CN117777151A - 一种af594tsa的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于荧光染料制备技术领域，具体涉及一种AF594TSA的制备方法。本发明从商业可得的7‑甲氧基‑2,2,4‑三甲基‑1,2‑二氢喹啉出发，经过关键步骤与偏苯三酸酐缩合，甲基磺酸化以及与酪胺的缩合反应，实现AF594TSA的高效制备。本发明首次实现了AF594TSA的克级制备，反应条件简单，反应过程中减少了重金属/贵金属、强酸的使用，避免了对反应仪器的依赖如微波反应釜，能够以更廉价便捷的合成路线合成AF594TSA。
Description
技术领域
本发明属于荧光染料制备技术领域，具体涉及一种AF594TSA的制备方法。
背景技术
荧光探针(Fluorescent Probes)是生物化学研究的重要工具，它是一种可以用来检测和跟踪活细胞中的某种物质的技术。荧光探针的应用非常广泛，它可以用来检测和分析活细胞中的多种物质，包括蛋白质、糖、氨基酸、核酸、脂质等。荧光探针还可以用来检测细胞内的活性，比如细胞凋亡、增殖、分化和迁移等，从而利用荧光探针来研究活细胞中物质的代谢变化，以及细胞对外界刺激的反应。
尽管荧光染料的应用多种多样，常规染料在生物应用中存在一定的局限性。第一，传统的染料容易出现二聚体形成的自猝灭现象；第二，典型的发射带常规染料的半宽度约为40-80nm，当使用这些传统的染料进行多路复用应用时，很难找到一组发射光谱可分辨的染料；第三，传统染料的低荧光量子产率降低了检测灵敏度。这些都限制了传统染料的应用。
AF594TSA是一种荧光探针，常用于生物研究中作为免疫荧光染色的一种试剂。它具有良好的灵敏度、良好的特异性和光稳定性等特点，可以与抗体结合，在细胞和组织中产生强烈的荧光信号，用于检测和定位蛋白质、核酸等生物分子。AF594TSA在荧光显微镜下发出红色荧光，具有较高的淬灭常数，因此可以进行多重荧光染色。此外，AF594TSA还可以用于流式细胞术、荧光免疫分析、酶联免疫组织化学等研究领域，具有很强的荧光信号，可以与抗体结合，将抗体标记的蛋白质或细胞可视化。同时，AF594TSA还具有较高的光稳定性，可以长时间观察细胞荧光信号，并且具有较好的细胞膜通透性，可以用于细胞内检测。
2009年，德国马克斯-普朗克生物物理化学研究所Stefan W. Hell教授合成出新型罗丹明荧光染料，并将其作为光活化标签用于定位研究，以及对各种生物体进行精确到几十纳米的成像，实现了多色染色、良好的光激活、大量发射光子和选择性化学结合。随后，该小组优化筛选了具有强烈红色荧光、两个极性残基（羟基、伯磷酸盐或磺酸基团）以及更高的氨基活性位点水解稳定性（NHS酯或混合N-琥珀酰亚胺基碳酸盐）的新型罗丹明的合成、反应活性和光物理特性，所有荧光团都含有一个N-烷基-1,2-二氢-2,2,4-三甲基喹啉片段。
2019年，美国专利US10513610B1描述了可用作荧光探针的被磺酸或磺酸盐取代一次或多次的4,7-二氯罗丹明染料，该专利的染料任选地具有可用于制备荧光缀合物的反应性基团。此外，该发明的染料具有更高的水溶性、改进的荧光量子产率和改进的光稳定性。并且，使用该专利的染料制备的标记生物分子显示出显著减少的二聚体形成。
波特兰州立大学化学系Robert M. Strongin等人根据分子力学设计了一系列几何形状明确的阳离子荧光团，它们含有双芳基连接体，以增强刚性，防止共轭生物分子与荧光团之间发生分子内折叠。该结构同样与AF594TSA染色剂具有相同的骨架，具有很强的荧光信号用于细胞检测实验。
上述多种方法合成具有相同骨架（N-烷基-1,2-二氢-2,2,4-三甲基喹啉季铵盐）荧光基团，与AF594TSA的基本骨架一致。但现有的合成路线中，所需贵金属铋等，还有氢溴酸、多聚磷酸等试剂的使用不符合绿色化学合成，或需要使用微波反应器等条件所限，难以放大合成。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种AF594TSA的制备方法，该方法首次实现AF594TSA的克级制备。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种AF594TSA的制备方法，按如下合成路线制备：
其中，步骤1具体包括：
将化合物1溶于溶剂中，在氮气或惰性气体氛围下加入碳酸铯和碘甲烷，于90℃下反应1h得到化合物2；
步骤2具体包括：
将步骤1所得化合物2溶于溶剂中，在0℃下加入三溴化硼后移至室温下反应过夜得到化合物3；
步骤3具体包括：
将化合物3和化合物4溶于溶剂中，在氮气或惰性气体氛围下190℃反应过夜得到化合物5；
步骤4具体包括：
在0℃下，氮气或惰性气体氛围中将化合物5与浓硫酸混合，然后移至室温环境反应6h得到化合物6；
步骤5具体包括：
在氮气或惰性气体氛围中将化合物6和HATU溶于溶剂中，0℃下加入DIPEA并混匀，再向体系中加入酪胺的DMF溶液，然后移至室温环境反应2h得到AF594TSA。
优选的，步骤1中所述溶剂为DMF，化合物1、碳酸铯和碘甲烷的摩尔比为10:5.6:38。
优选的，步骤2中所述溶剂为二氯甲烷，步骤1中化合物1与步骤2中三溴化硼的摩尔比为2:3。
优选的，步骤3中所述溶剂为邻二氯苯，化合物3与化合物4的摩尔比为2:1。
优选的，步骤4中所述浓硫酸的浓度为80%，化合物5与浓硫酸的用量比为1.8mol:10L。
优选的，步骤5中所述溶剂为DMF，化合物6、HATU、DIPEA和酪胺的摩尔比为1:1.6:4:1.2。
优选的，步骤1所述于90℃下反应1h后还包括：用LCMS检测反应完全后将反应液倒入冰水中淬灭，用乙酸乙酯萃取并用饱和食盐水洗涤，合并有机相用无水硫酸钠干燥，旋干后得到化合物2。
优选的，步骤2所述加入三溴化硼后移至室温下反应过夜后还包括：用LCMS检测反应完全后在0℃下加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭，用二氯甲烷萃取，旋干有机相后经柱层析分离纯化得到化合物3。
优选的，步骤3所述在氮气或惰性气体氛围下190℃反应过夜后还包括：将反应体系冷却至室温后加入乙醚析出固体，将固体抽滤并用乙醚洗涤后重新溶于甲醇中，再经硅胶柱层析分离纯化后得化合物5。
优选的，步骤4所述室温环境反应6h后还包括：用LCMS检测反应完全后将反应液加入到冰二氧六环中，再缓慢加入水稀释并用三乙胺中和未反应的硫酸，随后将得到的反应液用硅胶柱分离纯化，纯化后冻干即得到化合物6。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明从商业可得的7-甲氧基-2,2,4-三甲基-1,2-二氢喹啉出发，经过关键步骤与偏苯三酸酐缩合，甲基磺酸化以及与酪胺的缩合反应，实现AF594TSA的高效制备。
（2）本发明首次实现了AF594TSA的克级制备，反应条件简单，反应过程中减少了重金属/贵金属、强酸的使用，避免了对反应仪器的依赖如微波反应釜，能够以更廉价便捷的合成路线合成AF594TSA。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例AF594TSA的合成路线。
图2为本发明实施例合成的化合物6的核磁图谱。
图3为本发明实施例合成的AF594TSA的核磁图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
实施例
如图1所示，本实施例提供一种AF594TSA的制备方法，按如下步骤进行：
步骤1：称取化合物1(7-甲氧基-2,2,4-三甲基-1,2-二氢喹啉，2g，10mmol)溶于10mL的DMF中，在氮气氛围下分别加入碳酸铯(1.8g，5.6mmol)和碘甲烷(5.4g，38mmol)，于90℃下反应1小时，用LCMS检测反应完全后将反应液倒入冰水中淬灭，用乙酸乙酯萃取并用饱和食盐水洗涤，合并有机相用无水硫酸钠干燥，旋干后得到棕色油状物为化合物2粗品，无需纯化可直接用于下一步。
步骤2：将步骤1所得化合物2粗品重新溶于干燥二氯甲烷中，在0℃下缓慢滴加三溴化硼(15mL，15mmol，1 M in DCM)，滴加完毕后移至室温下搅拌过夜，用LCMS检测反应完全后，0℃下加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭，二氯甲烷萃取，旋干有机相后经柱层析分离纯化得到灰色固体为化合物3(1.5g，产率75%)。
步骤3：称取化合物3(1g，5mmol)和化合物4(偏苯三酸酐，0.48g，2.5mmol)溶于3mL邻二氯苯中，在氮气氛围下加热至190℃搅拌过夜，冷却至室温后加入20mL乙醚析出固体，将固体抽滤并用乙醚洗涤后重新溶于少量甲醇中，再经硅胶柱层析(DCM/MeOH 10:1- 2:1)分离纯化后得到蓝紫色粉末状固体未化合物5(0.8g，产率57%)。
重复以上步骤合成得到1.6g化合物5。
步骤4：称取化合物5(1g，1.8mmol)于反应瓶中并使之充满氮气，在0℃下缓慢加入10mL浓度80%的浓硫酸，然后移至室温继续反应6小时，经LCMS检测反应完全后将反应液加入到冰二氧六环中，再缓慢加入水稀释，并加入三乙胺中和未反应的硫酸，随后将得到的反应液用C-18硅胶柱分离纯化，洗脱液为50%-95%乙腈/水(0.1%甲酸)，纯化后冻干得到蓝紫色固体未化合物6(0.75g，产率60%)。
所得化合物6的核磁图谱如图2所示，1H NMR (400 MHz, Methanol-d4) δ 8.84(s, 1H), 8.41 (dd, J = 7.9, 1.8 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.14 (s,2H), 6.76 (s, 2H), 5.86 (s, 2H), 3.71 – 3.51 (m, 4H), 3.13 (s, 6H), 1.52 (s,6H), 1.50 (s, 6H)。
步骤5：反应瓶中，称取化合物6(0.75g，1mmol)和HATU(2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，0.59g，1.6mmol)溶于15mL的DMF中并使之充满氮气，在0℃下加入DIPEA(N,N-二异丙基乙胺，0.54g，4mmol)，搅拌十分钟后，将酪胺(0.17g，1.2mmol)溶于5mL的DMF得到酪胺的DMF溶液加入到反应体系中；然后移至室温后继续反应2小时，经LCMS检测反应完全后用C-18硅胶柱分离纯化，洗脱液为50%-95%乙腈/水(0.1%甲酸)，纯化后冻干得到蓝紫色固体为终产物AF594TSA(0.7g，产率80%)。
终产物核磁图谱如图3所示，表明本发明成功合成了AF594TSA。1H NMR (600 MHz,Methanol-d4) δ 8.65 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.14 (dd, J = 7.9, 1.8 Hz, 1H), 7.49(d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.18 (s, 2H), 7.14 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.80 (s, 2H),6.76 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.88 (s, 2H), 3.69 (d, J = 14.1 Hz, 2H), 3.63 –3.55 (m, 4H), 3.17 (s, 6H), 2.89 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.55 (s, 6H), 1.53 (s,6H)。
本发明从商业可得的7-甲氧基-2,2,4-三甲基-1,2-二氢喹啉出发，经过关键步骤与偏苯三酸酐缩合，甲基磺酸化以及与酪胺的缩合反应，实现AF594TSA的高效制备。
本发明首次实现了AF594TSA的克级制备，反应条件简单，反应过程中减少了重金属/贵金属、强酸的使用，避免了对反应仪器的依赖如微波反应釜，能够以更廉价便捷的合成路线合成AF594TSA。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种AF594TSA的制备方法，其特征在于，按如下合成路线制备：
其中，步骤1具体包括：
将化合物1溶于溶剂中，在氮气或惰性气体氛围下加入碳酸铯和碘甲烷，于90℃下反应1h得到化合物2；
步骤2具体包括：
将步骤1所得化合物2溶于溶剂中，在0℃下加入三溴化硼后移至室温下反应过夜得到化合物3；
步骤3具体包括：
将化合物3和化合物4溶于溶剂中，在氮气或惰性气体氛围下190℃反应过夜得到化合物5；
步骤4具体包括：
在0℃下，氮气或惰性气体氛围中将化合物5与浓硫酸混合，然后移至室温环境反应6h得到化合物6；
步骤5具体包括：
在氮气或惰性气体氛围中将化合物6和HATU溶于溶剂中，0℃下加入DIPEA并混匀，再向体系中加入酪胺的DMF溶液，然后移至室温环境反应2h得到AF594TSA。
2.根据权利要求1所述AF594TSA的制备方法，其特征在于，步骤1中所述溶剂为DMF，化合物1、碳酸铯和碘甲烷的摩尔比为10:5.6:38。
3.根据权利要求1所述AF594TSA的制备方法，其特征在于，步骤2中所述溶剂为二氯甲烷，步骤1中化合物1与步骤2中三溴化硼的摩尔比为2:3。
4.根据权利要求1所述AF594TSA的制备方法，其特征在于，步骤3中所述溶剂为邻二氯苯，化合物3与化合物4的摩尔比为2:1。
5.根据权利要求1所述AF594TSA的制备方法，其特征在于，步骤4中所述浓硫酸的浓度为80%，化合物5与浓硫酸的用量比为1.8mol:10L。
6.根据权利要求1所述AF594TSA的制备方法，其特征在于，步骤5中所述溶剂为DMF，化合物6、HATU、DIPEA和酪胺的摩尔比为1:1.6:4:1.2。
7.根据权利要求1所述AF594TSA的制备方法，其特征在于，步骤1所述于90℃下反应1h后还包括：用LCMS检测反应完全后将反应液倒入冰水中淬灭，用乙酸乙酯萃取并用饱和食盐水洗涤，合并有机相用无水硫酸钠干燥，旋干后得到化合物2。
8.根据权利要求1所述AF594TSA的制备方法，其特征在于，步骤2所述加入三溴化硼后移至室温下反应过夜后还包括：用LCMS检测反应完全后在0℃下加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭，用二氯甲烷萃取，旋干有机相后经柱层析分离纯化得到化合物3。
9.根据权利要求1所述AF594TSA的制备方法，其特征在于，步骤3所述在氮气或惰性气体氛围下190℃反应过夜后还包括：将反应体系冷却至室温后加入乙醚析出固体，将固体抽滤并用乙醚洗涤后重新溶于甲醇中，再经硅胶柱层析分离纯化后得化合物5。
10.根据权利要求1所述AF594TSA的制备方法，其特征在于，步骤4所述室温环境反应6h后还包括：用LCMS检测反应完全后将反应液加入到冰二氧六环中，再缓慢加入水稀释并用三乙胺中和未反应的硫酸，随后将得到的反应液用硅胶柱分离纯化，纯化后冻干即得到化合物6。
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