KR20190043711A

KR20190043711A - 형광 화합물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20190043711A
Application number: KR1020170135622A
Authority: KR
Inventors: 박진우; 김기원; 신경림
Original assignee: (주)바이오액츠
Priority date: 2017-10-19
Filing date: 2017-10-19
Publication date: 2019-04-29
Also published as: KR102112719B1

Abstract

본 발명의 목적은 형광강도, 상대양자효율, 표지율 면에서 우수하여 조영제 조성물로도 이용될 수 있는 형광 화합물, 이를 이용한 표지방법 등을 제공하고자 한다. 본 발명에 따른 형광 화합물은 형광강도, 상대양자효율, 표지율 면에서 우수하여 타겟 물질의 표지 및 염색에 보다 효과적으로 활용될 수 있다. 또한, 광학 안정성이 우수하여 장시간의 염색에도 안정적 형광을 나타내며, 체내에 투여시 축적되지 않으면서도 형광 강도가 우수하여 종래의 염료에 비하여 소량의 사용에도 염색 및 체내 영상화가 용이하여 경제적으로 이용이 가능하다.

Description

형광 화합물 및 이의 제조방법{Fluorescence Compounds and Preparation Method Therof}

본 발명은 형광 화합물에 관한 것이다.

생체 물질 자체는 가시광 및 근적외 영역의 형광이 미약하거나 없으므로 바이오 분야에서는 생체 내/외에서 세포 및 세포 이하 단계에서의 생물학적인 현상을 관찰하거나 생체 내로 투영되어 조영 및 질환부위의 광학 영상을 얻기 위하여 생체 물질에 형광 염료 또는 형광 염료가 미리 표지된 특정 생체 물질을 광학장비와 함께 활용하는 다양한 기법을 통해 영상화한 자료를 얻고 있다.

바이오 분야에서 사용되는 다양한 광학 분석(optical anylsis) 장비들은 내장된 광원 및 필터에 따라 형광을 관찰하기에 적합한 여기 파장(excitation wavelength) 및 형광 파장(emission wavelength)를 가진 형광 염료를 기본 소재나 시약으로 선택하게 된다.

주로 사용되는 광학 분석 장비로는 세포 관찰을 위한 형광현미경(fluorescece microscope), 공초점현미경(confocal microscope), 유세포분석기(flowcytometer), 마이크로어레이(microarray), 정량 중합효소연쇄반응 장치(qualitative PCR system), 핵산 및 단백질 분리, 분석을 위한 전기영동(electrophoresis) 장치, 실시간 생체내 영상 장비(in vivo imaging system) 등 연구 목적의 장비 외에도, 면역 분석 기법(immnuno assay)이나 PCR 분석 및 통계 기술이 접목된 핵산 및 단백질 진단 키트(또는 바이오칩) 기반 체외 진단(in vitro diagnosis) 장비와 의료 영상 수술(image-guided surgery)을 위한 수술대 및 내시경 장비 등의 진단 및 치료를 위한 것들이 알려져 있으며, 지속적으로 새로운 응용 분야 및 더 높은 수준의 해상도 및 데이터 처리 능력을 가진 장비가 개발되고 있다.

일반적으로 단백질 또는 펩타이드 등 생체 분자의 표지를 위해 사용되는 형광염료(fluorescent dye)는 대부분 안트라닐레이트(anthranilate), 1-알킬틱 이소인돌(1-alkylthic isoindoles), 피롤리논(pyrrolinones), 비메인(bimanes), 벤즈옥사졸(benzoxazole), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 벤조퓨란(benzofurazan), 나프탈렌(naphthalenes), 쿠마린(coumarins), 시아닌(cyanine), 스틸벤(stilbenes), 카바졸(carbazoles), 페난트리딘(phenanthridine), 안트라센(anthracenes), 보디피(bodipy), 플로세인(fluoresceins), 에오신(eosins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 크리센(chrysenes) 및 아크리딘(acridines) 등의 구조가 포함되어 있다.

상기에서 예시한 다수의 형광 발색단 중에서 바이오 분야에서 이용 가능한 형광 염료 구조를 선별하는 경우, 일반적으로는 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉, 수용액 및 수용성 버퍼 내에 존재할 때 강한 형광을 내는 것과 형광 장비에 맞는 여기 및 형광 파장을 갖는 것이 중요하다.

바이오 분야에서 주로 적용될 수 있는 염료는 가급적 수용액이나 친수성 조건에서 광표백(photobleaching) 및 소광(quenching) 현상이 적고, 다량의 빛을 흡수할 수 있도록 몰흡광계수(molecular extinction coefficient)가 커야 하며, 생체 분자 자체의 형광 범위와 멀리 떨어진 500 nm 이상의 가시광선 영역이나 근적외선 영역에 있어야 하고, 다양한 pH 조건에서 안정하여야 하나, 상기 제한 사항을 만족할 수 있는 생체 분자 표지용으로 사용 가능한 염료의 구조는 한정되어 있다.

이러한 요구 조건에 부합하는 형광 색원체로는 시아닌, 로다민, 플로세인, 보디피, 쿠마린, 아크리딘, 피렌 유도체들이 있는데, 염료 단독 또는 생체 분자 구조 내의 특정 치환기와 결합이 가능하도록 반응기를 도입시키기도 하며, 그 중 잔텐(xanthane) 계열의 플로세인 및 로다민과, 폴리메틴(polymethine) 계열의 시아닌 유도체 염료 화합물들이 주로 상품화되어 있다.

특히 시아닌 발색단을 가진 염료 화합물은 다양한 흡수/여기 파장의 화합물을 합성하기 용이하다는 장점 외에도, 일반적으로 광학 및 pH 안정성이 탁월하고, 좁은 흡수 및 발광 파장 범위를 가지며, 500 내지 800 nm의 형광 영역을 갖기 때문에 생체 분자의 자체 형광 영역과 중첩되지 않아 분석이 용이하며, 용매 및 용해도 특성에 따라 다소 차이는 있지만, 높은 몰흡광계수를 나타내는 등 많은 장점이 있어 생물학적 응용에 많이 이용된다.

그 이외에도, 시아닌 발색단을 가진 염료 화합물은 화상표시장치용 광학필터나 레이저 용착용 수지 조성물의 용도로 유용하게 이용될 수도 있다. 특정한 광에 강도가 큰 흡수를 가지는 화합물은 액정표시장치, 플라즈마 디스플레이 패널, 전계발광디스플레이, 음극관 표시장치, 형광 표시관 등의 화상표시장치용 광학필터나 DVDㅁR 등의 광학 기록 매체의 광학 요소로서 널리 이용되고 있다. 광학 필터에는 불필요한 파장의 광들을 선택적으로 흡수하는 기능이 요구되는데, 동시에 형광등 등의 외광의 반사나 글레어를 방지하기 위해서는 480~500 nm 및 540~560 nm의 파장광 흡수가 요구되며, 화상품질을 높이기 위해서는 근적외선의 파장을 선택적으로 흡수하는 기능이 요구되고 있다.

상기와 같이, 산업적으로 유용하게 적용하기 위해서는 광학 및 pH 안정성이 우수하면서도 특정 파장 범위에서 좁은 흡수/발광 파장 범위를 가지면서도 높은 몰흡광계수를 나타내는 신규한 염료의 개발이 지속적으로 요구되는 바이다.

한국 공개특허 제10-2010-0094034호 한국 공개특허 제10-2013-0005381호 한국 공개특허 제10-2011-0136367호 한국 공개특허 제10-2011-0122314호

본 발명의 목적은 형광강도, 상대양자효율, 표지율 면에서 우수하여 조영제 조성물로도 이용될 수 있는 형광 화합물, 이를 이용한 표지방법 등을 제공하고자 한다.

이러한 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 A₁ 및 상기 A₂는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 SO₃ ^-이거나 SO₃H이며,

상기 A₃은 CO₂ ^-이거나 CO₂H이고,

상기 Z는 OH이거나 NH(CH₂)_mNH-Q이며,

상기 m은 1 내지 5이고,

상기 Q는 하기 화학식의 구조를 가지며,

[화학식 1a]

상기 X는 할라이드이고,

상기 Y는 NH(CH₂)_nCO₂-L

상기 n은 3 내지 7이고,

상기 L은 H이거나 하기 화학식의 구조를 가진다.

[화학식 1b]

또한, 본 발명은 본 발명의 여러 구현예에 따른 화합물을 포함하는 형광 표지용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 여러 구현예에 따른 화합물과 표지 대상 물질과 접촉시키는 단계를 포함하는 형광 표지 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 형광 화합물은 형광강도, 상대양자효율, 표지율 면에서 우수하여 타겟 물질의 표지 및 염색에 보다 효과적으로 활용될 수 있다. 또한, 광학 안정성이 우수하여 장시간의 염색에도 안정적 형광을 나타내며, 체내에 투여시 축적되지 않으면서도 형광 강도가 우수하여 종래의 염료에 비하여 소량의 사용에도 염색 및 체내 영상화가 용이하여 경제적으로 이용이 가능하다.

도 1은 화합물 1-3과 대조형광염료의 형광강도를 비교한 그래프이다.
도 2는 화합물 1-3과 대조형광염료의 상대양자효율을 비교한 그래프이다.
도 3은 화합물 1-3과 대조형광염료를 사용하여 단백질 반응물 간 형광강도를 비교한 그래프이다.
도 4는 FOBI 분석 결과 이미지이다.
도 5a 내지 5c는 Plate reader 측정 결과를 보여주는 그래프이다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 발명의 일 측면은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 A₃은 CO₂ ^-이거나 CO₂H이고,

상기 Z는 OH이거나 NH(CH₂)_mNH-Q이며,

상기 m은 1 내지 5이고,

상기 Q는 하기 화학식의 구조를 가지며,

[화학식 1a]

상기 X는 할라이드이고,

상기 Y는 NH(CH₂)_nCO₂-L

상기 n은 3 내지 7이고,

상기 L은 H이거나 하기 화학식의 구조를 가진다.

[화학식 1b]

일 구현예에 있어서, 제1항에 있어서, 상기 m은 2 또는 3이고, 상기 X는 Cl 또는 F이며, 상기 n은 5이다.

다른 구현예에 있어서, 상기 형광 화합물은 하기 화합물 중 하나이다.

[화학식 2a]

[화학식 2b]

[화학식 2c]

[화학식 2d]

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 여러 구현예에 따른 화합물을 포함하는 형광 표지용 조성물에 관한 것이다.

이때, 상기 표지의 대상 물질은 섬유, 생체분자, 나노입자, 유기화합물 또는 이들 2종 이상의 조합일 수 있다.

또한, 상기 생체분자의 예에는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 다양한 구현예에 따른 화합물과 표지 대상 물질과 접촉시키는 단계를 포함하는 형광 표지 방법에 관한 것이다.

이때, 상기 표지 대상 물질은 섬유, 생체분자, 나노입자, 유기화합물 또는 이들 2종 이상의 조합일 수 있다.

일 구현예에 따르면, 상기 생체분자는 인체 외 생체분자이거나 또는 인간을 제외한 포유동물의 생체분자이다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.

실시예

실시예 1 : 화합물 3-1의 합성

(1) 화합물 2-1의 합성

m-아니시딘(m-Anisidine) (24.6 g, 0.2 mol, 1 eq, Sigma-Aldrich)와 p-톨루엔술폰산(p-toluenesulfonic acid) 2.6 g을 사이클로헥산(cyclohexane) 200 mL에 넣고 분산하였다. 용액을 80 내지 90 ℃로 가열한 후 아세톤 42 mL을 반응액에 8 내지 10 시간 동안 세류한 후, 온도를 유지하며 일야교반을 진행하였다. 반응 완료 후 70 ℃로 냉각한 후 소다회 0.6 g을 증류수 20 mL에 녹여 반응액에 투입한 후 2 시간 동안 상온 교반하였다. 반응액을 증류수를 사용하여 추출한 후 유기층을 회수하여 감압 건조하였다. MC를 사용하여 실리카겔 크로마토그래피로 정제한 후 건조하여 화합물 2-1을 얻었다(19.2 g, 43%).

Rf = 0.65 (실리카겔, MC)

(2) 화합물 2-2의 합성

화합물 2-1 16 g (78.3 mmol, 1 eq)를 아이오도메탄 (Iodomethane) (166 g, 1.174 mol, 15 eq)에 투입한 후, 12 시간 동안 가열환류 반응을 진행하였다. 반응 완료 후 감압건조하여 아이오도메탄을 제거하였다. MC를 사용하여 실리카겔 크로마토그래피로 정제한 후 건조하여 화합물 2-2를 얻었다(14.1 g, 83%).

Rf = 0.8 (실리카겔, MC)

(3) 화합물 2-3의 합성

화합물 2-2 14.11 g (64.9 mmol)을 아세트산 50 mL와 브롬산 50 mL 혼합용액에 넣고 가열환류 반응을 진행하였다. 상온으로 냉각 후 MC 300 mL, 증류수 200 mL을 투입한 후 30 분 동안 교반하였다. 교반 후 30% 가성소다용액을 투입하여 중화하였다. 반응액을 추출하여 유기층을 회수한 후 감압건조 진행하였다(11.4 g, 86%).

Rf = 0.2 (실리카겔, MC)

(4) 화합물 2-4의 합성

화합물 2-3 (11.4 g, 56.1 mmol, 2 eq)과 트리멜리틱 무수화물 (Trimellitic anhydride) (5.38 g, 28 mmol, 1 eq)과 p-톨루엔술폰산 (p-Toluenesulfonic acid) 1 g을 프로판산 (Propionic acid) 60 mL에 투입한 후, 12 시간 동안 가열환류 반응을 진행하였다. 반응 완료 후 감압건조하여 용매를 제거한 후, 실리카겔 크로마토그래피를 사용하여 정제를 진행하여 화합물 2-4를 얻었다(6.4 g, 41%).

Rf = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:1 v/v)

LC/MS, 계산치 C35H35N2O5 563.66, 측정치 567.0

(5) 화합물 3-1의 합성

3-1

화합물 2-4 (3 g, 5.32 mmol)에 냉각된 진한 황산 40 mL을 투입하였다. 0 ℃로 냉각한 후 2 시간 동안 반응한 후에 상온에서 12 시간 동안 반응을 진행하였다. 반응 완료 후 다이옥산 (Dioxane) 60 mL을 투입한 후, 디에틸이더(diethylether) 2 L를 투입하여 입자를 생성하였다. 뷰흐너 깔때기에 규조토를 넣고 여과한 후, 걸러진 고체를 물에 분산하여, 소듐 바이카보네이트 (Sodium bicarbonate)를 투입하여 중화하였다. 반응액을 뷰흐너 깔때기로 여과한 후 여액을 감압건조 진행하였다. 실리카겔 크로마토그래피를 사용하여 정제를 진행한 후 감압건조 진행하여 화합물 1을 얻었다(610 mg, 16%).

Rf = 0.6 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:5 v/v)

LC/MS, 계산치 C35H33N2O11S2 721.77, 측정치 720.6

실시예 2 : 화합물 1-1의 제조

(1) 화합물 3-2의 합성

화합물 3-1 (250 mg, 0.346 mmol, 2 eq)을 DMF (12 mL)와 DW 5 mL 혼합용액에 넣고 완용하였다. 0 ℃로 냉각한 후, O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늅 테드라플르오로보레이트 (O-(N-Succinimidyl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate, TSTU) (312 mg, 1.038 mmol, 3 eq, Sigma-Aldrich)을 투입하여 2시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후 동결건조하여 입자를 생성한 후, 아세토니트릴과 물을 사용하여 역상 크로마토그래피로 정제하여 화합물 3-1을 얻었다(40 mg, 14%).

Rf = 0.4 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)

LC/MS, 계산치 C39H38N3O13S2 820.86, 측정치 817.9

(2) 화합물 3-3의 합성

화합물 3-1 (2 g, 2.77 mmol, 1 eq)을 DMF 100 mL에 완용하였다. 디(N-숙신이미딜)카보네이트(Di(N-succinimidyl) Carbonate, DSC) (2.13 g, 8.3 mmol, 3 eq, TCI)을 용액에 투입한 후, N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine, DIPEA) (4.83 mL, 27.7 mmol, 10 eq, Sigma-Aldrich)을 투입하였다. 40 ℃로 승온하여 2 시간 동안 반응을 진행한 후, 디에틸이더를 투입하여 입자를 석출시켰다. 입자를 여과 및 건조 진행한 후, 다시 DMF를 투입하여 용해시켰다. 에틸렌디아민(Ethylenediamine) (500 mg, 8.3 mmol, 3 eq)을 투입하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응액에 디에틸이더를 투입하여 입자를 석출시킨 후, 여과 및 건조를 진행하였다. 건조 완료 후 아세토니트릴과 증류수를 사용하여 역상크로마트그래피로 정제를 진행하였다. 정제 완료 후 건조를 진행하여 화합물 3-3을 얻었다(297 mg, 14%).

Rf = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)

LC/MS, 계산치 C37H39N4O10S22- 763.86, 측정치 763.1

(3) 화합물 1-1의 합성

1-1

화합물 3-3 (297 mg, 0.388 mmol)을 증류수 30 mL에 완용한 후, 냉장보관하였다. 시아누릭 클로라이드 (Cyanuric chloride, CNC) (215 mg, 1.16 mmol, 3 eq)을 아세토니트릴 30 mL에 완용한 후 DIPEA (135 μL, 0.776 mmol, 2 eq)을 투입하여 냉동보관하였다. CNC 용액에 화합물 3-3 용액을 투입한 후 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다.

반응 확인 후, 6-아미노헥사노익 산(6-aminohexanoic acid) (152 mg., 1.16 mmol, 3 eq)을 증류수 15 mL에 녹인 후 반응액에 투입하였다. DIPEA (405 μL, 2.328 mmol, 6 eq)을 투입한 후 40℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 동결건조하여 얻어진 화합물을 역상크로마토그래피로 정제하여 화합물 1-1을 얻었다(168 mg, 43%).

Rf = 0.3 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)

LC/MS, 계산치 C46H50ClN8O12S22- 1006.52 측정치 1005.2

실시예 3 : 화합물 1-2의 제조

(1) 화합물 2-5의 합성

6-Aminohexanoic acid (1 g, 7.624 mmol)을 증류수 200 mL에 완용 한 후 냉장보관하였다. CNC (4.22 g, 22.87 mmol, 3 eq)을 아세토니트릴 200 mL에 완용 후 DIPEA (2.66 mL, 15.25 mmol, 2 eq)을 투입하여 냉동보관하였다. CNC 용액에 6-Aminohexanoic acid 용액을 투입한 후 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.

반응 확인 후, 1,3-Propanediamine (1.69g, 22.87 mmol, 3 eq)을 CNC 반응액에 투입 후 DIPEA (7.97 mL, 45.74 mmol, 6 eq)을 투입하여 50℃에서 2시간 반응시켰다. 반응 완료 후 동결건조하여 얻어진 화합물을 역상크로마토그래피로 정제하여 화합물 2-5을 얻었다(1.13 g, 47%).

Rf = 0.5 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)

LC/MS, 계산치 C12H21ClN6O2 316.79, 측정치 315.0

(2) 화합물 1-2의 합성

1-2

화합물 3-1 (2 g, 2.77 mmol, 1 eq)을 DMF 100 mL에 완용하였다. DSC (2.13 g, 8.3 mmol, 3 eq)을 용액에 투입한 후, DIPEA (4.83 mL, 27.7 mmol, 10 eq)을 투입하였다. 40 ℃로 승온하여 2 시간 동안 반응을 진행한 후, 디에틸이더를 투입하여 입자를 석출시켰다. 입자를 여과 및 건조 진행한 후, 다시 DMF를 투입하여 용해시켰다. 용액에 화합물 2-5 (2.63 g, 8.3 mmol, 3 eq)을 투입한 후 DIPEA (4.83 mL, 27.7 mmol, 10 eq)을 투입하고 50 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응액에 디에틸이더를 투입하여 입자를 석출시킨 후 여과 및 건조 진행하였다. 건조 완료 후 아세토니트릴과 증류수를 사용하여 역상 크로마트그래피로 정제를 진행하였다. 정제 완료 후 건조를 진행하여 화합물 1-2을 얻었다. (415 mg, 15%).

Rf = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)

LC/MS, 계산치 C47H53ClN8O12S22- 1021.55 측정치 1020.0

실시예 4 : 화합물 1-3의 제조

(1) 화합물 1-3의 합성

1-3

화합물 1-1 (165 mg, 0.164 mmol, 1 eq)을 DMF 20 mL에 완용하였다. DSC (126 mg, 0.491 mmol, 3 eq)을 용액에 투입한 후, DIPEA (285 μL, 1.638 mmol, 10 eq)을 투입하였다. 40 ℃로 승온하여 2 시간 동안 반응을 진행한 후, 디에틸이더를 투입하여 입자를 석출시켰다. 입자를 여과 및 건조 진행한 후, 아세토니트릴과 증류수를 사용하여 역상크로마트그래피로 정제를 진행하였다. 정제 완료 후 건조를 진행하여 화합물 1-3을 얻었다. (31 mg, 17%).

Rf = 0.2 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:2 v/v)

LC/MS, 계산치 C50H53ClN9O14S22- 1103.59, 측정치 1103.0

실시예 5 : 화합물 1-4의 제조

화합물 1-3 (30 mg, 0.0272 mmol, 1 eq)을 DMF 10 mL에 완용하였다. 2-(2'-클로로에틸설포닐)에틸아민 염산염 (2-(2-chloroethylsulfonyl)ethanamine hydrochloride) (6 mg, 0.0272 mmol, 1 eq)을 용액에 투입한 후, DIPEA (47 μL, 0.272 mmol, 10 eq)을 투입하였다. 40 ℃ 로 승온하여 4 시간 동안 반응을 진행한 후, 디에틸에테르를 투입하여 입자를 석출시켰다. 입자의 여과 및 건조를 진행한 후, 아세토니트릴과 증류수를 사용하여 역상 크로마트그래피로 정제를 진행하였다. 정제 완료 후 건조를 진행하여 화합물 1-4을 얻었다. (15 mg, 49 %)

Rf = 0.3 (RP-C18, 아세토니트릴/물 1:4 v/v)

LC/MS, 계산치 C₅₀H₆₀ClN₉O₁₃S₃ 1126.71, 측정치 1125.9

시험예 1: 화합물의 광학특성 평가

(1) 화합물 1-3과 대조형광염료의 최대 흡ㅇ형광 파장 및 몰 흡광계수 분석

화합물 1-3과 대조형광염료 (Alexa Fluor?? 594 NHS ester)의 기본 광학특성을 분석하였다. Powder 상태의 2 종 염료에 DMF를 넣어 각각 10 mg/mL로 Stock solution을 제조하였고, 이후 pH 7.4 10 mM Phosphate buffered saline (이하 1x PBS)을 이용하여 각 15.1 μM 농도의 희석 샘플을 준비하였다. 해당 샘플들에 대하여 Agilent 사의 Cary 8454 UV/Vis Spectrophotometer 기기를 활용하여 흡광 측정을 진행하였고, 샘플 당 1/2 dilution하여 1/8 희석 샘플까지 총 4 회씩 분석하였다(Blank : 1x PBS).

분석 결과를 통해 우선 화합물 1-3 및 대조형광염료의 여기 파장(최대 흡수 파장)을 순서대로 593, 591 nm로 확인하였고, 해당 파장 설정 하에 PerkinElmer의 LS 55 Fluorescence spectrometer를 이용하여 형광을 분석하였다. 형광 측정은 화합물 1-3 및 대조형광염료에 대해 0.013 μM의 동일 몰 농도 샘플을 제조하여 진행하였다.

표 1에 광학특성 분석 결과를 나타내었고, 몰 흡광계수의 경우 염료 당 흡광 4 회 분석 결과를 토대로 Beer's Law (A=Ebc)에 따라 산출하였다.

(2) 화합물 1-3과 대조형광염료의 형광강도 비교

화합물 1-3과 대조형광염료(Alexa Fluor?? 594 NHS ester)의 형광강도를 비교하였다. 시험예 1-(1)에서 동일 몰 농도(0.013 μM)로 제조한 샘플과 더불어, 대조형광염료에 대하여 화합물 1-3과 동일 무게만큼 사용하였을 때를 가정하여 샘플 하나를 추가 제조(Alexa Fluor?? 594 NHS ester, 몰 농도 환산 시 0.0175 μM)하여 함께 비교하였다.

여기파장 591 nm 설정 하에 LS 55 Fluorescence spectrometer를 이용하여 측정하였다. 도 1과 같이 동일 중량 및 동일 몰 농도 분석 조건 모두에서 화합물 1-3의 형광강도가 가장 강함을 알 수 있다.

(2) 상대양자효율 (Relative quantum yield) 비교

Rhodamine 6G (TCI)를 기준으로, 화합물 1-3과 대조형광염료 (Alexa Fluor?? 594 NHS ester)의 상대양자효율을 측정하였다. Rhodamine 6G 역시 DMF를 넣어 10 mg/mL Stock solution을 제조한 후 사용하였다. pH 7.4 1x PBS을 이용하여 10 μM의 농도로 희석한 후 흡광 및 형광을 측정하였다. 10 μM 농도로부터 1/2 dilution을 시행하여 1/1024x 농도 샘플까지 총 11 회씩 흡ㅇ형광 측정을 하였다.

수학식 1에 측정값을 대입하여 상대양자효율을 분석하였고, 표 2 및 도 2와 같은 결과를 얻었다. 화합물 1-3의 상대 양자효율이 대조형광염료보다 높음을 확인할 수 있다.

시험예 2 : 단백질에 labeling한 후의 성능 비교

(1) 단백질 반응물(Conjugates) 간 형광강도 비교

화합물 1-3과 대조형광염료 (Alexa Fluor?? 594 NHS ester)를 항체 (Goat anti-Mouse IgG H+L Secondary Ab, 140 kDa, Thermo)에 표지한 후 반응물 (Conjugates) 간의 형광강도를 비교하였다. 항체 0.5 mg에, Alexa Fluor?? 594 NHS ester 기준 25 fold (molar) 양인 0.0732 mg으로 동일 중량의 염료를 IgG와 각각 반응하였고 (즉, 'IgG 0.5 mg+화합물 1-3 0.0732 mg', 'IgG 0.5 mg + 대조염료 0.0732 mg'. 단, 염료들이 10 mg/mL stock solution 상태임에 따라 7.32 μL 씩 사용), Fluorescence spectrometer (LS 55, PerkinElmer)와 FOBI (Fluorescence-labeled Organism Bioimaging Instrument, NeoScience), 그리고 Multi-label plate reader (Enspire 2300, PerkinElmer) 기기를 활용하여 삼중 분석하였다.

결과에 앞서 반응 조건으로는, Coupling buffer의 pH가 8.3~8.5가 되도록 pH 7.4 1x PBS와 1 M pH 9.5 Sodium carbonate-Bicarbonate buffer를 적정 비로 혼합하여 사용하였고, 항체의 최종 반응 농도가 2 mg/mL이 되도록 설계하였다. 상온 (25 ℃), 암실 환경에서 1 시간 동안 자석 교반하며 반응시켰고, 이후 1x PBS로 미리 Buffer equilibrium 해 둔 PD-10 Column (GE Healthcare)을 이용하여 정제 해 반응물을 획득하였다.

수득한 반응물을 활용하여 우선 FL spectrometer로 형광강도를 비교 분석하였다. 도 3이 그 결과로, 각 반응물 4 μL를 3 mL의 1x PBS에 섞어 희석한 후 Excitation 592 nm 설정 하에 측정하였다.

이어서, FOBI 및 Plate reader 분석을 진행하였다. 각 반응물의 원액과 1/2, 1/4. 1/10 희석 샘플 (1x PBS 이용), 그리고 Blank로 1x PBS를 96-well Black plate에 순서대로 well 당 100 μL 씩 주입하고 분석하였다. FOBI Imaging은 기기 상 Light source Green (520 nm) channel 및 Green Emission filter를 적용, Exposure time 500 ms, Gain 3 x 설정 하에 수행하였고, Plate reader 분석의 경우 ① 대조형광염료 (Alexa Fluor?? 594 NHS ester)의 해당 사 분석 증명서 상 Specification 기준 (최대 흡ㅇ형광 파장 590/617 nm)을 기기 프로토콜 설정에 적용하여 한 차례, ② IgG와 대조형광염료 반응물의 실제 최대 흡ㅇ형광 파장을 적용하여 한 차례 (591/619 nm), ③ IgG와 화합물 1-3 반응물의 실제 최대 흡ㅇ형광 파장을 적용하여 한 차례 (593/619 nm)로 총 3 회에 걸쳐 확인하였다. 세 차례 분석에서 Wavelength 이외의 기기 설정은 모두 동일하게 하였다 (Measurement height 9.5 mm, Number of flashes 50 등).

도 4에 FOBI Image를, 도 5에 Plate reader 측정 결과 그래프를 제시하였다. 도 5의 형광강도는 Blank 보정 된 결과로서, Blank well의 형광수치가 매우 낮고 (8~14 FU), 모든 결과 치에 동일하게 적용이 되기 때문에 보정 전과 경향에 있어서의 차이는 없다. 도 3 내지 도 5로부터 단백질 (IgG)에 표지 한 이후의 형광강도에 있어서도 화합물 1-3의 Conjugate가 더 강한 형광세기를 띠는 것을 확인할 수 있다. 도 4의 경우 기기 옵션의 한계로 인해 여기 파장과 완벽히 일치하는 Laser line 설정 하에 분석을 진행하지는 못하였으나, 가장 유사한 환경에서 분석을 진행한 결과 앞선 내용과 동일한 경향을 나타냄을 알 수 있다. 도 3에서는 화합물 1-3의 단백질 반응물이 대조형광염료의 단백질 Conjugate에 비해 150% 수준의 형광강도를, 도 5에서는 모든 희석 배율에서 30~45% 정도 더 높은 강도를 갖는 것으로 분석 되었다. 이는 화합물 1-3의 분자량이 대조형광염료에 비해 약 35%가 더 큼에도 대조형광염료와 같은 중량만큼의 염료를 사용 (대조형광염료 기준 25 fold로, 화합물 1-3 기준으로는 약 18.6 fold 수준)하여 표지했을 때의 결과에 해당된다. 도 5에서 세 가지 파장 조건 설정으로 측정을 진행한 결과에 있어서는 예상했던 대로 ②, ③ 번 그래프와 같이 각 Conjugates의 실제 파장 영역에서 해당 반응물의 형광강도가 약간씩 더 높게 확인되었고, 전반적인 비교 경향은 유사하였다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
[화학식 1]

상기 A₁ 및 상기 A₂는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 SO₃ ^-이거나 SO₃H이며,
상기 A₃은 CO₂ ^-이거나 CO₂H이고,
상기 Z는 OH이거나 NH(CH₂)_mNH-Q이며,
상기 m은 1 내지 5이고,
상기 Q는 하기 화학식의 구조를 가지며,
[화학식 1a]

상기 X는 할라이드이고,
상기 Y는 NH(CH₂)_nCO₂-L
상기 n은 3 내지 7이고,
상기 L은 H이거나 하기 화학식의 구조를 가진다.
[화학식 1b]
제1항에 있어서, 상기 m은 2 또는 3이고,
상기 X는 Cl 또는 F이며,
상기 n은 5인 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항에 있어서, 상기 형광 화합물은 하기 화합물 중 하나인 것을 특징으로 하는 화합물.
[화학식 2a]

[화학식 2b]

[화학식 2c]

[화학식 2d]
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 형광 표지용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 표지의 대상 물질은 섬유, 생체분자, 나노입자, 유기화합물 또는 이들 2종 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 형광 표지용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 생체분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 표지용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물과 표지 대상 물질과 접촉시키는 단계를 포함하는 형광 표지 방법.
제7항에 있어서, 상기 표지 대상 물질은 섬유, 생체분자, 나노입자, 유기화합물 또는 이들 2종 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 형광 표지 방법.
제8항에 있어서, 상기 생체분자는 인체 외 생체분자이거나 또는 인간을 제외한 포유동물의 생체분자인 것을 특징으로 하는 형광 표지 방법.
제9항에 있어서, 상기 생체분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형광 표지 방법.