为了减少第一生物分子与第二生物分子缀合的发生，可以适当地控制式(I)至(XIII)的化合物的浓度(例如，以便它们相对于所述生物分子的浓度是过量的)和/或这些生物分子可以在空间上不同(例如，处于不同的细胞区室内)。
在一些实施方案中，两个或更多个缀合反应利用不同的反应化学进行。作为非限制性例子，第一修饰的生物分子包含叠氮化物并且第二修饰的生物分子包含膦。利用点击化学，第一生物分子可以与包含炔的式(I)至(XIII)中任一者的第一化合物缀合，并且利用Staudinger连接反应，第二生物分子可以与包含叠氮化物的式(I)至(XIII)中任一者的第二化合物缀合。点击反应和Staudinger连接反应可以同时或依次地进行。在一些实施方案中，为了减少第一生物分子与第二生物分子缀合的发生，可以适当地控制式(I)至(XIII)的化合物的浓度(例如，以便它们相对于所述生物分子的浓度是过量的)和/或这些生物分子可以在空间上不同(例如，处于不同的细胞区室内)。
在细胞中缀合
在一些实施方案中，提供了在细胞中使修饰的生物分子与式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合的方法。在一些此类实施方案中，在缀合后将缀合的生物分子与细胞分离。在一些实施方案中，在缀合后，在细胞环境下鉴定、检测和/或定量缀合的生物分子(例如，在活细胞中，或在鉴定、检测和/或定量生物分子之前已经被固定和/或可透化的细胞中)。
在一些实施方案中，在细胞中使修饰的生物分子与式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合的方法包括使包含修饰的生物分子的细胞在允许式(I)至(XIII)中任一者的化合物接触修饰的生物分子的条件下与式(I)至(XIII)中任一者的化合物接触。在一些实施方案中，如果修饰的生物分子位于细胞表面上，则使细胞与包含式(I)至(XIII)中任一者的化合物的组合物接触允许缀合所述修饰的生物分子。在一些实施方案中，当修饰的生物分子位于细胞内部时，细胞可以在具有或没有细胞的事先固定和/或可透化的情况下与包含式(I)至(XIII)中任一者的化合物的组合物接触。在一些实施方案中，例如当借助点击反应进行缀合过程时，细胞也可以与铜离子源、还原剂和/或铜离子螯合剂接触。也可以缀合反应中包含额外组分，如缓冲剂、去污剂、盐等。本领域技术人员可以根据应用选择合适的额外组分。
缀合可以在有氧或无氧条件下如在氮气或氩气下进行，并且可以进行任何适宜的时间长度，例如，从5分钟至6小时，从10分钟至3小时、从20分钟至3小时、或从30分钟至2小时。反应可以在宽温度范围，例如，在4℃和50℃之间，在10℃和40℃之间，或在15℃和30℃之间进行。
细胞可以利用任何方法，包括但不限于用4%甲醛或甲醇处理来固定。
细胞可以借助任何方法，包括但不限于用NP-40缓冲液或0.1%Triton缓冲液处理来可透化。
在一些实施方案中，使包含多于一种修饰的生物分子的细胞与式(I)至(XIII)中任一者的多于一种的化合物接触，其中式(I)至(XIII)化合物是可检测方式不同的。在一些此类实施方案中，将细胞与两个或更多个式(I)至(XIII)的化合物同时或依次地接触。上文描述了可在这类多重反应中使用的非限制性示例性化学柄。
在缀合后，可以根据本领域已知的方法分离和/或检测缀合的生物分子。示例性的这类方法在此讨论。
在一些实施方案中，一种方法包括：
(a)使包含修饰的生物分子的细胞在允许修饰的生物分子与式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合的条件下接触式(I)至(XIII)中任一者的化合物以形成缀合的生物分子；并且
(b)检测缀合的生物分子。
在一些实施方案中，修饰的生物分子包含叠氮化物并且式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含末端炔。在一些实施方案中，修饰的生物分子包含末端炔、活化炔或膦，并且式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含叠氮化物。在一些实施方案中，所述方法包括在(b)之前或之后分离缀合的生物分子。在一些实施方案中，所述方法包括在(a)之前固定细胞。在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含报告分子。在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含荧光团。在一些实施方案中，检测过程包括用适宜波长的光照射缀合的生物分子从而报告分子发射光线，并且观察发射的光。
在溶液中缀合
在一些实施方案中，提供了在溶液中使修饰的生物分子与式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合的方法。这类溶液包括但不限于细胞裂解物，分离的生物分子的溶液(其中所述生物分子从其中通常发现所述生物分子的细胞的至少一些组分分离)、细胞上清液、液态生物样品(下文描述)等。
在一些实施方案中，在溶液中使修饰的生物分子与式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合的方法包括使修饰的生物分子在允许式(I)至(XIII)中任一者的化合物借助点击反应、1,3-偶极环加成反应或Staudinger连接反应与修饰的生物分子发生反应的条件下与式(I)至(XIII)中任一者的化合物接触。在一些实施方案中，例如当借助点击反应发生缀合过程时，也可以在溶液中包含铜离子源、还原剂和/或铜离子螯合剂。也可以缀合反应中包含额外组分，如缓冲剂、去污剂、盐等。本领域技术人员可以根据应用选择合适的额外组分。
在一些实施方案中，多于一种修饰的生物分子存在于溶液中。在一些此类实施方案中，还将多于一种的(I)至(XIII)中任一者的化合物添加至该溶液并且与多于一种修饰的生物分子缀合。在一些实施方案中，将两种或更多种式(I)至(XIII)的化合物依次或同时地添加至溶液。在一些实施方案中，式(I)至(XIII)的化合物是可检测方式不同的。上文描述了可以在这类多重反应中使用的非限制性示例性化学柄。
缀合可以在有氧或无氧条件下如在氮气或氩气下进行，并且可以进行任何适宜的时间长度，例如，从5分钟至6小时，从10分钟至3小时、从20分钟至3小时或从30分钟至2小时。反应可以在宽温度范围，例如，在4℃和50℃之间，在10℃和40℃之间，或在15℃和30℃之间进行。
在缀合后，可以根据本领域已知的方法分离和/或检测缀合的生物分子。在此讨论示例性的这类方法。
在一些实施方案中，一种方法包括：
(c)使修饰的生物分子在允许修饰的生物分子与式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合的条件下与式(I)至(XIII)中任一者的化合物接触以形成缀合的生物分子；并且
(d)检测缀合的生物分子。
在一些实施方案中，修饰的生物分子包含叠氮化物并且式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含末端炔。在一些实施方案中，修饰的生物分子包含末端炔、活化炔或膦，并且式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含叠氮化物。在一些实施方案中，所述方法包括分离缀合的生物分子。在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含报告分子。在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含荧光团。在一些实施方案中，检测过程包括用适宜波长的光照射缀合的生物分子，从而报告分子发射光线，并且观察发射的光。
在固相支持物上缀合
在一些实施方案中，提供了在固相支持物上使修饰的生物分子与式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合的方法。非限制性的示例的这类固相支持物包括本文中讨论的各种固相支持物，包括但不限于固体和半固体基质，如玻璃、载片、阵列、二氧化硅粒子、聚合物粒子、微量滴定平板和聚合物凝胶。在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含固相支持物作为取代基。在一些实施方案中，修饰的生物分子与固相支持物结合。
修饰的生物分子可以借助任何手段与固相支持物结合。例如，在一些实施方案中，修饰的生物分子可以已经借助非共价相互作用吸附到固相支持物上。在一些实施方案中，修饰的生物分子包含结合对的一个成员，并且与包含该结合对的另一个成员的固相支持物结合。在一些实施方案中，修饰的生物分子已经借助先前反应与固相支持物缀合，所述先前反应可以是是点击反应、1,3-偶极环加成反应、Staudinger连接反应或其他类型的反应。因此，在一些实施方案中，修饰的生物分子利用除用于点击反应、1,3-偶极环加成反应或Staudinger连接反应的化学柄之外的官能团与固相支持物连接，在这一基础上，连接的修饰生物分子随后借助化学柄在点击反应、1,3-偶极环加成反应或Staudinger连接反应中与式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合。仅以举例方式，修饰的生物分子可以利用羟基、羧基、氨基、巯基、醛、卤素、硝基、氰基、酰氨基、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、异氰酸酯、砜、磺酸酯、磺酰胺或亚砜官能团固定至固相支持物。
当在固相支持物上发生生物分子与式(I)至(XIII)中任一者的化合物的缀合时，在一些实施方案中，反应以与用于溶液相缀合相似的组成实施。
在一些实施方案中，一种方法包括：
(e)使修饰的生物分子在允许修饰的生物分子与式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合的条件下与式(I)至(XIII)中任一者的化合物接触以形成缀合的生物分子，其中所述修饰的生物分子或式(I)至(XIII)中任一者的化合物固定在固相支持物上；并且
(f)检测缀合的生物分子。
在一些实施方案中，修饰的生物分子包含叠氮化物并且式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含末端炔。在一些实施方案中，修饰的生物分子包含末端炔、活化炔或膦，并且式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含叠氮化物。在一些实施方案中，所述方法包括分离缀合的生物分子。在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含报告分子。在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含荧光团。在一些实施方案中，检测过程包括用适宜波长的光照射缀合的生物分子，从而报告分子发射光，并且观察发射的光。
分离缀合的生物分子
在一些实施方案中，在借助点击反应、1,3-偶极环加成反应或Staudinger连接反应缀合后，分离缀合的生物分子。分离缀合的生物分子的非限制性示例方法包括沉降、离心、磁性吸引、色谱方法和电泳方法。
在一些实施方案中，通过已经与生物分子缀合的式(I)至(XIII)中任一者的化合物上的取代基促进缀合的生物分子的分离。作为非限制性例子，式(I)至(XIII)中任一者的化合物可以包含结合对子的成员，所述成员然后与该结合对子的互补成员结合以分离缀合的生物分子。例如，在一些实施方案中，式(I)至(XIII)中任一者的化合物包含生物素，从而可以通过与含有链霉亲和素的固相支持物，如链霉亲和素涂覆的多孔平板或链霉亲和素涂覆的微粒子结合分离缀合的生物分子。作为又一个非限制性例子，式(I)至(XIII)中任一者的化合物可以包含微粒子(包括，例如磁性微粒子)作为取代基，从而缀合的生物分子可以通过离心分离(或与磁铁接触分离，如果微粒子是磁性的)。
在一些实施方案中，缀合的生物分子由薄层或柱层析分离。非限制性的示例的这类层析包括大小排阻层析、离子交换层析和亲和层析。在一些实施方案中，缀合的生物分子用等电聚焦分离。在一些实施方案中，缀合的生物分子用电泳分离。非限制的示例的电泳包括凝胶电泳(例如，琼脂糖凝胶电泳和丙烯酰胺凝胶电泳)、毛细管电泳、毛细管凝胶电泳和平板凝胶电泳。凝胶电泳可以是变性或非变性的，并且可以包括变性凝胶电泳和随后非变性凝胶电泳(例如，“2D”凝胶)。可以在分离之前、期间或之后的任何时间检测缀合的生物分子。在一些实施方案中，例如当通过凝胶电泳分离缀合的生物分子时，可以在分离介质(例如，凝胶)中，或者在分离期间或者在分离之后，检测缀合的生物分子。
本领域技术人员可以根据与缀合的生物分子缀合的部分、生物分子的同一性或类型和具体应用选择合适的分离方法。
缀合的生物分子的检测
在一些实施方案中，在缀合后检测缀合的生物分子。在一些实施方案中，使用作为式(I)至(XIII)中任一者的化合物的取代基的报告分子来检测，其中所述化合物已经与生物分子缀合。在一些实施方案中，使用作为式(I)至(XIII)中任一者的化合物的取代基的载体分子来检测，其中所述化合物已经与生物分子缀合。在一些实施方案中，使用作为式(I)至(XIII)中任一者的化合物的取代基的固相支持物来检测，其中所述化合物已经与生物分子缀合。短语“使用…来检测”包括对报告分子、载体分子或固相支持物的直接或间接检测。可以通过任何方法检测缀合的生物分子。许多检测方法是本领域已知的，并且下文将仅通过说明方式讨论一些非限制性示例性方法。本领域技术人员可以根据报告分子、载体分子、固相支持物、生物分子和与之连接的任何其他部分的同一性和/或特性，选择合适的检测方法。
对缀合的生物分子的检测可以在缀合后的任何时间和如果实施这类分离，在分离之前、期间或之后的任何时间进行。
在一些实施方案中，用于检测的部分是本文所述的可以作为式(I)至(XIII)化合物上的取代基使用的任何荧光团。非限制性的示例的这类荧光团包括荧光素、罗丹明、TAMRA、Alexa染料、SYPRO染料和BODIPY染料。
在一些实施方案中，方法包括修饰的生物分子的多路检测，例如，通过使修饰的生物分子与包含不同报告分子的式(I)至(XIII)的化合物缀合。在一些实施方案中，可以实施缀合反应，从而包含特定化学柄的修饰的生物分子与包含特定报告分子的式(I)至(XIII)的化合物缀合。
仅以说明的方式，作为非限制性例子，提供了包含第一修饰生物分子、第二修饰生物分子和第三修饰生物分子的组合物，其中第一修饰生物分子包含膦，第二修饰生物分子包含叠氮化物，并且第三修饰的生物分子包含末端炔。使得组合物在Cu(I)离子不存在的情况下与包含第一报告分子和叠氮化物部分的第一式(I)至(XIII)中任一者的化合物接触。第一个化合物借助Staudinger连接反应与第一生物分子缀合。在一些实施方案中，使未缀合的第一化合物无活性和/或从组合物中移除。此后，将包含第二报告分子和末端炔的式(I)至(XIII)中任一者的第二化合物和包含第三报告分子和叠氮化物的式(I)至(XIII)中任一者的第三化合物在Cu(I)离子存在下添加至组合物。借助点击反应，第二化合物与第二修饰生物分子缀合并且第三化合物与第三修饰生物分子缀合。在缀合后，三种缀合生物分子各自包含不同的报告分子，并且在一些实施方案中，可以用多路检测方法检测。
在一些实施方案中，凝胶内荧光检测法允许定量性区别分析生物分子并且顺从于与其他蛋白质凝胶染液多路复用。在一些实施方案中，利用荧光可激发和/或UV可激发报告分子作为式(I)至(XIII)的化合物的取代基允许在相同的1-D或2-D凝胶中多路检测生物分子(例如，糖蛋白、磷蛋白和总蛋白)。
在一些实施方案中，可以通过蛋白质印迹法检测修饰的生物分子(例如，蛋白质)，其中通过凝胶电泳分离修饰的生物分子并将其转移至印迹膜。可以使修饰的生物分子在印迹膜上与式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合，并且随后检测生物分子。可选地，在一些实施方案中，可以将事先已经与式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合的修饰生物分子通过凝胶电泳分离并转移至印迹膜，并随后检测。
“凝胶内”检测法的另一个可能方面是使用其中含有苯基硼酸的分子经接头系留至叠氮化物部分或炔部分的“通用”点击化学，总体检测电泳凝胶或蛋白质印迹膜中的蛋白质。苯基硼酸在某些条件下与糖蛋白上的顺-二醇部分稳定连接。在一些实施方案中，可以使用这类含有苯基硼酸的分子在电泳分离后以叠氮化物部分或炔部分修饰糖蛋白。随后，叠氮化物部分或炔部分可以用来使糖蛋白经点击化学、活化炔化学或Staudinger连接反应与包含例如报告分子的式(I)至(XIII)中任一者的化合物缀合。在一些实施方案中，随后可以直接或间接(使用例如报告分子)检测缀合的糖蛋白。在一些实施方案中，目的糖蛋白可以随后通过切下包含修饰的糖蛋白的凝胶部分来分离，并且苯基硼酸在酸性条件下与糖蛋白解离，因而从糖蛋白释放缀合的式(I)至(XIII)中任一者的化合物。在一些实施方案中，可以随后使用例如质谱法鉴定糖蛋白。
在一些实施方案中，当检测包括检测光响应时，可以通过用导致可检测光响应的波长的光照射并且用于检测这种光响应的装置观察，在任何时间检测缀合的生物分子。在一些实施方案中，这类照射借助紫外或可见波长发射灯、弧光灯、激光或甚至阳光或普通室内光，其中这类光源的波长与正在检测的部分(如荧光团或发色团)的吸收光谱重叠。在一些实施方案中，这类照射借助紫外或可见波长发射灯、弧光灯、激光或甚至阳光或普通室内光，其中荧光化合物显示强烈的可见光吸收以及荧光发射。
在一些实施方案中，照明源包括但不限于手持式紫外灯、汞弧灯、氙灯、氩气激光、激光二极管、蓝色激光二极管、和YAG激光。这些照明源任选地集成至激光扫描仪、流式细胞仪、荧光微量平板读数仪，标准或微型荧光计或色谱探测仪中。任选地通过目测，或通过使用以下装置的任一种：CCD照相机、视频照相机、照相胶片、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、光电二极管阵列、量子计数器、外荧光显微镜、扫描式显微镜，流式细胞仪，荧光微量平板读数仪，或通过信号放大装置如光电倍增管，检测照明后的荧光发射。
在一些实施方案中，例如，当使用流式细胞仪、荧光显微镜或荧光计检验样品时，任选地使用所述仪器区别和/或区分具有可检测差异的光学特性的多种荧光团。在一些实施方案中，当使用流式细胞仪检验样品时，样品的检验任选地包括通过使用分选装置基于荧光响应分离样品内的粒子。
在某些实施方案中，使用物理或化学猝灭剂任选地猝灭荧光。
样品
最终用户将决定样品的选择和制备样品的方式。可以随本文所述的方法和组合物使用的样品包括但不限于任何生物衍生的材料或水溶液，其含有修饰的生物分子。在某些实施方案中，样品也包括其中已经添加修饰的生物分子的材料。可以随本文所述的方法和组合物使用的样品可以是生物流体，包括但不限于全血、血浆、血清、鼻分泌物、痰、唾液、尿、汗、透皮渗出物、脑脊髓液等。在其他实施方案中，样品是包含组织和细胞培养基的生物流体，其中修饰的目的生物分子已经分泌至培养基中。这类培养物中所用的细胞包括但不限于原核细胞和真核细胞，后者包括原代培养物和永生化细胞系。这类真核细胞包括而不限于卵巢细胞、上皮细胞、循环型免疫细胞、β细胞、肝细胞和神经元。在某些实施方案中，样品可以是来自动物的完整器官、组织或细胞，包括但不限于肌肉、眼、皮肤、性腺、淋巴结、心脏、脑、肺、肝脏、肾、脾、胸腺、胰脏、实体瘤、巨噬细胞、乳腺、间皮等。
试剂盒
在一些实施方案中，提供试剂盒，其中所述试剂盒包含式(I)至(XIII)中任一者的化合物。在一些实施方案中，试剂盒还包含铜离子源。在一些实施方案中，试剂盒还包含还原剂。在一些实施方案中，试剂盒还包含铜离子螯合剂。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于修饰生物分子的试剂。本文中描述了非限制性的示例的这类铜离子源、还原剂、铜离子螯合剂和用于修饰生物分子的试剂。
在一些实施方案中，试剂盒还包含式(V)的铜离子螯合剂。
上文已经提供本发明的详细描述情况下，以下实施例出于说明本发明的目的给出并且不应当解释为限制本发明或权利要求的范围。
以下实施例意在说明但不限制本发明。
实施例1
图1A显示制备用于产生式(I)至(XIII)中任一者的化合物的试剂的示例性方法。示例性方法如下。
一般合成方法
除非另外指明，否则化学药品从Sigma-Aldrich、AlfaAesar、TCI America、Fisher Scientific、Adesis Inc或EMD购买。使用0.25mm硅胶60F254平板进行分析性薄层层析，并且用254nmUV光或用溴甲酚绿可视化。在Bruker Avance400MHz或VarianInova500MHz光谱仪上记录1HNMR谱。将所有样品溶解于CDCl3、CD3OD、D2O或d6-DMSO中，并且化学迁移(δ)相对于作为内标物的残余溶剂峰以每百万份表述。缩写是：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；br，宽峰。耦合常数(J)以赫兹(Hz)报告。使用电喷雾电离(ESI)在Applied Biosystems200QTRAPP质谱仪或Agilent 1100 MSD离子阱质谱仪上记录质谱。在Perkin Elmer LS50B Luminescence光谱仪上在HPLC级甲醇中确定所选化合物的吸光度和荧光特性。
使用Waters 2695 Alliance HPLC偶联于单-四极WatersMicromass ZQ质谱仪和Xterra MS C18柱(2.5μm粒度，4.6×50mm尺度)，获得分析性LC-MS数据。洗脱梯度是在20分钟内5-95%乙腈/10mMNH4OAc，pH=7。MS数据以负电离模式和正电离模式同时记录。使用Waters600HPLC配Waters996二极管阵列探测器、Waters 717 plus自动进样器，和Luna C18柱(Phenomenex；5μm粒度，4.6mmx250mm尺度)，进行制备性HPLC纯化。
吡啶甲基6-(甲氧羰基)烟酸(2)的制备：将12.6g吡啶-2,5-二甲酸悬浮于150mL甲醇中，并缓慢添加4.5g95%硫酸。将反应加热至回流持续2.5小时，冷却至25℃，并且在室温整体倾入750mL去离子(DI)水。白色沉淀物形成，并且将悬液搅拌20分钟，经带有滤纸的布氏漏斗过滤。将沉淀物用去离子水淋洗并收集。将这种物质溶解于150mL加热至35℃的二氯甲烷中，用150mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤1次。分离两个层，并且将2N HCl添加至有机层直至pH为1-2。一种白色沉淀物形成，并且将它用配备滤纸的布氏漏斗过滤。将产物用去离子水淋洗，收集并且在真空下干燥以提供4.75g化合物2。TLC(80:20ACN:H2O，紫外线)：Rf=.53(双甲基酯Rf=0.83)。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)：9.12(brs,1H),8.42(t,1H),8.15(t,1H),3.89(s,3H)。
5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)2-甲基吡啶-2,5-二甲酸酯(3)的制 备：将100mg2在环境温度溶解于10mL二氯甲烷中。添加N-羟基琥珀酰亚胺(95mg)，随后添加133mg1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，并且将混合物在室温搅拌2小时。随后将混合物用15mL氯仿稀释，随后添加15mL2%HCl溶液。接着将有机层用15mL去离子水洗涤1次。随后将有机相用MgSO4干燥，过滤，并且将3直接用于下一步步骤中。TLC(乙酸乙酯，紫外线)：Rf=0.53。
5-((2-((叔丁氧羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)吡啶甲酸甲酯(4) 的制备：通过溶解于15mL二氯甲烷中直接使用化合物3。在室温添加0.30mL N,N-二异丙基乙胺，随后添加119mg(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯盐酸盐并且将反应搅拌50分钟，在此时间，添加30mL二氯甲烷，然后添加20mL2M的Na2CO3。分离各个层并且将有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩成残余物，将所述残余物溶解于3mL温甲醇中并加载到硅胶层析柱上，并用乙酸乙酯和甲醇洗脱以提供104mg作为白色固体的4。TLC(乙酸乙酯，紫外线)：Rf=0.32。1H NMR(400MHz,CDCl3)：9.15(d,1H),8.30(d,1H)，8.14(复合物,2H),5.32(brs,1H),4.00(s,3H),3.56(m,2H),3.41(m,2H),1.39(s,9H)。
(2-(6-(羟甲基)烟酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(5)的制备。将化合物4(2.4g)溶解于50mL甲醇中，并且小心地添加567mg NaBH4以控制气体生成。添加THF(5mL)，将反应置于65℃的预热浴中。将反应在这个温度搅拌35分钟，在此时间，滴加6mL 2MNa2CO3，随后滴加6mL水。随后将混合物浓缩至1/5原始体积，并且添加100mL乙酸乙酯。分离各个层并且将有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩成油，将所述油溶解于二氯甲烷中并用具有0.5%三乙胺的二氯甲烷和甲醇一起急骤层析以提供0.91g作为白色固体的5。TLC(乙酸乙酯，紫外线)：Rf=0.13)。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)：8.89(s,1H),8.61(s,1H),8.17(d,1H),7.54(d,1H),6.93(m,1H),5.53(s,1H),4.61(s,2H),3.29(m,2H),3.12(m,2H),2.51(s,2H)，1.7(s,9H)。
(2-(6-(叠氮甲基)烟酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(6)的制备。将化合物5(132mg)溶解于5mL DMF中。添加叠氮化钠(218mg)，随后添加三苯膦(129mg)和四溴化碳(189mg)，将反应搅拌1小时，在此时间，添加10mL1M Na2CO3，然后添加30mL乙酸乙酯。有机层用(每次)15mL NaHCO3饱和溶液洗涤2次，将有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩成清亮油。随后通过快速层析纯化该物质，使用乙酸乙酯作为洗脱剂。TLC(乙酸乙酯，紫外线)：Rf=0.30.1HNMR(400MHz,CDCl3)：9.04(d,1H),8.19(dd,1H),7.72(brs,1H),7.43(d,1H),5.17(t,1H),4.55(s,2H),3.58(q,2H),3.43(q,2H),1.43(s,9H)。
图1B显示从(2-(6-(叠氮甲基)烟酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(6)制备式(I)至(XIII)中任一者的化合物的示例性方法。该示例性方法如下。
代表性叠氮-染料缀合的化合物6-(叠氮甲基)-N-(2-(6,8-二氟- 7-羟基-2-氧代-2H-色烯-3-羧酰胺基)乙基)烟酰胺(8)的制备。将化合物6(5.2mg)溶解于1mL DCM中，冷却至5℃，随后添加1mLTFA，并且将混合物搅拌15分钟，随后允许逐步加温至环境温度。随后将混合物浓缩至橙色油并且在真空下干燥2小时，在此时间，将混合物溶解于0.8mL DMF中。在环境温度，添加0.1mLN,N-二异丙基乙胺，随后添加4.9mg Pacific Blue SE(7)。将混合物搅拌1小时，随后将反应混合物直接加载到硅胶柱上并用二氯甲烷和甲醇层析以提供浅黄色油。随后将该物质通过制备性HPLC纯化，所述制备性HPLC使用10mM乙酸铵和甲醇梯度，以获得通过HPLC分析确定的纯度>99%的产物。1H NMR(400MHz,d3-MeOD)：9.21(t,1H),8.98(d,1H),8.68(d,1H),8.26(d,1H),7.57(d,1H),7.26(dd,1H),4.58(s,2H)，3.67-3.64(m,4H)。
QSYpAzide的制备将具有以下结构的QSY吡啶甲基叠氮化物(“QSYp Azide”)：
Figure BDA00003765945201051
基本上如上文对化合物(8)所述那样制备，除了使用QSY-SE(LifeTechnologies产品目录号#Q-10193):
Figure BDA00003765945201052
替代Pacific Blue SE(7)。其他标记的叠氮化合物，如AF488-pAzide、AF647-pAzide和生物素-PEG-pAzide，其中PEG是一个或多个聚乙二醇重复单元。可以使用与化合物8的方法基本上相似的方法制备这些化合物。以这种方式合成的化合物的选择例子包括以下结构物：
Figure BDA00003765945201053
N-乙基生物素吡啶甲基叠氮化物：MS(ESI)：MH+=475.3，473.3(负模式)。
Figure BDA00003765945201061
AF488-吡啶甲基叠氮化物：LCMS(ESI)：Xterra C8，0.2mL/分钟50mmx2.1mm。在20分钟范围内40-100%ACN/10mMNH4OAc，pH=7。Tr=2.1分钟，MH+=737.05。
TAMRA吡啶甲基叠氮化物：
Figure BDA00003765945201062
AF647-吡啶甲基叠氮化物：LCMS(ESI)：Xterra C8，50mmx2.1mm、0.2mL/分钟。在20分钟范围内40-100%ACN/10mMNH4OAc，pH=7。Tr=2.1分钟，MH+=737.05。
Figure BDA00003765945201071
AF594-吡啶甲基叠氮化物：LCMS(ESI)：Xterra C8，50mmx2.1mm、0.2mL/分钟。在20分钟范围内0-60%ACN/10mM NH4OAc，pH=7。Tr=2.1min，MH+=925.3。
Figure BDA00003765945201072
AF555-吡啶甲基炔(这种化合物以类似于化合物15的方式制备)。
AF488-吡啶甲基叠氮化物：LCMS(ESI)：Xterra C8，50mmx2.1mm、0.2mL/分钟。在20分钟范围内40-100%ACN/10mMNH4OAc，pH=7。Tr=6.17min，MH+=1048.39。
图2显示制备式(I)至(XIII)中任一者的化合物的示例性方法。示例性方法如下。
6-((丙-2-炔-1-基氧代)甲基)烟酸(10)的制备。6-(羟甲基)尼烟酸甲酯(9，303mg)溶解于THF中。将0.28mL的9M溴丙炔在甲苯中的溶液在环境温度添加至反应容器。在12小时后，将反应混合物用50mL Et2O稀释并且用30mL碳酸氢钠饱和溶液洗涤1次。将有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩成残余物，将所述残余物在硅胶层析柱上用乙酸乙酯和己烷层析以获得油。TLC(乙酸乙酯，紫外线)：Rf=0.64。1H NMR(400MHz,CDCl3)：9.16(d,1H),8.32(dd,1H),7.57(d,1H),4.80(s,2H),4.33(dd,2H),3.96(s,3H),2.50(t,1H)。
6-((丙-2-炔-1-基氧代)甲基)烟酸(11)的制备。将化合物10(18mg)溶解于0.5mL甲醇中。将LiOH(0.131mL的2M水溶液)在环境温度添加至混合物，并且将反应搅拌30分钟，在此时间，将反应混合物直接施加至硅胶柱并用二氯甲烷(DCM)和甲醇层析以提供作为浅黄色油的11。TLC(乙酸乙酯，紫外线)：Rf=0.10.1H NMR(400MHz,CDCl3)：9.21(s,1H),8.36(d,2H),7.48(s,1H),4.80(s,2H),4.31(s,2H),2.49(s,1H)。
(2-(6-((丙-2-炔-1-基氧代)甲基)烟酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁 酯的制备(12)。将化合物11(11mg)溶解于2mL DCM中。在环境温度添加0.12mL三乙胺，随后添加27μL氯甲酸乙酯，并且将混合物搅拌2小时，在此时间，将混合物冷却至-15℃，并添加57mg(2-氨乙基)氨基甲酸叔丁酯盐酸盐，并且将混合物搅拌12小时。随后将混合物直接施加在硅胶柱上并且用己烷和乙酸乙酯层析以提供作为白色粉末的12。TLC(乙酸乙酯，紫外线)：Rf=0.43。1H NMR(400MHz,CDCl3)：9.02(s,1H),8.17(dd,1H),7.60(brs,1H),7.54(d,1H),5.07(brs,1H),4.79(s,2H),4.32(d,2H),3.58(q,2H),3.44(m,2H),2.50(t,1H),2.06(s,1H),1.44(s,9H)。
化合物15的制备。将化合物12(3.5mg)溶解于0.3mLDCM中并且在0-5℃添加0.5mL三氟乙酸。在1.4小时后，移除溶剂并且将样品置于真空下3小时。随后添加化合物14(4.9mg)，随后添加0.60ml DCM，并且最后添加0.10mL N,N-二异丙基乙胺。在2小时后，将反应混合物直接在真空下浓缩，并且添加0.30mL甲醇和0.20mL8%三乙胺在水中的溶液。将反应搅拌1小时。随后添加0.20mL8%三乙胺在水中的溶液并且将反应搅拌30分钟，随后浓缩成残余物。将随后该物质通过HPLC纯化，使用10mMNH4OAc/MeOH梯度。收集含有产物的级分并浓缩，溶解于水中并且冻干以提供作为红色粉末的15。分析性HPLC：Luna C18 250mmx4.6mm，5μm柱，1.0mL/分钟，在30分钟范围内5-95%的10mM NH4OAc/甲醇梯度。TR=20.8分钟，在254nm和490nm下纯度>99%。1H NMR(400MHz,D2O)：8.46(s,1H),7.83(dd,2H),7.74(dd,1H),7.26(s,1H),7.08(d,1H),6.60(dd,4H),4.42(s,2H),4.12(d,2H),3.54(m,4H),2.80(m,1H)[将酰胺NH与D2O交换]。
实施例2
为了相对于缺少吡啶基的相似反应物，比较使用吡啶甲基叠氮化物反应物的点击反应速率，Cu(I)催化的叠氮化物-炔环加成反应在Oregon Green
Figure BDA00003765945201091
488(“OG”)炔(Life Technologies，Carlsbad，CA))和具有以下结构的QSY
Figure BDA00003765945201092
Azide：
Figure BDA00003765945201093
或具有以下结构的QSY
Figure BDA00003765945201101
吡啶甲基叠氮化物(“QSY pAzide”；见实施例1)之间实施：
Figure BDA00003765945201102
每个反应含有10μM OG炔、40μM QSY Azide或QSYpAzide、5mM抗坏血酸钠，并且在含有100mM Tris，pH8和25%1,2丙二醇缓冲液中添加各种浓度的CuSO4。QSY充当OG的猝灭剂。因此，点击反应使染料紧密靠近，导致OG荧光信号的熄灭。
如图3中所示，在测试的全部Cu浓度下，使用吡啶甲基试剂QSY pAzide的点击反应速率(A)快于使用试剂QSY Azide的点击反应速率(B)。因此，吡啶甲基部分的存在增加本实验中点击反应的速率。
接下来，确定使Cu(I)稳定的铜螯合剂对OG炔和QSYpAzide或QSY Azide之间点击反应的影响。在这个实验中，在抗坏血酸钠和2mM、1mM、0.5mM或0.25mMCu2+存在下；或在抗坏血酸钠和0.25mM、0.125mM、0.0625mM、或0.03125mMCu2+及具有以下结构的THPTA：
Figure BDA00003765945201103
以THPTA:Cu的摩尔比为0:1至8:1存在时使反应实施30分钟。
4图中显示结果。如该图中所示，在更高浓度的Cu2+并且在THPTA不存在下，在30分钟内OG炔和QSY Azide之间发生非常少的点击反应。相比之下，当使用QSY pAzide作为反应物时，在至少0.5mM Cu2+存在下，大于50%的OG炔在30分钟内被猝灭。THPTA的存在明显地增加30分钟内QSY pAzide和QSY Azide的点击反应的程度(例如，在THPTA存在和不存在的情况下比较0.25mM Cu2+)。因此，THPTA不仅减少对可能有害于生物系统的Cu2+离子的需要，它还大大增加吡啶甲基点击反应物和非吡啶甲基点击反应物的反应速率。
实施例3
为了测定吡啶甲基叠氮化物是否在点击反应速率方面显示相似的增强作用，在以下点击反应中使用各种炔：
Figure BDA00003765945201111
通过在各个时间点取得反应混合物的等分试样并且施加样品至薄层层析(TLC)平板，测定至反应结束的时间。随后使用有机溶剂混合物使TLC平板展层。通过对应于起始物质和产物的各个点的强度估计反应进程。估计反应时间。
下文显示本实验的结果。
Figure BDA00003765945201112
在这个实验中，吡啶甲基炔反应物的使用导致比相同条件下非吡啶甲基炔短得多的反应时间。
实施例4
用于确定点击反应相对速率的荧光点击测定法用来以下述程序测试各种叠氮化合物，所述程序改编自Zhou和Fahrni,J.Am.Chem.Soc.,2004,126,8862-8863:
Figure BDA00003765945201121
一般反应条件：pH7.4的100μM Tris缓冲液中的20μM叠氮化物、40μM7-乙炔基香豆素16和4mM抗坏血酸钠，伴有在25±1℃的25%v/v 1,2-丙二醇。通过添加CuSO4:125μM引发反应。在MolecularDevices SpectraMax M5微量平板读数仪上记录香豆素荧光，在320nm处激发并在430nm处检测发射，临界值在420nm上。使用从已知浓度(1.25-40μM)的2-吡啶甲基叠氮化物和7-乙炔基香豆素16之间的三唑加合物产生的校正曲线，使香豆素三唑的导通荧光与其浓度相关。荧光测量以30秒间隔进行至少30分钟。每种叠氮化物的测量进行三次或更多次重复。在每个时间点由来自数据集的标准偏差确定误差。从全部数据扣除背景荧光用于标准化。
如Zhou和Fahrnii,J.Am.Chem.Soc.,2004,126,8862-8863中先前描述，制备并表征香豆素-炔16。
如下文所述合成使用的各种有机叠氮化合物。
苄基叠氮化物(如下文显示)是可商业获得的：
Figure BDA00003765945201131
2-叠氮甲基吡啶(2-吡啶甲基叠氮化物)的合成。
Figure BDA00003765945201132
根据Brotherton,W.S.；Michaels,H.A.；Simmons,J.T.；Clark,R.J.；Dalal,N.S.；Zhu,L.Organic Letters2009,11,4954 4957的已公开文献程序，制备并表征这种化合物。
4-叠氮甲基苯甲酸的合成
Figure BDA00003765945201133
如Zhou和Fahrni,J.Am.Chem.Soc.,2004,126,8862-8863中所述，制备并表征这种化合物。
4-叠氮甲基烟酸的合成
Figure BDA00003765945201134
将5-(叠氮甲基)烟酸甲酯(114mg，0.59mmol)溶解于甲醇(2.5mL)中。随后添加LiOH在水(1.78mL，1.78mmol)中的1.0M溶液，并且将混合物搅拌25分钟，在此时间，添加乙酸(60μL)并且将混合物直接加载到用乙酸乙酯+1%乙酸平衡的硅胶柱上并且用乙酸乙酯+1%乙酸至4%乙腈/乙酸乙酯+1%乙酸进行层析以提供作为黄色固体的101mg(96%)这种化合物。Rf=0.35(乙酸乙酯+1%乙酸，254nmUV)。1H NMR(400MHz,1:1CDCl3:CD3OD)：9.75(dd，J=2.0，0.4Hz,1H),8.98(dd，J=8.0.2.0Hz,1H),8.12(d，J=8.0Hz,1H),5.35(s,1H),5.18(s,2H)。MS(ESI-):177(M+，100%；133.0(60%)。
5-(叠氮甲基)烟酸甲酯的合成。
Figure BDA00003765945201141
如Khilevich,A.,Liu,B.,Mayhugh,D.R.,Schekeryantz,J.M.和Zhang,D.,Imidazolecarboxamide derivatives as mGluR2 receptor potentiatorsand their preparation,pharmaceutical compositions and use in the treatment ofdepression(咪唑甲酰胺衍生物作为mGluR2受体增效剂和它们的制备、药物组合物和治疗抑郁的用途).WO2010/009062.2010年1月21日中所述，制备并表征这种化合物。
2-叠氮甲基-4-甲氧基吡啶的合成。
Figure BDA00003765945201142
将2-(羟甲基)-4-甲氧基吡啶(278mg，2.0mmol)在氩气下溶解于50mL圆底烧瓶中的四氢呋喃(15mL)内。将该烧瓶用冰/水浴冷却至0-5℃持续10分钟，在此时间，添加粉状KOH(157mg，2.8mmol)，随后添加对-甲苯磺酰氯(pTsCl)。将反应搅拌12小时，在此时间，添加二乙醚(30mL)。将混合物转移至分液漏斗，并且添加NaHCO3饱和溶液(40mL)。将有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩成残余物，将所述残余物在硅胶层析柱上用10%至50%乙酸乙酯/己烷梯度层析。Rf=0.69(乙酸乙酯，254nm UV)。随后将该物质溶解于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，并添加叠氮化钠(266mg，4.09mmol)，并且反应在环境温度搅拌16小时，在此时间，将反应混合物用二乙醚(30mL)稀释并用NaHCO3饱和溶液(3x30mL)、随后用盐水(25mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并且在真空下浓缩。所得到的残余物在硅胶上用15%至50%乙酸乙酯/己烷梯度层析，以提供100mg(30%产率)作为浅黄色油的这种化合物。Rf=0.68(乙酸乙酯,254nmUV)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：8.34(d,J=5.6Hz,1H,),6.81(d,J=2.4Hz1H),4.39(s,2H),3.81(s,3H)。
2-叠氮甲基-4-氯吡啶的合成
Figure BDA00003765945201151
如Jung,F.H.,Cephalosporin derivatives(头孢菌素衍生物).EP专利号0127992.1984年12月12日中所述，制备并表征2-叠氮甲基-4-氯吡啶。
(6-叠氮甲基吡啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
Figure BDA00003765945201152
将(6-(羟甲基)吡啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(24mg，0,107mmol)溶解于DMF(2mL)中，并且添加叠氮化钠(35mg，0.54mmol)，随后同时添加四溴化碳(179mg，0.54mmol)和三苯膦(142mg，0.54mol)。将混合物在环境温度搅拌2小时，随后稀释于乙酸乙酯(20mL)和饱和NaHCO3溶液(20mL)中。分离各个层，并且将有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩成黄色油，将所述黄色油层析(硅胶上15-90%乙酸乙酯/己烷)以提供作为薄膜的这种化合物16.8mg(63%)。Rf=0.92(乙酸乙酯，254nm UV)。MS(ESI+)：250.0(M+H+，100%；194.0，25%)。
5-甲酯基烟酸的合成
如Luk,K-C.,So,S-S.,Zhang,J.和Zhang,Z.Preparation ofoxindoles as inhibitors of MDM2-p53 interaction for the treatment ofcancer(作为MDM2-p53相互作用的抑制剂用于治疗癌症的羟吲哚的制备).WO2006136606.2006年12月28日中所述，制备并表征这种化合物。
5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)2-甲基吡啶-2,5-二甲酸酯的合成
Figure BDA00003765945201162
将5-甲酯基烟酸(100mg，0.55mmol)在环境温度溶解于二氯甲烷(10mL)中。添加N-羟琥珀酰亚胺(NHS；95mg，0.83mmol)，随后添加1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)盐酸盐(133mg，0.69mol)，并且将混合物在环境温度搅拌2小时。随后将混合物用氯仿(15mL)稀释，随后添加2%HCl溶液(15mL)。将有机层用水(15mL)洗涤，用MgSO4干燥并过滤。将这种化合物直接用于下一步步骤中，在无需进一步纯化。Rf=0.53(乙酸乙酯，254nm UV)。
5-(2-(叔丁氧羰基氨基)乙基)氨基甲酰基吡啶甲酸甲酯的合 成。
将5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)2-甲基吡啶-2,5-二甲酸酯(155mg，0.55mmol)溶解于二氯甲烷(15mL)中。在环境温度添加N,N-二异丙基乙胺(0.30mL，1.65mmol)，随后添加(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(119mg，0.61mmol)。将反应搅拌50分钟，随后用二氯甲烷(30mL)和2M Na2CO3溶液(20mL)稀释。分离各个层，并且将有机层用MgSO4干燥，过滤并和在真空下浓缩。将残余物溶解于温甲醇(3mL)中，加载到硅胶层析柱上并且用乙酸乙酯随后用95:5乙酸乙酯:甲醇洗脱以提供104mg(58%)作为白色固体的这种化合物。Rf=0.32(乙酸乙酯，254nm UV)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：9.15(d,J=2Hz,1H),8.30(d,J=1.6Hz,1H),8.14(络合物,2H),5.32(brs,1H),4.00(s,3H),3.56(m,2H),3.41(m,2H),1.39(s,9H)。
(2-(6-(羟甲基)烟酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成。
Figure BDA00003765945201172
将NaBH4(55mg，1.46mmol)缓慢添加至溶解于甲醇(3mL)中的5-(2-(叔丁氧羰基氨基)乙基)氨基甲酰基吡啶甲酸甲酯(157mg，0.49mmol)。添加THF(10mL)并且将反应烧瓶置于预热至65℃的油浴中。将反应在65℃搅拌15分钟，在此时间，在10分钟范围内添加2M Na2CO3溶液(6mL)，随后添加水(6mL)。随后将混合物浓缩至其原始体积的1/5并且直接用0.5%三乙胺和乙酸乙酯/甲醇层析以提供作为白色固体的这种化合物(132mg，91%)。Rf=0.10(乙酸乙酯，254nm UV)。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)：8.89(s,1H),8.61(s,1H),8.18(d,J=8.0Hz,1H),7.55(d,J=8.0Hz,1H),6.93(m,1H),5.53(brs,1H),4.61(s,2H),3.29(m,2H),3.12(d,J=6.0Hz,2H),2.51(s,2H),1.7(s,9H)。
(2-(6-(叠氮甲基)烟酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成。
Figure BDA00003765945201181
将(2-(6-(羟甲基)烟酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(132mg，0.45mmol)溶解于DMF(5mL)中。添加叠氮化钠(218mg，3.36mmol)，随后添加三苯膦(129mg，0.492mmol)和四溴化碳(189mg，185mg，0.56mmol)。将反应在环境温度搅拌1小时，在此时间，添加2M Na2CO3溶液(10mL)，随后添加乙酸乙酯(30mL)。将有机层用饱和NaHCO3溶液(2×15mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并且在真空下浓缩。所得到的清亮油通过硅胶层析使用乙酸乙酯作为洗脱剂来纯化，以提供作为白色固体的这种化合物。Rf=0.30(乙酸乙酯,254nm UV)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：9.04(d,J=1.6Hz,1H),8.19(dd,J=8.1,2.3Hz,1H),7.72(brs,1H),7.43(d,J=8.1Hz,1H),5.17(t,J=8.1Hz,5.8Hz,1H),4.55(s,2H),3.58(q,J=4.9Hz,2H),3.43(q,J=5.9Hz,2H),1.43(s,9H)。LCMS(ESI+)：296.50(MH+,100%),240.38(86%)；TR=8.8分钟。
2-(2-(羟甲基)吡啶-4基氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯的合成
Figure BDA00003765945201191
向40mL配备搅拌棒的压力管添加4-氯-2-吡啶基甲醇(0.25g，1.74mmol)、N,N-二异丙基乙胺(1.52mL，8.71mmol)，并且添加甲苯(0.925mL；8.71mmol)，添加(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.55g，3.50mmol)。将容器用氩气吹扫并随后置于预加热至125℃的油浴中。将油浴的温度经30分钟增加至140℃。在2小时后，TLC(条件如下)指示原料几乎完全耗尽。将反应冷却至环境温度并倾析出甲苯层。添加甲醇(15mL)并将混合物加热至大约40℃持续5分钟以破坏固体残余物。将混合物浓缩至其原始体积的1/5后，添加CHCl3(5mL)并且将残余物加载到用二氯甲烷(DCM)+0.5%三乙胺平衡的5cmx15cm硅胶柱上。采用DCM至DCM/含0.5%三乙胺的10%甲醇的快速层析提供了该化合物和起始的(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(1:1.4摩尔比)的不可分混合物。Rf=0.38(15%MeOH/DCM+0.1%TEA，254nm UV)。将这这种混合物用于下一步步骤中，在无需进一步纯化。1H NMR(400MHz,CD3OD)：(9)7.93(d,J=5.6Hz,1H),6.75(d,J=2.4z,1H),6.48(dd,J=6.0,2.4Hz,1H),4.54(s,2H),3.66(s,1H),3.26(m,4H),1.46(s,9H);2-氨基乙基氨基甲酸叔丁酯)3.33(m,2H),3.12(t,J=6.4Hz,2H),2.71(t,J=6.4Hz,2H),1.44(s,9H)。
叔丁基2-(2-(叠氮甲基)吡啶-4基氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯的 合成
Figure BDA00003765945201201
将2-(2-(羟甲基)吡啶-4-基氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯的混合物溶解于20mL螺盖小瓶中的DMF(3.5mL)内。在环境温度，添加叠氮化钠(91mg，1.40mmol)，随后同时添加三苯膦(370mg，1.40mmol)和四溴化碳(470mg，1.40mmol)。在1小时后，添加额外的91mg叠氮化钠(1.40mmol)，随后同时添加三苯膦(370mg，1.40mmol)和四溴化碳(470mg，1.40mmol)。将反应搅拌另一个小时并且在氮气流下浓缩以除去溶剂。所得到的残余物用1%至10%MeOH/CHCl3层析以提供作为白色固体的这种化合物(75mg，27%经2个步骤)。Rf=0.22(5%MeOH/DCM+0.1%TEA,254nmUV)。1H NMR(400MHz,CD3OD)：8.00(d,J=6.4Hz,1H),6.71(d,J=1.6Hz,1H),6.63(dd,J=6.0,2.0Hz,1H),4.38(s,2H),3.33(m,2H;与残余MeOH重叠),3.25(m,2H),1.96(s,2H),1.44(s,9H)。MS(ESI+)：293.3(M+H+)。
2-叠氮基乙基吡啶的合成
Figure BDA00003765945201202
如Brotherton,W.S.；Michaels,H.A.；Simmons,J.T.；Clark,R.J.；Dalal,N.S.；Zhu,L.Organic Letters2009,11,4954-4957所述,制备并表征2-叠氮基乙基吡啶。
3-叠氮基-1-(吡啶-2-基)丙-1-酮的合成
Figure BDA00003765945201211
将2-吡啶甲酸(74mg，0.60mmol)在氩气下溶解于无水二氯甲烷(4mL)。随后添加三乙胺(0.84mL，6.0mmol)，接着添加氯甲酸乙酯(86μL，0.90mmol)。将反应混合物在环境温度搅拌30分钟，在此时间，添加2-叠氮基乙胺盐酸盐(11mg，0.90mmol)。在环境温度进一步搅拌12小时后，在真空下移除溶剂，并且将所得到的残余物溶解于乙酸乙酯中，加载到制备性TLC平板上，并且使用4:1己烷:乙酸乙酯酯溶剂体系展层。将含有产物的条带收集并用10:1氯仿:甲醇淋洗，过滤并浓缩成黄色油(25mg，22%)。Rf=0.64(乙酸乙酯,紫外线)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：8.76(d,J=4Hz,1H),8.14(d,J=8Hz,1H),7.83(dd,J=7.6,6.4Hz,1H),7.47(m,1H),4.49(dd,J=7.2,6.8Hz,2H),3.95(s,1H),1.45(t，J=7.2Hz,3H)。
2-叠氮甲基喹啉的合成
Figure BDA00003765945201212
如Brotherton,W.S.；Michaels,H.A.；Simmons,J.T.；Clark,R.J.；Dalal,N.S.；Zhu,L.Organic Letters2009,11,4954-4957所述，制备并表征2-叠氮甲基喹啉。
6-溴甲基-2,2′-二吡啶的合成。
Figure BDA00003765945201213
如Murashima,T.;Tsukiyama,S.;Fujii,S.;Hayata,K.;Sakai,H.;Miyazawa,T.;Yamada,T.Organic&Biomolecular Chemistry 2005,3,4060-4064所述，制备并表征6-溴甲基-2,2′-二吡啶。
6-叠氮甲基-2,2′-二吡啶的合成。
Figure BDA00003765945201221
向6-溴甲基-2,2′-二吡啶(75mg，0.30mmol)在DMF(2mL)中的溶液添加叠氮化钠(59mg，0.90mmol)。将反应混合物搅拌2小时，随后用二乙醚(20mL)和饱和NaHCO3溶液(15mL)稀释。分离各个层，并且将有机层进一步用饱和NaHCO3溶液(2×15mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并且浓缩成油。LC-MS(ESI+)：221.39(MH+，44%)；TR=17.4分钟。
2-叠氮甲基苯并咪唑的合成。
Figure BDA00003765945201222
如Hideg,K.;Hankovszky,H.O.Synthesis-Stuttgart1978,313-315所述，制备并表征2-叠氮甲基苯并咪唑。
5-(6-(叠氮甲基)烟酰胺基)戊酸的合成。
向6-叠氮甲基烟酸(30mg，0.168mmol)在无水DMF(500μL)中的溶液添加二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC；65mg，0.253mmol)和三乙胺(TEA；120μL，0.840mmol)。允许反应在环境温度继续进行3小时。将反应混合物用氯仿和水稀释。将各层分离，并且将水层用氯仿3次提取。将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，并且在真空下浓缩。残余混合物由二氧化硅层析(1:1己烷:乙酸乙酯)纯化以提供6-叠氮甲基烟酸的琥珀酰亚胺酯。Rf=0.67，在9:1氯仿:甲醇中。
向5-叠氮甲基烟酸琥珀酰亚胺酯(15mg，0.055mmol)在无水DMF(500μL)中的溶液添加5-氨基戊酸(32mg，0.273mmol)和TEA(38μL，0.273mmol)。反应在环境温度继续进行12小时。随后在真空下移除TEA和DMF，并且将所得到的残余物在9:1氯仿:甲醇中干式加载到到二氧化硅柱上，并且使用9:1氯仿:甲醇作为洗脱剂纯化。Rf=0.19，在9:1氯仿:甲醇中。1H NMR(D2O,500MHz)：8.83(s,1H),8.18(d,1H,J=8.5Hz),7.59(d,1H,J=8Hz),4.62(s,2H),3.42(m,2H),2.32(m,2H),1.65(m,4H)。
ALEXAFLUOR-647(AF-647)-吡啶甲基叠氮化物缀合物的合 成。
Figure BDA00003765945201231
向8-(2-氨基乙基)-6-(叠氮甲基)烟酰胺(5.5mg，0.019mmol)在DMF(0.95mL)中的溶液添加DIPEA(100μL)和ALEXA FLUOR647琥珀酰亚胺酯(ALEXA FLUOR647-SE；20mg，0.016mmol)。在环境温度搅拌10小时后，将反应混合物浓缩并且直接通过制备性HPLC使用5-95%10mM NH4OAc/MeOH的30分钟梯度以流速1mL/分钟纯化。将含有产物的级分合并并在真空下浓缩。随后将残余物溶解于水(10mL)中，快速冷冻，随后冻干以产生13.6mg作为浅蓝色粉末的ALEXAFLUOR-647-吡啶甲基叠氮化物(83%)。在647nm处，Tr=20.8分钟。MS(ESI+)：1061.3(M+H+;2%),531.2,6%);(ESI-):1060.3(两性离子,17%),540.3(52%),529.3(M2-.100%)。HPLC：在254nm和644nm时纯度>99%。
荧光(fluorogenic)测定试剂的合成性制备。
为了制备16和例如2-叠氮甲基吡啶之间的三唑加合物，将16(20mg，0.073mmol)溶解于DMSO(4mL)中。随后添加2-叠氮甲基吡啶(20mg，0.15mmol)，接着添加0.50M抗坏血酸钠在水中的溶液(59μL，0.029mmol)，和并且添加0.25M硫酸铜(II)在水中的溶液(30μL，0.007mmol)。将反应搅拌1小时并且在真空下移除溶剂。将粗制反应混合物溶解于甲醇中并且直接加载到制备性TLC平板(0.25mm厚度)上，并且将平板用95:5乙腈:H2O展层。将含有产物的二氧化硅收集并且在氯仿(30mL)中超声处理持续3分钟并且过滤。将滤液浓缩以形成8.9mg作为棕褐色固体的II(30%产率)。Rf=0.80(97:3乙腈:H2O)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：12.27(brs,1H),8.58(dd,J=4.8,4.0Hz,1H),7.92-7.82(m,3H),7.44-7.35(m,3H),5.81(s,1H),5.44(s,1H),4.51(s,2H),3.37(s,4H),2.71(J=7.6,6.0Hz,1H),2.57(t,J=7.6,6.0Hz,1H)。最大激发值=325nm，最大发射值=415nm(含25%1,2-丙二醇的100mMTris缓冲液)。LC-MS(ESI+)：435.48(MH+，100%)，407.49(65%)；TR=8.4分钟。图5B显示在31μMCu和THPT以4:1(THPTA:Cu)比率存在下某些点击反应的结果。
各种叠氮化物(R-N3)，包括以下显示的那些：
Figure BDA00003765945201251
与16反应。
除非另外指出，否则在含有25%1,2-丙二醇的100mM Tris缓冲液中制备16和这些叠氮化合物的储备溶液。在SpectraMax M5仪上记录数据，同时在320nm处进行激发并在430nm处检测发射，在420nm截止。将该仪器设置成动力学模式。以用于荧光测量的顶部读数模式使用96孔板。每孔中的总体积是200μL。总是将CuSO4/水溶液最后添加至平板以启动反应，并且至少每分钟进行测量，持续60分钟。当反应中包THPTA时，THPTA:Cu的比率是4:1。也使用16:1抗坏血酸钠:Cu的固定比率。在储备溶液和最终溶液中的试剂浓度如下：
组分 初始浓度 终浓度
16 100μM 40μM
叠氮化物 100μM 20μM
图5中显示这个实验的结果。
图5A显示在125μM Cu存在下某些点击反应的结果。从图5A中可以看到，6-(叠氮甲基)烟酸发生点击反应比4-(叠氮甲基)苯甲酸快得多。认为这归因于6-(叠氮甲基)烟酸的杂原子，该杂原子与Cu离子协调一致并转而加速反应的速率。
图5B显示当添加至吡啶甲基叠氮化物的反应时配体如THPTA具有的加合效应。当使用epically基团和配体的组合时，点击反应较快。甚至当4-叠氮甲基苯甲酸在THPTA存在下与炔反应时，点击反应比吡啶甲基叠氮化物不与配体或不与配体(如THPTA)一起使用时快得多。
下文显示叠氮化物杂环结构物及5分钟和30分钟反应时间后其铜(I)催化的叠氮化物-炔环加成反应转化率的总结。使用的浓度是20μM叠氮化物、40μM7-乙炔基香豆素、125μM CuSO4和4mM抗坏血酸钠。反应在25℃在含有25%v/v 1,2丙二醇的100μM TrispH7.4中进行。
Figure BDA00003765945201261
Figure BDA00003765945201271
Figure BDA00003765945201281
几种趋势是明显的。
首先，2-吡啶甲基叠氮化物和6-(叠氮甲基)烟酸是比它们的碳环类似物苄基叠氮化物和4-(叠氮甲基)苯甲酸快得多的反应物，在这些条件下产生>35倍和>19倍的初始CuAAC速率改善。
其次，在多种吡啶甲基叠氮化物结构物当中，具有供电子基团的叠氮化物产生比具有吸电子基团更快的速率，推测是因为前者增强吡啶基氮的螯合强度。例外是具有烷基氨基取代基的吡啶甲基叠氮化物，它在30分钟后产生低转化率。
第三个观察结果是，具有其他铜配位基序的叠氮基化合物总体上不具有如2-吡啶甲基叠氮化物同样强的加速作用。2-叠氮基乙基吡啶，其含有在吡啶基环和叠氮基之间的额外亚甲基间隔物(以产生六元螯合环)，在5分钟后比吡啶甲基叠氮化物产生低至少约3倍的产物。尽管是强效铜螯合剂，但是6-叠氮甲基-2,2′-二吡啶和2-(叠氮甲基)苯并咪唑各自在30分钟后均不产生任何产物。
实施例5
如下确定GFP在各种浓度的Cu(II)、Cu(II)外加抗坏血酸钠(以产生Cu(I))和Cu(II)外加抗坏血酸钠和THPTA存在下的稳定性。
将GFP(5nM)在25℃在含有25%1,2-丙二醇的100mM Tris缓冲液内在2mM、1mM、0.5mM、0.25mM、0.125mM、或0.0625mM CuSO4存在下温育。在温育混合物中不包含抗坏血酸。然后以各个时间间隔测量GFP荧光。如图6A中所示，在CuSO4的最高浓度2mM，在这个实验中，GFP信号30分钟后是最大值的60%。发现GFP在<0.5mM Cu(II)时基本上稳定。
在下一个实验中，将5nM GFP在25℃在含有25%1,2-丙二醇的100mM Tris缓冲液内在2mM、1mM、0.5mM、0.25mM、0.125mM、或0.0625mM CuSO4存在下温育。在每种混合物中，以大于Cu(II)浓度10倍的浓度包含抗坏血酸钠(即，对于1mMCu(II)，包含10mM抗坏血酸钠)。然后以各个时间间隔测量GFP荧光。如图6B中所示，在Cu(II)和抗坏血酸钠的最高浓度(2mM Cu(II)外加20mM抗坏血酸钠)下，这个实验中，GFP信号在38分钟后是最大值的53%。发现GFP在<0.25mM Cu(II)外加2.5mM抗坏血酸钠时基本上稳定。
最后，在Cu(II)存在下，伴随或不伴随抗坏血酸钠并且具有或没有THPTA时确定GFP稳定性。在这个实验中，将5nM GFP在25℃在含有25%1,2-丙二醇的100mM Tris缓冲液内在(i)2mMCu(II)；(ii)1mM Cu(II)、10mM抗坏血酸钠；(iii)1mM Cu(II)、4mM THPTA、10mM抗坏血酸钠；或(iv)0.125mM Cu(II)、0.5mMTHPTA、和10mM抗坏血酸钠存在下温育。在这个实验中，通常将混合物温育30分钟。如图7A中所示，在这个实验中，GFP信号在全部测试条件下逐渐减小。与含有单独Cu(II)或Cu(II)外加抗坏血酸的混合物相比，包含THPTA和较低浓度Cu(II)的混合物显示较少的GFP信号衰减。
为了确定GFP是否会在完成点击反应的时间框架期间明显降解，Oregon Green
Figure BDA00003765945201301
(“OG”)炔和QSY-叠氮化物之间的点击反应在上文描述的相同的4种条件(外加低铜对照)下实施。如图7B中所示，在导致图7A中GFP信号衰减最低的THPTA和低铜存在下的这些点击反应是最快的。在伴随THPTA的Cu(II)最低浓度(0.125mM Cu(II)外加0.5mM THPTA和10mM抗坏血酸钠)下，点击反应在约20分钟内完成，在此时间，GFP信号仍是最大值的约95%(见图7A)。这些结果显示铜催化的点击反应可以在生物系统中实施，同时蛋白质降解不明显。
实施例6
用于EU标记细胞中RNA的一般方法：将表达GFP的Erk2 稳定转染的A375细胞以细胞密度5000个细胞/孔涂板过夜
将表达Erk2-GFP(Life Technologies)的人恶性黑色素瘤(A375)细胞在含有L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基(LifeTechnologies)中培养，所述培养基补充有10%v/v胎牛血清(LifeTechnologies)、非必需氨基酸(Life Technologies)和5μg/mL杀稻瘟素。将全部细胞在37℃于5%CO2下维持。
这些细胞用200μM 5-乙炔基尿苷(EU)脉冲(pulse)1小时，随后用PBS中的3.7%福尔马林固定15分钟。随后将细胞用PBS中的3%BSA洗涤两次，随后用PBS中的0.5%Triton透化20分钟。将透化的细胞用PBS中的3%BSA洗涤两次。点击反应在室温实施1小时，随后PBS中的3%BSA将细胞洗涤2次并用PBS淋洗2次。点击条件是具有或没有螯合物和AF647-吡啶甲基叠氮化物或AF647-叠氮化物情况的组合。然后将点击的细胞用Hoechst染液(PBS中1ug/mL)在室温染色30分钟，随后用PBS洗涤3次。将细胞在ArrayScan上成像。
实施例7
用于HPG标记细胞中蛋白质的一般方法。
将用表达GFP的Erk2稳定转染的A375细胞以细胞密度5000个细胞/孔涂板过夜。
这些细胞用50μML-高炔丙基甘氨酸(HPG)在40μM放线菌酮存在或不存在下脉冲1小时，随后用PBS中的3.7%福尔马林固定15分钟。随后将细胞用PBS中的3%BSA洗涤两次，随后用PBS中的0.5%Triton透化20分钟。将透化的细胞用PBS中的3%BSA洗涤两次。点击反应在室温使用2mM CuSO4和10mM抗坏血酸钠实施1小时，随后PBS中的3%BSA洗涤2次并用PBS淋洗2次。点击反应根据螯合物、Cu和AF647-吡啶甲基叠氮化物或AF647-叠氮化物组合来实施。
a.4:1螯合物/铜+吡啶甲基叠氮化物
b.2:1螯合物/铜+吡啶甲基叠氮化物
c.1:1螯合物/铜+吡啶甲基叠氮化物
d.无螯合物无吡啶甲基=经典点击
然后将点击的细胞用Hoechst染液(PBS中1ug/mL)在室温染色30分钟，随后用PBS洗涤3次。将细胞在ArrayScan上成像。
实施例8
在点击HPG标记细胞中的蛋白质后用鬼笔环肽AF546标记 的一般方法。
将用表达GFP的Erk2稳定转染的A375细胞以细胞密度5000个细胞/孔涂板过夜。在用含有HPG的培养基温育之前，将细胞用具有钙和镁的DPBS洗涤1次，随后在无甲硫氨酸的DMEM中(Life Technologies)培育30分钟。这些细胞用50μM HPG在40μM放线菌酮存在或不存在下脉冲1小时，随后用PBS中的3.7%福尔马林固定15分钟。随后将细胞用PBS中的3%BSA洗涤两次，随后用PBS中的0.5%Triton透化20分钟。将透化的细胞用PBS中的3%BSA洗涤两次。点击反应在室温使用2mM CuSO4和10mM抗坏血酸钠实施1小时，随后将细胞用PBS中的3%BSA洗涤2次并用PBS淋洗2次。使用4:1螯合物/铜和AF647-吡啶甲基叠氮化物实施点击反应。然后将点击的细胞用鬼笔环肽-AF546(30分钟在室温)缀合物染色，随后用Hoechst染液(PBS中1ug/mL)在室温染色30分钟，随后用PBS洗涤3次。将细胞在ArrayScan上成像。
图13至图17进一步显示使用吡啶甲基叠氮化物以代谢方式标记蛋白质中炔的螯合作用辅助的铜(I)催化的叠氮化物-炔环加成反应的用途的通用性，并且与无螯合作用辅助相比发现检测灵敏度高得多。
实施例9
使用半乳糖基转移酶，用UDPGalNAz在其GlcNAc位点修饰单克隆抗体抗TSH。GalNAz基团随后使用BCS以标准点击反应、以DIBO点击反应或以THPTA/吡啶甲基点击反应进行点击反应。Cu 2mM是采用2mM Cu+10mM抗坏血酸持续4分钟的原始Cu点击反应，随后添加10mM BCS，同时温育30分钟。THPTA/吡啶甲基点击反应用补充有THPTA的0.25mM Cu以摩尔比0:1、1:1、2:1、4:1和8:1在10mM抗坏血酸存在下实施40分钟。对于含有Cu的全部反应，使用10μM吡啶甲基Oregon绿色炔。DIBO点击反应用20μM的DIBO-Oregon Green488实施3小时。在图18中，对照抗体的样品用galT指示-(在eGalNAz修饰步骤中不添加半乳糖基转移酶)。使用SBP(SeeBlue
Figure BDA00003765945201331
外加2预染标准物；LC5925)和M12(Mark12TM未染色标准物；LC5677)作为分子量标准。凝胶用FUJIFILM FLA-9000针对488nm染料，随后针对SYPRORuby通用蛋白质染液的荧光检测来成像。
实施例10
用工程化的吡啶甲基叠氮化物连接酶和螯合作用辅助的铜(I) 催化的叠氮化物-炔环加成反应，位点特异性标记细胞表面蛋白
将吡啶甲基叠氮化物结构转化成硫辛酸连接酶(一种可用于细胞中位点特异性蛋白质标记的大肠杆菌酶)的底物(例如，如下文显示的5-(6-(叠氮甲基)烟酰胺基)戊酸)。数据显示，发现大肠杆菌硫辛酸连接酶(LplA)的W37V突变体高效催化携带末端羧酸酯的吡啶甲基叠氮化物衍生物连接到活哺乳动物细胞表面上表达的重组蛋白，如图19中所述。在具有50μM铜的极端温和条件下，以高产率并伴随最小可观察细胞毒性时，将连接的吡啶甲基叠氮化物随后用各种炔-荧光团以化学选择方式衍生化，甚至对活的神经元进行衍生化。将我们的用于细胞表面上特异性蛋白质标记的螯合作用辅助的铜(I)催化的叠氮化物-炔环加成反应方案与采用烷基叠氮随后采用螯合作用辅助的铜(I)催化的叠氮化物-炔环加成反应的类似标记方案平行比较，显示前者产生9倍更高的信号，而背景最小，在仅5分钟标记后(对于第二步骤)。
5-(6-(叠氮甲基)烟酰胺基)戊酸的合成
向6-叠氮甲基烟酸(30mg，0.168mmol；来自实施例4)在无水DMF(500μL)中的溶液添加二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC；65mg，0.253mmol)和三乙胺(TEA；120μL，0.840mmol)。允许反应在环境温度进行3小时。将反应混合物用氯仿和水稀释。将各层分离，并且将水层用氯仿3次提取。将合并的有机层用盐水(300mL)洗涤，经MgSO4干燥，并且在真空下浓缩。残余混合物由二氧化硅层析(1:1己烷:乙酸乙酯)纯化以提供6-叠氮甲基烟酸的琥珀酰亚胺酯。Rf=在9:1氯仿:甲醇中的0.67。
向5-叠氮甲基烟酸琥珀酰亚胺酯(15mg，0.055mmol)在无水DMF(500μL)中的溶液添加5-氨基戊酸(32mg，0.273mmol)和TEA(38μL，0.273mmol)。反应在环境温度进行12小时。随后在真空下移除TEA和DMF，并且将所得到的残余物在9:1氯仿:甲醇中干式加载到到硅胶柱上，并且使用9:1氯仿:甲醇作为洗脱剂纯化。Rf=0.19，在9:1氯仿:甲醇中。1H NMR(D2O,500MHz)：8.83(s,1H),8.18(d,1H,J=8.5Hz),7.59(d,1H,J=8Hz),4.62(s,2H),3.42(m,2H),2.32(m,2H),1.65(m,4H)。
用于制备LAP-吡啶甲基叠氮化物加合物的体外LplA催化的吡 啶甲基叠氮化物连接反应。酶促反应组成如下：在Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中的20%v/v甘油中150μM LAP(氨基酸序列：GFEIDKVWYDLDA)，5μM W 37VLplA，500μM5-(6-(叠氮甲基)烟酰胺基)戊酸，1mM ATP，和5mM Mg(OAc)2，在30℃持续30分钟。将该反应用EDTA(终浓度50mM)猝灭以产生LAP-吡啶甲基叠氮化物加合物，并且在Varian Prostar HPLC上使用反相C18Microsorb-MV100柱(250×4.6mm)分析。在210nm记录色谱图。使用水中30-60%乙腈伴以0.1%三氟乙酸，流速1ml/分钟的10分钟梯度。图20显示这些色谱图。LAP具有7.5分钟停留时间；与吡啶甲基叠氮化物连接，停留时间增加至11分钟。数据显示W37VlplA催化吡啶甲基叠氮化物连接至LAP。
细胞培养
将人胚胎肾(HEK)细胞在补充有10%v/v胎牛血清(PAALaboratories)的最低基本培养基(MEM，Mediatech)中培养。
对于海马神经元培养物，将Spague Dawley大鼠幼崽在第18胚胎日处死。将海马组织用木瓜蛋白酶(Worthington)和DNA酶I(Roche)消化并涂布于用在含有L-谷氨酰胺的MEM(Sigma)中的聚-D-赖氨酸(Sigma)和小鼠层粘连蛋(Life Technologies)预处理的玻璃盖玻片上，所述MEM补充有10%v/v胎牛血清(PAA Laboratories)和B27(LifeTechnologies)。在体外3日后，将一半生长培养基替换为补充有B27和GlutaMAX(Life Technologies)的神经基础培养基(LifeTechnologies)。
基因构建体
以下构建体的完整核苷酸序列是本领域已知的：pYFJ16中用于在大肠杆菌中表达的LplA变体；pDisplay中的LAP-CFP；pECFP-N1中的LAP-neurexin-1β；和pNICE中的LAP-neuroligin-1。
成像.
荧光成像。对于图21和图22，细胞在Tyrode缓冲液或DPBS中以落射荧光或共聚焦模式成像。对于落射荧光成像，我们使用具有40x浸油物镜的Zeiss AxioObserver倒置显微镜。使用Slidebook软件(Intelligent Imaging Innovations)采集和分析CFP(420Y20激发，425双色，475Y40发射)、Alexa Fluor
Figure BDA00003765945201361
647(630Y20激发，660双色，680Y30发射)、鉴别干涉对比(DIC)图像。对于共聚焦成像，我们使用具有40x浸油物镜的Zeiss Axiovert 200M倒置显微镜。这种显微镜配备Yokogawa转盘式共聚焦光头、四通带陷波二向色镜(405Y488Y568Y647)、和491(DPSS)、561nm(DPSS)、640nm(DPSS)激光(均为50mW)。使用Slidebook软件采集YFP/Alexa488(491激光激发，528Y38发射)、AlexaFluor
Figure BDA00003765945201363
568(561激光激发，617Y73发射)、AlexaFluor647(640激光激发，680/30发射)和DIC图像。每个实验中的荧光图像相对于相同的强度范围标准化。获取时间范围从10-1000毫秒。
采用PRIME方法随后采用螯合作用辅助的铜(I)催化的叠氮 化物-炔环加成反应的细胞表面蛋白质标记的一般方案。
人胚胎肾(HEK)细胞在大约80%汇合度时（confluency）使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用LAP标记的neurexin-1β(对于0.95cm2培养皿，400ng)和黄荧光蛋白标记的组蛋白2B蛋白(H2B-YFP；100ng)的表达质粒转染。转染后24小时，将细胞用细胞生长培养基中10μM纯化的W37VLplA、200μM上文产生的5-(6-(叠氮甲基)烟酰胺基)戊酸、1mM ATP和5mM Mg(OAc)2在室温处理20分钟。在已经通过迅速替换培养基2-3次移除过量LplA标记试剂后，将细胞进一步用DPBS中的20μM Alexa Fluor
Figure BDA00003765945201365
647-炔、50μMCuSO4、250μM THPTA和2.5mM抗坏血酸钠在室温进一步标记5分钟。在用新鲜生长培养基洗涤2-3次移除过量的CuAAC标记试剂后将细胞立即成像。
图21显示螯合作用辅助的铜(I)催化的叠氮化物-炔环加成反应的结果，所述环加成反应用于将Alexa Fluor
Figure BDA00003765945201371
647标记到活HEK细胞中的neurexin上。用省略ATP(第二列)或野生型LplA替代W37VLplA(第三列)来显示阴性对照。H2B-YFP是核定位的YFP转染标记。用省略ATP(第二列)或野生型LplA替代W37VLplA(第三列)来显示阴性对照。H2B-YFP是核定位的YFP转染标记。显示共聚焦图像。全部图像的标尺长度为10μm。
用PRIME标记解离的活神经元中的LAP-neuroligin-1随后进 行螯合作用辅助的CuAAC。
使用Lipofectamine2000，利用制造商推荐试剂量的一半量，将神经元在第5日在体外用LAP标记的neuroligin-1(500ng用于1.9cm2培养皿)和绿色荧光蛋白标记的Homer1b(Homer-GFP；100ng用于1.9cm2培养皿)的表达质粒转染。将神经元在第11日在体外用预处理的补充的神经基础培养基中10μM纯化的W37VLplA、200μM上文产生的5-(6-(叠氮甲基)烟酰胺基)戊酸、1mM ATP和5mMMg(OAc)2在37℃标记20分钟。在补充的预处理的培养基中简单淋洗后，将神经元进一步用Tyrodes缓冲液中的20μM AlexaFluor
Figure BDA00003765945201372
647-炔、50μM Tempol、50μM CuSO4、250μM THPTA和2.5mM抗坏血酸钠在室温在标记5分钟。将标记溶液随后替换为补充的含有500μM磺酸浴酮灵的神经基础培养基，所述神经基础培养基与神经元温育30秒。用补充的神经基础培养基进一步洗涤2次后，将神经元在Tyrode缓冲液中活体成像。
图22显示螯合作用辅助的铜(I)催化的叠氮化物-炔环加成反应，用于将Alexa Fluor
Figure BDA00003765945201373
647标记到活海马神经元中的neuroligin-1上。表达LAP-neuroligin-1和GFP标记的Homer1b的DIV11(在体外11日)的大鼠海马神经元借助W37VLplA用5-(6-(叠氮甲基)烟酰胺基)戊酸标记，随后借助螯合作用催化的铜(I)催化的叠氮化物-炔环加成反应用Alexa Fluor
Figure BDA00003765945201381
647-炔标记，并且在简单淋洗后活体成像。标记条件与采用PRIME方法用于细胞表面蛋白质标记的以上一般方案中相同，除了：1)对于底部行使用更高的300μM[CuSO4]；2)将基清除剂Tempol(50μM)添加至CuAAC标记溶液；和3)在第一次淋洗期间使用生物相容性铜螯合剂磺酸浴酮灵(500μM)以立即猝灭点击反应。第二列中的Alexa 
Figure BDA00003765945201382
647图像对应于加框的区域1和2，以更高放大率显示。白色箭头指示使用300μM CuSO4时局部肿胀的区域。显示共聚焦图像。全部图像的标尺长度为10μm。

Claims (66)

1.一种下式的化合物：
Figure FDA00003765945100011
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
R1、R2、R3和R4独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或者选自R1、R2、R3和R4的两个取代基，其中所述至少两个取代基的每一个处在不同的碳原子上，共同形成稠合部分，所述稠合部分选自环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且全部的剩余取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或者剩余取代基中的至少两个共同形成稠合部分，所述稠合部分选自环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且任何剩余的取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
R5和R6独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；
选自R1、R2、R3、R4、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外的荧光团结合的报告分子、载体分子、固相、治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合处于以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是独立单一的共价键或Z是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-10个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、碳-氧键和碳-硫键的任何组合组成，所述组合处于直链或支链烷基或杂烷基的形式；并且
G是选自叠氮反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有下式：
3.根据权利要求2所述的化合物，其中所述化合物具有下式：
Figure FDA00003765945100042
4.根据权利要求2所述的化合物，其中所述化合物具有下式：
Figure FDA00003765945100043
其中
R2、R3、R4和R7至R12独立地选自氢、卤素、--SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或者选自R2、R3、R4和R7至R12的两个取代基，其中所述两个取代基处在不同的碳原子上，共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且全部的剩余取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或剩余取代基中的两个也共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且剩余取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或R7至R12，其中所述两个取代基处于相同的碳原子上，共同形成选自烷基或杂烷基的螺环部分，所述螺环部分进一步任选地用卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基取代；
选自R1、R2、R3、R4、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外的荧光团结合的报告分子、载体分子、固相、治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；并且
G选自叠氮反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
5.一种下式的化合物：
其中：
R1、R2、R3和R4独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或选自R1、R2、R3和R4的两个取代基共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且剩余的两个取代基也共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，或剩余两个取代基独立地选自：氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
R5和R6独立地选自氢、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或
选自R1、R2、R3、R4、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外的荧光团结合的报告分子、载体分子、固相或治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合处于以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
A是碳，并且R5和R6独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次，或者A、R5和R6不存在；
B选自O、S和NR7，其中R7选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基以及X-L，其中：
X选自任选地与一个或多个额外的荧光团结合的报告分子、载体分子、固相、治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是独立单一的共价键或Z是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-10个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、碳-氧键和碳-硫键的任何组合组成，所述组合为直链或支链烷基或杂烷基的形式；并且
G选自叠氮反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
6.一种下式的化合物：
Figure FDA00003765945100101
Figure FDA00003765945100111
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
R1、R2、R3和R4独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；
R5和R6独立地选自氢、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或
选自R1、R2、R3和R4的两个取代基，其中所述两个取代基处在不同的碳原子上，共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且剩余的取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或
选自R1、R2、R3、R4、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外的荧光团结合的报告分子、载体分子、固相或治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
B、C、D和E选自O、S和N，其中N进一步由R7、R8或R9取代，其中R7、R8或R9选自氢、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、取代的杂芳基和X-L，其中：
X选自任选地与一个或多个额外的荧光团结合的报告分子、载体分子、固相或治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是独立单一的共价键或Z是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-10个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键，碳-氮键、碳-氧键和碳-硫键的任何组合组成，所述组合为具有1-10个原子的链长度的直链或支链烷基或杂烷基的形式，或不存在；并且
G选自叠氮反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中所述化合物具有式(VI)，并且R1、R2、R3和R4独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基，烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或R1与R2、R2与R3、R3与R4共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且R5和R6独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基。
8.一种下式的化合物：
Figure FDA00003765945100151
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
R1、R2和R3独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；
R5和R6独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或
选自R1、R2、R3、R5和R6的两个取代基，其中所述两个取代基处于不同的碳原子，共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且剩余的取代基选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
选自R1、R2、R3、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外的荧光团结合的报告分子、载体分子、固相或治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是独立单一的共价键或Z是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-10个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键，碳-氮键、碳-氧键和碳-硫键的任何组合组成，所述组合为具有1-10个原子的链长度的直链或支链烷基或杂烷基的形式，或不存在；并且
G是选自叠氮反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
9.一种下式的化合物：
Figure FDA00003765945100171
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
R1和R2独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基，和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基，和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；
R5和R6独立地选自氢、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或
选自R1、R2、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外的荧光团结合的报告分子、载体分子、固相或治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是独立单一的共价键或Z是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-10个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键，碳-氮键、碳-氧键和碳-硫键的任何组合组成，所述组合为具有1-10个原子的链长度的直链或支链烷基或杂烷基的形式，或不存在；并且
G是选自叠氮反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
10.一种下式的化合物：
Figure FDA00003765945100191
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
m和n是1和4之间的整数；
B是O或S，并且R3和R4不存在，或N和R3或R4不存在；
R7选自氢、烷基、杂烷基、取代的烷基和取代的杂烷基；
R1、R2、R3、R4、每个R′和每个R″独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；
或选自R1、R2、R3、R4、R′和R″的两个取代基，其中所述两个取代基处在不同的碳原子上、共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且全部的剩余取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或剩余取代基中的两者也共同形成选自以下的稠合部分：环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且剩余的取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
其中，R5和R6独立地选自氢、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或
选自R1、R2、R3、R4、R5、R6、R′和R″的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外的荧光团结合的报告分子、载体分子、固相或治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是独立单一的共价键或Z是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-10个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键，碳-氮键、碳-氧键和碳-硫键的任何组合组成，所述组合为具有1-10个原子的链长度的直链或支链烷基或杂烷基的形式，或不存在；并且
G是选自叠氮反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄。
11.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中除一个R取代基之外，全部R取代基均是H。
12.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中L是具有0至15个原子的链长度的烷基。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中L是具有0至5个原子的链长度的烷基。
14.根据权利要求12所述的化合物，其中L是-NH-(CH2)n-NH-C(O)-，其中n是1至12。
15.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述报告分子包括发色团、荧光团、荧光蛋白、磷光染料、叠层染料、粒子、半抗原、酶或放射性同位素。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中所述荧光团是呫吨、香豆素、花青、芘、噁嗪、borapolyazaindacene或carbopyranine。
17.根据权利要求15所述的化合物，其中所述酶是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或β-内酰胺酶。
18.根据权利要求15所述的化合物，其中所述粒子是半导体纳米晶体。
19.根据权利要求1至14中任一项所述的化合物，其中所述载体分子是氨基酸、肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组合体、酪胺、合成聚合物、聚合物微粒子、生物细胞、细胞组分、离子螯合部分、酶底物或病毒。
20.根据权利要求1至14中任一项所述的化合物，其中所述载体分子是抗体、抗体片段、抗原、抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、葡聚糖、IgG结合蛋白、荧光蛋白、琼脂糖或非生物微粒子。
21.根据权利要求1至14中任一项所述的化合物，其中所述固相支持物是气凝胶、水凝胶、树脂、珠、生物芯片、微流体芯片、硅芯片、多孔板、膜、传导性金属、非传导性金属、玻璃或磁性支持物。
22.根据权利要求1至14中任一项所述的化合物，其中所述固相支持物是硅胶、聚合物膜、粒子、衍生化塑料薄膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、氧化铝凝胶、多糖、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、多元醇、琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、淀粉、FICOLL、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊糖、硝酸纤维素、重氮纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、尼龙、胶乳珠、磁珠、顺磁珠、超顺磁珠或淀粉。
23.根据权利要求1至14中任一项所述的化合物，其中所述治疗性分子是紫杉酚、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、或其类似物或同系物。
24.根据权利要求1至14中任一项所述的化合物，其中所述治疗性分子是抗代谢物、烷基化剂、蒽环类、抗生素或抗有丝分裂药。
25.根据权利要求1至14中任一项所述的化合物，其中所述治疗性分子是相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、白喉毒素、肿瘤坏死因子、γ-干扰素、α-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、白介素-1、白介素-2、白介素-6、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子或粒细胞集落刺激因子。
26.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中G是炔反应基。
27.根据权利要求26所述的化合物，其中所述炔反应基是叠氮化物。
28.根据权利要求1至25中任一项所述的化合物，其中G是叠氮化物反应基。
29.根据权利要求28所述的化合物，其中所述叠氮化物反应基是末端炔。
30.修饰生物分子的方法，其包括以下步骤：在溶液中使包含叠氮化物反应性部分的生物分子与根据权利要求24所述的化合物反应以提供修饰的生物分子。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述叠氮化物反应性部分包括末端炔、活化炔或三芳基膦。
32.修饰生物分子的方法，其包括以下步骤：在溶液中使包含炔反应性部分的生物分子与根据权利要求26所述的化合物反应以提供修饰的生物分子。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述炔反应性部分包含叠氮化物。
34.根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述生物分子是核酸、寡核苷酸、蛋白质、肽、糖类、多糖、糖蛋白、脂质、激素、药物或前药。
35.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述溶液还包含铜离子。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述方法还包含至少一个还原剂。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中所述方法还包含铜螯合剂。
38.根据权利要求36所述的方法，其中至少一种还原剂是抗坏血酸、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、TCP(2,4,6-三氯酚)、NADH、NADPH、硫代硫酸盐、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、半胱氨酸、金属铜、醌、氢醌、维生素K1、Fe2+、Co2+或施加的电势。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述至少一种还原剂是抗坏血酸。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述铜螯合剂是铜I螯合剂。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述铜螯合剂是下式的化合物：
Figure FDA00003765945100271
其中X、Y和Z各自独立地具有下式：
Figure FDA00003765945100272
其中：
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、烷氧基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；并且
B、C、D和E是C或N；并且
L1、L2和L3是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-5个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基和取代的杂环烷基。
42.根据权利要求41所述的方法，其中选自X、Y和Z的至少一种取代基的R1、R2、R3、R4和R5各自是H。
43.根据权利要求42所述的方法，其中X、Y和Z的每一个的R1、R2、R3、R4和R5各自是H。
44.根据权利要求41所述的方法，其中L1、L2和L3各自是具有1-5个原子的链长度的烷基。
45.根据权利要求44所述的方法，其中L1、L2和L3各自是-CH2CH2-。
46.根据权利要求37所述的方法，其中所述铜螯合剂是N,N,N′,N′-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)、EDTA、新亚铜试剂、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)、吡啶-2,6-二羧酸(PDA)、S-羧甲基-L-半胱氨酸(SCMC)、1,10菲咯啉、或其衍生物、曲恩汀、谷胱甘肽、组氨酸、聚组氨酸、三(羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)或四乙撑多胺(TEPA)。
47.根据权利要求37所述的方法，其中所述铜螯合剂是1,10菲咯啉、红菲绕啉二磺酸(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸)或浴酮灵二磺酸(2,9-二甲基-4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸盐)。
48.试剂盒，其包含根据权利要求1至29中任一项所述的化合物。
49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含铜离子源。
50.根据权利要求48或权利要求49所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含至少一种还原剂。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含铜螯合剂。
52.根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述至少一种还原剂是抗坏血酸、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、TCP(2,4,6-三氯苯酚)、NADH、NADPH、硫代硫酸盐、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、半胱氨酸、金属铜、醌、氢醌、维生素K1、Fe2+、Co2+或施加的电势。
53.根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述至少一种还原剂是抗坏血酸。
54.根据权利要求51所述的试剂盒，其中所述铜螯合剂是铜I螯合剂。
55.根据权利要求51所述的试剂盒，其中述铜螯合剂是下式的化合物：
Figure FDA00003765945100301
其中X、Y和Z各自独立地具有下式：
Figure FDA00003765945100302
其中：
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基羧酰胺基，烷基芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；并且
B、C、D和E是C或N；并且
L1、L2和L3是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-5个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基和取代的杂环烷基。
56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中选自X、Y和Z的至少一种取代基的R1、R2、R3、R4和R5各自是H。
57.根据权利要求56所述的试剂盒，其中X、Y和Z的每一个的R1、R2、R3、R4和R5各自是H。
58.根据权利要求55所述的试剂盒，其中L1、L2和L3各自是具有1-5个原子的链长度的烷基。
59.根据权利要求58所述的试剂盒，其中L1、L2和L3各自是-CH2CH2-。
60.根据权利要求51所述的试剂盒，其中所述铜螯合剂是N,N,N′,N′-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)、EDTA、新亚铜试剂、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)、吡啶-2,6-二羧酸(PDA)、S-羧甲基-L-半胱氨酸(SCMC)、1,10菲咯啉或其衍生物、曲恩汀、谷胱甘肽、组氨酸、聚组氨酸、三(羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)或四乙撑多胺(TEPA)。
61.根据权利要求51所述的方法，其中所述铜螯合剂是1,10菲咯啉、红菲绕啉二磺酸(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸)或浴酮灵二磺酸(2,9-二甲基-4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸盐)。
62.根据权利要求1所述的化合物，它们选自：
Figure FDA00003765945100321
63.根据权利要求6所述的化合物，其是
Figure FDA00003765945100342
64.根据权利要求12所述的化合物，其是
Figure FDA00003765945100343
65.一种化合物，其选自：
Figure FDA00003765945100351
Figure FDA00003765945100361
66.一种组合物，其包含：
(a)下式的化合物：
Figure FDA00003765945100362
其中：
A是碳，或A、R5和R6不存在；
R1、R2、R3和R4独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；或者选自R1、R2、R3和R4的两个取代基，其中所述至少两个取代基的每一个处在不同的碳原子上，共同形成稠合部分，所述稠合部分选自环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且全部的剩余取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；或者剩余取代基中的至少两个共同形成稠合部分，所述稠合部分选自环烷基、杂环烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基，并且任何剩余的取代基独立地选自氢、卤素、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
R5和R6独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基，烷基和芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、肼、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；
选自R1、R2、R3、R4、R5和R6的至少一个取代基包含X-L-，其中：
X选自任选地与一个或多个额外的荧光团结合的报告分子、载体分子、固相、治疗性分子，如肽、蛋白质、抗体、多糖、核酸聚合物、离子络合部分、脂质或非生物有机聚合物或聚合物微粒子或纳米粒子；或
X是一种反应基，如羧酸、活化的羧酸酯、胺、肼、卤代乙酰胺、烷基卤、异硫氰酸酯或马来酰亚胺基；并且
L是独立单一的共价键或L是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-24个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基；
Z是独立单一的共价键或Z是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-10个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、碳-氧键和碳-硫键的任何组合组成，所述组合为直链或支链烷基或杂烷基链的形式；并且
G是选自叠氮反应基、炔反应基和膦反应基的化学柄；和
(b)下式的化合物：
Figure FDA00003765945100391
其中X、Y和Z各自独立地具有下式：
Figure FDA00003765945100392
其中：
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢、卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基羧酰胺基，烷基芳基部分任选地由卤素、-SO3X、羧酸、羧酸的盐、CN、硝基、羟基、氨基、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、烷基硫基、烷酰基氨基、烷氨基羰基、芳基、杂芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基和取代的杂芳基、芳基羧酰胺基取代一次或多次；并且
B、C、D和E是C或N；并且
L1、L2和L3是共价的连接基团，所述共价的连接基团具有1-5个选自C、N、O、P和S的非氢原子并且由单一、双重、叁重或芳族碳-碳键、碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键和磷-氮键的任何组合组成，所述组合为以下形式：烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基和取代的杂环烷基。
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