CN106460232A - 用于原位合成的探针阵列的寡核苷酸探针倒转方法 - Google Patents

用于原位合成的探针阵列的寡核苷酸探针倒转方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106460232A
CN106460232A CN201580027347.8A CN201580027347A CN106460232A CN 106460232 A CN106460232 A CN 106460232A CN 201580027347 A CN201580027347 A CN 201580027347A CN 106460232 A CN106460232 A CN 106460232A
Authority
CN
China
Prior art keywords
connector
branch
group
cyclisation
coupled
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580027347.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106460232B (zh
Inventor
格伦·麦克加尔
维贾伊·辛格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shengjie Technology (Hangzhou) Co.,Ltd.
Shengjie Technology (Jiaxing) Co.,Ltd.
Original Assignee
Sheng Jie Technology Holdings Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sheng Jie Technology Holdings Ltd filed Critical Sheng Jie Technology Holdings Ltd
Publication of CN106460232A publication Critical patent/CN106460232A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106460232B publication Critical patent/CN106460232B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/14—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support
    • C40B50/18—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support using a particular method of attachment to the solid support

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Structural Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及用于在原位合成的阵列中倒转寡核苷酸探针的方法。这些方法可用于将探针相对于基底的取向由3'结合的倒转为5'结合的。这些方法也可用于从原位合成的阵列中减少或消除截短的探针序列的存在。

Description

用于原位合成的探针阵列的寡核苷酸探针倒转方法
交叉引用
本申请要求于2014年5月23日提交的美国临时专利申请号62/002,760的权益，该申请通过引用并入本文。
背景技术
例如通过光刻法，在原位合成的阵列上合成寡核苷酸探针，可产生不完整的或“截短的”探针序列的群体，其伴随以期望或预期的全长合成的探针序列(“全长”探针序列)。截短的探针序列的存在可能对阵列的性能有不利影响，尤其是在需要酶访问(addressing)游离探针末端的试验(例如，聚合酶延伸反应，连接反应)中。
与此相反，固定在珠阵列(例如，Illumina)和其他打点阵列上的寡核苷酸探针可以通过以合成方式附接在该探针的5'末端上的胺或其他官能团而附接在它们的基底上。用这种方式，仅全长序列可以得到固定，从而可以减少或几乎消除与暴露的游离3'末端相关联的截短或其他缺陷。
发明内容
可能希望从原位合成的阵列(诸如，采用光刻法制备的那些阵列)上的探针中选择性地除去截短的合成后探针序列。本发明提供了实现这种对截短序列的选择性去除，并同时倒转探针序列的取向，以便可以将从3'末端合成的探针序列转变为通过它们的5'末端附接至基底上的探针序列的方法。
具体而言，本发明包括用于原位合成的阵列的探针倒转方法，其可采用通用连接体和市售的构件和试剂。这些方法可包括引入用于释放游离3'-OH末端的通用可切割连接体亚磷酰胺(phosphoramidite)，引入用于寡核苷酸合成和合成后环化的具有可正交访问的官能团的分支连接体，利用市售试剂用于环化步骤的更有效的交联化学过程，以及其他改进。之前尝试在原位合成的阵列上倒转探针的方法涉及大量特定连接体、构件和试剂，这可以使得在大规模生产原位合成的阵列中的应用不切实际。
本发明的一个方面提供了一种方法，其包括：(a)提供基底；(b)将分支连接体偶联至所述基底，其中所述分支连接体包含(i)包含合成后反应性基团的第一分支，和(ii)第二分支；(c)将可切割连接体偶联至所述第二分支；(d)以3'到5'取向在所述可切割连接体上合成寡核苷酸，所述寡核苷酸包含(i)通过所述可切割连接体偶联至所述第二分支的3'末端，以及(ii)偶联至OH基团的5'末端；(e)使所述OH基团发生反应，以提供偶联至所述寡核苷酸的所述5'末端的环化基团；(f)通过将所述环化基团与所述合成后反应性基团进行反应而使所述寡核苷酸发生环化，从而使所述寡核苷酸的所述5'末端偶联至所述第一分支；以及(g)切割所述可切割连接体，从而使所述寡核苷酸的所述3'末端从所述第二分支上解偶联(de-coupling)。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述分支连接体通过与所述基底结合的OH基团偶联至所述基底。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述分支连接体包含图3A中所示的结构。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述分支连接体包含图3B中所示的结构。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述可切割连接体包含图4A中所示的结构。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述可切割连接体包含图4B中所示的结构。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述分支连接体通过与所述基底结合的OH基团偶联至所述基底。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述环化利用磷酸三酯或H-膦酸酯化学过程来进行。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述环化利用甲酰胺偶联来进行。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述环化利用Huisgen“点击”化学过程来进行。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述环化利用硫代磷酸酯-BrAc化学过程来进行。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述环化利用硫代磷酸酯-卤代烷化学过程来进行。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述切割包括使用NH4OH进行脱保护。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述合成包括光刻法。
本发明的一个方面提供了一种方法，其包括：(a)提供包含多个位点的基底；(b)将分支连接体偶联至所述多个位点中的每一个，其中所述分支连接体包含(i)包含合成后反应性基团的第一分支，和(ii)第二分支；(c)将可切割连接体偶联至每个所述位点上所述分支连接体的所述第二分支；(d)在每个所述位点上的所述可切割连接体上以3'到5'取向合成寡核苷酸探针，从而产生(i)于3'末端处偶联至第一位点的所述可切割连接体上并且于5'末端处偶联至OH基团上的全长寡核苷酸，其中所述全长寡核苷酸包含目标数目的核苷酸，和(ii)于3'末端处偶联至第二位点的所述可切割连接体上并且在5'末端处缺少OH基团的截短的寡核苷酸，其中所述截短的寡核苷酸包含少于所述目标数目的核苷酸；以及(e)使偶联至所述全长寡核苷酸的所述5'末端的所述OH基团发生反应，以提供偶联至所述全长寡核苷酸的所述5'末端上的环化基团；(f)通过将所述环化基团与所述第一位点上所述分支连接体的所述合成后反应性基团进行反应而使得所述全长寡核苷酸发生环化，从而使所述全长寡核苷酸的所述5'末端偶联至所述第一位点上所述分支连接体的所述第一分支；以及(g)切割所述多个位点中的每一个上的所述可切割连接体，从而(i)使所述全长寡核苷酸的所述3'末端从所述第一位点上所述分支连接体的所述第二分支上解偶联，并且(ii)从所述第二位点释放所述截短的寡核苷酸。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述分支连接体通过与所述基底结合的OH基团偶联至所述基底。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述分支连接体包含图3A中所示的结构。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述分支连接体包含图3B中所示的结构。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述可切割连接体包含图4A中所示的结构。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述可切割连接体包含图4B中所示的结构。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述分支连接体通过与所述基底结合的OH基团偶联至所述基底。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述环化利用磷酸三酯或H-膦酸酯化学过程来进行。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述环化利用甲酰胺偶联来进行。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述环化利用Huisgen“点击”化学过程来进行。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述环化利用硫代磷酸酯-BrAc化学过程来进行。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述环化利用硫代磷酸酯-卤代烷化学过程来进行。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述切割包括利用NH4OH进行脱保护。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述合成包括光刻法。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述切割从所述多个位点释放至少50％的寡核苷酸，其包含少于所述目标数目的核苷酸。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述切割从所述多个位点释放至少70％的寡核苷酸，其包含少于所述目标数目的核苷酸。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述切割从所述多个位点释放至少90％的寡核苷酸，其包含少于所述目标数目的核苷酸。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：
图1示出了探针倒转方法的示例性示意图。
图2A示出了探针倒转方法的第一部分的示例性示意图。
图2B示出了探针倒转方法的第二部分的示例性示意图。
图3A示出了分支连接体的示例性通式。
图3B示出了分支连接体的示例性通式。
图4A示出了可切割连接体的示例性通式。
图4B示出了可切割连接体的示例性通式。
图5A示出了利用磷酸三酯或H-膦酸酯化学过程的环化化学过程的示例性示意图。
图5B示出了利用甲酰胺偶联的环化化学过程的示例性示意图。
图5C示出了利用Huisgen“点击”化学过程的环化化学过程的示例性示意图。
图5D示出了利用硫代磷酸酯-BrAc化学过程的环化化学过程的示例性示意图。
图5E示出了利用硫代磷酸酯-卤代烷化学过程的环化化学过程的示例性示意图。
图6示出了利用碘化物和硫代磷酸酯化学过程的探针倒转方法的第二部分的示例性示意图。
图7A示出了SiO2基底硅烷化的示例性步骤。
图7B示出了将分支连接体添加到硅烷化的基底表面上的示例性步骤。
图7C示出了用光活化的寡核苷酸合成化学过程的连续循环添加连接体亚磷酰胺的示例性步骤。
图7D示出了用光引导的合成添加通用可切割连接体的示例性步骤。
图7E示出了继续光刻合成以完成寡核苷酸序列阵列的示例性步骤。
图7F示出了将6-溴己基亚磷酰胺添加到寡核苷酸序列的示例性步骤。
图7G示出了通过用二甲基甲酰胺中的叠氮化钠处理，用叠氮基替代溴的示例性步骤。
图7H示出了以5'-叠氮基和靠近基底表面的炔部分进行Huisgen(“点击”)反应的示例性步骤。
图7I示出了从寡核苷酸序列的碱基上除去酰基保护基并在3'端切割通用连接体的示例性步骤。
具体实施方式
本发明提供了原位合成的寡核苷酸探针的环化方法。本文公开的方法也可以减少或消除截短的寡核苷酸探针(其不含完整的合成寡核苷酸序列)，同时保留全长寡核苷酸探针(其包含完整的合成寡核苷酸序列)。
术语“寡核苷酸”可以指核苷酸链。在一些情况下，寡核苷酸为少于200个残基的长度，例如15到100个核苷酸的长度。寡核苷酸可以包含至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个碱基。寡核苷酸可以为约3至约5个碱基、约1至约50个碱基、约8至约12个碱基、约15至约25个碱基、约25至约35个碱基、约35至约45个碱基，或约45至约55个碱基。寡核苷酸(也被称为“oligo”)可以是任何类型的寡核苷酸(例如，引物)。寡核苷酸可以包含天然核苷酸、非天然核苷酸或它们的组合。
如本文所用的术语“约”是指指定量的+/-10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
图1示出了寡核苷酸探针倒转方法的示意图，该方法将全长寡核苷酸探针由相对于合成基底的3'-5'取向倒转为相对于合成基底的5'-3'取向，同时还去除截短的寡核苷酸探针。提供包含活性表面基团101的合成基底100。连接体102偶联至所述活性表面基团，并且原位进行寡核苷酸合成，从而以3'-5'取向产生截短的寡核苷酸探针103和全长寡核苷酸探针104。仅向全长寡核苷酸探针的5'上提供环化基团105。然后，该环化基团朝向连接体环化，从而将全长寡核苷酸的5'末端偶联至基底上。最后，切割位于合成寡核苷酸的3'末端上的连接体，从而释放截短的寡核苷酸探针，而留下仅在5'末端偶联至基底上的全长寡核苷酸探针。
图2A和图2B示出了探针倒转方法化学过程的示例性示意图。例如，从图2A开始，提供具有包含OH基团的活性表面基团201的合成基底200。该活性表面基团发生反应211，以将包含合成后反应性基团203的分支连接体亚磷酰胺(amidite)(BL)202偶联至基底上。分支连接体亚磷酰胺可以通过标准DNA合成方案添加至合成基底上。示例性的分支连接体亚磷酰胺示于图3A和图3B中。该分支连接体发生反应212，以将可切割连接体亚磷酰胺(CL)204偶联至该分支连接体。可切割连接体可以通过标准DNA合成方案添加至合成基底上。示例性的可切割连接体亚磷酰胺示于图4A和图4B中。以标准的3'到5'取向原位进行寡核苷酸合成213，从而产生偶联至可切割连接体的寡核苷酸探针。全长寡核苷酸探针205具有5'OH基团，而截短的寡核苷酸探针则加帽。继续如图2B，全长寡核苷酸探针5'末端的OH基团发生反应214，以向该探针的5'末端添加环化基团206，并激活分支连接体上的合成后反应性基团207。该环化基团和该合成后反应性基团发生反应215，以产生环化的全长寡核苷酸探针208。截短的寡核苷酸探针保持未环化。采用标准的脱保护反应216(例如，使用NH4OH)使寡核苷酸探针脱保护并切割3'末端可切割连接体。这产生倒转的全长寡核苷酸探针209，此时其在5'末端处偶联至基底。经切割的可切割连接体210得以保留，而截短的寡核苷酸探针则从基底上释放。
本文描述的方法可以采用不同的环化化学过程。示例性的环化化学过程示于图5A、图5B、图5C、图5D和图5E中。图5A示出了利用磷酸三酯或H-膦酸酯化学过程的环化化学过程的示例性示意图。如图所示，提供了全长寡核苷酸探针的5'末端的OH基团501和合成后反应性基团502。如图所示的环化基团503偶联至全长寡核苷酸探针的5'末端，并且如图所示激活504合成后反应性基团。该环化基团和该合成后反应性基团发生环化505。可用作503和505中所示的PG基团的示例基团示于506。图5B示出了利用甲酰胺偶联的环化化学过程的示例性示意图。提供全长寡核苷酸探针的5'末端的OH基团和合成后反应性基团512。如图所示的环化基团513偶联至全长寡核苷酸探针的5'末端。该环化基团和该合成后反应性基团发生环化515。图5C示出了利用Huisgen“点击”化学过程的环化化学过程的示例性示意图。如图所示，提供全长寡核苷酸探针的5'末端的OH基团521和合成后反应性基团522。如图所示的环化基团523偶联至全长寡核苷酸探针的5'末端，并且如图所示激活524合成后反应性基团。通过利用Cu+，该环化基团和该合成后反应性基团发生环化525。图5D示出了利用硫代磷酸酯-BrAc化学过程的环化化学过程的示例性示意图。如图所示，提供全长寡核苷酸探针的5'末端的OH基团531和合成后反应性基团532。如图所示的环化基团533偶联至全长寡核苷酸探针的5'末端，并且如图所示激活534合成后反应性基团。该环化基团和该合成后反应性基团发生环化535。图5E示出了利用硫代磷酸酯-卤代烷化学过程的环化化学过程的两个示例性示意图。如图所示，提供全长寡核苷酸探针的5'末端的OH基团541和合成后反应性基团542。如图所示的环化基团543或553偶联至全长寡核苷酸探针的5'末端，并且如图所示激活544合成后反应性基团。该环化基团和该合成后反应性基团发生环化545或555。环化可以在偶联至相同分支连接体上的环化基团与合成后反应性基团之间发生，或者，环化可以在不同的邻近分支连接体的环化基团与合成后反应性基团之间发生。
合成基底可以具有不同的形式或形状，诸如流动池、测序流动池、流动通道、微流体通道、毛细管、压电表面、孔、微孔、微孔阵列、微阵列、芯片、晶片、表面阵列、非磁性珠、磁珠、铁磁珠、顺磁珠、超顺磁珠以及聚合物凝胶。
合成基底可以包含任何适宜的材料，包括但不限于玻璃(例如，可控多孔玻璃)、二氧化硅、氧化钛、氧化铝、氧化铟锡(ITO)、硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、聚环烯烃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、其他塑料、钛或金。
基底可以包含聚合物涂层或凝胶，如聚丙烯酰胺凝胶或PDMS凝胶。凝胶和涂层可以额外地包含用于改变其物理化学性质例如疏水性的组分。例如，聚丙烯酰胺凝胶或涂层可以在其聚合物结构中包含改性的丙烯酰胺单体，诸如乙氧基化的丙烯酰胺单体、磷酰胆碱丙烯酰胺单体、甜菜碱丙烯酰胺单体及其组合。
释放截短的探针序列可以提高存在于阵列中的全长序列的百分比。在一些情况下，在探针倒转方法之后，仍然与阵列基底结合的探针中有至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或99.999％为全长序列。在一些情况下，在探针倒转方法之后，仍然与阵列基底结合的探针全部或基本上全部为全长序列。在一些情况下，探针倒转方法可以释放至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或99.999％的在探针倒转方法之前与阵列基底结合的截短的探针。在一些情况下，探针倒转方法可以释放在探针倒转方法之前与阵列基底结合的全部或基本上全部截短的探针。
实施例1-寡核苷酸探针的合成和倒转
对适宜的平面基底如玻璃、二氧化硅或具有天然氧化物层的硅进行清洁，并用共价键合的伯羟基烷基基团的表面层进行“激活”，该基团作为寡核苷酸合成的表面起始位点。可以使用以前描述的多种方法中的任意一种(参见例如，美国专利号5,959,098–“Substrate preparation process；”J.Am.Chem.Soc.1997,119(22),5081–“Theefficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates；”美国专利号6,262,216–“Functionalized silicon compounds and methods for theirsynthesis and use；”美国专利号8,105,821–“Silane mixtures；”美国专利公开号2013165350A1–“Surface Linkers for Array Synthesis”)。在本实施例中，将晶片利用硫酸-过氧化氢混合物(例如，NanostripTM)来清洁；用水冲洗，并干燥。然后通过利用包含N-(2-羟乙基)-N,N-双(3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基)胺和N-(2-氰乙基)-N,N-双(3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基)胺(比例为1:0至1:20，硅烷总浓度为1-10％w/v)在乙醇中的混合物的溶液处理，对基底进行硅烷化1-8小时(参见例如，图7A)。在硅烷化之后，将硅烷化的基底用乙醇和水冲洗，并且最后进行干燥。该基底已准备好进行阵列合成。
随后将基底的活性表面放置在与自动化寡核苷酸合成仪相连接的密封流动池上，并利用标准固相寡核苷酸合成方案，将具有炔侧链的分支连接体(例如，炔修饰的丝氨醇亚磷酰胺，Glen Research，P/N 10-1992)添加至基底表面上。随后是利用三氯乙酸的去封闭步骤，以暴露连接体的羟基以便之后添加亚磷酰胺(参见例如，图7B)。任选地，可在炔亚磷酰胺附接之前引入一个或多个间隔亚磷酰胺。炔侧链是这样的部分：一旦所有的全长探针序列均完成，其随后会发生反应，与附接至寡核苷酸探针序列5'末端的叠氮基形成共价键。
然后，通过光活化的寡核苷酸合成化学过程的连续循环添加一个或多个间隔亚磷酰胺(参见例如，图7C)，在别处已经描述了其中的细节(参见例如，J.Am.Chem.Soc.1997,119(22),5081–“The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays onglass substrates；”Methods in Molecular Biology,2001,170,71,Rampal JB,ed.–“Photolithographic synthesis of high-density oligonucleotide arrays；”CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry 2005,12:12.5.1–12.5.10–“DNA MicroarrayPreparation by Light-Controlled In Situ Synthesis”)。除非另有说明，否则在后续步骤中使用相同的偶联方法来延伸和修饰构成阵列的所有寡核苷酸链。
然后利用光引导的合成方案来添加通用的可切割连接体(例如，通用亚磷酰胺(Universal Phosphoramidite)，AM Chemicals，P/N 02120)(参见例如，图7D，上图)，随后添加与待合成的探针序列的第一个核苷酸相对应的5'-PPG-保护的核苷酸(参见例如，图7D，下图)。这一对步骤重复4次，每次利用一个独特的光刻掩模将A、G、C和T这四种核苷酸通过通用连接体附接至基底区域，该基底区域已经被指定用于在3'位置以该碱基起始的序列。继续进行光刻合成以完成寡核苷酸序列的阵列(参见例如，图7E——注意所有序列均被上位地描绘)。
在阵列中的探针序列完成并且5'末端脱保护后，将6-溴己基亚磷酰胺(例如，GlenResearch，P/N 10-1992)添加到阵列中所有序列的5'末端上(参见例如，图7F)。然后通过利用二甲基甲酰胺中的叠氮化钠处理该阵列，用叠氮基替代溴(参见例如，图7G)。
然后进行Huisgen(“点击”)反应，其中5'-叠氮基与靠近基底表面的炔部分反应(参见例如，JACS,2007,129(21),6859–“Template-Directed Oligonucleotide StrandLigation,Covalent Intramolecular DNA Circularization and Catenation UsingClick Chemistry”)。通过加入硫酸铜[II]、抗坏血酸钠和诸如三-三唑基胺的配体的水溶液催化该环加成反应。任选地，该溶液在加入前脱氧。这导致在该寡核苷酸的5'末端之间形成1,2,3-三唑形式的共价连接(参见例如，图7H)。为了简便起见，将该“点击”反应描绘成在同一寡核苷酸分子内的叠氮基与炔之间发生。然而，该反应也可以在两个不同却相邻的寡核苷酸上的官能团之间发生，这只是可能的，而不是重要的。
然后用NH4OH、CH3NH2、NH2CH2CH2NH2或其混合物处理整个阵列基底。这从寡核苷酸序列的碱基上除去酰基保护基，并且也切割在3'末端的通用连接体，释放出它们的游离3'-羟基末端，同时它们通过5'-三唑连接仍然与支持物共价结合(参见例如，图7I)。
实施例2-检测倒转效率
如实施例1所述制备寡核苷酸探针阵列。在倒转之前，序列在3'末端处附接至基底，因此由于3'-羟基被封闭，它们将无法作为DNA聚合酶的起始位点。一旦倒转，该阵列上的序列的3'-羟基就暴露出来并且能够作为DNA聚合酶的起始位点。因此，通过使阵列上的序列与具有3’突出端的互补寡核苷酸序列进行杂交来简单地验证探针的倒转。然后将DNA聚合酶与荧光标记后的脱氧核苷三磷酸一起加至阵列。这导致杂交的探针序列延伸一个或多个荧光核苷酸，这可以通过利用荧光显微镜对阵列进行成像而方便地检测。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到许多变化、改变和替代。应当理解，本文描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。意欲以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (31)

1.一种方法，其包括：
(a)提供基底；
(b)将分支连接体偶联至所述基底，其中所述分支连接体包含(i)包含合成后反应性基团的第一分支，和(ii)第二分支；
(c)将可切割连接体偶联至所述第二分支；
(d)以3'到5'取向在所述可切割连接体上合成寡核苷酸，所述寡核苷酸包含(i)通过所述可切割连接体偶联至所述第二分支的3'末端，以及(ii)偶联至OH基团的5'末端；
(e)使所述OH基团发生反应以提供偶联至所述寡核苷酸的所述5'末端的环化基团；
(f)通过将所述环化基团与所述合成后反应性基团进行反应而使所述寡核苷酸发生环化，从而使所述寡核苷酸的所述5'末端偶联至所述第一分支；以及
(g)切割所述可切割连接体，从而使所述寡核苷酸的所述3'末端从所述第二分支上解偶联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分支连接体通过与所述基底结合的OH基团偶联至所述基底。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述分支连接体包含图3A中所示的结构。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述分支连接体包含图3B中所示的结构。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述可切割连接体包含图4A中所示的结构。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述可切割连接体包含图4B中所示的结构。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述环化基团包含叠氮基，并且所述合成后反应性基团包含炔。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述环化利用磷酸三酯或H-膦酸酯化学过程来进行。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述环化利用甲酰胺偶联来进行。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述环化利用Huisgen“点击”化学过程来进行。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述环化利用硫代磷酸酯-BrAc化学过程来进行。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述环化利用硫代磷酸酯-卤代烷化学过程来进行。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述切割包括利用NH4OH进行脱保护。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述合成包括光刻法。
15.一种方法，其包括：
(a)提供包含多个位点的基底；
(b)将分支连接体偶联至所述多个位点中的每一个，其中所述分支连接体包含(i)包含合成后反应性基团的第一分支，和(ii)第二分支；
(c)将可切割连接体偶联至每个所述位点上所述分支连接体的所述第二分支；
(d)在每个所述位点上的所述可切割连接体上以3'到5'取向合成寡核苷酸探针，从而产生(i)于3'末端处偶联至第一位点的所述可切割连接体上并且于5'末端处偶联至OH基团上的全长寡核苷酸，其中所述全长寡核苷酸包含目标数目的核苷酸，和(ii)于3'末端处偶联至第二位点的所述可切割连接体上并且在5'末端处缺少OH基团的截短的寡核苷酸，其中所述截短的寡核苷酸包含少于所述目标数目的核苷酸；以及
(e)使偶联至所述全长寡核苷酸的所述5'末端的所述OH基团发生反应，以提供偶联至所述全长寡核苷酸的所述5'末端上的环化基团；
(f)通过将所述环化基团与所述第一位点上所述分支连接体的所述合成后反应性基团进行反应而使所述全长寡核苷酸发生环化，从而使所述全长寡核苷酸的所述5'末端偶联至所述第一位点上所述分支连接体的所述第一分支；以及
(g)切割所述多个位点中的每一个上的所述可切割连接体，从而(i)使所述全长寡核苷酸的所述3'末端从所述第一位点上所述分支连接体的所述第二分支上解偶联，并且(ii)从所述第二位点释放所述截短的寡核苷酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述分支连接体通过与所述基底结合的OH基团偶联至所述基底。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述分支连接体包含图3A中所示的结构。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述分支连接体包含图3B中所示的结构。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述可切割连接体包含图4A中所示的结构。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述可切割连接体包含图4B中所示的结构。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述环化基团包含叠氮基，并且所述合成后反应性基团包含炔。
22.根据权利要求15所述的方法，其中所述环化利用磷酸三酯或H-膦酸酯化学过程来进行。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述环化利用甲酰胺偶联来进行。
24.根据权利要求15所述的方法，其中所述环化利用Huisgen“点击”化学过程来进行。
25.根据权利要求15所述的方法，其中所述环化利用硫代磷酸酯-BrAc化学过程来进行。
26.根据权利要求15所述的方法，其中所述环化利用硫代磷酸酯-卤代烷化学过程来进行。
27.根据权利要求15所述的方法，其中所述切割包括利用NH4OH进行脱保护。
28.根据权利要求15所述的方法，其中所述合成包括光刻法。
29.根据权利要求15所述的方法，其中所述切割从所述多个位点释放至少50％的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含少于所述目标数目的核苷酸。
30.根据权利要求15所述的方法，其中所述切割从所述多个位点释放至少70％的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含少于所述目标数目的核苷酸。
31.根据权利要求15所述的方法，其中所述切割从所述多个位点释放至少90％的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含少于所述目标数目的核苷酸。
CN201580027347.8A 2014-05-23 2015-05-22 用于原位合成的探针阵列的寡核苷酸探针倒转方法 Active CN106460232B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462002760P 2014-05-23 2014-05-23
US62/002,760 2014-05-23
PCT/US2015/032227 WO2015179790A1 (en) 2014-05-23 2015-05-22 Oligonucleotide probe inversion process for in situ synthesized probe arrays

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106460232A true CN106460232A (zh) 2017-02-22
CN106460232B CN106460232B (zh) 2019-12-24

Family

ID=54554851

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580027347.8A Active CN106460232B (zh) 2014-05-23 2015-05-22 用于原位合成的探针阵列的寡核苷酸探针倒转方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10533216B2 (zh)
EP (1) EP3146094B1 (zh)
CN (1) CN106460232B (zh)
WO (1) WO2015179790A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111542532A (zh) * 2017-10-04 2020-08-14 生捷科技控股公司 酶法合成寡核苷酸的方法和体系
CN114621307A (zh) * 2022-04-12 2022-06-14 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种寡核苷酸空间坐标编码方法及其微流控装置

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106460232B (zh) 2014-05-23 2019-12-24 生捷科技控股公司 用于原位合成的探针阵列的寡核苷酸探针倒转方法
US10689690B2 (en) 2015-08-13 2020-06-23 Centrillion Technology Holdings Corporation Library construction using Y-adapters and vanishing restriction sites
US10695735B2 (en) 2015-08-18 2020-06-30 Centrillion Technology Holdings Corporation Probe inversion process for in situ synthesized probe arrays
EP3133171B1 (en) * 2015-08-18 2018-10-17 Centrillion Technology Holdings Corporation Probe inversion process for in situ synthesized probe arrays
WO2018102660A1 (en) * 2016-12-02 2018-06-07 Centrillion Technologies, Inc. In situ probe inversion process for constructing probe arrays
EP3768881A4 (en) * 2018-03-21 2021-12-15 Centrillion Technology Holdings Corporation METHOD AND SYSTEM FOR PRODUCING DNA SEQUENCING ARRAYS

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998051698A1 (en) * 1997-05-14 1998-11-19 Marek Kwiatkowski Synthesis of oligonucleotides
US20040152905A1 (en) * 2003-01-31 2004-08-05 Guzaev Andrei P. Universal building blocks and support media for synthesis of oligonucleotides and their analogs
US20080305964A1 (en) * 2004-12-15 2008-12-11 Roy Bar-Ziv Single-Step Platform for On-Chip Integration of Bio-Molecules
US20120035115A1 (en) * 2008-09-23 2012-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with cycloaddition
CN102702010A (zh) * 2012-05-23 2012-10-03 北京大学 光敏感的功能化固载相及其制备方法和应用
CN103502218A (zh) * 2011-03-04 2014-01-08 生命科技公司 用于缀合生物分子的化合物和方法

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5242974A (en) 1991-11-22 1993-09-07 Affymax Technologies N.V. Polymer reversal on solid surfaces
US6077668A (en) * 1993-04-15 2000-06-20 University Of Rochester Highly sensitive multimeric nucleic acid probes
US5959098A (en) * 1996-04-17 1999-09-28 Affymetrix, Inc. Substrate preparation process
US6077608A (en) 1996-09-19 2000-06-20 Ppg Industries Ohio, Inc. Multilayered coating with powder clear coating and substrates therewith and method
US6262216B1 (en) * 1998-10-13 2001-07-17 Affymetrix, Inc. Functionalized silicon compounds and methods for their synthesis and use
US6255476B1 (en) * 1999-02-22 2001-07-03 Pe Corporation (Ny) Methods and compositions for synthesis of labelled oligonucleotides and analogs on solid-supports
US20070275411A1 (en) 2006-05-25 2007-11-29 Mcgall Glenn H Silane mixtures
CA3152535C (en) 2004-05-13 2023-08-29 Nanobiosym, Inc. Nano-pcr: methods and devices for nucleic acid amplification and detection
WO2006053571A2 (en) 2004-11-22 2006-05-26 Peter Birk Rasmussen Template directed split and mix systhesis of small molecule libraries
US7749701B2 (en) 2005-08-11 2010-07-06 Agilent Technologies, Inc. Controlling use of oligonucleotide sequences released from arrays
US8114636B2 (en) 2006-02-10 2012-02-14 Life Technologies Corporation Labeling and detection of nucleic acids
US20110257385A1 (en) * 2010-02-23 2011-10-20 Life Technologies Corporation Methods for flip-strand immobilizing and sequencing nucleic acids
GB201004292D0 (en) * 2010-03-15 2010-04-28 Olink Ab Assay for localised detection of analytes
CN103429754B (zh) 2010-09-23 2016-08-10 桑特里莱恩科技控股公司 天然延伸平行测序
JP6017458B2 (ja) 2011-02-02 2016-11-02 ユニヴァーシティ・オブ・ワシントン・スルー・イッツ・センター・フォー・コマーシャリゼーション 大量並列連続性マッピング
US20130165350A1 (en) * 2011-12-22 2013-06-27 Affymetrix, Inc. Surface linkers for array synthesis
US9328382B2 (en) 2013-03-15 2016-05-03 Complete Genomics, Inc. Multiple tagging of individual long DNA fragments
US10329614B2 (en) 2013-08-02 2019-06-25 Stc.Unm DNA sequencing and epigenome analysis
CN106460232B (zh) 2014-05-23 2019-12-24 生捷科技控股公司 用于原位合成的探针阵列的寡核苷酸探针倒转方法
EP3133171B1 (en) 2015-08-18 2018-10-17 Centrillion Technology Holdings Corporation Probe inversion process for in situ synthesized probe arrays
WO2018102660A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 Centrillion Technologies, Inc. In situ probe inversion process for constructing probe arrays

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998051698A1 (en) * 1997-05-14 1998-11-19 Marek Kwiatkowski Synthesis of oligonucleotides
US20040152905A1 (en) * 2003-01-31 2004-08-05 Guzaev Andrei P. Universal building blocks and support media for synthesis of oligonucleotides and their analogs
US20080305964A1 (en) * 2004-12-15 2008-12-11 Roy Bar-Ziv Single-Step Platform for On-Chip Integration of Bio-Molecules
US20120035115A1 (en) * 2008-09-23 2012-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with cycloaddition
CN103502218A (zh) * 2011-03-04 2014-01-08 生命科技公司 用于缀合生物分子的化合物和方法
CN102702010A (zh) * 2012-05-23 2012-10-03 北京大学 光敏感的功能化固载相及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEAUCAGE S L等: "Strategies in the preparation of DNA Oligonucleotide Arrays for diagnostic applications", 《CURRENT MEDICINAL CHEMISTRY》 *
RAJESH K. ARIGELA等: "Cascade Intermolecular Michael Addition Intramolecular Azide/Internal Alkyne 1,3-Dipolar Cycloaddition Reaction in One Pot", 《ORGANIC LETTERS》 *
RAKESH H. VEKARIYA等: "A Concomitant Allylic Azide Rearrangement/Intramolecular Azide−Alkyne Cycloaddition Sequence", 《ORG. LETT.》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111542532A (zh) * 2017-10-04 2020-08-14 生捷科技控股公司 酶法合成寡核苷酸的方法和体系
CN111542532B (zh) * 2017-10-04 2024-03-15 生捷科技控股公司 酶法合成寡核苷酸的方法和体系
CN114621307A (zh) * 2022-04-12 2022-06-14 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种寡核苷酸空间坐标编码方法及其微流控装置

Also Published As

Publication number Publication date
CN106460232B (zh) 2019-12-24
EP3146094A1 (en) 2017-03-29
EP3146094A4 (en) 2017-11-22
WO2015179790A1 (en) 2015-11-26
EP3146094B1 (en) 2019-08-28
US20170067095A1 (en) 2017-03-09
US10533216B2 (en) 2020-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106460232A (zh) 用于原位合成的探针阵列的寡核苷酸探针倒转方法
ES2949821T3 (es) Matrices moleculares
US9303055B2 (en) Linkers and co-coupling agents for optimization of oligonucleotide synthesis and purification on solid supports
CN105431554B (zh) 无催化剂的表面官能化和聚合物接枝
AU2023200850A1 (en) Polynucleotide libraries having controlled stoichiometry and synthesis thereof
EP1431312A1 (en) Method for production and a composition for immobilising biological macromolecules in hydrogels and the use of said composition for producing biochips
AU2002305061A1 (en) Linkers and co-coupling agents for optimization of oligonucleotide synthesis and purification on solid support
US20050277155A1 (en) Method of immobilizing probes, in particular for producing biochips
TW201840855A (zh) 用於無模板酶促核酸合成的組成物及方法
CA2413273C (en) Organism-related substance microarray and method of producing the same
KR20070092724A (ko) Ｄｎａ 사슬 신장방법, ｄｎａ 사슬 증폭방법 및 ｄｎａ사슬 신장용 마이크로어레이
CN106467913A (zh) 用于原位合成探针阵列的探针倒转方法
KR20030020232A (ko) 에폭시기를 갖는 방사형 폴리에틸렌글리콜 유도체를이용한 하이드로 젤 바이오칩의 제조방법
CN106674283A (zh) 可完全去疤的可逆末端终止功能核苷酸及其应用
KR100348868B1 (ko) 고분자 광산발생제를 이용한 고체기질 위에서의 염기함유 올리고머 합성방법
US20190060860A1 (en) High-density nucleic acid arrays on polyester substrates
CN114689880A (zh) 固相载体及其制备方法和应用以及生物芯片
CN117480008A (zh) 用于dna合成的电接枝膜
WO2018169726A1 (en) Hydroxyalkylated polyacrylamide surface coatings for in situ synthesis of dna arrays
ITTO20090860A1 (it) Metodo per realizzare microarray a lunghi oligonucleotidi e microarray a lunghi oligonucleotidi

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210329

Address after: Block C, sub Science Center, 4760 Jiangnan Avenue, Binjiang District, Hangzhou City, Zhejiang Province

Patentee after: Shengjie Technology (Hangzhou) Co.,Ltd.

Patentee after: Shengjie Technology (Jiaxing) Co.,Ltd.

Address before: Greater Cayman, Cayman Islands

Patentee before: Shengjie Technology Holdings