CN114957299A - 用于检测凋亡细胞的荧光探针及其制备方法 - Google Patents

用于检测凋亡细胞的荧光探针及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114957299A
CN114957299A CN202210200860.4A CN202210200860A CN114957299A CN 114957299 A CN114957299 A CN 114957299A CN 202210200860 A CN202210200860 A CN 202210200860A CN 114957299 A CN114957299 A CN 114957299A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
fluorescent probe
cell
formula
fluorescence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210200860.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114957299B (zh
Inventor
刘军
陈虹羽
张仕禄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
North Sichuan Medical College
Original Assignee
North Sichuan Medical College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by North Sichuan Medical College filed Critical North Sichuan Medical College
Priority to CN202210200860.4A priority Critical patent/CN114957299B/zh
Publication of CN114957299A publication Critical patent/CN114957299A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114957299B publication Critical patent/CN114957299B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/02—Boron compounds
    • C07F5/027—Organoboranes and organoborohydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/576—Six-membered rings
    • C07F9/58—Pyridine rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6447—Fluorescence; Phosphorescence by visual observation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1007—Non-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1014—Carbocyclic compounds bridged by heteroatoms, e.g. N, P, Si or B
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新型检测细胞凋亡的荧光探针及其制备方法和应用，属于用于荧光成像的小分子标记探针领域。本发明的荧光探针具有较大的Stokes位移，能避免一些生物自荧光的干扰；且本发明的荧光探针不能透过活细胞的细胞膜，但能透过凋亡细胞的细胞膜与细胞内的负电荷物质相结合，在细胞质或细胞核中出现明显荧光等优点，可广泛用于凋亡细胞的选择性检测研究。该类探针与ATP、DNA或RNA能选择性结合，并产生大的荧光增强，可用于这些物质的荧光检测。该类探针具有较高的光敏性，可广泛应用于光照下产生ROS去诱导细胞的凋亡或抑制细菌生长。该类探针丰富的电荷，具有用于膜电势监测的潜力。该荧光探针还具有体积小、标记特异性高、制备简单方便，易于质量控制，可广泛推广。

Description

用于检测凋亡细胞的荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及一类用于检测细胞凋亡的新型荧光探针及其制备方法和应用，属于荧光成像的小分子标记探针领域。
背景技术
细胞凋亡的概念是Kerr等澳大利亚病理学家于1972年首先提出的，随后受到世人的广泛关注。经过近几十年的发展，细胞凋亡已成为生命科学领域的研究热点。细胞增殖和死亡的平衡维持对多细胞有机体的发育与生命的维持至关重要。研究细胞凋亡的重要意义在于最终可能有利于阐明多种疾病，包括病毒感染、神经退化性疾病、免疫缺陷和恶性肿瘤的发病机理，并为这些疾病治疗探索新的方法。细胞凋亡的检测在评估细胞凋亡过程中具有重要作用，同时也是疾病治疗效果的检测手段之一，在生物医学领域有着不可替代的重要地位。因此，研究细胞凋亡的检测体系非常重要。
荧光成像或检测分析法具有灵敏度高、选择性好、操作简单等优点，并且在生物样本检测中不会对样品带来损伤，已广泛用于各种生物体内检测。众所周知，外翻的磷脂酰丝氨酸作为常见的凋亡靶点之一，商业凋亡试剂盒AnnexinV这种大分子蛋白对其良好的靶向性，但是其制备工艺复杂、价格昂贵，且化学性质不稳定。商用的PI染料也可用于细胞凋亡检测，但只能检测晚期凋亡细胞。市面上虽然已经开发了许多其他荧光探针通过检测细胞凋亡过程中产生或释放的生物标记物，如caspase 3/7、DNA片段或细胞色素c等，来实现细胞凋亡检测，但目前仍然缺乏发光在530nm-610nm范围内且具有较大Stokes位移的商用细胞凋亡检测荧光探针。另外，目前报道的凋亡检测荧光探针没有光敏性，不具有诱导细胞凋亡的潜力。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种新型检测细胞凋亡的荧光探针及其制备方法和应用，本发明的荧光探针具有较大的Stokes位移，能避免一些生物自荧光的干扰；且本发明的荧光探针能透过细胞膜与细胞内的负电荷物质相结合，在细胞质或细胞核中出现明显荧光等优点，可广泛用于凋亡细胞的选择性检测研究。
本发明的技术方案具体如下：
一方面，本发明的目的在于提供一种新型检测细胞凋亡的荧光探针，其化学结构通式如下所示：
Figure BSA0000267637040000021
其中，R为C1-C4烷基。
另一方面，本发明的目的还在于提供一种制备上述式(I)、(II)所示荧光探针的方法。
在一个具体的实施方案中，式(I)化合物的制备方法如下：
Figure BSA0000267637040000022
(a)由化合物1反应得到三(4-溴-2，6-二甲基苯基)硼烷(化合物2)；
(b)化合物3、化合物4在弱碱条件下，通过偶联反应得化合物5；
(c)化合物2、化合物5在溶剂中通过偶联反应，得化合物6；
(d)化合物6经烷基化反应得到式I化合物。
在一个具体的实施方案中，式(II)化合物的制备方法如下：
Figure BSA0000267637040000023
(e)化合物7反应得到化合物8；
(f)化合物8、化合物5在溶剂中通过偶联反应，得化合物9；
(g)化合物6，经烷基化反应，得到式II化合物。
另一方面，本发明的另一目的在于提供上述荧光探针的使用方法。
另一方面，本发明的另一目的在于提供上述荧光探针在检测凋亡细胞上的用途。具体地，本发明进一步提供上述式(I)、(II)结构所示荧光探针在检测凋亡细胞上的用途。
本发明的荧光探针，最大吸收波长在430nm左右，最大发射波长在560nm左右，具有较大的Stokes位移，能避免一些生物自荧光的干扰。本发明的荧光探针在结构上具有六个正电荷，能与细胞内的一些负电荷物质，如ATP、RNA、DNA等进行结合，结合后荧光强度增强。同时结构中六个正电荷使探针具有高的亲水性，从而降低了其细胞通透性，导致该类探针无法透过正常活细胞的细胞膜。当细胞发生凋亡后，细胞膜外翻，导致探针能透过凋亡细胞的细胞膜与细胞内的一些负电荷物质相结合，由于其通透性改变，导致探针能透过细胞膜与细胞内的负电荷物质相结合，在细胞质或细胞核中出现明显荧光，通过荧光增强从而实现了对凋亡细胞的选择性检测。
本发明的有益效果为：
(1)本发明所述的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，体积小，易于推广。
(2)本发明所述的荧光探针具有高特异性，在各种活细胞中均无法透过细胞膜，只在细胞质或细胞核(凋亡细胞)中出现强的荧光，具有广阔的应用前景。
(3)本发明所述的荧光探针最大吸收波长在430nm附近，最大发射波长在560nm附近，可以填补目前市场上细胞凋亡检测探针的空白。
(4)本发明所述的荧光探针，在进行相应细胞凋亡检测时能出现明显的荧光增强，有助于裸眼观测。
(5)本发明所述的荧光探针，具有一定的光敏性，在光照下具有诱导细胞凋亡的潜力，如可广泛应用于光照下产生ROS去诱导细胞的凋亡或抑制细菌生长。
(6)本发明所述的荧光探针丰富的电荷，具有用于膜电势监测的潜力。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明荧光探针式I-1对各种活细胞的荧光成像结果；
图2是本发明荧光探针式I-1对各种凋亡细胞的成像结果；
图3是本发明荧光探针式I-1在活细胞和凋亡细胞共同存在中对凋亡细胞的选择性成像结果；
图4是本发明荧光探针式II-1对各种活细胞的荧光成像结果；
图5是本发明荧光探针式II-1对各种凋亡细胞的成像结果。
具体实施方案
本发明提供了一种新型用于检测细胞凋亡的荧光探针，其化学结构通式如下所示：
Figure BSA0000267637040000041
其中，R为C1-C4烷基；优选地R为C1-C3烷基。
在本发明的一个优选实施方案中，R为C1-C4烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、或叔丁基等；更优选地，R为甲基、乙基、丙基、异丙基、或正丁基。
在本发明的一个优选实施方案中，R为甲基，所述荧光探针的结构如式(I-1)或(II-1)：
Figure BSA0000267637040000042
在本发明的一个优选实施方案中，R为乙基，所述荧光探针的结构如式(I-2)或(II-2)。
在本发明的一个优选实施方案中，R为正丙基，所述荧光探针的结构如式(I-3)或(II-3)。
在本发明的一个优选实施方案中，R为正丁基，所述荧光探针的结构如式(I-4)或(II-4)。
另一方面，本发明还提供了一种制备上述式(I)、(II)所示荧光探针的方法。
在本发明的一个具体实施方案中，式(I)化合物的制备方法，具体步骤如下：
Figure BSA0000267637040000043
(a)将化合物1溶于有机溶剂中，加入正丁基锂搅拌，再加入三氟化硼乙醚络合物，反应得到三(4-溴-2，6-二甲基苯基)硼烷(化合物2)；
(b)化合物3、化合物4、碳酸钾、四三苯基膦钯在溶剂中混合搅拌，反应得到化合物5；
(c)化合物2、化合物5、Pd2(dba)3、BINAP、叔丁基醇钠溶入有机溶剂中，搅拌反应得到化合物6；
(d)化合物物6与C1-C4卤代烷基经烷基化反应，得到式I化合物。根据本发明，所述步骤(a)中，所述有机溶剂为四氢呋喃、乙醚等，优选为脱气乙醚。优选地，该反应在惰性气氛下进行，更优选为氮气、或氩气保护下反应。反应温度优选在-78℃下进行，如在-78℃下加入正丁基锂和三氟化硼乙醚。
根据本发明，所述步骤(b)中，所述有机溶剂优选为二氧六环/水。所述反应优选在100℃进行。
根据本发明，所述步骤(c)中，所述有机溶剂优选为甲苯；所述反应优选在氩气保护下进行。所述反应优选为90℃。
根据本发明，所述步骤(d)中，所述烷基化反应优选为碘代烷或溴代烷反应，如化合物6与碘代烷或溴代烷反应得到式I化合物；更优选地卤代反应产物经离子交换提纯得到式I化合物。进一步优选地，碘代反应优选在0℃-r.t进行，溴代反应优选在80℃下进行。
在本发明的另一个具体实施方案中，式(II)化合物的制备方法如下：
Figure BSA0000267637040000051
(e)将化合物7溶于有机溶剂中，加入正丁基锂搅拌，再加入亚磷酸三乙酯，反应过夜，加入双氧水得到化合物8；
(b)化合物3、化合物4、碳酸钾、四三苯基膦钯在溶剂中混合搅拌，反应得到化合物5；
(f)化合物8、化合物5、Pd2(dba)3、BINAP、叔丁基醇钠溶入有机溶剂中，反应得到化合物9；
(g)化合物9与C1-C4卤代烷基经烷基化反应，得到式II化合物。
根据本发明，所述步骤(e)中，所述有机溶剂为四氢呋喃、乙醚等，优选为脱气乙醚。优选地，该反应在惰性气氛下进行，更优选为氮气、或氩气保护下反应。反应温度优选在-78℃下进行，如在-78℃下加入正丁基锂和亚磷酸三乙酯。
根据本发明，所述步骤(f)中，所述有机溶剂优选为甲苯。所述反应在惰性气氛下进行，优选为氮气、或氩气保护下反应，更优选在氩气保护下反应。反应温度优选90℃。
根据本发明，所述步骤(g)中，所述烷基化反应优选为碘代烷或溴代烷反应，如化合物9与碘代烷或溴代烷反应得到式II化合物；更优选地，卤代反应后经离子交换提纯得到式II化合物。进一步优选地，碘代反应优选在0℃进行，溴代反应优选在80℃下进行。
本发明进一步提供上述荧光探针在检测凋亡细胞上的用途，如上述式(I)、(II)结构所示荧光探针在检测凋亡细胞上的用途。
另一方面，本发明还提供上述荧光探针的使用方法。
本发明上文以及下文所述的各个实施方案/技术方案以及各个实施方案/技术方案中的特征应当被理解为可以任意进行相互组合，这些相互组合得到的各个方案均包括在本发明的范围内，就如同在本文中具体地且逐一地列出了这些相互组合而得到的方案一样，除非上下文清楚地显示并非如此。
为了进一步说明本发明的指导思想，给出下列系列具体实施例，但本发明并不受这些具体实施例的限制，任何了解该领域的技术人员对本发明的些许改动将可以达到类似的结果，这些改动也包含在本发明之中。
以下实施例说明上述本发明，然而其不以任何方式限制本发明的范围。本发明的组合的有益效果也可以通过本领域技术人员已知的其他测试模型确定。
本发明中，所用试剂、设备的来源和商品名，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同，常规未标注试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
实施例1
化合物2的制备
Figure BSA0000267637040000061
在氮气的保护下，将化合物1(10g，32mmol)溶解于干燥的乙醚(60mL)中，冷却至-78℃，向溶液中滴加20mL正丁基锂正己烷溶液(1.6M)。将反应升至室温搅拌20min后，再次冷却至-78℃，加入三氟化硼乙醚(1.25mL，10mmol)，室温搅拌过夜，水洗，硫酸镁干燥。除去溶剂，硅胶柱纯化(石油醚)得白色固体化合物2(4.0g，71％)。LCMS(ESI)：m/z 562.9[M+H]+.1HNMR(400MHz，CDCl3)δ：1.97(s，18H)，7.11(s，6H).13C NMR(75MHz，CDCl3)δ：144.9，142.5，130.6，124.1，22.7.
实施例2
化合物5的制备
Figure BSA0000267637040000062
将双(4-溴苯基)胺(6.54g，20mmol)、吡啶硼酸(12.3g，100mmol)、碳酸钾(27.6g，200mmol)、四三苯基膦钯(200mg)加入溶剂(二氧六环/水＝3/2，250mL)中，100℃加热回流5-7天，至双(4-溴苯基)胺反应完全。静止分层，分离上层，水洗，硫酸镁干燥。除去溶剂，硅胶柱纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1/1)得到化合物5，直接用于下一步。LCMS(ESI)：m/z 324.4[M+H]+.
实施例3
化合物6的制备
Figure BSA0000267637040000071
化合物2(0.56g，1mmol)、化合物5(1.94g，6mmol)、50mg Pd2(dba)3、100mg BINAP、0.58g叔丁基醇钠溶入甲苯(80mL)中，120℃回流反应5天。除去溶剂，二氯甲烷萃取，水洗，硫酸镁干燥，除去溶剂，柱层析纯化(乙酸乙酯→乙酸乙酯/甲醇＝5/1)得到化合物6(760mg，59％)。LCMS(ESI)：m/z 1290.6[M+H]+.1H NMR(400MHz，CD2Cl2)δ：2.12(s，18H)，6.84(s，6H)，7.27-7.29(d，J＝8Hz，12H)，7.55-7.57(d，J＝8Hz，12H)，7.65-7.67(d，J＝8Hz，12H)，8.64-8.65(d，J＝4Hz，12H).13C NMR(100MHz，CD2Cl2)δ：150.10，146.80，142.45，131.59，127.97，124.67，120.68，22.74.
实施例4
化合物I-1的制备
Figure BSA0000267637040000072
将化合物6(30mg)和CH3I(1mL)在常温搅拌混合，出现红色沉淀物后搅拌过夜。添加甲醇(1mL)并继续搅拌过夜。除去溶剂，将残余物溶于水，并向溶液中加入六氟磷酸钾饱和水溶液，析出沉淀。将沉淀物溶解于乙腈中，向乙腈溶液中加入四丁基氯化铵溶液，产生沉积物，过滤并用乙腈洗涤五次，在真空烘箱中干燥固体，得黄色固体化合物I-1(35mg，96％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ：2.16(s，18H)，4.39(s，18H)，6.93(s，6H)，7.27-7.29(d，J＝8Hz，12H)，8.06-8.08(d，J＝8Hz，12H)，8.37-8.39(d，J＝8Hz，12H)，8.83-8.85(d，J＝8Hz，12H).13C NMR(100MHz，CD3OD)δ：154.84，150.20，147.08，145.03，143.01，129.36，125.13，123.98，123.28，22.15.
实施例5
化合物I-2的制备
Figure BSA0000267637040000081
将化合物6(30mg)、CH3CH2I(1mL)和DMF(2mL)混合，在80℃搅拌过夜。把反应液倒入水中，向溶液中加入六氟磷酸钾，析出沉淀。将沉淀物溶解在乙腈中，向乙腈溶液中加入过量的四丁基氯化铵溶液，产生沉积物，过滤并用乙腈洗涤沉积物五次，真空干燥，得黄色固体化合物I-2(38mg，98％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ：1.70(s，18H)，2.17(s，18H)，4.68(s，18H)，6.94(s，6H)，7.39(s，12H)，8.08(s，12H，)，8.41(s，12H)，8.95(s，12H).13C NMR(100MHz，CD3OD)δ：155.10，150.21，147.07，143.89，143.01，129.40，128.00，125.15，123.98，123.98，123.63，55.87，22.15，15.29.
实施例6
化合物I-3的制备
Figure BSA0000267637040000082
将化合物6(30mg)、CH3CH2CH2Br(1mL)和DMF(2mL)的混合物在80℃下搅拌过夜。除去溶剂，向残余物中加入六氟磷酸钾，析出沉淀，将沉淀物溶解于乙酸乙酯中，向乙酸乙酯溶液中加入过量的四丁基氯化铵水溶液中，产生沉淀，过滤，将沉淀物溶解于少量甲醇中，再加入乙酸乙酯，析出沉淀，反复五次。真空烘箱中干燥固体，得黄色固体化合物I-3(47mg，99％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ：1.05-1.09(m，18H)，2.07-2.12(m，12H)，2.17(s，18H)，4.524.63(m，12H)，6.94(s，6H)，7.37-7.39(d，J＝8Hz，12H)，8.07-8.10(d，J＝12Hz，12H)，8.41-8.42(d，J＝4Hz，12H)，8.93-8.94(d，J＝4Hz，12H).13C NMR(100MHz，CD3OD)δ：155.19，150.24，147.06，144.13，143.04，129.43，127.99，125.16，123.99，123.60，61.96，24.29，22.15，9.41.
实施例7
化合物8的制备
Figure BSA0000267637040000091
在氮气的保护下，将化合物7(2.36g，10mmol)溶解于干燥的乙醚(60mL)中，冷却至-78℃，逐渐滴加4mL正丁基锂正己烷溶液(2.5M)，反应一小时后，升温至室温继续搅拌2小时。再次将混合物冷却至-78℃，并通过注射添加磷酸三乙酯(0.55g，3mmol)。将反应混合物逐渐恢复至室温并搅拌过夜。在真空下除去溶剂并添加水，用CH2Cl2萃取混合物，Na2SO4干燥，收集有机层，除去溶剂，将30％H2O2(30mL)和CH2Cl2(60mL)加入到所得固体中，并在室温下搅拌过夜。分离有机层，用水、盐水洗涤。除去溶剂，柱色谱法纯化残余物，得白色固体化合物8(1.26g，82％)。LCMS(ESI)：m/z 561.2[M+H]+.
实施例8
化合物9的制备
Figure BSA0000267637040000092
化合物8(0.51g，1mmol)、BPA(1.94g，6mmol)、50mg Pd2(dba)3、100mg BINAP、0.58g叔丁基醇钠溶入80mL甲苯中，120℃回流反应5天。除去溶剂，二氯甲烷萃取，水洗，硫酸镁干燥，除去溶剂，柱层析(乙酸乙酯→乙酸乙酯/甲醇＝5/1)得到化合物9(558mg，45％)。LCMS(ESI)：m/z 1242.5[M+H]+.1H NMR(400MHz，CCl2D2)δ：7.25-7.27(m，6H)，7.31-7.33(d，J＝8Hz，12H)，7.56-7.58(m，12H)，7.62-7.64(d，6H)，7.67-7.70(m，12H)，8.65-8.67(m，12H).13C NMR(100MHz，CD3OD)δ：149.89，147.47，133.47，133.34，133.23，128.20，122.39，122.26，121.10.
实施例9
化合物II-1的制备
Figure BSA0000267637040000093
将化合物9(30mg)和CH3I(1mL)在常温搅拌混合，出现红色沉淀物后搅拌过夜。添加甲醇(1mL)并继续搅拌过夜。除去溶剂，将残余物溶于水，并向溶液中加入六氟磷酸钾饱和水溶液，析出沉淀。将沉淀物溶解于乙腈中，向乙腈溶液中加入四丁基氯化铵溶液，产生沉积物，过滤并用乙腈洗涤五次，在真空烘箱中干燥固体，得黄色固体化合物II-1(36mg，96％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ：4.41(s，18H)，7.42-7.44(d，J＝8Hz，18H)，7.77-7.82(m，6H)，8.09-8.11(d，J＝8Hz，12H)，8.40-8.41(d，J＝4Hz，12H)，8.87-8.88(d，J＝4Hz，12H).13C NMR(100MHz，CD3OD)δ：154.80，149.78，145.17，133.59，133.48，129.59，129.17，125.05，124.52，124.40，123.59.
实施例10
化合物H-2的制备
Figure BSA0000267637040000101
将化合物9(30mg)、CH3CH2I(1mL)和DMF(2mL)混合在80℃搅拌过夜。把反应液倒入水中，向溶液中加入六氟磷酸钾，析出沉淀。将沉淀物溶解在乙腈中，向乙腈溶液中加入过量的四丁基氯化铵溶液，产生沉积物，过滤并用乙腈洗涤沉积物五次，真空干燥，得黄色固体化合物II-2(39mg，99％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ：1.68-1.72(m，18H)，4.64-4.94(m，12H)，7.42-7.44(d，J＝8Hz，18H)，7.77-7.82(m，6H)，8.09-8.11(d，J＝8Hz，12H)，8.40-8.41(d，J＝4Hz，12H)，8.87-8.88(d，J＝4Hz，12H).13C NMR(100MHz，CD3OD)δ：155.08，149.80，144.01，129.62，129.20，125.06，123.94，55.99，15.25.
实施例11
化合物II-3的制备
Figure BSA0000267637040000102
将化合物9(30mg)、CH3CH2CH2Br(1mL)和DMF(2mL)的混合物在80℃下搅拌过夜。除去溶剂，向残余物中加入六氟磷酸钾，析出沉淀，将沉淀物溶解于乙酸乙酯中，向乙酸乙酯溶液中加入过量的四丁基氯化铵水溶液中，产生沉淀，过滤，将沉淀物溶解于少量甲醇中，再加入乙酸乙酯，析出沉淀，反复五次。真空烘箱中干燥固体，获得黄色固体化合物II-3(41mg，99％)。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ：1.02-1.09(m，18H)，2.07-2.12(m，12H)，4.53-4.67(m，12H)，7.42-7.44(d，J＝8Hz，18H)，7.77-7.82(m，6H)，8.11-8.12(d，J＝4Hz，12H)，8.42-8.44(d，J＝8Hz，12H)，8.95-8.97(d，J＝8Hz，12H).13C NMR(100MHz，CD3OD)δ：155.12，149.82，144.28，133.33，129.64，129.17，125.05，123.86，61.95，24.31，9.38.
实施例12
化合物I-1在检测凋亡细胞的性能测试
称取1.6mg化合物I-1溶于1mL水中，配置成化合物I-1的1mM水溶液。
将小鼠成纤维细胞NIH/3T3、胰腺癌细胞BXPC-3、宫颈癌细胞Hela、卵巢癌细胞SKOV-3、大脑胶质瘤细胞U87MG、分别利用培养基(培养基中DMEM培养液和胎牛血清的体积比为9∶1)培养在共聚焦培养皿上。放置于条件为37℃、5％(体积分数)CO2和20％(体积分数)O2的培养箱中培养24-48h。移除培养基，用PBS(磷酸盐缓冲溶液)洗三次，然后加入不含血清的杜尔贝科改良伊格尔(DMEM)培养基1mL，分别于各培养皿中加入5uL化合物I-1的1mM水溶液，继续在培养箱中培养30min，PBS冲洗培养细胞6次。利用共聚焦显微镜进行荧光成像，成像条件为：激发波长405nm，收集范围为：530-580nm。
图1表示各类活细胞与5uM化合物I-1共培养30min后的共聚焦成像图；其中，1(a)-(e)表示用405nm激光激发，530-580nm区间收集的荧光信号，1(f)-(j)表示与1(a)-(e)相对应的明场图。如图1所示，在上述各活细胞成像中，各细胞内几乎没有荧光信号(图1a-e)，表明化合物I-1对上述各正常活细胞的完整细胞膜通透性差。这可归因于化合物I-1分子结构中的六个强亲水性甲基吡啶阳离子基团，使得其难以穿过细胞膜的疏水区域。
这些细胞在没有营养物的情况下继续培养24小时以诱导凋亡，然后在相同条件下用化合物I-1染色30min。使用商业凋亡检测试剂盒(红色荧光染料标记的膜联蛋白、碘化丙啶)对细胞进行共培养，并基于试剂盒两种探针的信号分析细胞凋亡阶段。图2表示各类凋亡细胞与5uM化合物I-1共培养30min后再与5uM碘化丙啶和红色荧光标记的膜联蛋白共培养的共聚焦成像图；其中，2(a)-(e)表示用405nm激光激发，530-580nm区间收集的荧光信号，2(f)-(j)表示用560nm激光激发，570-670nm区间收集的荧光信号，2(k)-(o)表示用640nm激光激发，650-750nm区间收集的荧光信号，2(p)-(t)表示与(a)-(e)相对应的明场图。如图2所示，显示了化合物I-1可以进入实验中使用的六种类型的凋亡细胞(图2a-e)，并且显示出强荧光，这些细胞的凋亡状态可以由红色荧光染料标记的膜联蛋白的信号(图2k-o)证实。晚期凋亡细胞还可以通过核内碘化丙啶的同步荧光信号(图2f-j)来鉴别。在凋亡细胞中，化合物I-1的荧光信号主要与碘化丙啶的荧光信号一致，表明化合物I-1在细胞核内的分布是由于其与DNA结合所致，只能被碘化丙啶染色的为坏死细胞。图3表示化合物I-1在活细胞中识别凋亡细胞的成像结果，由图3可见，只有凋亡细胞中有强荧光，化合物I-1的荧光信号没有出现在坏死细胞中，表明探针可以区分凋亡细胞和坏死细胞。图3所示表明化合物I-1能准确从大量活细胞中区分出个别凋亡细胞。综上所述，这些结果证明了化合物I-1在细胞凋亡检测中的优异性能。
实施例13
化合物II-1在检测凋亡细胞的性能测试
将胰腺癌细胞BXPC-3、大脑胶质瘤细胞U87MG、卵巢癌细胞SKOV-3、宫颈癌Hela分别利用培养基(培养基中DMEM培养液和胎牛血清的体积比为9∶1)培养在共聚焦培养皿上。放置于条件为37℃、5％(体积分数)CO2和20％(体积分数)O2的培养箱中培养24-48h。移除培养基，用PBS洗三次，然后加入不含血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基，分别于各培养皿中加入本发明所述化合物II-1的溶液，继续在培养箱中培养30min，PBS冲洗培养细胞6次。利用共聚焦显微镜进行荧光成像，如图4所示，成像条件为：激发波长405nm，收集范围为：510-560nm。
图4表示各类活细胞与5uM化合物II-1共培养30min后的共聚焦成像图；其中，4(a)-(d)表示用405nm激光激发，530-580nm区间收集的荧光信号，4(e)-(h)表示与(a)-(d)相对应的明场图。如图4所示，在上述活细胞成像中，细胞内没有荧光信号(图4a-d)，表明化合物II-1对正常活细胞的完整细胞膜通透性差。这可归因于其分子结构中的六个强亲水性甲基吡啶阳离子基团，使得其难以穿过细胞膜的疏水区域。
这些细胞在没有营养物的情况下继续培养24小时以诱导凋亡，然后在相同条件下用化合物II-1染色30min。使用商业凋亡检测试剂盒(红色荧光染料标记的膜联蛋白/碘化丙啶)对细胞进行共培养，并基于试剂盒两种探针的信号分析细胞凋亡阶段。图5表示各类凋亡细胞与5uM化合物II-1共培养30min后再与5uM碘化丙啶和红色荧光标记的膜联蛋白共培养的共聚焦成像图；其中，5(a)-(d)表示用405nm激光激发，530-580nm区间收集的荧光信号，5(e)-(h)表示用560nm激光激发，570-670nm区间收集的荧光信号，5(i)-(l)表示用640nm激光激发，650-750nm区间收集的荧光信号，5(m)-(p)表示与5(a)-(d)相对应的明场图。图5a-d显示了化合物II-1可以进入实验中使用的六种类型的细胞，并且在细胞凋亡后显示出强荧光，这些细胞的凋亡状态可以由红色荧光染料标记的膜联蛋白的信号证实。晚期凋亡细胞可以通过核内碘化丙啶的同步荧光信号来鉴别。在凋亡细胞中，化合物II-1的荧光信号主要与碘化丙啶的荧光信号一致，表明其在细胞核内的分布是由于其与DNA结合所致。只能被碘化丙啶染色的为坏死细胞。

Claims (5)

1.一种荧光探针，其特征在于，其结构式如式I或式II所示：
Figure FSA0000267637030000011
其中，R为C1-C4烷基。
2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
式I所示的荧光探针的合成路线如下：
Figure FSA0000267637030000012
其中，R为C1-C4烷基；
(a)将化合物1溶于有机溶剂中，与正丁基锂、三氟化硼乙醚络合物反应得到化合物2；
(b)化合物3、化合物4、碳酸钾、四三苯基膦钯在溶剂中搅拌，反应得到化合物5；
(c)化合物2、化合物5、Pd2(dba)3、BINAP、叔丁基醇钠溶入有机溶剂中，反应得化合物6；
(d)化合物物6与C1-C4卤代烷基经烷基化反应，得到式I化合物。
3.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
式II所示的荧光探针的合成路线如下：
Figure FSA0000267637030000021
其中，R为C1-C4烷基；
(e)将化合物7溶于有机溶剂中，与正丁基锂、亚磷酸三乙酯反应后，加入双氧水得到化合物8；
(b)化合物3、化合物4、碳酸钾、四三苯基膦钯在溶剂中搅拌，反应得到化合物5；
(f)化合物8、化合物5、Pd2(dba)3、BINAP、叔丁基醇钠溶入有机溶剂中，反应得到化合物9；
(g)化合物9与C1-C4卤代烷基经烷基化反应，得到式II化合物。
4.如权利要求1所述的荧光探针，其中，R为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
5.一种如权利要求1所述的荧光探针在检测细胞凋亡上的应用。
CN202210200860.4A 2022-02-24 2022-02-24 用于检测凋亡细胞的荧光探针及其制备方法 Active CN114957299B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210200860.4A CN114957299B (zh) 2022-02-24 2022-02-24 用于检测凋亡细胞的荧光探针及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210200860.4A CN114957299B (zh) 2022-02-24 2022-02-24 用于检测凋亡细胞的荧光探针及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114957299A true CN114957299A (zh) 2022-08-30
CN114957299B CN114957299B (zh) 2024-04-09

Family

ID=82976387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210200860.4A Active CN114957299B (zh) 2022-02-24 2022-02-24 用于检测凋亡细胞的荧光探针及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114957299B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116217435A (zh) * 2023-02-08 2023-06-06 新乡医学院 一种检测dna损伤的荧光探针及其制备方法和应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5483435A (en) * 1977-12-15 1979-07-03 Ricoh Co Ltd Photoreceptor for electrophtography
JP2001093670A (ja) * 1999-09-28 2001-04-06 Konica Corp 有機エレクトロルミネッセンス素子
JP2007108309A (ja) * 2005-10-12 2007-04-26 Konica Minolta Business Technologies Inc 有機感光体、画像形成方法及び画像形成装置
US20090269793A1 (en) * 2005-10-11 2009-10-29 Centre National De La Recherche Scientifiique (CNRS) Compounds and Kits for the Detection and the Quantification of Cell Apoptosis
CN101747372A (zh) * 2010-01-21 2010-06-23 中国科学院长春应用化学研究所 芳胺类化合物、含芳胺类化合物的有机电致发光器件及其制备方法
CN103450238A (zh) * 2013-09-03 2013-12-18 太仓碧奇新材料研发有限公司 一种硼核星状空穴传输材料及其制备方法
CN108033979A (zh) * 2017-12-12 2018-05-15 北京启顺京腾科技有限责任公司 一种甲醇汽油添加剂及其制备方法与应用
CN112300121A (zh) * 2020-10-27 2021-02-02 四川大学华西医院 一种能专一性标记细胞膜的n-芳基取代咔唑类荧光探针及其制备方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5483435A (en) * 1977-12-15 1979-07-03 Ricoh Co Ltd Photoreceptor for electrophtography
JP2001093670A (ja) * 1999-09-28 2001-04-06 Konica Corp 有機エレクトロルミネッセンス素子
US20090269793A1 (en) * 2005-10-11 2009-10-29 Centre National De La Recherche Scientifiique (CNRS) Compounds and Kits for the Detection and the Quantification of Cell Apoptosis
JP2007108309A (ja) * 2005-10-12 2007-04-26 Konica Minolta Business Technologies Inc 有機感光体、画像形成方法及び画像形成装置
CN101747372A (zh) * 2010-01-21 2010-06-23 中国科学院长春应用化学研究所 芳胺类化合物、含芳胺类化合物的有机电致发光器件及其制备方法
CN103450238A (zh) * 2013-09-03 2013-12-18 太仓碧奇新材料研发有限公司 一种硼核星状空穴传输材料及其制备方法
CN108033979A (zh) * 2017-12-12 2018-05-15 北京启顺京腾科技有限责任公司 一种甲醇汽油添加剂及其制备方法与应用
CN112300121A (zh) * 2020-10-27 2021-02-02 四川大学华西医院 一种能专一性标记细胞膜的n-芳基取代咔唑类荧光探针及其制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116217435A (zh) * 2023-02-08 2023-06-06 新乡医学院 一种检测dna损伤的荧光探针及其制备方法和应用
CN116217435B (zh) * 2023-02-08 2023-09-26 新乡医学院 一种检测dna损伤的荧光探针及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114957299B (zh) 2024-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5319714B2 (ja) 過酸化水素検出方法に用いるシグナリング化合物
CA3018564A1 (en) Ultra bright dimeric or polymeric fluorescent and colored dyes
GB2283744A (en) Diaminoxanthenes
CN110927137B (zh) 一种基于单苯环骨架的细胞脂滴荧光成像探针及其应用
CN110218220A (zh) 一种功能化金属-有机框架化合物、其形成的复合物及其制备方法和应用
CN114957299B (zh) 用于检测凋亡细胞的荧光探针及其制备方法
CN109824565A (zh) 一种光响应性多功能化学交联剂及其制备方法与应用
CN111440143B (zh) 基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物及其制备方法与应用
CN110272432B (zh) 一种耐酸性光控荧光分子开关及其合成方法和应用
CN110746423B (zh) 芳基咪唑并菲啰啉荧光染料的合成及对金属离子的识别
US5958673A (en) Fluorescent dye
CN112341379A (zh) 多芳基硫吡啶正离子盐光控细胞焦亡材料及其制备方法和应用
CN107286926B (zh) 基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料及其制备方法和应用
CN112266388B (zh) 一类具有标记功能用于超分辨成像的亚硝基笼化罗丹明衍生物及应用
CN110642848B (zh) 可见光与近红外荧光染料的合成与其应用
CN113563298A (zh) 一类含水溶性取代基罗丹明荧光染料其制备方法和应用
CN113651821A (zh) 一种基于吡咯并吡咯二酮的衍生物荧光探针及其在应用
CN115028652B (zh) 用于卵巢癌光动力诊疗的高光敏性荧光探针
CN108440386B (zh) 一种双光子荧光pH探针的制备方法及其在细胞成像中的应用
CN117777151B (zh) 一种af594tsa的制备方法
CN112250700A (zh) 氟硼二吡咯类蛋白质错误折叠探针Halo-BODIPY及其制备方法与应用
CN110862405A (zh) 实时检测细胞内nadh/nad+的荧光探针材料及制备方法和应用
CN114890958B (zh) 双光子染料化合物、其制备方法及其应用
CN114853665B (zh) 一种荧光化合物及其制备方法和应用
CN116041225B (zh) 一种前列腺特异性膜抗原靶向的aie荧光化合物及制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant