JP2010517594A - 核酸の標識および検出の方法 - Google Patents

核酸の標識および検出の方法 Download PDF

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Abstract

特定の実施形態では、レポーター分子、担体分子または固体支持体のアジド修飾核酸コンジュゲートを形成するための新しい方法が提供される。他の実施形態では、核酸をアジド基で酵素により標識するための方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２００６年２月１０日出願の米国仮出願第６０／７７２，２２１号、および２００６年６月１３日出願の米国仮出願第６０／８０４，６４０号に基づく優先権を主張する２００７年２月１２出願の米国特許出願第１１／６７４，１４０号の一部継続出願である。これらの内容を、参照により、あたかもそれらが完全に本願明細書に示されたかのごとくに、援用する。
発明の分野
本発明は、概して、核酸ポリマーを標識する方法およびそれらの使用に関する。
背景情報
ヌクレオチドを標識するための従来の方法は直接的なものであるが、重大な欠点を有する。直接的なフルオロフォアの標識に関して、ヌクレオチド上の嵩高い色素分子は、酵素が、ヌクレオチドをＤＮＡまたはＲＮＡ鎖に組み込むことを困難にする。加えて、１つのフルオロフォアについて最適化された手順は、別の化学的に異なるフルオロフォアについては最適でないこともある。
サザンブロットおよびマイクロアレイへのハイブリダイゼーションのための標識されたプローブを生成するために、例えば、５’末端および３’末端を３２Ｐで標識することなど、種々の方法が使用されてきた。加えて、ニックトランスレーションは、ＤＮＡｓｅ Ｉを使用して核酸出発物質中に一本鎖ニックを生成し、かつＤＮＡポリメラーゼを使用してそのニックを満たす。標識されたデオキシヌクレオチド（例えばｄＵＴＰ−ジゴキシゲニンまたはｄＵＴＰフルオレセイン）は、他の非標識のデオキシヌクレオチドとともに、その反応混合物に含まれる。これらの方法は標識されたプローブを生成するが、他方で、それらは出発物質を増幅する方法を提供しない。
ヌクレオチド（例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および修飾されたｄＵＴＰ−ジゴキシゲニンまたはフルオレセイン）の混合物の存在下でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、鋳型鎖のコピーを合成するために使用することができる。これらの単位複製配列は、ハイブリダイゼーションアッセイのためのプローブとして使用することができる。その反応が起こるためには、この混合物は、修飾されたｄＵＴＰに加えて非修飾ｄＴＴＰを含有していなければならない。
ＰＣＲは、二本鎖ＤＮＡ鋳型を出発物質として使用する。この鋳型は、逆転写によってＲＮＡから作製することができ、その後、標識されたヌクレオチドのＰＣＲ組み込みによって標識することができる。この方法は、確かに出発物質の増幅をもたらすが、デオキシヌクレオチドの蛍光性類似体の置換は１００％未満であり、比活性は、標識に依存して様々となり得る。
従って、本発明の１つの目的は、従来の方法に付随する問題を回避する、ヌクレオチド標識のための改良された方法を提供することである。好ましくは、この方法は、ＦＩＳＨプローブの生成、サザンブロットのためのプローブの生成、ノーザンブロットのためのプローブの生成、化学発色インサイツハイブリダイゼーションプローブ（ＣＩＳＨ）、インサイツＰＣＲ、インサイツでの等温増幅、ＤＮＡフィンガープリント法、およびＳＮＰ検出を含めた種々の用途に使用できるであろう。
本発明の一態様は、核酸コンジュゲートを形成する方法であって、
アジド修飾ヌクレオチドヌクレオチドを、ＤＮＡ増幅酵素の存在下で少なくとも１種の他のヌクレオチドと接触させることにより、前記アジド修飾ヌクレオチドを核酸ポリマーに組み込み、アジド修飾核酸ポリマーを形成する工程と、
前記アジド修飾核酸ポリマーを、活性化もしくは末端アルキンまたはホスフィン部分を含むレポーター分子、担体分子または固体支持体と接触させて、核酸ポリマー−レポーター分子、担体分子、固体支持体コンジュゲートを形成する工程と
を含む方法を提供する。
本発明の別の態様は、核酸コンジュゲートを形成する方法であって、
末端アルキン修飾ヌクレオチドヌクレオチドを、ＤＮＡ増幅酵素の存在下で少なくとも１種の他のヌクレオチドと接触させることにより、前記末端アルキン修飾ヌクレオチドを核酸ポリマーに組み込み、末端アルキン修飾核酸ポリマーを形成する工程と、
前記末端アルキン修飾核酸ポリマーを、アジド部分を含むレポーター分子、担体分子または固体支持体と接触させて、核酸ポリマー−レポーター分子、担体分子、固体支持体コンジュゲートを形成する工程と
を含む方法を提供する。
本発明の別の態様は、核酸コンジュゲートを形成する方法であって、
ホスフィン修飾ヌクレオチドヌクレオチドを、ＤＮＡ増幅酵素の存在下で少なくとも１種の他のヌクレオチドと接触させることにより、前記ホスフィン修飾ヌクレオチドを核酸ポリマーに組み込み、ホスフィン修飾核酸ポリマーを形成する工程と、
前記ホスフィン修飾核酸ポリマーを、アジド部分を含むレポーター分子、担体分子または固体支持体と接触させて、核酸ポリマー−レポーター分子、担体分子、固体支持体コンジュゲートを形成する工程と
を含む方法を提供する。
本発明の別の態様は、アジド、アルキンまたはホスフィン修飾核酸ポリマーを作製する方法であって、
少なくとも１種のアジド、アルキンまたはホスフィン修飾ヌクレオチドを核酸増幅酵素の存在下でインキュベートして、アジド、アルキンまたはホスフィン修飾核酸ポリマーを形成する工程
を含む方法を提供する。
別の実施形態では、前記核酸酵素はＤＮＡポリメラーゼである。
別の実施形態では、前記核酸酵素はＲＮＡポリメラーゼである。
別の実施形態では、前記アジド、アルキンまたはホスフィン修飾核酸ポリマーの融解温度は高められる。
別の実施形態では、前記レポーター分子は、キサンテン、シアニン、クマリン、ボラポリアザインダセンまたはピレン色素である。別の実施形態では、前記レポーター分子は酵素基質またはハプテンである。
別の実施形態では、前記担体分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖類、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、合成ポリマー、ポリマー微粒子、生物細胞またはウイルスである。別の実施形態では、前記担体分子は、抗体もしくはその断片、アビジンもしくはストレプトアビジン、ビオチン、血液成分タンパク質、デキストラン、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、ＩｇＧ結合タンパク質、蛍光タンパク質、増殖因子、レクチン、リポ多糖、微生物、金属結合タンパク質、金属キレート化部分、非生物微粒子、ペプチド毒素、ホスファチジルセリン−結合タンパク質、構造タンパク質、低分子薬物、またはチラミドを含む。
別の実施形態では、前記固体支持体は、微小流体チップ、シリコンチップ、顕微鏡スライド、マイクロプレートウェル、シリカゲル、ポリマー膜、粒子、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、多糖類、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、ラテックスビーズ、電磁ビーズ、常磁性ビーズ、または超常磁性ビーズである。
別の実施形態では、前記固体支持体は、セファロース、ポリ（アクリレート）、ポリスチレン、ポリ（アクリルアミド）、ポリオール、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、デンプン、ＦＩＣＯＬＬ、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロースまたはデンプンである。
本発明の別の態様は、アジド修飾核酸ポリマーを検出する方法であって、
末端アルキン部分を含むレポーター分子と、
アジド修飾核酸ポリマーと
を含むアジド−アルキン環化付加反応混合物を形成する工程と、
前記アジド−アルキン環化付加反応混合物を、十分な時間量の間インキュベートして、核酸ポリマー−レポーター分子コンジュゲートを形成する工程と、
前記核酸ポリマー−レポーターコンジュゲートを、前記核酸ポリマー−レポーター−レポーター分子コンジュゲートの大きさおよび／または重量によって分離して、分離した核酸ポリマー−レポーター−レポーター分子コンジュゲートを形成する工程と、
前記分離した核酸ポリマー−レポーター−レポーター分子コンジュゲートを、適切な波長で照射して、照射した核酸ポリマー−レポーター−レポーター分子コンジュゲートを形成する工程と、
前記照射した核酸ポリマー−レポーター−レポーター分子コンジュゲートを観察する工程であって、ここで前記核酸ポリマーが検出される工程と
を含む方法を提供する。
より具体的な実施形態では、前記形成する工程はさらに、
ａ．銅イオンと、
ｂ．少なくとも１種の還元剤と、
ｃ．銅キレート剤と
を含む。
別の実施形態では、前記レポーター分子は、キサンテン、シアニン、クマリン、ボラポリアザインダセンまたはピレン色素である。別の実施形態では、前記レポーター分子は、酵素基質、蛍光タンパク質またはハプテンである。
別の実施形態では、前記銅キレート剤は銅（Ｉ）キレート剤である。別の実施形態では、前記銅キレート剤は、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）、ＥＤＴＡ、ネオクプロイン、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、ピリジン−２，６−ジカルボン酸（ＰＤＡ）、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システイン（ＳＣＭＣ）、１，１０フェナントロリン，もしくはその誘導体、トリエンチン、グルタチオン、ヒスタジン（ｈｉｓｔａｄｉｎｅ）、ポリヒスタジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔａｄｉｎｅ）またはテトラ−エチレンポリアミン（ＴＥＰＡ）である。別の実施形態では、前記銅キレート剤は、１，１０フェナントロリン、バソフェナントロリンジスルホン酸（４，７オジフェニル（ｏｄｉｐｈｅｎｙｌ）−１，１０−フェナントロリンジスルホン酸）またはバソキュプロインジスルホン酸（２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホネート）である。
別の実施形態では、前記還元剤は、アスコルベート、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ＴＣＰ（２，４，６−トリクロロフェノール）、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオサルフェート、２−メルカプトエタノール、ジチオトレオトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｏｔｏｌ）、グルタチオン、システイン、金属銅、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ１、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、または印加電位である。別の実施形態では、前記還元剤はアスコルベートである。
別の実施形態では、前記分離する工程は、クロマトグラフィまたは電気泳動を含む。別の実施形態では、前記クロマトグラフィは、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、またはアフィニティークロマトグラフィのうちの１つ以上を含む。
別の実施形態では、前記電気泳動は、ゲル電気泳動、一次元（１Ｄ）ゲル電気泳動、二次元（２Ｄ）ゲル電気泳動、未変性ゲル電気泳動、変性ゲル電気泳動、等電点電気泳動、またはキャピラリー電気泳動を含む。
本発明の別の態様は、アジド−アルキン環化付加反応混合物であって、
末端アルキン部分を含むレポーター分子と、
アジド修飾核酸と、
銅イオンと、
少なくとも１種の還元剤と、
銅キレート剤と
を含む、アジド−アルキン環化付加反応混合物を提供する。
本発明の別の態様は、固定化したアジド修飾核酸を検出する方法であって、
前記アジド修飾核酸を、固体または半固体マトリクスに固定化して、固定化したアジド修飾核酸を形成する工程と、
前記固定化したアジド修飾核酸を、アジド反応性基を含有するレポーター分子と接触させて、接触したアジド修飾核酸を形成する工程と、
前記接触したアジド修飾核酸を、十分な量の時間インキュベートして、レポーター分子−核酸コンジュゲートを形成する工程と、
前記レポーター分子−核酸コンジュゲートを、適切な波長で照射して、照射したレポーター分子−核酸コンジュゲートを形成する工程と、
前記照射したレポーター分子−核酸コンジュゲートを観察する工程であって、それにより前記固定化したアジド修飾核酸が検出される工程と
を含む方法を提供する。
本発明の別の態様は、固定化したアルキン修飾核酸を検出する方法であって、
前記アルキン修飾核酸を、固体または半固体マトリクスに固定化して、固定化したアルキン修飾核酸を形成する工程と、
前記固定化したアルキン修飾核酸を、アジド基を含有するレポーター分子と接触させて、接触したアルキン修飾核酸を形成する工程と、
前記接触したアルキン修飾核酸を、十分な量の時間インキュベートして、レポーター分子−核酸コンジュゲートを形成する工程と、
前記レポーター分子−核酸コンジュゲートを、適切な波長で照射して、照射したレポーター分子−核酸コンジュゲートを形成する工程と、
前記照射したレポーター分子−核酸コンジュゲートを観察する工程であって、それにより前記固定化したアルキン修飾核酸が検出される工程と
を含む方法を提供する。
別の実施形態では、前記固体または半固体支持体は、スライド、アレイ、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、ヒドロゲル、ポリマー粒子またはガラスである。
本発明の別の態様は、キットであって、
アジド−ｄＡＴＰと、
テロメラーゼ酵素と、
アジド反応性レポーター分子、担体分子または固体支持体と
を含むキットを提供する。
本発明の別の態様は、核酸ポリマーを標識するためのキットであって、
アジド、アルキンまたはホスフィン部分を含む少なくとも１種のヌクレオチド類似体と、
アジド、アルキンもしくはホスフィン部分を含むレポーター分子、担体分子または固体支持体と
を含むキットを提供する。
そのより具体的な実施形態は、さらに核酸増幅酵素を含む。
本発明の別の態様は、テロメラーゼ酵素活性を測定する方法であって、
ａ）細胞を、有効量の、アジド基を含むｄＮＴＰヌクレオチドおよびテロメラーゼ酵素と接触させ、前記ｄＮＴＰヌクレオチドが少なくとも１種の核酸ポリマーに組み込まれるようにする工程と、
ｂ）前記核酸ポリマーを、アルキンまたはホスフィン部分を含むレポーター分子と接触させ、アジド修飾核酸ポリマーレポーター分子コンジュゲートを形成する工程と、
ｃ）前記アジド修飾核酸ポリマーレポーター分子コンジュゲートを、レポーター分子を含まない核酸ポリマーから分離する工程と、
ｄ）前記アジド修飾核酸ポリマーレポーター分子コンジュゲートを照射して、テロメラーゼ活性を決定する工程と
を含む方法を提供する。
本発明の別の態様は、テロメラーゼ酵素活性を測定する方法であって、
ａ）細胞を、有効量の、アルキンまたはホスフィン基を含むｄＮＴＰヌクレオチドおよびテロメラーゼ酵素と接触させ、前記ｄＮＴＰヌクレオチドが少なくとも１種の核酸ポリマーに組み込まれるようにする工程と、
ｂ）前記核酸ポリマーを、アジド部分を含むレポーター分子と接触させ、アルキンまたはホスフィン修飾核酸ポリマーレポーター分子コンジュゲートを形成する工程と、
ｃ）前記アルキンまたはホスフィン修飾核酸ポリマーレポーター分子コンジュゲートを、レポーター分子を含まない核酸ポリマーから分離する工程と、
ｄ）前記アルキンまたはホスフィン修飾核酸ポリマーレポーター分子コンジュゲートを照射して、テロメラーゼ活性を決定する工程と
を含む方法を提供する。
Ｎ３−ｄＡＴＰのテロメラーゼ組み込みのゲル中検出を示す図である。 Ｎ３−ｄＡＵＰではなくＮ３−ｄＡＴＰのテロメラーゼ組み込みのゲル中検出および用量依存性を示す図である。 「クリック」化学を用いてアルキン−ＴＡＭＲＡで標識されたＮ３−ｄＡＴＰのテロメラーゼ組み込みのゲル中検出および用量依存性を示す図である。 「クリック」化学を用いてアジド−ＴＡＭＲＡで標識されたエチニル−ｄＡＵＰのテロメラーゼ組み込みのゲル中検出を示す図である。 「クリック」化学を用いてアジド−ＴＡＭＲＡで標識されたエチニル−ｄＡＵＰのテロメラーゼ組み込みのゲル中検出を示す図である。 線形増幅および種々のポリメラーゼを用いるエチニル−ｄＡＵＰの組み込みのゲル中検出を示す図である。このエチニル−ｄＡＵＰは、「クリック」化学を用いてアジド−ＴＡＭＲＡで標識された。 銅キレート剤（ＢＣＳ）の存在がテロメラーゼラダー形成を維持することを示す図である。 ヘリカーゼ酵素用いる増幅を示す概略図である。 鎖置換増幅（ＳＤＡ）を示す概略図である。 実施例１３で使用されるプライマーの位置を示す図であり、これより２９３ｂｐの予測される単位複製配列サイズが与えられる。 クリック修飾ｄＵＴＰ混合物についての指数関数的増幅または閾値サイクル（ＣＴ）の始まりが、非修飾ｄＵＴＰ混合物について示された始まりと非常に類似していることを示す線形増幅プロットである。クリックｄＵＴＰについての平均ＣＴは、非修飾ｄＵＴＰについての１０．９７に対して９．７８である。 実施例１３の反応についての解離曲線を示す図であり、この図は温度の関数として蛍光の変化を示す。クリック修飾ｄＵＴＰ混合物は、非修飾ｄＵＴＰ混合物の８８Ｃに対して、９３Ｃで融解する。 ＴＡＭＲＡについて走査（左）またはＳＹＢＲ ＧＯＬＤでの標識後に走査（右）したリアルタイムＰＣＲ生成物のゲル分析である。 ＴＡＭＲＡについて反応チューブのイメージを示す図である。 ＴＡＭＲＡについて走査された反応生成物のドットブロットを示す図である。 実施例１５について実験の設定を示す図である。
定義および略語
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の組成物またはプロセス工程に限定されないことを理解すべきである。そのようなものは変わり得るものだからである。本願明細書中および添付の特許請求の範囲中で使用する場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうではないと示していない限り、複数の指示対象を包含していることに注意しなければならない。従って、例えば、「１つのリガンド」と言うときは複数のリガンドを含み、「１種の核酸」と言うときは複数の核酸を含む、などである。
別段の定義がされない限り、本願明細書において使用するすべての専門用語および科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者が共通に理解するのと同じ意味を有する。以下の用語および略語（表１）を、本願明細書に記載される本発明の目的のために定義する。
（表１）略語の一覧
Figure 2010517594
本発明の特定の化合物は、非溶媒和形態、および溶媒和形態（水和形態を含む）で存在することができる。一般に、溶媒和形態は非溶媒和形態と等価であり、それらは本発明の範囲内に包含される。本発明の特定の化合物は、複数の結晶形態または非晶質形態で存在することができる。一般に、すべての物理的形態は、本発明によって企図される使用については等価であり、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。
本発明の特定の化合物は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を有する。ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体は、本発明の範囲内に包含される。
本願明細書に記載される化合物は、単一の異性体（例えば、鏡像異性体、ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ、位置異性体、ジアステレオマー）として、または異性体の混合物として調製することができる。好ましい実施形態では、その化合物は、実質的に単一の異性体として調製される。実質的に異性体として純粋な化合物を調製する方法は当該技術分野で公知である。例えば、ある鏡像異性体が富んだ混合物および純粋な鏡像異性体化合物は、鏡像異性体として純粋な合成中間体を、キラル中心の立体化学を変化しないまま残すかまたはその完全な反転を生じるかのいずれかの反応と組み合わせて使用することにより、調製することができる。あるいは、最終生成物または合成経路に沿った中間体は、単一の立体異性体に分割することができる。特定の立体中心を反転させるかまたは変化しないまま残すための手法、および立体異性体の混合物を分割するための手法は当該技術分野で周知であり、特定の状況に合わせて適切な方法を選択するのは、十分に当業者の能力の範囲内にある。一般的に、Ｆｕｒｎｉｓｓら（編者），ＶＯＧＥＬ’ｓ ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ ＯＦ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第５版、Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｌｔｄ．、Ｅｓｓｅｘ、１９９１、８０９−８１６頁；およびＨｅｌｌｅｒ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２３：１２８（１９９０）を参照。
本願明細書において開示される化合物はまた、かかる化合物を構成する１つ以上の原子において、非天然の比率の同位体原子を含んでいてもよい。例えば、その化合物は、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）または炭素−１４（１４Ｃ）などの放射性同位体で放射性標識されていてもよい。本発明の化合物のすべての同位体のバリエーションは、それが放射性であろうとなかろうと、本発明の範囲内に包含されることが意図されている。
開示された化合物が共役した環系を含む場合、共鳴安定化によって、形式電荷が分子全体にわたって分散することが許容される。特定の電荷が特定の環系上または特定のヘテロ原子上に局在化するものとして描かれてもよいが、電荷がその化合物の別の部分上に形式的に局在化する同等な共鳴構造としても描くことができることは、一般に理解されている。
形式電荷を有する選択された化合物は、適切な生物学的に適合性の対イオンを伴わずに示されてもよい。かかる対イオンは、その化合物上に存在する正電荷または負電荷とバランスをとる役割を果たす。本願明細書において使用する場合、生物学的に適合性の物質は、使用される場合に毒性でなく、かつ生体分子に対して実質的に有害な効果を有しない。負に帯電した対イオンの例としては、とりわけ、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸イオン、アルカンスルホネート、アリールスルホネート、リン酸イオン、過塩素酸イオン、テトラフルオロボレート、テトラアリールホウ化物、硝酸イオンおよび芳香族カルボン酸もしくは脂肪族カルボン酸のアニオンが挙げられる。好ましい対イオンとしては、塩化物、ヨウ化物、過塩素酸イオンおよび種々のスルホネートを挙げることができる。正電荷を帯びた対イオンの例としては、とりわけ、アルカリ金属、またはアルカリ土類金属イオン、アンモニウム、またはアルキルアンモニウムイオンが挙げられる。
置換基が左から右へ書かれた従来の化学式によって特定されている場合、それらは、右から左へ構造を書くと生じることになる化学的に同一の置換基を等しく包含する。例えば、−ＣＨ２Ｏ−は−ＯＣＨ２−も記述していると意図されている。
単独もしくは別の用語との組合せにおける用語「アシル」または「アルカノイル」は、特記しない限り、明記された数の炭素原子およびアルカンラジカルの少なくとも１つの末端上のアシルラジカルからなる、安定な直鎖もしくは分枝鎖状の、または環状炭化水素ラジカル、あるいはこれらの組合せを意味する。この「アシルラジカル」は、カルボン酸から−ＯＨ部分を取り除くことにより、カルボン酸から誘導される基である。
単独または別の置換基の一部としての用語「アルキル」は、特記しない限り、指定された炭素原子の数を有する（すなわち、Ｃ１−Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）、完全飽和、モノ不飽和もしくは多不飽和であってよくかつ二価（「アルキレン」）および多価ラジカルを含むことができる直鎖もしくは分枝鎖状の、または環状炭化水素ラジカル、あるいはこれらの組み合わせを意味する。飽和炭化水素ラジカルの例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルの同族体および異性体などの基が挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有するアルキル基である。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−プロピニルおよび３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにより高級の同族体および異性体が挙げられるが、これらに限定されない。用語「アルキル」は、特に断りのない限り、「ヘテロアルキル」などの、以下でより詳細に定義されるアルキルの誘導体を含むことも意図されている。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と呼ばれる。
本発明で有用な例示的なアルキル基は、約１個〜約２５個の間の炭素原子を含む（例えばメチル、エチルなど）。８個以下の炭素原子を有する直鎖、分枝鎖または環状炭化水素鎖は、本願明細書において「低級アルキル」とも呼ばれるであろう。加えて、本願明細書において使用する場合の用語「アルキル」は、さらに炭化水素鎖断片の１つ以上の炭素原子において１つ以上の置換を含む。
用語「アミノ」または「アミン基」は、Ｒ、Ｒ’およびＲ”が独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群から選択される、基−ＮＲ’Ｒ”（またはＮＲＲ’Ｒ”）を指す。置換アミンは、Ｒ’またはＲ”が水素以外のものである、アミン基である。一級アミノ基では、Ｒ’およびＲ”はともに水素であり、他方、二級アミノ基では、Ｒ’またはＲ”のいずれか（両方ではない）が水素である。加えて、用語「アミン」および「アミノ」は、基−ＮＲＲ’Ｒ”およびその生物学的に適合性のアニオン性対イオンを含有する、窒素のプロトン化および四級化バージョンを含むことができる。
本願明細書において使用する場合の用語「アリール」は、２０個以下の炭素原子を有する環状芳香族炭素鎖、例えば、フェニル、ナフチル、ビフェニル、およびアントラセニルを指す。このアリール基の１つ以上の炭素原子は、例えば、アルキル；アリール；ヘテロアリール；ハロゲン；ニトロ；シアノ；ヒドロキシル、アルコキシルまたはアリールオキシル；チオまたはメルカプト、アルキルチオ、またはアリールチオ；アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアルキルアミノ、ジアリールアミノまたはアリールアルキルアミノ；アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、ジアリールアミノカルボニル、またはアリールアルキルアミノカルボニル；カルボキシル、またはアルキルオキシカルボニルもしくはアリールオキシカルボニル；アルデヒド；アリールカルボニルまたはアルキルカルボニル；イミニル、またはアリールイミニルもしくはアルキルイミニル；スルホ；アルキルカルボニルまたはアルキルカルボニル；イミニル、またはアリールイミニルもしくはアルキルイミニル；スルホ；アルキスルホニルまたはアリールスルホニル；ヒドロキシイミニル、またはアリールイミニルまたはアルコキシイミニルで置換されていてもよい。加えて、アリール基の２つ以上のアルキル置換基またはヘテロアルキル置換基は、一緒になって、縮合したアリール−アルキルまたはアリール−ヘテロアルキル環系（例えば、テトラヒドロナフチル）を形成してよい。複素環式基を含む置換基（例えば、ヘテロアリールオキシ、およびヘテロアラルキルチオ）は、上記の用語と同様に定義される。
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）は、それらの従来の意味で使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介してその分子の残りに結合するアルキル基を指す。
単独または別の用語との組合せにおける用語「ヘテロアルキル」は、特記しない限り、明記された数の炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、およびＳｅからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなる直鎖もしくは分枝鎖状、または環状の炭素含有ラジカル、あるいはこれらの組合せを意味し、この窒素、リン、硫黄、およびセレン原子は任意に酸化され、その窒素ヘテロ原子は任意に四級化される。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉ、およびＳｅは、ヘテロアルキル基のいずれの内部位置に存在してもよく、またはアルキル基がその分子の残りに結合している位置に存在してもよい。例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３のように、２個までのヘテロ原子は連続していてもよい。同様に、単独もしくは別の置換基の一部としての用語「ヘテロアルキレン」は、ヘテロアルキルから誘導される二価ラジカルを意味し、例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が挙げられるが、これらによって限定されない。ヘテロアルキレン基については、ヘテロ原子は、鎖末端のいずれかまたは両方を占めることもできる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。なおさらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基については、その連結基の式が書かれる方向は、その連結基の配向を含意しない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
単独もしくは他の用語と組合せての用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、特記しない限り、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状バージョンを表す。加えて、ヘテロシクロアルキルについては、ヘテロ原子は、複素環がその分子の残りに結合している位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「アリール」は、特記しない限り、単環、または一緒に縮合しているかもしくは共有結合されている多環（好ましくは１〜３個の環）であってよい多不飽和、芳香族部分を意味する。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＳｅから選択される１〜４個のヘテロ原子を含むアリール基（または環）を指し、この窒素、硫黄、およびセレン原子は任意に酸化され、その窒素原子は任意に四級化される。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介してその分子の残りに結合されていてもよい。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル、ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルおよび６−キノリルが挙げられる。上記のアリールおよびヘテロアリール環系の各々についての置換基は、後述される許容できる置換基の群から選択される。
簡潔さのために記すが、他の用語と組合せて使用される場合の用語「アリール」（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）は、上記のアリール環およびヘテロアリール環の両方を含む。従って、用語「アリールアルキル」は、炭素原子（例えば、メチレン基）が、例えば、酸素原子によって置き換えられているアルキル基（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）を含むアルキル基に、アリール基が結合されているラジカル（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を、含むことが意図されている。
上記の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）の各々は、示されたラジカルの置換および非置換の形態の両方を含む。各種のラジカルについての好ましい置換基は、以下で提供される。
アルキルおよびヘテロアルキルラジカル（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと呼ばれることが多い基を含む）の置換基は、総称として「アルキル基置換基」と呼ばれ、それらは、０から（２ｍ’＋１）までの数の（式中、ｍ’はかかるラジカル中の炭素原子の総数である）、以下（これらに限定されない）から選択される種々の基の１つ以上であってよい：−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ”’）＝ＮＲ””、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””は、各々、好ましくは独立に、水素、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（例えば、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール）、置換もしくは非置換のアルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。化合物が複数のＲ基を含む場合、例えば、そのＲ基の各々は、複数存在するＲ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””基として独立に選択される。Ｒ’およびＲ”が同じ窒素原子に結合している場合、それらは、その窒素原子と一緒になって５員環、６員環、または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニル（これらに限定されない）を含むことが意図されている。上記の置換基の考察から、当業者は、用語「アルキル」は、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）ならびにアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）などの水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を含むことが意図されているということを理解するであろう。
アルキルラジカルについて記載された置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基についての置換基は、総称として「アリール基置換基」と呼ばれる。その置換基は、０からその芳香族環系上の利用できる原子価の総数までの範囲の数の、例えば：ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ”’）＝ＮＲ””、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル（式中、Ｒ’Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””は、好ましくは独立に、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリールおよび置換もしくは非置換のヘテロアリールから選択される）から選択される。化合物が複数のＲ基を含む場合、例えば、そのＲ基の各々は、複数存在するＲ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””基として独立に選択される。以下のスキームでは、記号Ｘは上記の「Ｒ」を表す。
アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、任意に式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−（式中、ＴおよびＵは独立に−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、ｑは０〜３の整数である）の置換基で置き換えられてもよい。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、任意に式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−、（式中、ＡおよびＢは独立に、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは１〜４の整数である）の置換基で置き換えられてもよい。そのように形成された新しい環の単結合のうちの１つは、任意に二重結合で置き換えられていてもよい。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは、任意に式−（ＣＲＲ’）Ｓ−Ｘ−（ＣＲ”Ｒ”’）ｄ−（式中、ｓおよびｄは独立に、０〜３の整数であり、かつＸは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である）の置換基で置き換えられてもよい。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ”およびＲ”’は、好ましくは独立に、水素または置換もしくは非置換の（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される。
本願明細書において使用する場合、用語「ヘテロ原子」は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、ケイ素（Ｓｉ）、およびセレン（Ｓｅ）を含む。
用語「アミノ」または「アミン基」は、Ｒ、Ｒ’およびＲ”が独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群から選択される、基−ＮＲ’Ｒ”（またはＮ＋ＲＲ’Ｒ”）を指す。置換アミンは、Ｒ’またはＲ”が水素以外のものである、アミン基である。一級アミノ基では、Ｒ’およびＲ”はともに水素であり、他方、二級アミノ基では、Ｒ’またはＲ”のいずれか（両方ではない）が水素である。加えて、用語「アミン」および「アミノ」は、基−Ｎ＋ＲＲ’Ｒ”およびその生物学的に適合性のアニオン性対イオンを含有する、窒素のプロトン化および四級化バージョンを含むことができる。
本願明細書において使用する場合の用語「水溶液」は、主に水でありそして水の溶液特性を保持する溶液を指す。この水溶液が水に加えて溶媒を含有する場合は、通常は水は主たる溶媒である。
本願明細書において使用する場合の用語「カルボキシアルキル」は、一般式−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ（式中、ｎは１〜１８である）を有する基を指す。
用語「活性化アルキン」は、本願明細書において使用する場合、別の分子上のアルキン反応性基（アジド部分またはホスフィン部分など）と選択的に反応して活性化アルキン基とアルキン反応性基との間に共有化学結合を形成する化学的部分を指す。アルキン反応性基の例としては、アジドが挙げられる。「アルキン反応性」は、アルキン基と選択的に反応する化学的部分を含む分子を指すこともできる。本願明細書において使用する場合、活性化アルキンは、アジドなどの１，３−双極子と容易に反応する任意の末端アルキンまたはシクロオクチン（親双極子）を包含する。
用語「水溶液」は、本願明細書において使用する場合、主に水でありそして水の溶液特性を保持する溶液をいう。この水溶液が水に加えて溶媒を含有する場合は、通常は水は主たる溶媒である。
用語「アジド反応性」は、本願明細書において使用する場合、別の分子上のアジド修飾基と選択的に反応してアジド修飾基とアジド反応性基との間に共有化学結合を形成する化学的部分を指す。アジド反応性基の例としては、アルキンおよびホスフィン（例えば、トリアリールホスフィン）が挙げられる。「アジド反応性」は、アジド基と選択的に反応する化学的部分を含む分子も指す。
用語「緩衝液」は、本願明細書において使用する場合、化学物質の添加または削除に対して溶液の酸性または塩基性の変化を最少にするように作用する系を指す。
用語「担体分子」は、本願明細書において使用する場合、本発明の化合物に共有結合される生物学的成分または非生物学的成分を指す。かかる成分としては、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、合成ポリマー、ポリマー微粒子、生物細胞、ウイルスおよびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
本願明細書において使用する場合の用語「化学的手がかり（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｈａｎｄｌｅ）」は、アジド、アルキン、活性化アルキン、ホスファイト、ホスフィンなど特異的官能基を指す。この化学的手がかりは、天然に存在する生体分子中に稀にしか見出されず、かつ生体分子（例えば、未変性の細胞成分）に対して化学的に不活性である部分であるが、アジド反応性基またはアルキン反応性基と反応するとき、その反応は生物関連の条件（例えば、過剰の熱または強烈な（ｈａｒｓｅ）反応物質の非存在下などの細胞培養条件）下で効率的に起こり得るという点で、この化学的手がかりは、以下で定義される反応性基とは明確に異なる。
用語「クリック化学」は、本願明細書において使用する場合、１，２，４−トリアゾールを形成するためのアジドと末端アルキンとの間のＨｕｉｓｇｅｎ環化付加または２，３−双極性環化付加を指す。かかる化学反応には、単純なヘテロ原子有機反応物質（これに限定されない）を使用することができ、信頼性が高く、選択的、立体特異的、および発熱的である。
本願明細書において使用する場合の用語「環化付加」は、２つ以上のπ電子系（例えば、不飽和分子または同じ分子の不飽和部分）が一緒になって、結合の多重度の正味の減少がある環状生成物を形成する化学反応を指す。環化付加では、そのπ電子は、新しいσ結合を形成するために使用される。環化付加の生成物は、「付加体」または「環化付加体」と呼ばれる。異なる種類の環化付加が当該技術分野で公知であり、それらには、［３＋２］環化付加およびＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応が含まれるが、これらに限定されない。２，３−双極性環化付加とも呼ばれる［３＋２］環化付加は１，３−双極子と親双極子との間で起こり、典型的には５員の複素環式環を構築するために使用される。用語「［３＋２］環化付加」はまた、Ｂｅｒｔｏｚｚｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００４，１２６：１５０４６−１５０４７に記載される、アジドとシクロオクチンおよびジフルオロシクロオクチンとの間の「銅なし（ｃｏｐｐｅｒｌｅｓｓ）」［３＋２］環化付加をも包含する。
本願明細書において使用する場合の用語「検出可能な応答」とは、観察によるかまたは計測によるかのいずれかにより直接的または間接的に検出可能なシグナルの発生またはシグナルの変化をいう。典型的には、上記フルオロフォアが生来的に蛍光性であり、金属イオンもしくは生体化合物との結合の際にシグナルの変化を生じない場合には、この検出可能な応答はシグナルの発生である。あるいは、この検出可能な応答は、波長分布パターンまたは吸光度もしくは蛍光の強度の変化、あるいは光散乱、蛍光寿命、蛍光偏光、または上記のパラメータの組合せの変化を生じる光学的応答である。他の検出可能な応答としては、例えば、化学発光、リン光、放射性同位体からの放射線、磁力、および電子密度が挙げられる。
本願明細書において使用する場合の用語「検出可能に明確に異なる」は、観察によるか、または計測によるかのいずれかにより、物理的特性によって区別可能または分離可能であるシグナルを指す。例えば、フルオロフォアは、スペクトルの特徴によるか、または蛍光強度、寿命、偏光もしくは光退色速度によるかのいずれかによって、その試料中の別のフルオロフォアから、および任意に存在するさらなる物質から直ちに区別可能である。
本願明細書において使用する場合の用語「直接検出可能な」は、物質またはその物質から生成されたシグナルの存在が、化学修飾またはさらなる物質を必要とすることなく観察、計装設備、またはフィルムによって、即座に検出可能なことを指す。
本願明細書において使用する場合の用語「フルオロフォア」とは、生来的に蛍光性であるか、または生物学的化合物または金属イオンに結合するときに蛍光の変化を示す、すなわち蛍光発生性である組成物をいう。フロオロフォアは、フルオロフォアの溶解性、スペクトル特性または物理的特性を変化させる置換基を含んでいてもよい。多数のフルオロフォアが当業者に公知であり、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンゾアゾール、ボラポリアザインダセンおよびキサンテン（フルオレセイン、ローダミン、ロドールが挙げられる）、およびＲＩＣＨＡＲＤ Ｐ．ＨＡＵＧＬＡＮＤ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（第１０版、ＣＤ−ＲＯＭ、２００５年９月）（この文献を、参照によりその全体を本願明細書に援用する）に記載されている他のフルオロフォアが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「単離した」は、核酸ポリマーに関して本願明細書において使用される場合、その起源または操作によって、それが天然で付随している成分または最初に得られたときにそれが付随している成分の少なくともいくつかから分離されている核酸ポリマーを意味する。あるいはまたは加えて、「単離した」は、注目する核酸ポリマーが人の手によって生産または合成されていることを意味する。
用語「キット」は、本願明細書において使用する場合、関連する構成成分、通常は１つ以上の化合物または組成物のパーケージ化されたセットをいう。
用語「標識」は、本願明細書において使用する場合、標的または化合物に結合し本発明の方法で使用したときに（例えば、スペクトル特性、コンホメーションまたは活性に起因して）直接もしくは間接的に検出可能な化学的部分またはタンパク質を指し、レポーター分子および担体分子を含む。この標識は、直接検出可能（フルオロフォア）であってもよいし、間接的に検出可能（ハプテンまたは酵素）であってもよい。かかる標識としては、放射線計測装置を用いて測定できる放射活性標識；視覚的に観察することができるか、または分光光度計を用いて測定することができる色素（ｐｉｇｍｅｎｔ）、色素（ｄｙｅ）または他の色原体；スピン標識分析器を用いて測定することができるスピン標識；および蛍光標識（フルオロフォア）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの場合、出力シグナルは適切な分子付加体の励起によって生成され、そしてその色素が吸収する光を用いて励起することにより可視化することができるか、または例えば標準的な蛍光光度計または画像化システムを用いて測定することができる。この標識は化学発光物質であってもよい。この場合、出力シグナルはシグナル化合物の化学変性；金属含有物質；または酵素により生成される。酵素による場合は、シグナルの酵素依存性二次生成（例えば無色の基質からの着色生成物の生成）が起こる。標識という用語は、接合分子に選択的に結合することができる「タグ」またはハプテンも指す。この場合、接合分子は、その後基質とともに添加された場合に、検出可能なシグナルを生成するために使用される。例えば、タグとしてビオチンを使用し、次いでこのタグに結合するために西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のアビジンコンジュゲートまたはストレプトアビジンコンジュゲートを使用し、次いで発色基質（例えばテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））または蛍光発生基質（例えばアンプレックスレッド（Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ）試薬（モレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．））を使用してＨＲＰの存在を検出することができる。多数の標識が当業者には公知であり、粒子、フルオロフォア、ハプテン、酵素、およびそれらの発色基質、蛍光発生基質、化学発光基質ならびにＲＩＣＨＡＲＤ Ｐ． ＨＡＵＧＬＡＮＤ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＰＲＯＤＵＣＴＳ （第１０版，ＣＤ−ＲＯＭ，２００５年９月）（前出）に記載される他の標識が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「リンカー」または「Ｌ」は、本願明細書において使用する場合、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰからなる群から選択される１〜３０個の非水素原子を組み込む共有単結合または一連の安定な共有結合を指す。加えて、このリンカーは、担体分子または固体支持体を本発明のアジドもしくは活性化アルキン修飾ヌクレオチドまたは核酸ポリマーに共有結合で結合する。例示的な連結メンバーとしては、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｏ−などを含む部分が挙げられる。「切断可能なリンカー」は、反応または条件の結果によって分断され（ｂｒｏｋｅｎ）得る１つ以上の切断可能な基を有するリンカーである。用語「切断可能な基」は、解放される部分とコンジュゲートの残りとを連結している結合を切断することによって、コンジュゲートの一部分、例えば、レポーター分子、担体分子または固体支持体をそのコンジュゲートの残りから解放できる部分を指す。かかる切断は、性質上化学的であるか、または酵素により媒介されるかのいずれかである。例示的な酵素により切断可能な基としては、天然のアミノ酸、または天然のアミノ酸で終結するペプチド配列が挙げられる。酵素により切断可能な基に加えて、酵素以外の薬剤の作用により切断される１つ以上の部位を含むことは本発明の範囲内にある。例示的な非酵素的切断剤としては、酸、塩基、光（例えば、ニトロベンジル誘導体、フェナシル基、ベンゾインエステル）、および熱が挙げられるが、これらに限定されない。多くの切断可能な基が当該技術分野で公知である。例えば、Ｊｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７６１：１５２−１６２（１９８３）；Ｊｏｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１４５１８−１４５２５（１９９０）；Ｚａｒｌｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２４：９１３−９２０（１９８０）；Ｂｏｕｉｚａｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５５：１４１−１４７（１９８６）；Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：２０５−２１０（１９８６）；Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：１８５９−１８６７（１９８９）を参照。さらに、広範な切断可能な二官能性（ホモ二官能性およびヘテロ二官能性ともに）スペーサアームが市販されている。例示的な切断可能な基であるエステルは、試薬、例えば水酸化ナトリウムによって切断されてカルボン酸塩含有断片およびヒドロキシル含有生成物を生じる切断可能な基である。
本願明細書において使用する場合の用語「核酸ポリマー」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含めた一本鎖もしくは二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、特記しない限り、合成物の骨格を有する核酸様構造、および増幅生成物を包含する。本発明の文脈では、核酸ポリマーは、増幅反応またはハイブリダイゼーション反応で存在する単離した分子であってもよい。
本願明細書において使用する場合、用語「ヌクレオチド類似体」は、天然のヌクレオチドと構造が類似しており、かつ天然に存在するヌクレオチドと同様に機能する（例えば、天然に存在する塩基のうちの１つと塩基対合するのと類似の能力を示す）ことができる分子を指す。用語「ヌクレオシド類似体」は、本願明細書において使用する場合、天然のヌクレオシドと構造が類似しており、かつ天然に存在するヌクレオシドと同様に機能する（例えば、ＤＮＡ複製によってＤＮＡに組み込まれるのと類似の能力を示す）ことができる分子を指す。用語「ヌクレオチド」は、糖部分（ペントース）、ホスフェートもしくはポリホスフェートおよび窒素含有複素環式塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡの単量体ユニットを指す。この塩基は、グリコシド炭素（すなわち、ペントースの１’−炭素）を介して糖部分に連結され、塩基および糖のその組合せは、「ヌクレオシド」と呼ばれる。この塩基は、ヌクレオチド（またはヌクレオシド）を特徴付け、ＤＮＡの４種の塩基は、アデニン（またはＡ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）であり、かつＲＮＡの４種の塩基はアデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル（Ｕ）である。本発明の特定の実施形態では、ヌクレオチド類似体（またはヌクレオシド類似体）は、化学的手がかりを含み、本願明細書において使用する場合、「修飾ヌクレオチド」または「修飾核酸ポリマー」とも呼ばれる。
本願明細書において使用する場合の用語「反応性基」は、別の化学基と反応して共有結合を形成できる、すなわち適切な反応条件下で共有結合による反応性であり、かつ一般に別の物質に対する結合点を表す基を指す。本願明細書において使用する場合、反応性基は、生物系で一般に見出され、かつ通常の生物学的条件下で反応する化学的部分を指し、これらは、本願明細書においては、上で定義された化学的手がかり、本発明のアジドおよび活性化アルキン部分とは区別される。本願明細書において言及される場合、この反応性基は、異なる化合物上の官能基と化学的に反応して共有結合を形成することができる、カルボン酸またはスクシンイミジルエステルなどの部分である。反応性基としては、一般に、求核剤、求電子剤および光活性化可能な基が挙げられる。
用語「レポーター分子」は、担体分子または固体支持体（修飾ヌクレオチドまたは修飾核酸ポリマーなど）に結合することができ、かつ直接的または間接的のいずれかで検出することができる任意の部分を指す。レポーター分子としては、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、リン光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素および放射性同位体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいレポーター分子としては、フルオロフォア、蛍光タンパク質、ハプテン、および酵素が挙げられる。
本願明細書において使用する場合の用語「試料」とは、検出もしくは定量のための検体、または修飾ヌクレオチドもしくは核酸ポリマーを含有しているかも知れない任意の物質をいう。この検体は、反応性基（例えば、本発明の化合物をその検体に接合するのに利用できる基）を備えていてもよい。この試料は、標的と混じって見出される希釈剤、緩衝液、洗浄剤、および不純物、残屑なども含んでいてもよい。例えば、尿、血清、血漿、全血、唾液、涙液、脳脊髄液、乳頭からの分泌液などが挙げられる。また、固体、ゲルまたは半固体物質（例えば、緩衝液、抽出剤、溶媒などのような液体物質中に懸濁または溶解した粘液、体内組織、細胞など）も挙げられる。通常は、上記試料は生細胞、内因性宿主細胞タンパク質を含む生体液、核酸ポリマー、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、および緩衝液である。この試料は、水溶液、生存細胞培養液中にあるか、あるいは固体もしくは半固体表面（ポリアクリルアミドゲル、膜ブロットなど）上またはマイクロアレイ上に固定化されていてもよい。
用語「固体支持体」は、本願明細書において使用する場合、選択された溶媒系に実質的に不溶であるか、またはそれが可溶性である選択された溶媒系から（例えば、沈殿によって）直ちに分離することができる物質を指す。本発明を実施するうえで有用な固体支持体は、本願明細書に記載される選択された１種以上の化合物がその固体支持体に結合できるように活性化されているかまたは活性化することができる基を含むことができる。
本願明細書において使用する場合の用語「シュタウディンガーライゲーション」は、古典的シュタウディンガー反応の改良版である、ＳａｘｏｎおよびＢｅｒｔｏｚｚｉによって開発された化学反応を指す（Ｅ．ＳａｘｏｎおよびＣ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８７：２００７−２０１０）。古典的シュタウディンガー反応は、アジドとホスフィンまたはホスファイトを組み合わせることにより、アザ−イリド中間体が生成し、これが加水分解によってホスフィンオキシドおよびアミンを与える化学反応である。シュタウディンガー反応は、アジドをアミンに還元する穏和な方法であり、トリフェニルホスフィンが還元剤として一般に使用される。シュタウディンガーライゲーションでは、求電子剤トラップ（通常はメチルエステル）は、適切にトリアリールホスフィンのアリール基上（通常はリン原子のオルト）に置かれ、そしてアジドとの反応に供されてアザ−イリド中間体を与え、これが水系媒体中で転位してアミド基およびホスフィンオキシド官能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を有する化合物を生成する。シュタウディンガーライゲーションは、それが２つの出発分子を一緒に結び付ける（結合する／共有結合で連結する）ためそのように命名されており、他方、古典的シュタウディンガー反応では、２つの生成物は、加水分解後は共有結合で連結されていない。
用語「［核酸］の構造的完全性が減少しない」または「［核酸］の構造的完全性の保存」は、本願明細書において使用する場合、１）ゲル電気泳動および検出（染色など）によって分析される場合、標識された核酸から生じるバンドもしくはスポットが、分析された標識核酸から生じることにより、同量の電気泳動に供された非標識の核酸から生じる対応するバンドもしくはスポットに対して２０％を超えて強度が減少していない、好ましくは１０％を超えて減少していないこと、または２）ゲル電気泳動によって分析される場合、標識された核酸から生じるバンドもしくはスポットが、同量の電気泳動に供された非標識の核酸から生じる対応するバンドもしくはスポットよりも有意にシャープでないと観察されないこと（ここで、「有意にシャープでない」（「有意により拡散している」と同義）は、対応する非標識の核酸よりも、その検出可能なバンドもしくはスポットが、ゲル上で少なくとも５％多い、好ましくは１０％多い、より好ましくは２０％多い面積を占めることを意味する）のいずれかを意味する。標識された核酸の構造的完全性についての他の再現性のある試験としては、放出されたアミノ酸もしくはペプチドの検出、または質量分析が挙げられるが、これらに限定されない。
一般に、本発明の理解を容易にするため、アジド部分、アルキン部分またはホスフィンを用いた核酸の代謝または酵素による標識、およびアジド反応性部分、アルキン反応性部分またはホスフィン反応性部分を用いたかかる部分の化学的標識が最初に詳細に記載される。この後に、かかる標識された核酸が検出され、単離され、および／または分析されるいくつかの実施形態が続く。次いで、例示的な方法が開示される。
［３＋２］環化付加を用いた核酸ポリマーの標識
本願明細書に記載される方法に従って生成されるか、または本願明細書に記載される方法で利用される核酸ポリマーは、一本鎖または二本鎖デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーである。当業者なら分かるように、この核酸ポリマーは、少なくとも約８個のヌクレオチドを含む短いオリゴヌクレオチドおよび完全ゲノムＤＮＡ分子を含む広範なサイズのいずれかのポリヌクレオチドであってよい。
本願明細書に記載される標識方法のいくつかは、一般に、核酸ポリマーに組み込まれたヌクレオチド上の第１の反応性不飽和基と、レポーター分子、担体分子および／または固体支持体に結合した第２の反応性不飽和基との間の［３＋２］環化付加を含む。従って、一態様では、この修飾核酸ポリマーは、レポーター分子、担体分子および／または固体支持体上の活性化アルキンと反応して共有結合を形成するアジド基を含む。別の態様では、この修飾核酸ポリマーは、レポーター分子、担体分子および／または固体支持体上のアジド部分と反応して共有結合を形成する活性化アルキンを含む。
本願明細書に記載されるように、本願明細書において核酸とも呼ばれる核酸ポリマーのタグ化／標識は、核酸ポリマーへの生体直交型（ｂｉｏｏｒｔｈｏｇａｎｏｌ）部分の組み込み、引き続く標識の化学的結合を利用する。この生体直交型部分は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーションベースの熱サイクル（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）アプローチ、逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、線形増幅手法および等温ＤＮＡ増幅手法（例としてのみであるが、リアルタイム鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、Ｑ−β複製酵素増幅、自動Ｑ−β複製酵素増幅アッセイなど）ならびに他のＲＮＡポリメラーゼ媒介手法（例えば、核酸配列ベース増幅またはＮＡＳＢＡおよび転写媒介増幅（ＴＭＡ）など）を含む（これらに限定されない）生体外伸長および／または増幅手法を用いて核酸に組み込むことができる。特定の実施形態では、かかる生体直交型部分は、テロメラーゼベースの組み込みを用いて組み込まれる。これらの生体直交型部分は、非常に選択的な反応を介して修飾することができる独特の化学官能性を保有する、非未変性の、非摂動性の（ｎｏｎ−ｐｅｒｔｕｒｂｉｎｇ）化学的手がかりである。かかる部分の例としては、ヒドラジドおよびアミノオキシ誘導体、ホスフィン（シュタウディンガーライゲーション）で選択的に修飾できるアジド、活性化アルキンで選択的に修飾できるアジド、および末端アルキン（「クリック」化学）で選択的に修飾できるアジドが挙げられるが、これらに限定されない。かかる生体直交型部分を組み込むことができる核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびオリゴヌクレチドが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、ヘリカーゼ依存性増幅を用いる等温ＤＮＡ増幅技術が、生体直交型部分を核酸に組み込むために使用される。かかるヘリカーゼ依存性増幅の例としては、以下のものが挙げられる：
（ａ）ＤＮＡヘリカーゼの巻き戻し活性およびＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性を利用することによって、単一の温度（３７℃）でＤＮＡを増幅するｍＨＤＡ技術；
（ｂ）熱耐性ＤＮＡヘリカーゼの巻き戻し活性およびＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｅｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ）由来）のＤＮＡ合成活性を利用することによって単一の温度（６５℃）でＤＮＡを増幅するｔＨＤＡ技術；
（ｃ）ＤＮＡ増幅がＴ７ヘリカーゼおよびＴ７ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ローリングサークル型ＤＮＡ増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に類似している環状ＨＤＡ。このプラットフォームにおける他のアクセサリータンパク質としては、例えば、Ｔ７一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が挙げられる。このプラットフォームは、プラスミドまたは共有結合で閉じた環状ＤＮＡの生体外増幅に使用できる。この技術は、臨床診断および分子生物学において（例えば、ＤＮＡ配列決定および変異原性において）重要な用途を有する；ならびに
ｄ）ｒｔ−ＨＤＡは、Ｂｓｔポリメラーゼのポリメラーゼ活性を組み合わせて、一定温度条件下での逆転写酵素の逆転写酵素活性を利用する。
特定の実施形態では、等温ＤＮＡ増幅技術である、鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＳＤＡ）が、生体直交型部分を核酸に組み込むために使用される。ＳＤＡでは、制限部位を含有するプライマーが鋳型にアニーリングされる。次いで増幅プライマーは、５’隣接配列にアニーリングされ（ニックを形成する）、増幅を一定温度で開始させる。新しく合成したＤＮＡは制限酵素によってニックが入れられ、ポリメラーゼが増幅を再び開始し、新しく合成した鎖を置き換える。ＤＮＡの１０９個のコピーを１回の反応で作製することができる。
特定の実施形態では、等温ＤＮＡ増幅技術である、ループ媒介等温ＤＮＡ増幅（Ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が、生体直交型部分を核酸に組み込むために使用される。ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）法は、標的遺伝子上の６つの明確に異なる領域を認識する４種のプライマー、および等温条件下で反応を実施するための鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する。遺伝子の増幅および検出は、試料、プライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼおよび基質の混合物を６０〜６５℃の間の一定温度でインキュベートすることにより、１回の工程で完了することができる。この方法は、高増幅効率を提供し、ＤＮＡは１５〜６０分間に１０９〜１０１０回増幅される。その高特異性に起因して、増幅された生成物の存在が標的遺伝子の存在を示すことができる。ＬＡＭＰはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼも使用する。
特定の実施形態では、ローリングサークル型ＤＮＡ増幅／φ２９ベースのＤＮＡ全ゲノム（または部分的ゲノム）増幅が、生体直交型部分を核酸に組み込むために使用される。この方法はφ２９ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、高い忠実度および効率でＤＮＡ（直線状または環状）を増幅することができる。かかる増幅方法は、インサイツハイブリダイゼーションからＤＮＡプローブを調製するのに使用できる。
少なくとも１種のヌクレオチド類似体を含有する核酸ポリマーは、別の方法として、合成による方法および酵素による方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，１９８９，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，１９９０，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編集），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ「Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第Ｉ部および第ＩＩ部）」，１９９３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ；「ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」，１９９５，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編集），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；および「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，２００２，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編集），第５版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：Ｓｅｃａｕｃｕｓ，ＮＪ）を含めて、当該技術分野で周知の種々の方法のいずれかによって調製することができる。
本願明細書に記載される方法で使用される核酸は、ホスホロアミダイトアプローチに基づく自動の固相手順を用いて調製することができる。かかる方法では、各ヌクレオチド（ヌクレオチド類似体を含む）は、３’末端で固体支持体に結合されている成長しているポリヌクレオチド鎖の５’末端に個々に付加される。加えられたヌクレオチドは、５’位のジメトキシトリチル（ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｙｌ）（すなわちＤＭＴ）基により重合から保護されている三価の３’−ホスホロアミダイトの形態にある。塩基誘導ホスホロアミダイトカップリング、五価のホスホトリエステル中間体を与える温和な酸化の後、ＤＭＴ除去によって、ポリヌクレオチド伸長のための新しい部位が提供される。次いでこの核酸ポリマーは固体支持体から切断され、ホスホジエステルおよび環外アミノ基は水酸化アンモニウムで脱保護される。これらの合成は、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）／アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）（カリフォルニア州、フォスターシティー）、デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）（デラウエア州、ウィルミントン）またはミリゲン（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ）（マサチューセッツ州、ベッドフォード）から市販されているオリゴシンセサイザーなどの装置で実施することができる。
当業者には分かるように、本願明細書に記載される核酸ポリマーは、合成前修飾方法（すなわち、核酸分子へのヌクレオチド類似体の組み込み）または合成後修飾方法（すなわち、天然に存在するヌクレオチドから核酸分子中のヌクレオチド類似体への修飾）のいずれかによって調製してもよい。あるいは、ヌクレオチド類似体は、ＤＮＡ複製によって細胞または生命体のＤＮＡに、または以下に記載するような反応によってＲＮＡに組み込むことができる。
従って、特定の実施形態では、修飾された核酸ポリマーおよびポリマーそれ自身を作製するための方法が提供される。
一態様は、アジド、アルキンまたはホスフィン修飾核酸ポリマーを作製するための方法であって、核酸増幅酵素の存在下で少なくとも１種のアジド、アルキンまたはホスフィン修飾ヌクレオチドをインキュベートして、アジド、アルキンまたはホスフィン修飾核酸ポリマーを形成する工程を含む方法である。一態様では、核酸酵素はＤＮＡポリメラーゼであり、別の態様では、核酸酵素はＲＮＡポリメラーゼである。本発明者らは、予想外にも、核酸ポリマーへのアジド修飾ヌクレオチドの組み込みが、ハイブリダイゼーション条件下でそのポリマーの融解温度を高めることを見出した。従って、高められた融解温度を有するプローブが利用され得るあらゆる応用が、修飾核酸ポリマーを使用する本発明の方法において想起される。
本発明の核酸ポリマーの単離または精製は、必要な場合は、当該技術分野で周知の種々の方法のいずれかによって実施してよい。核酸ポリマーの精製は、典型的には、未変性アクリルアミドゲル電気泳動、アガロース電気泳動、またはサイズ排除、または例えばＪ．Ｄ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＦ．Ｅ．Ｒｅｇｎｉｅｒ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，１９８３，２５５：１３７−１４９）に記載されるアニオン交換ＨＰＬＣ、または逆相ＨＰＬＣ（Ｇ．Ｄ．ＭｃＦａｒｌａｎｄおよびＰ．Ｎ．Ｂｏｒｅｒ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９７９，７：１０６７−１０８０）のいずれかによって実施される。
所望の場合、合成核酸ポリマーの配列は、化学的分解（Ａ．Ｍ．ＭａｘａｍおよびＷ．Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８０，６５：４９９−５６０），マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析（Ｕ．Ｐｉｅｌｅｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３，２１：３１９１−３１９６）、アルカリホスファターゼおよびエキソヌクレアーゼ消化後の質量分析（Ｈ．ＷｕおよびＨ．Ａｂｏｌｅｎｅｅｎ， Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１，２９０：３４７−３５２）などを含む（これらに限定されない）任意の適切な配列決定方法を用いて確認することができる。
アジド部分、アルキン部分、またはホスフィン部分を含むヌクレオチドの組み込みによって容易にされた、標識された核酸の検出、単離および／または分析のための方法および組成物が本願明細書に提供される。特に、Ａ）アジド部分を含むヌクレオチドを核酸に組み込むための増幅方法のための新規な方法、Ｂ）かかるアジド修飾核酸を溶液中で標識し、次いで核酸を分離するための当該技術分野で公知の方法を用いて分離するための新規な方法、Ｃ）固定化された修飾核酸を標識するための新規な方法、およびＤ）かかる修飾核酸を用いたテロメラーゼベースのアッセイのための新規な方法が提示される。加えて、これらのアジド、活性化アルキンまたはホスフィン修飾核酸は、本願明細書に提示される方法を用いてレポーター分子、担体分子および／または固体支持体とコンジュゲートを形成することができる。このレポーター分子としては、標識を挙げることができるがこれに限定されず、他方、固体支持体としては、固体支持体樹脂、マイクロタイタープレートおよびマイクロアレイスライドを挙げることができるが、これらに限定されない。担体分子としては、アフィニティータグ、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリマーを挙げることができるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、核酸は、アルキン含有ヌクレオチドで修飾され、他の実施形態では、核酸は、ホスフィン含有ヌクレオチドで修飾される。
ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体
本願明細書に記載される方法で使用するために適切なヌクレオシド類似体（またはヌクレオチド類似体）としては、［３＋２］環化付加またはシュタウディンガーライゲーションを受けることができる反応性生体直交型部分を含む、本願明細書において定義されるような任意のヌクレオシド類似体（またはヌクレオチド類似体）が挙げられる。いくつかの実施形態では、この反応性生体直交型部分は、ヌクレオシド（またはヌクレオチド）の塩基によって保有される。反応性生体直交型部分を保有する塩基は、プリン（例えば、アデニンもしくはグアニン）またはピリミジン（例えば、シトシン、ウラシルもしくはチミン）であってよい。特定の実施形態では、この塩基はウラシルであり、いくつかのかかる実施形態では、ウラシルは５位に反応性生体直交型部分を保有する。特定の実施形態では、この塩基はアデニンであり、いくつかのかかる実施形態では、アデニンは、反応性生体直交型部分を保有する。特定の実施形態では、この生体直交型部分は、間接的にその塩基に結合されており、他方、他の実施形態では生体直交型部分は塩基に直接共有結合で結合されている。本願明細書に記載される方法で使用することができるヌクレオシド類似体の非限定的な例としては、５−エチニル−２’デオキシウラシル（本願明細書においてエチニルウラシルまたはＥｄＵとも呼ばれる）および５−アジド−２’−デオキシウラシル（本願明細書においてアジドウラシルまたはＡｄＵとも呼ばれる）ならびにそれらの三リン酸形態およびホスホロアミダイト形態が挙げられる。ＥｄＵは、基本的にＣ．−Ｓ．ＹｕおよびＦ．Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒ， Ｓｙｎｌｅｔｔ，２０００，１：８６−８８に記載される方法で合成することができ、ＡｄＵは、Ｐ．Ｓｕｎｔｈａｎｋａｒら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９８，２５８：１９５−２０１に記載されるアジド−ｄＵＭＰを合成するための方法と類似の方法を用いて合成することができる。ＥｄＵは、ベリーアンドアソシエイツ社（Ｂｅｒｒｙ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）（ミシガン州、デクスター）から市販されてもいる。
特定の実施形態では、この反応性生体直交型部分は、ヌクレオシド（またはヌクレオチド）の糖（リボースおよびデオキシリボース）によって保有される。特定の実施形態では、この生体直交型部分は間接的に糖に結合されているが、他方、他の実施形態では、生体直交型部分は直接的に共有結合によって糖に結合されている。特定の実施形態では、上記ヌクレオチドは、リン酸部分に結合された反応性生体直交型部分を有するヌクレオチド一リン酸である。特定の実施形態では、上記ヌクレオチドは、末端リン酸部分に結合された反応性生体直交型部分を有するヌクレオチド二リン酸である。特定の実施形態では、上記ヌクレオチドは、末端リン酸部分に結合された反応性生体直交型部分を有するヌクレオチド三リン酸である。反応性生体直交型部分を保有する糖は、プリン（例えば、アデニンもしくはグアニン）またはピリミジン（例えば、シトシン、ウラシルもしくはチミン）に共有結合によって結合することができる。特定の実施形態では、上記塩基はウラシルであり、他方、他の実施形態では上記塩基はアデニンである。本願明細書に記載される方法（図１を参照）で使用することができるヌクレオチド三リン酸類似体の非限定的な例としては、Ｎ３−ｄＡＴＰ（アジド−ｄＡＴＰ）、Ｎ３−ｄＵＴＰ（アジド−ｄＵＴＰ）、Ｎ３−ｄＴＴＰ、Ｎ３−ｄＧＴＰ、Ｎ３−ｄＣＴＰ、Ｅ−ｄＡＴＰ（エチニル−ｄＡＴＰ）およびＥ−ｄＵＴＰ（エチニル−ｄＵＴＰ）、Ｅ−ｄＧＴＰ、Ｅ−ｄＣＴＰ、Ｅ−ｄＴＴＰが挙げられる。
上記反応性生体直交型部分は、ニトリルオキシド、アジド、ジアゾメタン、ナイトレンまたはニトリルイミンなどの１，３−双極子であってよい。特定の実施形態では、この１，３−双極子はアジドである。あるいは、この反応性生体直交型部分は、アルケン（例えば、ビニル、プロピレニルなど）またはアルキン（例えば、エチニル、プロピニルなど）などの親双極子であってよい。特定の実施形態では、この親双極子はアルキン、例えば、エチニル基などである。
アジド、アルキンまたはホスフィン部分を含有する核酸の化学修飾
本願明細書に記載される方法を用いて化学修飾することができる核酸は、アジド部分、アルキン部分またはホスフィン部分を含有し、それらの部分は、アジド部分、アルキン部分またはホスフィン部分を含む核酸塩基を利用する種々の増幅手法を用いて核酸に組み込まれる。かかる核酸塩基は、本願明細書に記載されるようにして化学合成された。これらのアジド部分、アルキン部分およびホスフィン部分は、非常に選択的な反応を介して修飾することができる独特の化学官能性を保有する非未変性、非摂動性の生体直交型化学的部分である。本願明細書に記載される方法で使用されるかかる反応の非限定的な例は、図２に示されており、その例ではアジド部分またはアルキン部分を含む核酸の化学標識は、本願明細書において「クリック」化学とも呼ばれる銅（Ｉ）触媒によるアジド−アルキン環化付加を利用し、アジド部分またはホスフィン部分を含む核酸の化学標識は、シュタウディンガーライゲーションを利用し、そして活性化アルキン部分または活性化アルキン反応性部分を含む核酸の化学標識。
「クリック」化学
アジドおよび末端または内部アルキンは、１，３−双極性環化付加（Ｈｕｉｓｇｅｎ環化付加）反応を受けて、１，２，３−トリアゾールを与えることができる。しかしながら、この反応は長い反応時間および高い温度を必要とする。あるいは、アジドおよび末端アルキンは、室温で銅（Ｉ）触媒によるアジド−アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）を行うことができる。「クリック」化学としても公知のかかる銅（Ｉ）触媒によるアジド−アルキン環化付加は、有機アジドおよび末端アルキンが反応して１，２，３−トリアゾールの１，４−位置異性体を与えるＨｕｉｓｇｅｎ １，３−双極性環化付加のバリエーションである。「クリック」化学反応の例は、化合物のライブラリを作製するために高収率でかつ副反応がほとんどなく、（炭素−炭素結合とは異なり）ヘテロ原子連結で互いと反応する試薬を開発した、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓら（２００５年１０月６日に公開された米国特許出願公開第２００５０２２２４２７号，ＰＣＴ／ＵＳ０３／１７３１１号；Ｌｅｗｉｓ Ｗ Ｇら，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔ’ｌ Ｅｄ．４１（６）：１０５３；Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．ら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｅｄ．２００１，４０：２００４−２０２１に概説される方法）に記載されている。本願明細書に記載される場合、「クリック」化学は、核酸を標識するための方法で使用される。
標識（レポーター基、固体支持体または担体分子）を核酸に接合するために本願明細書に記載される方法で使用される「クリック」化学反応のための触媒として使用される銅は、Ｃｕ（Ｉ）の還元状態にある。かかる銅（Ｉ）触媒によるアジド−アルキン環化付加で使用される銅（Ｉ）の供給源は、臭化銅（Ｉ）またはヨウ化銅（Ｉ）などのハロゲン化銅（Ｉ）を含む（これらに限定されない）任意の銅（Ｉ）塩であってよい。しかしながら、この位置選択的環化付加は、金属触媒および還元剤の存在下でも行うことができる。特定の実施形態では、銅は、還元剤の存在下でＣｕ（ＩＩ）還元状態で（例えば、Ｃｕ（ＮＯ３）２、Ｃｕ（ＯＡｃ）２またはＣｕＳＯ４など（これらに限定されない）の塩として）で提供されてもよく、この場合はＣｕ（Ｉ）はＣｕ（ＩＩ）の還元によってその場で形成される。かかる還元剤としては、アスコルベート、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２，４，６−トリクロロフェノール（ＴＣＰ）、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオサルフェート、金属銅、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ１、グルタチオン、システイン、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、または印加電位が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、この還元剤としては、Ａｌ、Ｂｅ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｄ、Ｚｒ、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｉ、Ｒｈ、およびＷから選択される金属が挙げられる。
核酸を標識するためのこの銅（Ｉ）触媒によるアジド−アルキン環化付加は、水と種々の（部分的に）混和性の有機溶媒（アルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ｔｅｒｔ−ブタノール（ｔＢｕＯＨ）およびアセトンが挙げられる）との混合物を含めて、水および種々の溶媒中で実施することができる。
いかなる特定の機構にも限定されないが、Ｃｕ（Ｉ）状態の銅が、本願明細書に記載される方法で使用される銅（Ｉ）触媒によるアジド−アルキン環化付加、すなわち「クリック」化学反応のために好ましい触媒である。特定の金属イオンは、水系溶媒中で不安定であり（例としてはＣｕ（Ｉ））、それゆえその反応を改良するために安定化配位子／キレート剤を使用することができる。特定の実施形態では、少なくとも１種の銅キレート剤が本願明細書に記載される方法で使用され、その場合、かかるキレート剤はＣｕ（Ｉ）状態の銅に結合する。特定の実施形態では少なくとも１種の銅キレート剤が本願明細書に記載される方法で使用され、その場合、かかるキレート剤はＣｕ（ＩＩ）状態の銅に結合する。特定の実施形態では、この銅（Ｉ）キレート剤は１，１０フェナントロリン含有銅（Ｉ）キレート剤である。かかるフェナントロリン含有銅（Ｉ）キレート剤の非限定的な例としては、バソフェナントロリンジスルホン酸（４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホン酸）およびバソキュプロインジスルホン酸（ＢＣＳ；２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホネート）が挙げられるが、これらに限定されない。かかる方法で使用される他のキレート剤としては、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、ピリジン−２，６−ジカルボン酸（ＰＤＡ）、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システイン（ＳＣＭＣ）、トリエンチン、テトラエチレンポリアミン（ＴＥＰＡ）、ＮＮＮＮ−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）、ＥＤＴＡ、ネオクプロイン、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、ピリジン−２，６−ジカルボン酸（ＰＤＡ）、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システイン（ＳＣＭＣ）、トリス−（ベンジル−トリアゾリルメチル）アミン（ＴＢＴＡ）、またはこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。実に様々の金属キレート剤が化学、生化学、および医学の分野で公知であるが、ほとんどの金属キレート剤はいくつかの金属をキレートすることが公知であり、従って金属キレート剤は、一般的に、銅によって触媒される１，３環化付加反応におけるその機能について試験することができる。特定の実施形態では、ヒスチジンがキレート剤として使用され、他方、他の実施形態では、グルタチオンがキレート剤および還元剤として使用される。
本願明細書に記載される「クリック」化学反応で使用される還元剤の濃度は、マイクロモル濃度〜ミリモル濃度の範囲にあってもよい。特定の実施形態では、還元剤の濃度は、約１００μＭ〜約１００ｍＭである。他の実施形態では、還元剤の濃度は約１０μＭ〜約１０ｍＭである。他の実施形態では、還元剤の濃度は約１μＭ〜約１ｍＭである。
「クリック」化学を用いて核酸を標識するための本願明細書に記載される方法の特定の実施形態では、反応で使用される銅（ＩＩ）が還元剤と接触した後で、少なくとも１種の銅キレート剤が添加される。他の実施形態では、銅（ＩＩ）を還元剤と接触させた直後に、少なくとも１種の銅キレート剤を加えることができる。他の実施形態では、銅（ＩＩ）および還元剤が反応混合物中で混合された後約５秒〜約２４時間の間に銅キレート剤が加えられる。他の実施形態では、少なくとも１種の銅キレート剤を、いつでも、例えば（例としてのみであるが）、銅（ＩＩ）および還元剤を接触させた直後に、または反応混合物中で銅（ＩＩ）および還元剤を接触させて約５分間以内に、銅（ＩＩ）および還元剤を含む反応混合物に加えることができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の銅キレート剤を、銅（ＩＩ）および還元剤を使用のために反応混合物中に混合した後、約５秒〜約１時間の間、約１分〜約３０分間の間、約５分間〜約１時間の間、約３０分間〜約２時間の間、約１時間〜約２４時間の間、約１時間〜約５時間の間、約２時間〜約８時間の間に、加えることができる。
他の実施形態では、１種以上の銅キレート剤を、かかる「クリック」化学反応に２回以上加えることができる。複数の銅キレート剤が反応液に加えられる実施形態では、銅キレート剤のうちの２つ以上はＣｕ（Ｉ）状態の銅に結合させることができるか、または銅キレート剤のうちの１つ以上はＣｕ（Ｉ）状態の銅に結合させ、１つ以上のさらなるキレート剤はＣｕ（ＩＩ）状態の銅に結合させることができる。特定の実施形態では、「クリック」化学反応への銅キレート剤の初期の添加の後に１種以上の銅キレート剤を加えてもよい。特定の実施形態では、反応への銅キレート剤の初期の添加後に加えられたその１種以上の銅キレート剤は、もっと早い時期にその反応に加えられた銅キレート剤と同じであってもよいし、それとは異なっていてもよい。
本願明細書に記載される「クリック」化学反応で使用される銅キレート剤の濃度は、当該技術分野で周知の方法を用いて測定および最適化することができる。この方法としては、核酸を標識するために「クリック」化学を用い、次いでかかる標識された核酸を検出して標識反応の効率および標識された核酸の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を決定する、本願明細書において開示される方法が挙げられる。特定の実施形態では、本願明細書に記載される方法で使用されるキレート剤濃度は、マイクロモル濃度〜ミリモル濃度の範囲、例としてのみであるが１μＭ〜１００ｍＭである。特定の実施形態では、キレート剤濃度は約１０μＭ〜約１０ｍＭである。他の実施形態では、キレート剤濃度は、約５０μＭ〜約１０ｍＭである。他の実施形態では、キレート剤は、水混和性溶媒（アルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ｔｅｒｔ−ブタノール（ｔＢｕＯＨ）およびアセトンなど）を含む溶液として提供することができる。他の実施形態では、キレート剤は、溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）など）を含む溶液として提供することができる。
本願明細書に記載される「クリック」化学を利用する核酸を標識するための方法の特定の実施形態では、核酸はアジド部分を保有することができ、その際に標識はアルキン部分を保有し、他方、他の実施形態では、核酸はアルキン部分を保有することができ、標識はアジド部分を保有する。
特定の実施形態では、修飾核酸ポリマーコンジュゲートを形成するための方法であって、
上記アジド修飾ヌクレオチドヌクレオチドをＤＮＡ増幅酵素の存在下で少なくとも１種の他のヌクレオチドと接触させることにより、上記アジド修飾ヌクレオチドを核酸ポリマーに組み込み、アジド修飾核酸ポリマーを形成する工程と、
このアジド修飾核酸ポリマーを、活性化もしくは末端アルキンまたはホスフィン部分を含むレポーター分子、担体分子または固体支持体と接触させて、核酸ポリマー−レポーター分子、担体分子、固体支持体コンジュゲートを形成する工程とを含む方法が提供される。
別の実施形態では、修飾核酸ポリマーコンジュゲートを形成するための方法であって、
末端アルキン修飾ヌクレオチドをＤＮＡ増幅酵素の存在下で少なくとも１種の他のヌクレオチドと接触させることにより、上記末端アルキン修飾ヌクレオチドを核酸ポリマーに組み込み、末端アルキン修飾核酸ポリマーを形成する工程と、
その末端アルキン修飾核酸ポリマーを、アジド部分を含むレポーター分子、担体分子または固体支持体と接触させて、核酸ポリマー−レポーター分子、担体分子、固体支持体コンジュゲートを形成する工程とを含む方法が提供される。
シュタウディンガーライゲーション
三価のリン化合物と有機アジドとの間の反応が関与するシュタウディンガー反応（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒら Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９１９、２、６３５）は、多くの応用に使用されてきた（Ｇｏｌｏｌｏｂｏｖら Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９８０、３７、４３７）；（Ｇｏｌｏｌｏｂｏｖら Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２、４８、１３５３）。その２種の反応物質の性質にはほとんど制限がない。このシュタウディンガーライゲーションはシュタウディンガー反応の改良版であり、求電子剤トラップ（通常、メチルエステル）がトリアリールホスフィン上に置かれている。シュタウディンガーライゲーションでは、アザ−イリド中間体が、水系媒体中で転位してアミド結合およびホスフィンオキシドを生成し、その２つの分子を一緒に繋げているが、シュタウディンガー反応ではその２つの生成物は加水分解後は共有結合されていない。かかるライゲーションは、米国特許出願公開第２００６０２７６６５８号に記載されている。特定の実施形態では、ホスフィンは、アザ−イリド中間体をトラップして加水分解の際に安定なアミド結合を形成するため、隣接するアシル基（エステル、チオエステルまたはＮ−アシルイミダゾール（すなわちホスフィノエステル、ホスフィノチオエステル、ホスフィノイミダゾール）など）を有することができる。特定の実施形態では、このホスフィンは、ホスフィンを安定化するためのジアリールホスフィンまたはトリアリールホスフィンであってもよい。標識を核酸に接合するために本願明細書に記載されるシュタウディンガーライゲーション法で使用されるホスフィンとしては、環状もしくは非環状、ハロゲン化、２リン（ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ）、またはポリマー状のものさえ含まれるが、これらに限定されない。同様に、アジドはアルキル、アリール、アシルまたはホスホリルであってもよい。特定の実施形態では、かかるライゲーションは、無酸素の無水条件下で実施される。
本願明細書に記載されるシュタウディンガーライゲーションを利用する核酸を標識するための方法の特定の実施形態では、核酸はアジド部分を保有することができ、その際に標識はホスフィン部分を保有し、他方、他の実施形態では、核酸はホスフィン部分を保有することができ、標識はアジド部分を保有する。
特定の実施形態では、修飾核酸ポリマーコンジュゲートを形成するための方法であって、
ホスフィン修飾ヌクレオチドヌクレオチドをＤＮＡ増幅酵素の存在下で少なくとも１種の他のヌクレオチドと接触させることにより、上記ホスフィン修飾ヌクレオチドを核酸ポリマーに組み込み、ホスフィン修飾核酸ポリマーを形成する工程と、
ホスフィン修飾核酸ポリマーを、アジド部分を含むレポーター分子、担体分子または固体支持体と接触させて、核酸ポリマー−レポーター分子、担体分子、固体支持体コンジュゲートを形成する工程とを含む方法が提供される。
活性化アルキンの化学
アジドおよびアルキンは、活性化アルキンとアジドとの反応を使用することにより、無触媒［３＋２］環化付加を行うことができる。かかる無触媒［３＋２］環化付加は、標識（レポーター分子、固体支持体または担体分子）を核酸に接合するための本願明細書に記載される方法で使用することができる。アルキンは、環ひずみ（例としてのみであるが、８員環構造など）によって、そして電子吸引性基をかかるアルキン環に追加することによって活性化することができるし、またはアルキンはルイス酸（例としてのみであるが、Ａｕ（Ｉ）またはＡｕ（ＩＩＩ）など）の添加によって活性化することができる。
本願明細書に記載される活性化アルキンを利用する核酸を標識するための方法の特定の実施形態では、核酸はアジド部分を保有することができ、その際に標識は活性化アルキン部分を保有し、他方、他の実施形態では、核酸は活性化アルキン部分を保有することができ、標識はアジド部分を保有する。
アジド部分、アルキン部分またはホスフィン部分で核酸が修飾された後、それらを適切な条件下で反応に供して、レポーター分子、固体支持体または担体分子とのコンジュゲートを形成することができる。本願明細書に記載される方法および組成物では、アジド部分、アルキン部分またはホスフィン部分は、修飾核酸上の反応性官能基または化学的手がかりとして使用され、このときレポーター分子、固体支持体もしくは担体分子上のアジド反応性部分、またはレポーター分子、固体支持体または担体分子上のアルキン反応性部分、またはレポーター分子、固体支持体もしくは担体分子上のホスフィン反応性部分は修飾核酸との反応に供され、核酸および少なくとも１種のレポーター分子、少なくとも１種の固体支持体および／または少なくとも１種の担体分子を含む共有結合によるコンジュゲートを形成する。
特定の実施形態では、２つのアジド反応性基が核酸を標識するために使用され、第１のものは「クリック」化学反応で使用されるアルキン部分であり、第２のものは、シュタウディンガーライゲーションで使用されるホスフィン（トリアリールホスフィンなど）である。一実施形態では、「クリック」化学は、アジド部分およびレポーター分子、固体支持体もしくは担体分子を含む核酸ポリマーとコンジュゲートを形成するために利用され、このときこのレポーター分子、固体支持体および担体分子はアルキン部分を含む。別の実施形態では、「クリック」化学は、アルキン部分ならびにレポーター分子、固体支持体および／または担体分子を含む核酸ポリマーとコンジュゲートを形成するために利用され、このときこのレポーター分子、固体支持体および担体分子はアジド部分を含む。別の実施形態では、シュタウディンガーライゲーションは、アジド部分ならびにレポーター分子、固体支持体および／または担体分子を含む核酸ポリマーとコンジュゲートを形成するために利用され、このときこのレポーター分子、固体支持体および担体分子はトリアリールホスフィン部分を含む。別の実施形態では、シュタウディンガーライゲーションは、トリアリールホスフィン部分ならびにレポーター分子、固体支持体および／または担体分子を含む核酸ポリマーとコンジュゲートを形成するために利用され、このときこのレポーター分子、固体支持体および担体分子はアジド部分を含む。本願明細書に記載される方法は、これらの２種のアジド反応性基または化学反応に限定されることは意図されておらず、レポーター分子、固体支持体または担体分子に結合されたアジド反応性基を利用する任意の化学反応が、本願明細書に記載されるアジド、アルキンまたはホスフィン修飾核酸ポリマーとともに使用できることが想定されている。
特定の実施形態では、修飾核酸ポリマーコンジュゲートを形成するための方法であって、
アジド修飾ヌクレオチドヌクレオチドをＤＮＡ増幅酵素の存在下で少なくとも１種の他のヌクレオチドと接触させることにより、上記アジド修飾ヌクレオチドを核酸ポリマーに組み込み、アジド修飾核酸ポリマーを形成する工程と、
アジド修飾核酸ポリマーを、活性化もしくは末端アルキンまたはホスフィン部分を含むレポーター分子、担体分子または固体支持体と接触させて、核酸ポリマー−レポーター分子、担体分子、固体支持体コンジュゲートを形成する工程とを含む方法が提供される。
別の実施形態では、修飾核酸ポリマーコンジュゲートを形成するための方法であって、
末端アルキン修飾ヌクレオチドをＤＮＡ増幅酵素の存在下で少なくとも１種の他のヌクレオチドと接触させることにより末端アルキン修飾ヌクレオチドを核酸ポリマーに組み込み、末端アルキン修飾核酸ポリマーを形成する工程と、
末端アルキン修飾核酸ポリマーを、アジド部分を含むレポーター分子、担体分子または固体支持体と接触させて、核酸ポリマー−レポーター分子、担体分子、固体支持体コンジュゲートを形成する工程とを含む方法が提供される。
核酸を標識するために環化付加反応を利用する、本願明細書に記載されるとおりの方法は、触媒量のＣｕ（Ｉ）塩をその反応混合物に添加することにより、室温で、水系条件中で、優れた位置選択性で実施することができる。例えば、Ｔｏｍｏｅら，（２００２）Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４；およびＲｏｓｔｏｖｔｓｅｖら，（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９を参照。「クリック」化学環化付加から得られる５員環は、一般に還元性環境中では可逆性ではなく、水系環境中で長期間加水分解に対して安定である。従って、かかる５員環を介して標識剤、検出薬、レポーター分子、固体支持体または担体分子に結合された核酸は安定である。
本願明細書に記載される方法および組成物で使用されるレポーター分子、固体支持体および担体分子は、アジド部分と反応できる少なくとも１つのアルキン部分または少なくとも１つのホスフィン部分を含むことができる。本願明細書に記載される方法および組成物で使用されるレポーター分子、固体支持体および担体分子は、アルキン部分またはホスフィン部分と反応できる少なくとも１つのアジド部分を含むことができる。本願明細書に記載される方法および組成物で使用されるレポーター分子、固体支持体および担体分子は、アジド部分と反応することができる少なくとも１つのホスフィン部分を含むことができる。特定の実施形態では、本願明細書に記載されるこのレポーター分子、固体支持体および担体分子のホスフィン部分はトリアリールホスフィン部分である。
特定の実施形態では、本願明細書に記載される方法および組成物で使用されるレポーター分子としては標識を挙げることができるが、これらに限定されず、他方、固体支持体としては、固体支持体樹脂、マイクロタイタープレートおよびマイクロアレイスライドを挙げることができるが、これらに限定されない。この担体分子としては、アフィニティータグ、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリマーを挙げることができるが、これらに限定されない。
レポーター分子
本願明細書において提供される方法および組成物で使用されるレポーター分子としては、本願明細書に記載される修飾核酸に共有結合によって結合することができる、当業者に公知の任意の直接的または間接的に検出可能なレポーター分子が挙げられる。特定の実施形態では、本願明細書において提供される方法および組成物で使用されるレポーター分子は、アジド修飾核酸、アルキン修飾核酸またはホスフィン修飾核酸に共有結合によって結合することができる、当業者に公知の任意の直接的または間接的に検出可能なレポーター分子を含む。
本願明細書に記載される方法および組成物で使用されるレポーター分子は、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、リン光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素および放射性同位体（これらに限定されない）を含有することができる。特定の実施形態では、かかるレポーター分子としては、フルオロフォア、蛍光タンパク質、ハプテン、および酵素が挙げられる。
本願明細書に記載される方法および組成物におけるレポーター分子で使用されるフルオロフォアは、任意に１回以上種々の置換基（ハロゲン、ニトロ、シアノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル、アリールもしくはヘテロアリール環系、ベンゾ、または当該技術分野で公知のフルオロフォア上に典型的に存在する他の置換基が挙げられるが、これらに限定されない）によって置換されている１つ以上の芳香族もしくはヘテロ芳香族環を含むことができる。
本願明細書に記載される方法および組成物におけるレポーター分子において使用されるフルオロフォアは、２８０ｎｍより長い波長で吸収極大を示し、かつ修飾ヌクレオチド（例としてのみであるが、アジド、およびアルキンまたはホスフィンなど）に共有結合によって結合されたとき、そのスペクトル特性を保持する、任意の化学的部分である。本願明細書に記載される方法および組成物におけるレポーター分子において使用されるフルオロフォアとしては、限定されないが、以下が挙げられる：ピレン（米国特許第５，１３２，４３２号に開示される、任意の対応する誘導体化合物を含む）、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールまたはベンゾインドール、オキサゾールまたはベンゾオキサゾール、チアゾールまたはベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン（米国特許出願番号第０９／９６８，４０１号および同第０９／９６９，８５３号中の任意の対応する化合物を含む）、カルボシアニン（米国特許出願番号第０９／５５７，２７５号、同第０９／９６９，８５３号および同第０９／９６８，４０１号；米国特許第４，９８１，９７７号；同第５，２６８，４８６号；同第５，５６９，５８７号；同第５，５６９，７６６号；同第５，４８６，６１６号；同第５，６２７，０２７号；同第５，８０８，０４４号；同第５，８７７，３１０号；同第６，００２，００３号；同第６，００４，５３６号；同第６，００８，３７３号；同第６，０４３，０２５号；同第６，１２７，１３４号；同第６，１３０，０９４号；同第６，１３３，４４５号；および国際公開番号第ＷＯ０２／２６８９１号、同第ＷＯ９７／４０１０４号、同第ＷＯ９９／５１７０２号、同第ＷＯ０１／２１６２４号；欧州特許第１０６５２５０Ａ１号中の任意の対応する化合物を含む）、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレート、アントラニレート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン（ｂｏｒａｐｏｌｙａｚａｉｎｄａｃｅｎｅ）（米国特許第４，７７４，３３９号；同第５，１８７，２８８号；同第５，２４８，７８２号；同第５，２７４，１１３号；および同第５，４３３，８９６号中に開示される任意の対応する化合物を含む）、キサンテン（米国特許第６，１６２，９３１号；同第６，１３０，１０１号；同第６，２２９，０５５号；同第６，３３９，３９２号；同第５，４５１，３４３号；および米国特許出願番号第０９／９２２，３３３号中に開示される任意の対応する化合物を含む）、オキサジン（米国特許第４，７１４，７６３号中に開示される任意の対応する化合物を含む）またはベンゾオキサジン、カルバジン（米国特許第４，８１０，６３６号中に開示される任意の対応する化合物を含む）、フェナレノン、クマリン（米国特許第５，６９６，１５７号；同第５，４５９，２７６号；同第５，５０１，９８０号；および同第５，８３０，９１２号中に開示される対応する化合物を含む）、ベンゾフラン（米国特許第４，６０３，２０９号および同第４，８４９，３６２号中に開示される任意の対応する化合物を含む）ならびにベンズフェナレノン（米国特許第４，８１２，４０９号中に開示される任意の対応する化合物を含む）ならびにこれらの誘導体。本願明細書において使用する場合、オキサジンは、レゾルフィン（５，２４２，８０５号中に開示される任意の対応する化合物を含む）、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジン、およびこれらのベンゾ置換類似体を含む。
本願明細書に記載される方法および組成物におけるレポーター分子で使用されるキサンテン型フルオロフォアとしては、フルオレセイン、ロドール（ｒｈｏｄｏｌ）（米国特許第５，２２７，４８７号および同第５，４４２，０４５号中に開示される任意の対応する化合物を含む）またはローダミン（米国特許第５，７９８，２７６号；同第５，８４６，７３７号；米国特許出願番号第０９／１２９，０１５号中の任意の対応する化合物を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。本願明細書において使用する場合、フルオレセインとしては、ベンゾフルオレセインもしくはジベンゾフルオレセイン、セミナフトフルオレセイン、またはナフトフルオレセインが挙げられる。同様に、本願明細書において使用される場合のロドールには、セミナフトロダフルオル（ｓｅｍｉｎａｐｈｔｈｏｒｈｏｄａｆｌｕｏｒ）（米国特許第４，９４５，１７１号に開示される任意の対応する化合物を含む）が挙げられる。特定の実施形態では、フルオロフォアは、キサンテンの９位での共有単結合である連結を介して結合したキサンテンである。他の実施形態では、キサンテンとしては、９位で結合した３Ｈ−キサンテン−６−オール−３−オンの誘導体、９位で結合した６−アミノ−３Ｈ−キサンテン−３−オンの誘導体、または９位で結合した６−アミノ−３Ｈ−キサンテン−３−イミンの誘導体が挙げられる。
特定の実施形態では、本願明細書に記載される方法および組成物におけるレポーター分子において使用されるフルオロフォアとしては、キサンテン（ロドール、ローダミン、フルオレセインおよびこれらの誘導体）、クマリン、シアニン、ピレン、オキサジンおよびボラポリアザインダセンが挙げられる。他の実施形態では、かかるフルオロフォアは、スルホン化キサンテン、フッ素化キサンテン、スルホン化クマリン、フッ素化クマリン、およびスルホン化シアニンである。
本願明細書に記載される方法および組成物におけるレポーター分子で使用されるフルオロフォアの非限定的な例は図３に示されており、そこではかかるフルオロフォアはアジド部分、アルキン部分またはホスフィン部分で修飾されている。特定の実施形態では、「クリック」化学反応で使用されるかかるフルオロフォアは、コンジュゲートがＵＶ励起を必要とせず、かつ蛍光性π系へのアジドまたはアルキン基の接合に起因する消光効果が全て克服されるトリアゾール生成物を形成する。
修飾核酸に付加されるフルオロフォアの選択は、修飾核酸の吸収および蛍光発光特性を決定する。修飾核酸の検出に使用できるフルオロフォア標識の物理的特性としては、スペクトル特性（吸収、発光およびストークスシフト）、蛍光強度、寿命、偏光および光退色速度、またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。これらの物理的特性のすべては、１種のフルオロフォアを別のフルオロフォアから区別するのめに使用でき、これによって多様な分析が可能になる。特定の実施形態では、フルオロフォアは、４８０ｎｍを超える波長に吸収極大を有する。他の実施形態では、フルオロフォアは、４８８ｎｍまたは４８８ｎｍ付近〜５１４ｎｍ（アルゴンイオンレーザー励起源の出力による励起に特に適する）または５４６ｎｍ付近（水銀アークランプによる励起に特に適する）で吸収する。他の実施形態では、フルオロフォアは、組織または生物全体への適用においてＮＩＲ（近赤外領域）で発光することができる。
フルオロフォアの多くは発色団としての機能も果たすことができ、従って記載されたフルオロフォアは、本願明細書に記載される方法および組成物におけるレポーター分子において使用される発色団でもある。
フルオロフォアに加えて、酵素も、本願明細書に記載される方法および組成物で使用される検出試薬／レポーター分子のための標識として使用できる。検出可能なシグナルの増幅を得ることができ、その結果、高められたアッセイ感度をもたらすため、酵素は望ましい標識である。酵素自体は、検出可能な応答を生成しないが、適切な基質が酵素に接触したときに基質を分解する機能を果たし、その結果、その変換された基質は蛍光性、比色性または発光性のシグナルを生成する。標識試薬上の１つの酵素が、検出可能なシグナルへと変換される複数の基質をもたらすことができるため、酵素は検出可能なシグナルを増幅する。これは、試料中に少量の標的が存在する場合、あるいは酵素と同等かまたはそれよりも強いシグナルを与えるフルオロフォアが存在しない場合には、有利である。しかしながら、フルオロフォアは、さらなるアッセイ工程を必要とせず、従ってアッセイを完了するのに必要とされる全体の時間を減少させるため、最も好ましい。酵素基質は、測定可能な好ましい生成物、例えば比色性、蛍光性または化学発光性の生成物をもたらすように選択される。かかる基質は、当該技術分野で広範に使用され、その多くはＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＨＡＮＤＢＯＯＫ（前出）に記載されている。
特定の実施形態では、発色基質または蛍光発生基質および酵素の組合せは、オキシドレダクターゼ（例としてのみであるが、西洋ワサビペルオキシダーゼ）および基質（例としてのみであるが、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）または３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ））を使用する。これらの基質は、特徴的な色（それぞれ、褐色および赤色）を呈する。本願明細書に記載される酵素のレポーター分子とともに使用される他の発色性オキシドレダクターゼ基質としては、２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、４−クロロ−１−ナフトールが挙げられるが、これらに限定されない。本願明細書に記載される酵素のレポーター分子とともに使用される蛍光発生基質としては、ホモバニリン酸または４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、還元体フェノキサジンおよび還元体ベンゾチアジン（アンプレックス（Ａｍｐｌｅｘ）（登録商標）レッド試薬およびそのバリエーション（米国特許第４，３８４，０４２号）、アンプレックスウルトラレッド（ＵｌｔｒａＲｅｄ）試薬およびそのバリエーション（国際公開番号第ＷＯ０５０４２５０４号）を含む）ならびに還元体ジヒドロキサンテン（ジヒドロフルオレセイン（米国特許第６，１６２，９３１号）を含む）およびジヒドロローダミン（ジヒドロローダミン１２３を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ペルオキシダーゼ基質は、本願明細書に記載される酵素のレポーター分子とともに使用することができる。かかるパーオキシド基質としては、チラミド（米国特許第５，１９６，３０６号；同第５，５８３，００１号および同第５，７３１，１５８号）が挙げられるが、これに限定されない。このチラミドは、酵素の作用の前にもともと検出可能であるが、チラミドシグナル増幅法（ＴＳＡ）として記載されるプロセスにおいてペルオキシダーゼの作用により「適所に固定される」という点で、独特のクラスのペルオキシダーゼ基質を代表する。これらの基質は、顕微鏡検査、フローサイトメトリ、光学式走査および蛍光光度法による、その後の検出のために、細胞、組織またはアレイである試料中の標的を標識するのに広く利用されている。
他の実施形態では、本願明細書に記載されるレポーター分子において使用される発色基質（および、ある場合には蛍光発生基質）および酵素の組み合わせとしては、ホスファターゼ酵素（例えば、例としてのみであるが、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼまたはかかるホスファターゼの組換え型バージョン）が挙げられる。かかるホスファターゼとの組み合わせで使用される発色基質としては、限定されないが、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、６−クロロ−３−インドリルホスフェート、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルホスフェート、ｐ−ニトロフェニルホスフェートもしくはｏ−ニトロフェニルホスフェートが挙げられ、または蛍光基質としては、例えば４−メチルアンベリフェリルホスフェート、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリニリルホスフェート（ＤｉＦＭＵＰ、米国特許第５，８３０，９１２号）、フルオレセインジホスフェート、３−Ｏ−メチルフルオレセインホスフェート、レソルフィンホスフェート、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）ホスフェート（ＤＤＡＯホスフェート）もしくはＥＬＦ９７、ＥＬＦ３９または関連するホスフェート（米国特許第５，３１６，９０６号および同第５，４４３，９８６号））が挙げられる。
本願明細書に記載されるレポーター分子で使用される他の酵素としては、グリコシダーゼ（β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびβ−グルコシダーゼが含まれるが、これらに限定されない）が挙げられる。かかる酵素とともに使用される発色基質としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）および類似のインドリルガラクトシド、グルコシドならびにグルクロニド、ｏ−ニトロフェニル β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）およびｐ−ニトロフェニル β−Ｄ−ガラクトピラノシドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい蛍光発生基質としては、レソルフィン β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレセインジグルクロニドおよびそれらの構造変異体（米国特許第５，２０８，１４８号；同第５，２４２，８０５号；同第５，３６２，６２８号；同第５，５７６，４２４号および同第５，７７３，２３６号）、４−メチルアンベリフェリル β−Ｄ−ガラクトピラノシド、カルボキシアンベリフェリル β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびフッ素化クマリン β−Ｄ−ガラクトピラノシド（米国特許第５，８３０，９１２号）が挙げられる。
本願明細書に記載されるレポーター分子で使用されるさらなる酵素としては、ヒドロラーゼ（例えば、コリンエステラーゼおよびペプチダーゼ）、オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼおよびシトクロムオキシダーゼ）、ならびに適切な基質が公知であるレダクターゼが挙げられるが、これらに限定されない。
化学発光を生成する酵素およびその適切な基質もまた、本願明細書に記載されるレポーター分子で使用することができる。かかる酵素としては、天然型および組換え型のルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、ホスファターゼ、グリコシダーゼおよびオキシダーゼに対して化学発光を生成する基質（例えば、安定なジオキセタン、ルミノール、イソルミノールおよびアクリジニウムエステルを含有するもの）も、本願明細書に記載されるレポーター分子で使用することができる。
酵素に加えて、ハプテンは、本願明細書に記載される標識／レポーター分子で使用することができる。特定の実施形態では、かかるハプテンとしては、ホルモン、天然薬物および合成薬物、汚染物質、アレルゲン、影響因子（ａｆｆｅｃｔｏｒ）分子、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、リンフォカイン、アミノ酸、ペプチド、化学中間体、ヌクレオチド、ジゴキシン、ビオチンなども挙げられる。ビオチンは、酵素系において検出可能なシグナルをさらに増幅する機能を果たすことができ、単離目的のためのアフィニティクロマトグラフィで使用できるタグとして機能できるので、有用である。検出目的では、ビオチンに親和性を有する酵素コンジュゲート（例えば、例としてのみであるが、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））が使用される。その後、本願明細書に記載されるようなペルオキシダーゼ基質を加えて検出可能なシグナルを生成することができる。
蛍光タンパク質も、本願明細書に記載される方法、組成物および修飾核酸における使用のために、本願明細書に記載される標識／レポーター分子において使用できる。かかる蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびフィコビリプロテインおよびそれらの誘導体が挙げられる。蛍光タンパク質（特に、フィコビリプロテイン）は、タンデム色素標識した修飾核酸を作製する際に特に有用である。これらのタンデム色素は、より大きなストークスシフトを得るために蛍光タンパク質およびフルオロフォアを含み、その発光スペクトルは、その蛍光タンパク質の吸収スペクトルの波長よりさらにシフトしている。これは、発光した蛍光が最大限に最適化されている試料（換言すると、その発光がほとんどまたは少しも、蛍光タンパク質により再吸収されない試料）中の少量の標的を検出する場合に特に有利である。その蛍光タンパク質およびフルオロフォアは、エネルギー転移対として機能し、その蛍光タンパク質は、フルオロフォアが吸収する波長で発光し、その後、その蛍光タンパク質のみを用いた場合の発光波長から遠く離れた波長で、フルオロフォアが発光する。特に有用な組み合わせは、米国特許第４，５２０，１１０号；同第４，８５９，５８２号；同第５，０５５，５５６号に開示されるフィコビリプロテイン、ならびに米国特許第５，７９８，２７６号に開示されるスルホローダミンフルオロフォア、または米国特許出願番号第０９／９６８／４０１号および同第０９／９６９／８５３号に開示されるスルホン化シアニンフルオロフォア；または米国特許第６，１３０，１０１号に開示されるスルホン化キサンテン誘導体および米国特許第４，５４２，１０４号に開示される組み合わせである。あるいは、フルオロフォアは、エネルギードナーとして機能し、蛍光タンパク質は、エネルギーアクセプターである。
担体分子：アジド反応性、アルキン反応性およびホスフィン反応性
本願明細書に記載される方法および組成物では、修飾核酸は、担体分子に接合することができる。特定の実施形態では、この修飾核酸は、アジド部分を含有する担体分子と反応することができる少なくとも１つのアルキン部分または少なくとも１つのホスフィン部分を含有する。他の実施形態では、この修飾核酸は、アルキン部分またはホスフィン部分を含有する担体分子と反応することができる少なくとも１つのアジド部分を含有する。他の実施形態では、この修飾核酸は、アジド部分を含有する担体分子と反応することができる少なくとも１つのホスフィン部分を含有する。特定の実施形態では、修飾核酸および担体分子のホスフィン部分はトリアリールホスフィン部分である。
種々の担体分子が、本願明細書に記載される方法および組成物で使用することができ、その例としては、抗原、ステロイド、ビタミン、薬物、ハプテン、代謝産物、毒素、環境汚染物質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、核酸ポリマー、炭水化物、脂質、およびポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、この担体分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、合成ポリマー、ポリマー微粒子、生物細胞、ウイルスまたはこれらの組合せを含有する。
他の実施形態では、この担体分子は、ハプテン、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸ポリマー、タンパク質、ペプチドまたは多糖類から選択される。さらに他の実施形態では、この担体分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、チラミン、合成ポリマー、ポリマー微粒子、生物細胞、細胞成分、イオンキレート化部分、酵素基質またはウイルスである。さらなる実施形態では、この担体分子は、抗体もしくはその断片、抗原、アビジンまたはストレプトアビジン、ビオチン、デキストラン、ＩｇＧ結合タンパク質、蛍光タンパク質、アガロース、および非生物微粒子である。
担体分子が酵素基質である特定の実施形態では、その酵素基質は、アミノ酸、ペプチド、糖類、アルコール、アルカン酸、４−グアニジノ安息香酸、核酸、脂質、スルフェート、ホスフェート、−ＣＨ２ＯＣＯ−アルキルおよびこれらの組合せから選択される。特定の実施形態では、かかる酵素基質は、ペプチダーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、デアルキラーゼ、エステラーゼ、グアニジノベンゾターゼ（ｇｕａｎｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏｔａｓｅ）、スルファターゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素、エキソヌクレアーゼ、レダクターゼ、エンドグリコセラミラーゼおよびエンドヌクレアーゼから選択される酵素によって切断することができる。
他の実施形態では、担体分子は、アミノ酸（保護されているか、またはリン酸、炭水化物、もしくはＣ１〜Ｃ２２カルボン酸によって置換されているものを含む）、あるいはアミノ酸のポリマー（ペプチドもしくはタンパク質など）である。関連する実施形態では、担体分子は、少なくとも５個のアミノ酸、より好ましくは５〜３６個のアミノ酸を含有する。かかるペプチドとしては、神経ペプチド、サイトカイン、毒素、プロテアーゼ基質、およびタンパク質キナーゼ基質が挙げられるが、これらに限定されない。他のペプチドは、細胞小器官局在ペプチド、つまり、細胞性輸送機構による特定の細胞下部構造内での局在化のために被接合化合物を標的とするペプチド（核移行シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）としての機能を果たしてもよい。特定の実施形態では、このタンパク質担体分子としては、酵素、抗体、レクチン、糖タンパク質、ヒストン、アルブミン、リポタンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、フィコビリプロテインおよび他の蛍光タンパク質、ホルモン、毒素ならびに増殖因子が挙げられる。他の実施形態では、タンパク質担体分子は、抗体、抗体断片、アビジン、ストレプトアビジン、毒素、レクチン、または増殖因子である。さらなる実施形態では、担体分子はハプテン（ビオチン、ジゴキシン、ジゴキシゲニンおよびフルオロフォアが挙げられるが、これらに限定されない）を含有する。
本願明細書に記載される方法および組成物で使用される担体分子はまた、フルオロフォアもしくは他のリガンドの結合のために、さらなるリンカーもしくはスペーサー（アルキニル結合（米国特許第５，０４７，５１９号）、アミノアリル結合（米国特許第４，７１１，９５５号）または他の結合など）を任意に含有する核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたは核酸ポリマーを含有することができる。他の実施形態では、このヌクレオチド担体分子は、ヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシドまたはジデオキシヌクレオシドであり、他の実施形態では、この担体分子はペプチド核酸（ＰＮＡ）配列またはロックド核酸（ＬＮＡ）配列を含有する。特定の実施形態では、上記核酸ポリマー担体分子は、一本鎖もしくは複数本鎖（ｍｕｌｔｉ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）の、天然もしくは合成のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであるか、あるいは異例のリンカー（モルホリン誘導体化したリン酸（アンチバイラル社（ＡｎｔｉＶｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．）、オレゴン州、コーバリス）など）、またはペプチド核酸（Ｎ−（２−アミノエチル）グリジン単位）を組み込んでおり、その場合、核酸は５０個未満のヌクレオチド、より典型的には２５個未満のヌクレオチドを含有する。
本願明細書に記載される方法および組成物で使用される担体分子は、炭水化物またはポリオールを含有することもでき、その例としては、多糖類（デキストラン、ＦＩＣＯＬＬ、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、デンプン、アガロースおよびセルロースなど）、またはポリマー（ポリ（エチレングリコール）など）が挙げられる。特定の実施形態では、多糖類担体分子としては、デキストラン、アガロースまたはＦＩＣＯＬＬが挙げられる。
本願明細書に記載される方法および組成物で使用される担体分子としては、糖脂質、リン脂質、およびスフィンゴリピドなど（これらに限定されない）の脂質を挙げることができる。特定の実施形態では、かかる脂質は６〜２５個の炭素を含む。他の実施形態では、担体分子としては、リポソームなどの脂質ベシクルが挙げられる。
本願明細書に記載される方法および組成物で使用される担体分子はまた、細胞、細胞系、細胞断片、または細胞レベル下の粒子（ウイルス粒子、細菌粒子、ウイルス成分、生物細胞（動物細胞、植物細胞、細菌、もしくは酵母など）、または細胞成分が挙げられる）であってもよい。本願明細書に記載される方法および組成物において担体分子として有用なかかる細胞成分の非限定的な例としては、リソソーム、エンドソーム、細胞質、核、ヒストン、ミトコンドリア、ゴルジ装置、小胞体および液胞が挙げられる。
本願明細書に記載される方法および組成物で使用される担体分子は、非共有結合によって有機物質または無機物質と会合することもできる。
本願明細書に記載される方法および組成物で使用される担体分子はまた、特異的結合対のメンバーを含むことができ、この場合、核酸を特異的結合対のメンバーへ接合することができ、結合された対の形成に使用することができる。特定の実施形態では、標識された特異的結合対のメンバーの存在は、その特異的結合対の相補的メンバーの場所を示し；各特異的結合対のメンバーは、もう一方のメンバーの特定の空間的組織および極性の組織に特異的に結合しかつそれと相補的である表面上または空隙中に、ある面積を有する。特定の実施形態では、本願明細書において記載される色素化合物（フルオロフォアまたは発色団）は、特異的結合対のためのレポーター分子として機能する。例示的な結合対を表２に示す。
（表２）代表的な特異的結合対
Figure 2010517594
＊IgGは免疫グロブリンである。
†cDNAおよびcRNAはハイブリダイゼーションのために使用される相補鎖である。
特定の態様では、本願明細書に記載される方法および組成物で使用される担体分子は、抗体断片（抗Ｆｃ、抗Ｆｃアイソタイプ、抗Ｊ鎖、抗κ軽鎖、抗λ軽鎖、もしくは一本鎖断片可変タンパク質などであるが、これらに限定されない）、または非抗体ペプチドもしくはタンパク質（例えば、可溶性Ｆｃ受容体、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、レクチン、もしくはこれらの断片であるが、これらに限定されない）である。一態様では、この担体分子は、標的結合抗体のＦｃ部分または標的結合抗体のＦｃ部分のアイソタイプに特異的なＦａｂ断片である（米国特許出願第１０／１１８，２０４号）。一価のＦａｂ断片は、通常は、マウスのモノクローナル抗体または種々の動物（例えば、ウサギまたはヤギが挙げられるが、これらに限定されない）の中で産生したポリクローナル抗体のいずれかから生産される。これらの断片は、マウスのＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ３のような任意のアイソタイプから産生することができる。
代替的な実施形態では、プロテインＧのような非抗体タンパク質もしくはペプチドまたは他の適切なタンパク質は、単独で使用することができるし、またはアルブミンと組合せてもよい。好ましいアルブミンとしては、ヒト血清アルブミンおよびウシ血清アルブミンまたはオボアルブミンが挙げられる。プロテインＡ、ＧおよびＬは、当業者に公知の、ＩｇＧに対する少なくとも１つの結合ドメインを備えるタンパク質またはそれらの誘導体（すなわち、ＩｇＧに対する親和性を有するタンパク質）を含むものとして定義される。これらのタンパク質は修飾することができるが、必ずしもその必要はなく、記載される他の担体分子と同様にして反応性部分に接合されてもよい。
別の態様では、本願明細書に記載される方法および組成物で使用される担体分子は全体が無処置の抗体である。抗体は、抗原に応答して動物が分泌または産生し、かつ抗体の形成を誘導する抗原と特異的に結合するという特定の特性を有する可溶性物質または分子を示す当該技術分野の用語である。抗体が糖タンパク質であり、従って抗種抗体を生成するのに使用されるという理由で、抗体自体は抗原または免疫源としても機能する。抗体（免疫グロブリンとしても知られている）は、５つの明確に異なる種類、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥに分類される。基本的なＩｇＧ免疫グロブリン構造は、２つの同一の軽ポリペプチド鎖および２つの同一の重ポリペプチド鎖（互いにジスルフィド結合により連結される）からなる。
ＩｇＧを酵素パパインで処理すると、一価抗原結合断片（本願明細書において、Ｆａｂ断片と呼ばれる）を単離することができる。ＩｇＧをペプシン（別のタンパク質分解酵素）で処理すると、より大きな断片（Ｆ（ａｂ’）２）が生成する。この断片は、穏やかな還元緩衝液による処理によって半分に分割することができ、一価Ｆａｂ’断片を生じる。Ｆａｂ’断片は、Ｆａｂよりもわずかに大きく、そしてヒンジ領域（より小さいＦａｂ断片には見出されない）由来の１つ以上の遊離スルフヒドリルを含む。用語「抗体断片」は、抗体のＦａｂ’部分、Ｆ（ａｂ’）２部分およびＦａｂ部分を定義するために本願明細書中で使用される。抗体断片を生成するために、抗体分子をペプシンおよびパパインで処理することは、当該分野で周知である（Ｇｏｒｅｖｉｃら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｏｌ．，１１６：３（１９８５））。
本願明細書に記載される方法および組成物における担体分子として使用される一価Ｆａｂ断片は、マウスモノクローナル抗体または外来抗体もしくはその断片によって免疫した種々の動物において生成されるポリクローナル抗体のいずれかから産生される（米国特許第４，１９６，２６５号は、モノクローナル抗体を生成する方法を開示している）。典型的に、二次抗体は、ウサギまたはヤギにおいて産生されたポリクローナル抗体から誘導されるが、ポリクローナル抗体を生成する動物として当業者に公知の任意の動物が、抗種抗体を生成するのに使用できる。用語「一次抗体」は、一次抗体の領域に結合する「二次抗体」に対して、抗原に直接的に結合する抗体をいう。モノクローナル抗体は、リガンド結合抗体が、当業者に周知の方法を用いてマウスハイブリドーマ細胞株から通常産生されるモノクローナル抗体と適合性である限り、ポリクローナル抗体と等しく、そしていくつかの場合にはポリクローナル抗体より好ましい。
一態様では、本願明細書に記載される方法および組成物において担体分子として使用される抗体は、外来性抗体のＦｃ領域のみに対して生成される。本質的には、動物（例えば、マウス）は、外来抗体のＦｃ領域断片のみで免疫される。ポリクローナル抗体は、その後の血液から収集され、これを酵素（ペプシンまたはパパイン）で処理して、一価断片が生成される。次いで、この断片は、全免疫グロブリンタンパク質（動物はそのタンパク質に対して免疫される）かまたはそのＦｃ断片のみを含むカラム上でアフィニティ精製される。
固体支持体：アジド反応性、アルキン反応性またはホスフィン反応性
本願明細書に記載される方法および組成物の一態様では、修飾核酸は、共有結合によって固体支持体に接合させることができる。これには、限定されないが、本願明細書において開示される任意のアジド修飾核酸および本願明細書において開示される任意の固体支持体が含まれる。特定の実施形態では、修飾核酸は、アジド部分を含む固体支持体と反応することができる少なくとも１つのアルキン部分または少なくとも１つのホスフィン部分を含む。他の実施形態では、修飾核酸は、アルキン部分またはホスフィン部分を含む固体支持体と反応することができる少なくとも１つのアジド部分を含む。他の実施形態では、修飾核酸はアジド部分を含む固体支持体と反応することができる少なくとも１つのホスフィン部分を含む。特定の実施形態では、この修飾核酸および固体支持体のホスフィン部分はトリアリールホスフィン部分である。
種々の固体支持体を本願明細書に記載される方法および組成物で使用することができる。かかる固体支持体は、具体的な種類の支持体に限定されず、それゆえ非常に多くの数の支持体が当該技術分野で利用でき、当業者に公知である。かかる固体支持体としては、エーロゲルおよびヒドロゲル、樹脂、ビーズ、バイオチップ（薄膜コーティングバイオチップを含む）、微小流体チップ、シリコンチップ、マルチウェルプレート（マイクロタイタープレートまたはマイクロプレートとも呼ばれる）、膜、伝導性金属および非伝導性金属、ガラス（顕微鏡スライドを含む）ならびに磁気支持体などの固体および半固体マトリクスが挙げられるが、これらに限定されない。本願明細書に記載される方法および組成物で使用される固体支持体の他の非限定的な例としては、シリカゲル、ポリマー膜、粒子、誘導体化したプラスチックフィルム、誘導体化したガラス、誘導体化したシリカ、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、多糖類（セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）など）、ポリ（アクリレート）、ポリスチレン、ポリ（アクリルアミド）、ポリオール、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、デンプン、ＦＩＣＯＬＬ、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン（ポリ（エチレングリコール）を含む）、ナイロン、ラテックスビーズ、電磁ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、デンプンなどが挙げられる。特定の実施形態では、本願明細書に記載される方法および組成物で使用される固体支持体は、液相に実質的に不溶である。
特定の実施形態では、固体支持体は、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、カーボネート、カルバメート、イソシアネート、スルホン、スルホネート、スルホンアミド、スルホキシドなど（これらに限定されない）の固体支持体反応性官能基を含むことができ、かかる官能基は本願明細書に記載されるアジド含有核酸を共有結合によって結合させるのに使用される。他の実施形態では、この固体支持体は、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、カーボネート、カルバメート、イソシアネート、スルホン、スルホネート、スルホンアミド、スルホキシドなど（これらに限定されない）の固体支持体反応性官能基を含むことができ、かかる官能基は本願明細書に記載されるアルキン含有核酸を共有結合によって結合させるために使用される。さらに他の実施形態では、この固体支持体は、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、カーボネート、カルバメート、イソシアネート、スルホン、スルホネート、スルホンアミド、スルホキシドなど（これらに限定されない）の固体支持体反応性官能基を含むことができ、かかる官能基は本願明細書に記載されるホスフィン含有核酸を共有結合によって結合させるために使用される。他の実施形態では、この固体支持体は、アジド、アルキンまたはホスフィン部分で修飾された核酸を共有結合によって結合させるためのアジド、アルキンまたはホスフィン官能基を含む。
本願明細書に記載される方法および組成物で使用される適切な固相支持体は、所望の最終用途および種々の合成手順への適性に基づき選択することができる。例としてのみであるが、本願明細書に記載される修飾核酸を固体支持体に結合するためにアミド結合形成が望ましい場合、ポリスチレン（例えば、バケム社（Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．）、ペニンシュララボラトリーズ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）などから得られるＰＡＭ樹脂）、ポリハイプ（ＰＯＬＹＨＩＰＥ）（商標）樹脂（アミノテック（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ）、カナダから得られる）、ポリアミド樹脂（ペニンシュララボラトリーズから得られる），ポリエチレングリコールがグラフトされたポリスチレン樹脂（テンタゲル（ＴｅｎｔａＧｅｌ）（商標）、ラップポリマー（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）、ドイツ、チュービンゲン）、ポリジメチルアクリルアミド樹脂（ミリゲン／バイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、カリフォルニア州から入手できる）、またはＰＥＧＡビーズ（ポリマーラボラトリーズ（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から得られる）などのペプチド合成で一般に有用な樹脂を用いてもよい。特定の実施形態では、本願明細書に記載される修飾核酸は、アレイ形式で固体支持体上に堆積される。特定の実施形態では、かかる堆積は、支持体表面と送達機構（ピンもしくはキャピラリーなど）との間の直接表面接触によって、または液体を小型ノズルから固体表面へと移動させるために圧電性形態および他の形態の推進力を利用するインクジェット技術によって達成される。接触印刷の場合には、ロボット制御システムおよび多重印刷ヘッドによって、自動マイクロアレイ製作が可能になる。圧電性推進力技術による無接触堆積についても、ロボットシステムによって、連続装置およびドロップオンデマンドの（ｄｒｏｐ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ）装置のいずれかを用いて自動マイクロアレイ製作が可能になる。
組成物
一態様では、本願明細書において提供される修飾核酸、レポーター分子および担体分子は、修飾核酸、第１のレポーター分子、および担体分子を含む第１の組成物を形成するために使用することができる。別の実施形態では、第２の核酸は第２のコンジュゲートと組み合わせて第１の組成物を含み、この第２のコンジュゲートは、第２のレポーター分子に共有結合によって結合されている担体分子または固体支持体を含む。この第１および第２のレポーター分子は、異なる構造を有し、好ましくは異なる発光スペクトルを有する。他の実施形態では、第１および第２のレポーター分子は、それらの蛍光発光が基本的に重ならないように選択される。他の実施形態では、このレポーター分子は異なる励起スペクトルを有し、他方、他の実施形態では、レポーター分子は類似の励起波長を有し、同じレーザーによって励起される。かかる組成物では、第２の組成物中のコンジュゲートの担体分子（または固体支持体）は、同じ分子であってもよく、異なる分子であってもよい。種々の担体分子の特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）に関する本願明細書における考察は、この実施形態および他の実施形態に一般に適用できる。
別の態様では、本願明細書において提供される修飾核酸、レポーター分子および固体支持体は、修飾核酸、第１のレポーター分子、および固体支持体を含む第１の組成物を形成するために使用することができる。別の実施形態では、第２の組成物は、第２のコンジュゲートと組み合わせて第１の組成物を含む。第２のコンジュゲートは、第２のレポーター分子に共有結合によって結合される固体支持体または担体分子（本願明細書に記載される）を含む。この第１および第２のレポーター分子は、異なる構造を有し、好ましくは異なる発光スペクトルを有する。他の実施形態では、第１および第２のレポーター分子は、それらの蛍光発光が基本的に重ならないように選択される。他の実施形態では、このレポーター分子は異なる励起スペクトルを有し、他方、他の実施形態では、レポーター分子は類似の励起波長を有し、同じレーザーによって励起される。かかる組成物では、第２の組成物中のコンジュゲートの固体支持体（または担体分子）は、同じ分子であってもよく、異なる分子であってもよい。種々の固体支持体の特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）に関する本願明細書における考察は、本発明のこの実施形態および他の実施形態に一般に適用できる。
修飾核酸を標識および分離すること
修飾核酸−標識（レポーター分子、固体支持体または担体分子）コンジュゲートを形成するための方法が本願明細書に記載される。一態様では、修飾生体分子−レポーター分子コンジュゲートは、溶液中で形成され、次いで当該技術分野で公知の方法を用いて分離される。銅キレート剤を「クリック」化学接合反応に加えることによって、修飾核酸の標識効率およびゲル電気泳動でのそれらの分割が、銅キレート剤の添加がない反応と比べて改善することを、我々は予想外にも見出した。特定の実施形態では、「クリック」化学を用いて核酸を標識する方法には、アジド修飾核酸ならびに銅（ＩＩ）、還元剤、および少なくとも１種の銅（Ｉ）キレート剤を含む混合物中で反応する末端アルキンを含む標識が関与する。他の実施形態では、溶液中、「クリック」化学条件下で、アジド修飾核酸および末端アルキンを含むレポーター分子とのコンジュゲートを形成するための新規な方法が提供される。他の実施形態では、「クリック」化学は、アルキン修飾核酸およびアジドを含むレポーター分子とのコンジュゲートを形成するために使用することができる。他の実施形態では、シュタウディンガーライゲーションが、アジド修飾核酸およびホスフィンを含むレポーター分子とのコンジュゲートを形成するために使用され、他方、他の実施形態は、ホスフィン修飾核酸およびアジドを含むレポーター分子とのコンジュゲートを形成するために、シュタウディンガーライゲーションを使用する。さらに他の実施形態は、活性化アルキン修飾核酸を用いてアジドを含むレポーター分子とのコンジュゲートを形成し、またはアジド修飾核酸は、活性化アルキン含有レポーター分子とコンジュゲートを形成する。
本願明細書において提示される他の態様では、アジド基を含む核酸および末端アルキンを含む標識が、銅（ＩＩ）、還元剤、および少なくとも１種の銅（Ｉ）キレート剤を含む混合物中で反応させ、標識された核酸を生成する、「クリック」化学を用いて核酸を標識する方法は、標識された核酸の構造的完全性の保存をもたらす。他の実施形態では、標識後の核酸の構造的完全性が減少しない糖タンパク質を標識する方法は、末端アルキンを含む核酸およびアジド基を含む標識が、銅（ＩＩ）、還元剤、および少なくとも１種の銅キレート剤を含む混合物中で反応する、「クリック」化学を含む。
本願明細書に記載される「クリック」化学を用いてアジド基を含む核酸を標識するための方法は、末端アルキンを含む核酸についても使用することができ、この場合は、核酸と反応する標識はアジド基を含む。本願明細書に記載される「クリック」化学を用いてアジド基を含む核酸を標識および検出するための方法は、末端アルキンを含む核酸についても使用することができ、この場合は、この核酸と反応する標識はアジド基を含む。一実施形態は、核酸−レポーター分子コンジュゲートを形成するための本願明細書に記載される「クリック」化学反応を用いる方法であり、この反応では、反応混合物はアジド部分を有するレポーター分子、アルキン修飾核酸、銅（ＩＩ）イオン、少なくとも１種の還元剤および銅キレート剤を含む。特定の実施形態では、かかるアルキン修飾核酸はアルキン修飾糖タンパク質であり、かかるアジド部分を有するレポーター分子は、本願明細書に記載される任意のレポーター分子である。他の実施形態では、かかるアルキン修飾核酸はアルキン修飾糖タンパク質であり、かかるアジド部分を有するレポーター分子は本願明細書に記載される任意のフルオロフォアベースのレポーター分子である。
本願明細書において提示される他の方法は、本願明細書に記載される「クリック」化学環化付加反応を用いて分離した核酸を標識および検出するための方法である。この方法は、反応混合物中で、アジド基を含む核酸、末端アルキン基を含む標識、銅（ＩＩ）、還元剤、および銅キレート剤を混合する工程と、その反応混合物を、核酸へのその標識の化学的接合を促進する条件下でインキュベートする工程と、１つ以上の生化学的または生物物理学的な分離手法を用いてその核酸を分離する工程と、その核酸を検出する工程とを含む。他の実施形態では、この方法は、反応混合物中で、アルキン基を含む核酸、アジド基を含む標識、銅（ＩＩ）、還元剤、および銅キレート剤を混合する工程と、その反応混合物を、核酸へのその標識の化学的接合を促進する条件下でインキュベートする工程と、１つ以上の生化学的または生物物理学的な分離手法を用いてその核酸を分離する工程と、その核酸を検出する工程とを含む。
一実施形態は、修飾核酸標識（レポーター分子、固体支持体または担体分子）コンジュゲートを形成するための方法であって、
ａ）末端アルキン部分を有する標識、アジド修飾核酸、銅（ＩＩ）イオン、少なくとも１種の還元剤および銅キレート剤を含むアジド−アルキン環化付加反応混合物を形成する工程と、
ｂ）このアジド−アルキン環化付加反応混合物を、十分な時間量の間インキュベートして、核酸−標識コンジュゲートを形成する工程と、
ｃ）分離した核酸−標識コンジュゲートを形成するために核酸−標識コンジュゲートを分離する工程であって、接合した核酸標識が形成されて分離される工程と
を含む方法である。
代替的な実施形態では、工程ａ）は、アジド部分を有する標識を含み、かつ修飾核酸はアルキンを含む。
別の代替的な実施形態では、工程ａ）は、シュタウディンガーライゲーション反応を形成する工程を含む。
さらに別の実施形態では、工程ａ）は、銅（ＩＩ）イオン、少なくとも１種の還元剤および銅キレート剤を含まず、上記標識は、アジド部分または活性化アルキンを含み、かつ上記修飾核酸は、アジド部分または活性化アルキンを含む。
別の実施形態は、修飾核酸を検出するための方法であって、
ａ）末端アルキン部分を有するレポーター分子、アジド修飾核酸、銅（ＩＩ）イオン、少なくとも１種の還元剤および銅キレート剤を含むアジド−アルキン環化付加反応混合物を形成する工程と、
ｂ）このアジド−アルキン環化付加反応混合物を、十分な時間量の間インキュベートして、核酸−レポーター分子コンジュゲートを形成する工程と、
ｃ）分離した核酸−レポーター分子コンジュゲートを形成するために核酸−レポーター分子コンジュゲートを分離する工程と、
ｄ）分離した核酸−レポーター分子コンジュゲートを、適切な波長で照射して、照射した核酸−レポーター分子コンジュゲートを形成する工程と、
ｅ）照射した核酸−レポーター分子コンジュゲートを観察し、そこで核酸が検出される工程と
を含む方法である。
別の実施形態は、修飾核酸を検出するための方法であって、
ａ）アジド部分を有するレポーター分子、アルキン修飾核酸、銅（ＩＩ）イオン、少なくとも１種の還元剤および銅キレート剤を含むアジド−アルキン環化付加反応混合物を形成する工程と、
ｂ）このアジド−アルキン環化付加反応混合物を、十分な時間量の間インキュベートして、核酸−レポーター分子コンジュゲートを形成する工程と、
ｃ）分離した核酸−レポーター分子コンジュゲートを形成するために核酸−レポーター分子コンジュゲートを分離する工程と、
ｄ）分離した核酸−レポーター分子コンジュゲートを、適切な波長で照射して、照射した核酸−レポーター分子コンジュゲートを形成する工程と、
ｅ）照射した核酸−レポーター分子コンジュゲートを観察し、そこで核酸が検出される工程と
を含む方法である。
加えて、かかる「クリック」化学反応混合物は、１つ以上の緩衝液、ポリマー、塩、洗浄剤、または可溶化剤（これらに限定されない）を含むことができる。上記反応は、窒素ガス下またはアルゴンガス下などの無酸素条件下で実施することができ、任意の実行可能な時間長、例えば１０分間〜６時間、約２０分間〜約３時間、または約３０分間〜約２時間などの間実施することができる。この反応は、幅広い範囲の温度、例えば約４℃〜約５０℃の範囲で実施することができ、好ましくは約１０℃と約４０℃、典型的には約１５℃と約３０℃の間の温度で実施される。
分離および検出
本願明細書において提示される別の態様は、修飾核酸が「クリック」化学反応、シュタウディンガーライゲーションまたは活性化アルキン反応を用いて標識され、そして例えば、クロマトグラフィ法または電気泳動法（ゲル電気泳動が挙げられるが、これに限定されない）を用いて分離された後に、修飾核酸を検出するための方法である。特定の実施形態では、かかる核酸は、本願明細書に記載される方法を用いて修飾した。かかる修飾核酸を分離するために使用される分離方法としては、薄層クロマトグラフィもしくはカラムクロマトグラフィ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、またはアフィニティークロマトグラフィを含む）または等電点電気泳動、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、およびスラブゲル電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。ゲル電気泳動は、変性ゲル電気泳動または未変性ゲル電気泳動であってよく、これには変性ゲル電気泳動およびその後の非変性ゲル電気泳動（例えば、「２Ｄ」ゲル）を含めることができる。特定の実施形態では、この修飾核酸は、本願明細書に記載される方法を用いる分離に先立って、レポーター分子、担体分子および／または固体支持体とのコンジュゲートを形成するために使用される。他の実施形態では、修飾核酸は、本願明細書に記載される方法を用いる分離の後に、レポーター分子、担体分子および／または固体支持体とのコンジュゲートを形成するために使用される。
他の実施形態では、かかる分離および検出方法で使用される分離方法は、核酸について使用される任意の分離方法（例えば、クロマトグラフィ、固体支持体への捕捉、および電気泳動など）であってよい。かかる分離および検出方法の特定の実施形態では、ゲル電気泳動は核酸を分離するために使用され、分離した核酸は、結合された標識によってゲル中で検出される。例としてのみであるが、アジド部分を組み込んだ核酸は、末端アルキン含有フルオロフォアとの溶液反応で標識することができ、その核酸は、任意にさらにその反応混合物から精製することができ、電気泳動にかけることができる。この核酸は、フルオロフォアによる標識を刺激するために適切な波長の光を用いて、ゲル中で視覚化することができる。一本鎖または二本鎖核酸は、アジドまたはアルキンヌクレオチドの組み込みに先立って固体支持体に結合することができ、次いでそれぞれのアジドまたはアルキン化学物質またはポリマーとの「クリック」反応を行うことができる。アルキンまたはアジド−ヌクレオチドを有する核酸は、クリック反応の前後で固体支持体に結合することができる。
ゲル電気泳動は、トリス（Ｔｒｉｓ）−アセテートＥＤＴＡ、トリス−ボレートＥＤＴＡ、トリス−グリジン、ビストリスおよびビストリス−トリシンなど（これらに限定されない）の本願明細書に記載される任意の実行可能な緩衝液系を使用することができる。特定の実施形態では、本願明細書に記載される方法で使用される電気泳動ゲルは、アクリルアミド、例としてのみであるが、約２．５％〜約３０％、または約５％〜約２０％の濃度のアクリルアミドを含む。特定の実施形態では、かかるポリアクリルアミド電気泳動ゲルは、１％〜１０％架橋剤（ビスアクリルアミドが挙げられるが、これに限定されない）を含む。特定の実施形態では、本願明細書に記載される方法で使用される電気泳動ゲルは、アガロース、例としてのみであるが、約０．１％〜約５％、または約０．５％〜約４％、または約１％〜約３％の濃度のアガロースを含む。特定の実施形態では、本願明細書に記載される方法で使用される電気泳動ゲルは、アクリルアミドおよびアガロースを含み、例としてのみであるが、約２．５％〜約３０％のアクリルアミドおよび約０．１％〜約５％のアガロース、または約５％〜約２０％のアクリルアミドおよび約０．２％〜約２．５％のアガロースを含む電気泳動ゲルが挙げられる。特定の実施形態では、かかるポリアクリルアミド／アガロース電気泳動ゲルは、１％〜１０％架橋剤（ビスアクリルアミドが挙げられるが、これに限定されない）を含む。特定の実施形態では、核酸を分離するために使用されるゲルは、勾配ゲルであってもよい。
本願明細書に記載される方法は、スラブゲル電気泳動またはキャピラリーゲル電気泳動を用いた「ゲル中」検出のため、修飾核酸を検出するのに使用できる。一態様では、この方法は、アジド修飾核酸、末端アルキンを含む標識、銅（ＩＩ）、還元剤、および銅（Ｉ）キレート剤を反応混合物中で混合する工程と、この反応混合物を、核酸への標識の化学的接合を促進する条件下でインキュベートする工程と、１つ以上の生化学的分離手法を用いてその核酸を分離する工程と、核酸を検出する工程とを含む。かかる方法で使用される標識は、本願明細書に記載される任意の標識であってよい。かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は、本願明細書に記載される任意のキレート剤であってよい。特定の実施形態では、かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は、１，１０フェナントロリン含有銅（Ｉ）キレート剤である。他の実施形態では、この銅（Ｉ）キレート剤は、バソキュプロインジスルホン酸（ＢＣＳ；２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホネート）である。他の実施形態では、かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は、銅（ＩＩ）をキレートするために使用することができる。
いかなる特定の機構にも限定されないが、銅は核酸の切断を促進することができることが公知である。かかる方法における銅キレート剤の添加は、「クリック」化学反応で使用される銅の不利益な効果を減少させ、それによって核酸の構造的完全性を保存する。従って、本願明細書に記載される方法は、標識され検出された核酸の構造的完全性を保存し、それによって標識された核酸を「クリック」化学を用いて分離し検出する改善された方法を提供する。加えて、分離した分子の構造的完全性が保存されるクリック化学を用いて、分離した核酸を検出する方法は、かかる核酸の検出を改善する。
特定の実施形態では、キレート剤（ＢＣＳが挙げられるが、これに限定されない）の添加は、テロメラーゼラダー形成（Ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）（図１０を参照）を保存する。
「ゲル中」検出の別の実施形態では、上記方法は、末端アルキンを含むアルキン修飾核酸、アジド基を含む標識、銅（ＩＩ）、還元剤、および銅（Ｉ）キレート剤を反応混合物中で混合する工程と、その反応混合物を、核酸への標識の化学的接合を促進する条件下でインキュベートする工程と、標識された核酸を、１つ以上の生化学的分離手法を用いて分離する工程と、その核酸を検出する工程とを含む。これらの方法では、標識され検出された核酸の構造的完全性は保存される。かかる方法で使用される標識は、本願明細書に記載される任意の標識であってよい。かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は、本願明細書に記載される任意のキレート剤であってよい。特定の実施形態では、かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は、１，１０フェナントロリン含有銅（Ｉ）キレート剤である。他の実施形態では、その銅（Ｉ）キレート剤はバソキュプロインジスルホン酸（ＢＣＳ；２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホネート）である。他の実施形態では、かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は、銅（ＩＩ）をキレートするために使用することができる。
特定の実施形態では、ゲル中蛍光検出は、蛍光で励起可能なかつ／もしくはＵＶで励起可能なアルキンを含有するプローブ、または蛍光で励起可能なかつ／もしくはＵＶで励起可能なアジドを含有するプローブを利用する。特定の実施形態では、かかる分離および検出方法で使用される標識は、アルキン、アジドまたはホスフィンを含有するように誘導体化した本願明細書に記載される任意のフルオロフォアである。特定の実施形態では、かかるフルオロフォアとしては、フルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、アレクサ（Ａｌｅｘａ）色素、ＳＹＰＲＯ色素、またはＢＯＤＩＰＹ色素が挙げられるが、これらに限定されない。
本願明細書に記載される方法は、本願明細書に記載される方法を用いて修飾核酸を標識し、次いで全核酸染色を用いて、明確に異なるスペクトルの発光を有するフルオロフォアで標識された修飾核酸を含むそのゲルを染色することによる、核酸の多重検出に使用できる。
別の態様では、核酸は、アジドタグで標識し、ゲル上で電気泳動にかけることができ、そして得られたゲルはアルキンタグ（銅（Ｉ）の存在下での蛍光性アルキンタグなど）とともにインキュベートすることができる。銅（Ｉ）は、その天然の形態（例えばＣｕＢｒ）で加えることができ、または還元剤の添加によって銅（ＩＩ）化合物からその場で生成させることができる。かかる方法で使用される還元剤は、本願明細書に記載される任意の還元剤（アスコルベートまたはＴＣＥＰが挙げられるが、これらに限定されない）であってよい。銅（Ｉ）を安定化するキレート剤の添加によって、化学的ライゲーションを高めることができる。かかる方法で使用される蛍光性標識は、本願明細書に記載される任意のフルオロフォアであってよい。かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は、本願明細書に記載される任意のキレート剤であってよい。特定の実施形態では、かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は１，１０フェナントロリン含有銅（Ｉ）キレート剤である。他の実施形態では、銅（Ｉ）キレート剤はバソキュプロインジスルホン酸（ＢＣＳ；２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホネート）である。他の実施形態では、かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は、銅（ＩＩ）をキレートするために使用することができる。ライゲーション工程の後、そのゲルは洗浄され、タグ化タンパク質は、標準的な蛍光走査装置を用いて可視化される。
他の実施形態では、核酸は、アルキンタグで標識し、ゲル上で電気泳動にかけることができ、そして得られたゲルはアジドタグ（銅（Ｉ）の存在下での蛍光性アジドタグなど）とともにインキュベートすることができる。銅（Ｉ）は、その天然の形態（例えばＣｕＢｒ）で加えることができ、または還元剤の添加によって銅（ＩＩ）化合物からその場で生成させることができる。かかる方法で使用される還元剤は、本願明細書に記載される任意の還元剤（アスコルベートまたはＴＣＥＰが挙げられるが、これらに限定されない）であってよい。銅（Ｉ）を安定化するキレート剤の添加によって、化学的ライゲーションを高めることができる。かかる方法で使用される蛍光性標識は、本願明細書に記載される任意のフルオロフォアであってよい。かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は、本願明細書に記載される任意のキレート剤であってよい。特定の実施形態では、かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は１，１０フェナントロリン含有銅（Ｉ）キレート剤である。他の実施形態では、銅（Ｉ）キレート剤はバソキュプロインジスルホン酸（ＢＣＳ；２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホネート）である。他の実施形態では、かかる方法で使用される銅（Ｉ）キレート剤は、銅（ＩＩ）をキレートするために使用することができる。ライゲーション工程の後、そのゲルは洗浄され、タグ化タンパク質は、標準的な蛍光走査装置を用いて可視化される。
さらなる実施形態では、核酸は、アジドタグで標識し、ゲル上で電気泳動にかけることができ、そして得られたゲルは、シュタウディンガーライゲーションを用いて、ホスフィンタグ（蛍光性ホスフィン含有タグなど）とともにインキュベートすることができる。ライゲーション工程の後、そのゲルは洗浄され、タグ化核酸は、標準的な蛍光走査装置を用いて可視化される。かかる方法では、核酸（タンパク質など）の分解に寄与する銅の使用を回避することができる。
特定の実施形態では、本願明細書において開示される銅（Ｉ）キレート剤との「クリック」化学反応を用いて核酸に結合される標識もまた、核酸の分離に使用することができる。例としてのみであるが、アフィニティークロマトグラフィまたはビーズ捕捉手法は、本願明細書に記載される方法を用いて、ビオチンまたは他のアフィニティータグで標識された核酸を分離するのに使用できる。捕捉された分子は、アフィニティータグを用いてまたは他の手段によって検出することができ、そして／またはさらに構造または機能について分析することができる。
固定化された修飾核酸を標識するための方法
別の態様は、固体支持体上に固定化されている修飾核酸を標識するための方法を提供する。かかる方法で使用される固体支持体は、本願明細書に記載されており、それは固体または半固体マトリクスであってよい。かかる固体支持体としては、ガラス、スライド、アレイ、シリカ粒子、ポリマー粒子、マイクロタイタープレートおよびポリマーゲルが挙げられるが、これらに限定されない。この態様では、核酸は本願明細書に記載される方法を用いて修飾される。特定の態様では、まず修飾核酸を固定化し、次いで後に核酸およびレポーター分子、担体分子および固体支持体を含む核酸コンジュゲートを形成することが有利であり、この場合は、上記レポーター分子、担体分子または固体支持体が、コンジュゲートを形成するために使用される反応性基を含む。特定の実施形態では、かかる反応性基はアジドと反応するためのアルキンである。特定の実施形態では、かかる反応性基はアジドと反応するための活性化アルキンである。特定の実施形態では、かかる反応性基はアジドと反応するためのホスフィンである。特定の実施形態では、かかる反応性基はアルキンと反応するためのアジドである。特定の実施形態では、上記コンジュゲートは、「クリック」化学条件下で形成され、この場合、上記レポーター分子、担体分子または固体支持体はアルキンまたはアジドを含む。別の態様では、上記コンジュゲートは、シュタウディンガーライゲーション条件下で形成され、この場合、上記レポーター分子、担体分子または固体支持体はトリアリールホスフィンまたはアジドを含む。別の態様では、上記コンジュゲートは、活性化アルキンを用いて形成され、この場合、上記レポーター分子、担体分子または固体支持体は活性化アルキンまたはアジドを含む。
特定の態様では、まず修飾核酸を固定化し、次いで標準的なハイブリダイゼーション手法を用いて固定化された核酸を検出することが有利であり、この場合は、上記ハイブリダイズされたプローブは、当該技術分野で周知の方法を用いて検出される。この例では、修飾核酸は、アジドと反応するためのアルキンである反応性基を含む。特定の実施形態では、かかる反応性基はアジドと反応するための活性化アルキンである。特定の実施形態では、かかる反応性基はアジドと反応するためのホスフィンである。特定の実施形態では、かかる反応性基はアルキンと反応するためのアジドである。後で、核酸および固体支持体を含む核酸コンジュゲートが形成され、この場合、この固体支持体はコンジュゲートを形成するために使用される反応性基を含む。
特定の態様では、まずアジド修飾核酸を固定化し、次いで後にレポーター分子、担体分子または固体支持体を含む核酸コンジュゲートを形成することが有利であり、この場合は、レポーター分子、担体分子または固体支持体は、コンジュゲートの形成に先立ちアジド反応性基を含む。特定の実施形態では、上記コンジュゲートは、「クリック」化学条件下で形成され、この場合は、レポーター分子、担体分子または固体支持体は末端アルキンを含む。別の態様では、上記コンジュゲートは、シュタウディンガーライゲーション条件下で形成され、この場合は、レポーター分子、担体分子または固体支持体はトリアリールホスフィンを含む。
別の態様では、上記修飾核酸は、「クリック」化学またはシュタウディンガーライゲーションで使用される官能基以外の官能基を用いて固体支持体に結合され、この際に、結合された修飾核酸は、「クリック」化学条件下またはシュタウディンガーライゲーション下で、「クリック」化学またはシュタウディンガーライゲーションで使用される官能基を有するレポーター分子、担体分子または別の固体支持体とコンジュゲートを形成するために使用される。例としてのみであるが、この修飾核酸は、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、カーボネート、カルバメート、シオシアネート、スルホン、スルホネート、スルホンアミドまたはスルホキシド官能基を用いて、固体支持体に固定化することができる。特定の実施形態では、上記修飾核酸は、アジド修飾核酸、アルキン修飾核酸またはホスフィン修飾核酸である。
特定の実施形態では、上記アジド修飾核酸は、アジド反応性官能基以外の官能基を用いて固体支持体に結合され、この際に、結合されたアジド修飾核酸はクリック化学条件下でコンジュゲートを形成するために使用され、この場合は、レポーター分子、担体分子または別の固体支持体は末端アルキンを含む。別の実施形態では、上記アジド修飾核酸は、アジド反応性官能基以外の官能基を用いて固体支持体に結合され、この際に、結合されたアジド修飾核酸はシュタウディンガーライゲーション条件下でコンジュゲートを形成するために使用され、この場合は、レポーター分子、担体分子または他の固体支持体はトリアリールホスフィンを含む。
別の態様では、固定化したアジド修飾核酸を検出するための方法であって、
ａ）アジド修飾核酸を固体または半固体マトリクス上に固定化して、固定化したアジド修飾核酸を形成する工程と、
ｂ）この固定化したアジド修飾核酸をアルキン反応性基を含むレポーター分子と接触させて、接触したアジド修飾核酸を形成する工程と、
ｃ）十分な時間量の間、この接触したアジド修飾核酸をインキュベートして、レポーター分子−核酸コンジュゲートを形成する工程と、
ｄ）このレポーター分子−核酸コンジュゲートを、適切な波長で照射して、照射したレポーター分子−核酸コンジュゲートを形成する工程と、
ｅ）この照射したレポーター分子−核酸コンジュゲートを観察し、それによって上記固定化したアジド修飾核酸が検出される工程
を含む方法が提供される。
別の態様では、固定化したアルキン修飾核酸を検出するための方法であって、
ａ）アルキン修飾核酸を固体または半固体マトリクス上に固定化して、固定化したアルキン修飾核酸を形成する工程と、
ｂ）この固定化したアルキン修飾核酸を、アジド反応性基を含むレポーター分子と接触させて、接触したアルキン修飾核酸を形成する工程と、
ｃ）十分な時間量の間、この接触したアルキン修飾核酸をインキュベートして、レポーター分子−核酸コンジュゲートを形成する工程と、
ｄ）このレポーター分子−核酸コンジュゲートを、適切な波長で照射して、照射したレポーター分子−核酸コンジュゲートを形成する工程と、
ｅ）この照射したレポーター分子−核酸コンジュゲートを観察し、それによって上記固定化したアルキン修飾核酸が検出される工程
を含む方法が提供される。
ＲＮＡｉ
ＲＮＡｉは、遺伝子発現を選択的に低下させるための方法であり、特異的な遺伝子標的を研究するために使用される費用効率が高い方法である。典型的には、ＲＮＡｉオリゴは、短い２０塩基対ヌクレオチドである。標的とされる遺伝子へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、その遺伝子の特異的分解の引き金となり、それによって遺伝子発現を低下させる。クリック修飾オリゴを用いると、Ｔｍを高めることにより、これらの短いオリゴヌクレオチドのワトソン−クリック結合の特異性を潜在的に高めることができるであろう。類似の種類の実験は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を用いてなされている（Ｅｌｍｅｎ、Ｊ．ら、２００５、Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ）。このクリック修飾はまた、遊離ＲＮＡｉオリゴの、トランスフェクション後のヌクレアーゼによる破壊の受け易さを潜在的に低下させることもでき、それによってオリゴヌクレオチドの半減期および有効性を高めることができるであろう。
化学的に標識された核酸を用いる方法
アジド修飾−ｄＡＴＰおよびアルキン修飾−ｄＵＴＰを、増幅手法（ＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて核酸ポリマーに組み込むことができることが予想外にも観察された。アジド修飾−ｄＡＴＰおよびアルキン修飾−ｄＵＴＰを、テロメラーゼを用いて核酸ポリマーに組み込み、テロメラーゼラダー形成（図４〜図７（実施例１〜実施例４）を参照）を生じさせることができることもまた予想外にも観察された。テロメラーゼは、特異的ＤＮＡ配列反復（すべての脊椎動物において「ＴＴＡＧＧＧ」）を、真核生物の染色体の末端に見出されるテロメア領域におけるＤＮＡ鎖の３’末端に付加する酵素である。この酵素は、各複製サイクルの後に短縮されるテロメアを伸長させるときに鋳型として使用される、それ自身のＲＮＡ分子を保有する逆転写酵素である。それゆえ、本願明細書に記載される修飾ヌクレオチドを使用する方法の一態様は、テロメラーゼ活性アッセイにおけるものである。
別の態様では、かかる修飾ヌクレオチドは、クリック化学ベースで標識され、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、シュタウディンガーライゲーションを用いて標識される。さらに他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、活性化アルキン反応性を用いて標識される。特定の実施形態では、この修飾ヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアジド修飾ヌクレオチドであり、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、シュタウディンガーライゲーションを用いて標識されるアジドヌクレオチドである。さらに他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、活性化アルキン反応性を用いて標識されるアジド修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態では、この修飾ヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアルキン修飾ヌクレオチドであり、他方、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、アジドとの活性化アルキン反応を用いて標識される活性化アルキン修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態では、この修飾ヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアジド修飾−ｄＡＴＰであり（図６を参照）、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、シュタウディンガーライゲーションを用いて標識されるアジド修飾−ｄＡＴＰである。さらに他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、活性化アルキン反応性を用いて標識されるアジド修飾−ｄＡＴＰである。特定の実施形態では、この修飾ヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアルキン修飾−ｄＡＴＰであり、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、アジドとの活性化アルキン反応を用いて標識される活性化アルキン修飾−ｄＡＴＰである。特定の実施形態では、この修飾ヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアジド修飾−ｄＡＴＰであり、他方、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、シュタウディンガーライゲーションを用いて標識されるアジド修飾−ｄＵＴＰである。さらに他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、活性化アルキン反応性を用いて標識されるアジド修飾−ｄＡＴＰまたはｄＵＴＰである。特定の実施形態では、この修飾ヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアルキン修飾−ｄＵＴＰであり（図７〜図９を参照）、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、アジドとの活性化アルキン反応を用いて標識される活性化アルキン修飾−ｄＵＴＰである。このテロメラーゼアッセイは、非常に重要な癌診断としての役割を果たすことができる。なぜなら、この酵素は、公知のヒトおよび他の動物の癌の９０％で活性化されるからである。テロメラーゼ活性のレベルは、異なるレベルの癌疾患を表す信頼できるバイオマーカーとして使用することができる。それゆえ、このアッセイは、患者における癌の進行のレベルを診断し評価する際、および抗癌治療への応答を決定する際に役立つ。
従って、一実施形態では、テロメラーゼ酵素活性を測定する方法であって、
ａ）アジドまたはアルキン修飾ｄＮＴＰが少なくとも１種の核酸ポリマーに組み込まれるように、細胞を有効量のｄＮＴＰ混合物、アジド基またはアルキン基を含むｄＮＴＰ、末端ビオチン分子を含んでいてもよいテロメラーゼ基質プライマー分子、テロメラーゼ酵素と接触させる工程と、
ｂ）この核酸ポリマーをアルキン、活性化アルキン、アジド、またはホスフィン部分を含むレポーター分子に接触させて、修飾核酸ポリマーレポーター分子コンジュゲートを形成させる工程と、
ｃ）この修飾核酸ポリマーレポーター分子を遊離の未反応レポーターから分離する工程と、
ｄ）この標識された核酸レポーター分子コンジュゲートを検出する工程と
を含む方法が提供される。
別の態様では、本願明細書に記載されるかかる修飾ヌクレオチドは、本願明細書に記載される方法を用いて核酸ポリマーに組み込まれ、その方法としては、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーションベースの熱サイクルアプローチ、逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、線形増幅手法および等温ＤＮＡ増幅手法（例としてのみであるが、リアルタイム鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、Ｑ−β複製酵素増幅、自動Ｑ−β複製酵素増幅アッセイなど）、ならびに他のＲＮＡポリメラーゼ媒介手法（例えば、核酸配列ベース増幅またはＮＡＳＢＡなど）が挙げられる。次いで、かかる組み込まれたヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識され、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、シュタウディンガーライゲーションを用いて標識される。さらに他の実施形態では、かかる組み込まれたヌクレオチドは、活性化アルキン反応性を用いて標識される。特定の実施形態では、組み込まれたヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアジド修飾ヌクレオチドであり、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、シュタウディンガーライゲーションを用いて標識されるアジドヌクレオチドである。さらに他の実施形態では、かかる組み込まれたヌクレオチドは、活性化アルキン反応性を用いて標識されるアジド修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態では、組み込まれたヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアルキン修飾ヌクレオチドであり、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、アジドとの活性化アルキン反応を用いて標識される活性化アルキン修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態では、組み込まれたヌクレオチドはクリック化学を用いて標識されるアジド修飾−ｄＡＴＰであり（図６を参照）、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、シュタウディンガーライゲーションを用いて標識されるアジド修飾−ｄＡＴＰである。さらに他の実施形態では、かかる組み込まれたヌクレオチドは、活性化アルキン反応性を用いて標識されるアジド修飾−ｄＡＴＰである。特定の実施形態では、組み込まれたヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアルキン修飾−ｄＡＴＰであり、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、アジドとの活性化アルキン反応を用いて標識される活性化アルキン修飾−ｄＡＴＰである。特定の実施形態では、組み込まれたヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアジド修飾−ｄＵＴＰであり、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、シュタウディンガーライゲーションを用いて標識されるアジド修飾−ｄＵＴＰである。さらに他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、活性化アルキン反応性を用いて標識されるアジド修飾−ｄＵＴＰである。特定の実施形態では、組み込まれたヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアルキン修飾−ｄＵＴＰであり（図７〜図９を参照）、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、アジドとの活性化アルキン反応を用いて標識される活性化アルキン修飾−ｄＵＴＰである。
別の態様では、本願明細書に記載されるかかる修飾ヌクレオチドは、等温増幅を用いて核酸ポリマーに組み込まれる。次いで、かかる組み込まれたヌクレオチドはクリック化学を用いて標識され、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、シュタウディンガーライゲーションを用いて標識される。さらに他の実施形態では、かかる組み込まれたヌクレオチドは、活性化アルキン反応性を用いて標識される。特定の実施形態では、組み込まれたヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアジド修飾ヌクレオチドであり、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、シュタウディンガーライゲーションを用いて標識されるアジドヌクレオチドである。さらに他の実施形態では、かかる組み込まれたヌクレオチドは、活性化アルキン反応性を用いて標識されるアジド修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態では、組み込まれたヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアルキン修飾ヌクレオチドであり、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、アジドとの活性化アルキン反応を用いて標識される活性化アルキン修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態では、組み込まれたヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアジド修飾−ｄＡＴＰであり、他方、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、シュタウディンガーライゲーションを用いて標識されるアジド修飾−ｄＡＴＰである。さらに他の実施形態では、かかる組み込まれたヌクレオチドは、活性化アルキン反応性を用いて標識されるアジド修飾−ｄＡＴＰである。特定の実施形態では、組み込まれたヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアルキン修飾−ｄＡＴＰであり、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、アジドとの活性化アルキン反応を用いて標識される活性化アルキン修飾−ｄＡＴＰである。特定の実施形態では、組み込まれたヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアジド修飾−ｄＵＴＰであり、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、シュタウディンガーライゲーションを用いて標識されるアジド修飾−ｄＵＴＰである。さらに他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、活性化アルキン反応性を用いて標識されるアジド修飾−ｄＵＴＰである。特定の実施形態では、組み込まれたヌクレオチドは、クリック化学を用いて標識されるアルキン修飾−ｄＵＴＰであり（図７〜図９を参照）、他の実施形態では、かかる修飾ヌクレオチドは、アジドとの活性化アルキン反応を用いて標識される活性化アルキン修飾−ｄＵＴＰである。特に、図９は、Ｅ−ｄＵＴＰは種々のポリメラーゼを用いて組み込むことができることを示し、それによってプライマー伸長を用いた第２の鎖ｃＤＮＡ合成のための等温ＤＮＡ伸長アッセイを示している。
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドの混合物が、本願明細書に記載される方法を用いて組み込まれ、その方法としては、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーションベースの熱サイクルアプローチ、逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、線形増幅手法および等温ＤＮＡ増幅手法（例としてのみであるが、リアルタイム鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、Ｑ−β複製酵素増幅、自動Ｑ−β複製酵素増幅アッセイなど）、ならびに他のＲＮＡポリメラーゼ媒介手法（例えば、核酸配列ベース増幅またはＮＡＳＢＡなど）が挙げられる。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドの混合物は、アジド修飾ヌクレオチドの混合物であり、他の実施形態では、修飾ヌクレオチドの混合物は、アルキン修飾ヌクレオチドの混合物である。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドの混合物は、アジド修飾ｄＡＴＰおよびｄＵＴＰヌクレオチドの混合物であり、他の実施形態では、修飾ヌクレオチドの混合物は、アルキン修飾ｄＡＴＰおよびｄＵＴＰの混合物である。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドの混合物を有する核酸ポリマーは、上記のように標識される。
図４および図５は、アジド−ｄＡＴＰが逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）であるテロメラーゼ酵素によって組み込まれることを示し、図７は、エチニル−ｄＵＴＰもテロメラーゼ酵素によって組み込まれることを示す。従って、本願明細書に記載される修飾ヌクレオチドを使用する方法の別の態様は、エチニルｄＮＴＰもしくはアジドｄＮＴＰのいずれかを含有するヌクレオチド混合物または酵素（逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼなど）を用いてＲＴ−ＰＣＲの生成物を検出することである。かかる実験の生成物は、精製されてクリックベースの標識方法に供されるであろう。最終の標識された生成物は、沈殿またはサイズ排除クロマトグラフィのいずれかによって精製することができる。加えて、出発のテロメラーゼプライマーは、ビオチン化することができ、クリック反応の後テロメラーゼ修飾生成物の精製が可能になる。この方法は、第１の鎖ｃＤＮＡ合成（ＲＴ−ＰＣＲ）の一例である。
本願明細書に記載される修飾ヌクレオチドを使用する別の態様は、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および化学発色インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）および銀インサイツハイブリダイゼーション（Ｓｉｌｖｅｒ Ｉｎ−ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＳＩＳＨ）のための「クリック」化学ベースのオリゴヌクレオチド標識である。かかる方法では、クレノー（Ｅｘｏ−）、修飾されたまたは野生型のＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ）またはＢｓｔポリメラーゼ（ラージフラグメント）など（これらに限定されない）の標準的なポリメラーゼが使用され、プライマーを用いて、およびエチニルまたはアジドｄＮＴＰを用いて、所与の配列についての鋳型鎖が増幅される。調製されたＤＮＡ断片は、次いで、精製することができ、アジドもしくはアルキン標識のいずれか、蛍光標識、Ｑドットおよびナノ粒子を用いる「クリック」反応に供され、標識されたプローブを作り出すことができる。特定の実施形態では、かかるプローブは、シュタウディンガーライゲーションを用いて標識され、他の実施形態では、かかるプローブは活性化アルキン反応を用いて標識される。インサイツハイブリダイゼーションのような方法のためのプローブもまた、ＰＣＲおよびすべての市販されているＰＣＲポリメラーゼを用いて作り出すことができる。φ２９ ＤＮＡポリメラーゼまたは鎖置換活性を有する他のポリメラーゼを用いる、プラスミドまたは細菌の人工染色体（ＢＡＣ）の鋳型の等温増幅もまた行うことができる。特定の実施形態では、標識は、診断アッセイ中または臨床的アッセイ中に行われる。他の実施形態では、ＦＩＳＨおよびＣＩＳＨにおけるかかる標識は、ハイブリダイゼーションの後にクリック反応が行われてシグナルを生成することができる、自動インサイツハイブリダイゼーションプラットフォームである。例としてのみであるが、かかる自動システムは、ダコ（Ｄａｋｏ）、ベンタナメディカルシステムズ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびビジョンバイオシステムズ（Ｖｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から得られる機器である。
別の態様では、ＲＮＡプローブは、ＦＩＳＨおよびＣＩＳＨのために使用することができ、その場合、かかるプローブは「クリック」化学を用いて標識される。特定の実施形態では、かかるプローブは、シュタウディンガーライゲーションを用いて標識され、他の実施形態では、かかるプローブは活性化アルキン反応を用いて標識される。特定の実施形態では、かかるＲＮＡプローブは、ＲＮＡプローブを生成するための生体外転写系を用いる修飾ヌクレオチドの組み込みによって調製される。代替的方法は、アミノアリル−ＮＨＳエステル化学によって標識することができる小さいＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用する。特定の実施形態では、ファージＴ７またはＳＰ６由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、アルキン修飾オリゴヌクレオチド（例としてのみであるが、エチニルオリゴヌクレオチド）、またはアジドオリゴヌクレオチドを組み込むために使用され、修飾ＲＮＡプローブが生成される。かかる修飾ＲＮＡプローブは、「クリック化学」を用いてアジドもしくはアルキン蛍光性または発色性標識のいずれかで標識され、それによって蛍光発生性または発色性ＲＮＡプローブが生成される。
ヌクレオチド類似体を用いてリンタンパク質を修飾すること
別の態様では、リンタンパク質は、アルキンもしくはアジドタグ化ヌクレオチドを用いて生体内もしくは生体外で修飾することができ、これによってアジドまたはアルキン部分はリンタンパク質のγ−リン酸上に配置される。例としてのみであるが、かかる修飾は、図１に示されるヌクレオチドのうちの１つを、タンパク質キナーゼおよびキナーゼ標的分子を含有する反応混合物に加えることにより、達成することができる。特定の実施形態では、このリンタンパク質は、定量化、可視化、または富化のために、「クリック」化学条件下でアルキン含有標識（フルオロフォアまたはアフィニティ試薬が挙げられるが、これらに限定されない）と反応させることができるアジド含有リンタンパク質である。特定の実施形態では、このリンタンパク質は、定量化、可視化、または富化のために、「クリック」化学条件下でアジド含有標識（フルオロフォアまたはアフィニティ試薬が挙げられるが、これらに限定されない）と反応させることができるアルキン含有リンタンパク質である。他の実施形態では、かかる修飾リンタンパク質は、レポーター分子、担体分子および／または固体基質とコンジュゲートを形成するために使用することができる。
一態様では、アジドまたはアルキン部分を含有する修飾ヌクレオチド基質は、タンパク質を含めた細胞の高分子へのタグ化γ−リン酸分子の代謝による組み込みのために培養細胞に直接に加えられる。このプロセスには、リン酸化の動力学の変化を検出するための薬理作用のある物質でその細胞を処理する工程が含まれてもよい。生きた培養細胞へのかかる化合物の投入は、ヌクレオチドを浸透性をもたらす官能基で修飾することによって、または細胞浸透剤（ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を同時に加えることによって、高めることができるであろう。
別の態様では、キナーゼ反応が、細胞抽出物をキナーゼおよび基質の供給源として使用して、生体外で実施できるであろう。上記修飾ヌクレオチドは、反応混合物に添加され、その反応混合物は、注目する薬理作用のある物質を添加して、または添加せずにインキュベートされるであろう。生体外反応はまた、外因性キナーゼまたは基質供給源を、ヌクレオチド類似体とともにその細胞抽出物に加える工程を伴ってもよい。別の応用では、上記方法は、精製したキナーゼおよびキナーゼ基質を用いて、生体外で、細胞抽出物なしに、使用できるであろう。特定の実施形態では、このキナーゼ反応は、アレイとして固体基質上に堆積されたキナーゼ基質を用いて行うことができる。
これらの態様の各々では、上記反応混合物は、注目する特定のキナーゼのために最適化された緩衝液、キナーゼ供給源、金属イオン供給源、グリセロール、ヌクレオチドＡＴＰ類似体、およびＡＴＰを含有していてもよい。アルキンプローブを用いる「クリック」検出反応は、銅（Ｉ）、または銅（ＩＩ）還元剤の存在下での銅（ＩＩ）、銅（Ｉ）キレート化剤、および最適ｐＨ条件を維持するための適切な緩衝液の存在下で実施されるであろう。
本願明細書に記載される修飾ヌクレオチドを使用する方法の別の態様は、クリック化学、シュタウディンガーライゲーションまたは活性化アルキン反応を用いたペプチド−核酸（ＰＮＡ）コンジュゲートの調製である。かかる方法では、１つ以上のアミノ酸上でＯ−ＧｌｃＮａｃ修飾を有するペプチドは、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚの存在下でＧａｌＴ１反応に供され、アジド修飾ペプチドを生じる。かかる翻訳後の修飾は、「糖タンパク質の標識（Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）」と題する同時係属中の出願（米国仮出願第６０／７７２，２２１号）に記載されており、参照によりその全体を本願明細書に援用する。加えて、「糖タンパク質の標識（Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｇｌｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）」と題する同時係属中の出願（米国仮出願第６０／７７２，２２１号）に記載されている翻訳後に修飾された任意のタンパク質は、本願明細書に記載されるような修飾ヌクレオチドを用いる方法で使用することができる。特定の実施形態では、ペプチド−核酸コンジュゲートは、アジド連結ペプチドをアルキニル修飾オリゴヌクレオチドと「クリック」化学反応条件下で反応させることにより、作り出される。特定の実施形態では、ペプチド−核酸コンジュゲートは、アジド連結ペプチドをアルキニル修飾オリゴヌクレオチドと、１ｍＭまたは２ｍＭ 銅、１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムおよび２０ｍＭ ＢＣＳの存在下で反応させることにより、作り出される。特定の実施形態では、ペプチド−核酸コンジュゲートは、アジド連結ペプチドをエチニル修飾オリゴヌクレオチドと「クリック」化学反応条件下で反応させることにより、作り出される。特定の実施形態では、ペプチド−核酸コンジュゲートは、アジド連結ペプチドをエチニル修飾オリゴヌクレオチドと、１ｍＭまたは２ｍＭ 銅、１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムおよび２０ｍＭ ＢＣＳの存在下で反応させることにより、作り出される。
特定の実施形態では、ペプチド−核酸コンジュゲートは、アルキン連結ペプチドをアジド修飾オリゴヌクレオチドと「クリック」化学反応条件下で反応させることにより、作り出される。特定の実施形態では、ペプチド−核酸コンジュゲートは、アルキン連結ペプチドをアジド修飾オリゴヌクレオチドと、１ｍＭまたは２ｍＭ 銅、１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムおよび２０ｍＭ ＢＣＳの存在下で反応させることにより、作り出される。特定の実施形態では、ペプチド−核酸コンジュゲートは、エチニル連結ペプチドをアジド修飾オリゴヌクレオチドと「クリック」化学反応条件下で反応させることにより、作り出される。特定の実施形態では、ペプチド−核酸コンジュゲートは、エチニル連結ペプチドをアジド修飾オリゴヌクレオチドと、１ｍＭまたは２ｍＭ 銅、１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムおよび２０ｍＭ ＢＣＳの存在下で反応させることにより、作り出される。
試料および試料調製
エンドユーザーは、試料の選択およびそのその試料が調製される方法を決定するであろう。本願明細書に記載される方法および組成物とともに使用することができる試料としては、核酸を含有する任意の生物学的に誘導された物質または水溶液が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、試料としては、核酸が添加された物質も挙げられる。本願明細書に記載される方法および組成物とともに使用することができる試料は、限定されないが、全血、血漿、血清、鼻汁、痰、唾液、尿、汗、経皮滲出液、脳脊髄液などの生体液であってよい。他の実施形態では、この試料は、注目する核酸が培地の中に分泌されている、組織および細胞培養培地を含む生体液である。かかる培養物で使用される細胞としては、初代培養物および固定化細胞株を含む原核生物細胞および真核生物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。かかる真核生物細胞としては、卵巣細胞、上皮細胞、血中免疫細胞、β細胞、肝細胞、およびニューロンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、試料は、筋肉、眼、皮膚、生殖腺、リンパ節、心臓、脳、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、膵臓、固形腫瘍、マクロファージ、乳腺、中皮などを含む（これらに限定されない）動物由来の全臓器、組織または細胞であってよい。
無機緩衝液および有機緩衝液を含めて、種々の緩衝液を、本願明細書に記載される方法で使用することができる。特定の実施形態では、有機緩衝液は、双性イオン緩衝液である。例としてのみであるが、本願明細書に記載される方法で使用することができる緩衝液としては、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、リン酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、マレイン酸塩、カコジル酸塩、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−２−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリジン（トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ））、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリジン（ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ））、（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン（トリス（Ｔｒｉｓ））、トリス−アセテート−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）、グリジン、ビス［２−ヒドロキシエチル］イミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン（ビストリス（ＢｉｓＴｒｉｓ））、またはこれらの組合せが挙げられる。かかる緩衝液がゲル電気泳動分離で使用される特定の実施形態では、緩衝液は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むことができる。
本願明細書に記載される方法で使用されるかかる緩衝液の濃度は、約０．１ｍＭ〜１Ｍである。特定の実施形態では、その濃度は、１０ｍＭ〜約１Ｍである。特定の実施形態では、その濃度は約２０ｍＭ〜約５００ｍＭの間であり、他の実施形態では、その濃度は約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの間である。特定の実施形態では、緩衝液濃度は約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭであり、他方、他の実施形態では、緩衝液濃度は約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭである。
ｐＨは、具体的なアッセイ系に応じて異なるであろうが、一般には、スルホン酸部分の１つ以上が脱プロトン化されている、容易に測定可能な範囲内にある。
特定の実施形態では、本願明細書に記載される方法で使用される緩衝液は、常温で５〜９の間のｐＨを有する。特定の実施形態では、緩衝液は、常温で６〜８．５の間のｐＨを有する。特定の実施形態では、緩衝液は、常温で６〜８の間のｐＨを有する。特定の実施形態では、緩衝液は、常温で６〜７の間のｐＨを有する。特定の実施形態では、緩衝液は、２５℃で５〜９の間のｐＨを有する。特定の実施形態では、緩衝液は、２５℃で６〜８．５の間のｐＨを有する。特定の実施形態では、緩衝液は、２５℃で６〜８の間のｐＨを有する。特定の実施形態では、緩衝液は、２５℃で６〜７の間のｐＨを有する。
特定の実施形態では、本願明細書に記載される方法で使用される試料は、非イオン性洗浄剤を有する。本願明細書に記載される方法で使用される試料に加えられるかかる非イオン性洗浄剤の非限定的な例は、ポリオキシアルキレンジオール、脂肪アルコールのエーテル（アルコールエトキシレート（シェルケミカルカンパニー（Ｓｈｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手できるネオドール（Ｎｅｏｄｏｌ）およびユニオンカーバイドコーポレーション（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手できるタージトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ））、アルキルフェノールエトキシレート（ジェネラルアニリンアンドフィルムコーポレーション（Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｎｉｌｉｎｅ ａｎｄ Ｆｉｌｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手できるイゲパル（Ｉｇｅｐａｌ）界面活性剤）、エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマー（ビーエーエスエフ・ワイアンドットコーポレーション（ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手できるプルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）（商標）シリーズが挙げられる）、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル（モンサントカンパニー（Ｍｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手できるステアロックス（Ｓｔｅａｒｏｘ）ＣＤ）、アルキルフェノール界面活性剤（ロームアンドハースカンパニー（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手できるトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）シリーズ、トリトン Ｘ−１００が挙げられる）、アルコールエトキシレートのポリオキシエチレンメルカプタン類似体（モンサントカンパニーから入手できるノニック（Ｎｏｎｉｃ）２１８およびステアロックスＳＫ）、アルキルアミンのポリオキシエチレン付加体（アルマックカンパニー（Ａｒｍａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手できるエトデュオミーン（Ｅｔｈｏｄｕｏｍｅｅｎ）およびエトミーン（Ｅｔｈｏｍｅｅｎ）界面活性剤）、ポリオキシエチレンアルキルアミド、ソルビタンエステル（ソルビタンモノラウレートなど）ならびにアルコールフェノールエトキシレート（ジェファーソンケミカルカンパニー社（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）から入手できるサーフォニック（Ｓｕｒｆｏｎｉｃ））である。ソルビタンエステルの非限定的な例としては、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ツイーン（ＴＷＥＥＮ）２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート（ツイーン４０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート（ツイーン６０）およびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ツイーン８０）が挙げられる。特定の実施形態では、試料に添加されるかかる非イオン性洗浄剤の濃度は、０．０１〜０．５％である。他の実施形態では、濃度は約０．０１〜０．４体積％である。他の実施形態では、濃度は約０．０１〜０．３体積％である。他の実施形態では、濃度は約０．０１〜０．２体積％である。他の実施形態では、濃度は、約０．０１〜０．１体積％である。
照射
本願明細書に記載される化合物および組成物は、アッセイ前、アッセイ後またはアッセイ中のいつでも、検出可能な光学的応答を生じる波長の光を用いて照射し、その光学的応答を検出するための手段を用いて観察することができる。特定の実施形態では、かかる照射は、紫外または可視光の波長の輝線ランプ、アーク灯、レーザーによるものであってよく、または太陽光もしくは通常の室内用照明器具によるものでさえよく、その場合は、かかる光源の波長は、本願明細書に記載される化合物または組成物のフルオロフォアまたは発色団の吸収スペクトルと重なる。特定の実施形態では、かかる照射は、紫外または可視光の波長の輝線ランプ、アーク灯、レーザーによるものであってよく、または太陽光もしくは通常の室内用照明器具によるものでさえよく、相補的な特異的結合対のメンバーに結合されたものを含めて、蛍光性化合物は、強い可視吸収および蛍光発光を示す。
特定の実施形態では、本願明細書に記載される化合物または組成物のフルオロフォアもしくは発色団を照射するために使用される光源としては、手持ち式の紫外線ランプ、水銀アーク灯、キセノンランプ、アルゴンレーザー、レーザーダイオード、青色レーザーダイオードおよびＹＡＧレーザーが挙げられるが、これらに限定されない。これらの照射光源は、必要に応じて、レーザースキャナー、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダー、標準的蛍光光度計もしくは小型蛍光光度計、またはクロマトグラフ検出器に一体化される。かかるフルオロフォアの蛍光発光は、必要に応じて、目視検査により、あるいはＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザースキャン装置、蛍光光度計、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、量子カウンタ、落射蛍光顕微鏡、走査顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダーのいずれかの装置の使用により、あるいはその信号を増幅するための手段（光電子増倍管など）により検出される。上記試料がフローサイトメーター、蛍光顕微鏡または蛍光光度計を使用して検査される場合、その機器は、必要に応じて、典型的には本発明の蛍光性化合物の蛍光反応を第２のフルオロフォアの蛍光反応から見分けることによって、本発明の蛍光性化合物と検出可能に異なる光学特性を備えたその第２のフルオロフォアとの間を見分け、判別するために使用される。試料がフローサイトメーターを使用して検査される場合、その試料の検査には、必要に応じて、選別装置を使用することにより、蛍光反応に基づいて、その試料内の粒子を単離する工程が含まれる。
特定の実施形態では、蛍光は、必要に応じて物理的または化学的な消光剤のいずれかを用いて消光される。消光性部分の例としては、ＤＡＢＣＹＬ（すなわち、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）−安息香酸）スクシンイミジルエステル、ジアリールローダミンカルボン酸、スクシンイミジルエステル（もしくはＱＳＹ−７）、および４’，５’−ジニトロフルオレセインカルボン酸、スクシンイミジルエステル（もしくはＱＳＹ−３３）（すべて、例えば、モレキュラープローブから入手できる）、消光剤１（Ｑ１；エポックバイオサイエンス（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ワシントン州、ボセルから入手できる）、または「ブラックホールクエンチャー（Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ）」 ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、およびＢＨＱ−３（バイオサーチテクノロジー社（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州、ナヴァトから入手できる）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のキット
別の態様では、本発明は、Ｎ３−ｄＡＴＰ、酵素；アジド反応性レポーター分子、担体分子または固体支持体を含むキットを提供する。
一態様では、本発明は、末端アルキンを含む少なくとも１種の標識と、銅を含む溶液と、銅（Ｉ）キレート剤を含む溶液とを含む、核酸を標識するためのキットを包含する。このキットはさらに、還元剤、１種以上の緩衝液、または１種以上の洗浄剤を含む溶液を含むことができる。
一実施形態では、キットで準備されるアルキン標識は、キサンテン、クマリン、ボラポリアザインダセン、ピレンおよびシアニンなどのフルオロフォア（これらに限定されない）である。一実施形態では、キットは、２つ以上の異なる末端アルキン含有標識（そのうちの１つ以上はフルオロフォアである）を提供し、他の実施形態では、キットで準備されるアルキン標識は、ペプチドまたはハプテン（ビオチンなど）など（これらに限定されない）のタグである。
好ましい実施形態では、キットで準備される銅（Ｉ）キレート剤は、１，１０フェナントロリン、好ましくはバソキュプロインジスルホン酸である。いくつかの実施形態では、銅は、硫酸銅または酢酸銅の溶液の形で準備される。いくつかの実施形態では、還元剤はアスコルベートの形で準備される。
別の態様では、本発明は、アジド基を含む少なくとも１種の標識と、銅を含む溶液と、銅（Ｉ）キレート剤を含む溶液とを含む、核酸を標識するためのキットを包含する。このキットはさらに、還元剤、１種以上の緩衝液、または１種以上の洗浄剤を含む溶液を含むことができる。
この態様の一実施形態では、キットで準備されるアジド含有標識は、キサンテン、クマリン、ボラポリアザインダセン、ピレンおよびシアニンなど（これらに限定されない）のフルオロフォアである。他の実施形態では、キットで準備されるアジド標識は、ペプチドまたはハプテン（ビオチンなど）など（これらに限定されない）のタグである。
一実施形態では、キットは、２つ以上の異なるアジド含有標識（そのうちの１つ以上はフルオロフォアである）を提供する。好ましい実施形態では、キットで準備される銅（Ｉ）キレート剤は、１，１０フェナントロリン、好ましくはバソキュプロインジスルホン酸である。いくつかの実施形態では、銅は、硫酸銅または酢酸銅の溶液の形で準備される。いくつかの実施形態では、還元剤はアスコルベートの形で準備される。
本発明の詳細な説明を上述したが、以下の実施例は、本発明を例証する目的で提示されるものであり、本発明の範囲または特許請求の範囲を限定するものであると解釈されるべきではない。
実施例１：Ｎ３−ｄＵＴＰおよびＮ３−ｄＡＴＰを用いたテロメラーゼアッセイ
ＴＲＡＰｅｚｅ（商標）テロメラーゼアッセイ（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）キット Ｓ７７００）をＮ３−ｄＵＴＰおよびＮ３−ｄＡＴＰを用いて実施した。各反応液は、以下のものを含有していた：
（ａ）１×ＴＲＡＰ反応緩衝液（２０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３、１．５ ＭｇＣｌ２ ６３ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％ ツイーン（Ｔｗｅｅｎ） ２０、１ｍＭ ＥＧＴＡ）
（ｂ）５０μＭの異なる組合せのデオキシヌクレオシド三リン酸（詳細については表１を参照）
（ｃ）１μｌのＴＳプライマー（ＴＲＡＰｅｚｅ テロメラーゼキット、ケミコン）
（ｄ）１μｌのプライマー混合物（ＴＲＡＰｅｚｅ テロメラーゼキット、ケミコン由来の３種の別個のプライマー：Ｋ１順方向プライマー、ＲＰ逆方向プライマーおよびＴＳＫ１内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）プライマーを含有する）
（ｅ）２単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（ｆ）２μｌの、ＴＲＡＰｅｚｅ テロメラーゼキット（ケミコン）の陽性対照細胞（５００細胞）。この細胞抽出液を調製し、さらにＣＨＡＰＳ緩衝液で希釈した。その成分は、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ ベンズアミジン、５ｍｍ β−メルカプトエタノール、０．５％ ＣＨＡＰＳおよび１０％ グリセロールであった。
（ｇ）各反応液の体積を５０μｌにするのに必要なＰＣＲ等級の水。
反応を、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ＰＣＲ機器で、以下の条件下で実施した：
３０℃ − ３０分間 −保持
３２サイクルの ９５℃ − ３０秒
５９℃ − ３０秒
７２℃ − １分
次いで、４℃ − 無制限。
この反応液を取り出し、ＴＲＡＣＫ−ＩＴ シアン橙色ローディング色素（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ）と混合した。１，２，３，４と標識した反応液（図４および表１を参照）を、４〜２０％ トリボレート（Ｔｒｉ Ｂｏｒａｔｅ）ＥＤＴＡ−ポリアクリルアミドゲルに供した。このゲルを、１０Ｖで１０分間、１９０Ｖで９０分間流した。次いで、このゲルをカセットから取り出し、ＴＢＥ中のＳＹＢＲ ＧＯＬＤ原液の１：１０，０００倍希釈液を用いて２０〜３０分間染色してから、シグナルについて走査した（励起：４７３、発光：５２０）。
増幅の結果は図４に示してあり、各反応（ゲルのレーン）におけるｄＮＴＰの組合せの一覧を表１に提示する。
（表１）反応におけるｄＮＴＰの組み合わせ
Figure 2010517594
ゲル上で「Ｌ」と標識した最も左のレーンは、１０ｂｐ ｓｓ ＤＮＡラダー（１レーンあたり２００ｎｇ）である。
図４から、Ｎ３−ｄＵＴＰがＴａｑポリメラーゼによって組み込まれること（レーン２）、およびＮ３−ｄＡＴＰがテロメラーゼおよびＴａｑポリメラーゼの両方によって組み込まれること（レーン３）が分かる。
実施例２：Ｎ３−ｄＵＴＰおよびＮ３−ｄＡＴＰを用いたテロメラーゼアッセイの用量依存性
ＴＲＡＰｅｚｅ（商標）テロメラーゼアッセイ（ケミコンキット Ｓ７７００）を、Ｎ３−ｄＵＴＰおよびＮ３−ｄＡＴＰを用いて実施した。各反応液は、以下のものを含有していた：
（ａ）１×ＴＲＡＰ反応緩衝液（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３、１．５ ＭｇＣｌ２ ６３ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％ ツイーン２０、１ｍＭ ＥＧＴＡ）
（ｂ）５０μＭのデオキシヌクレオシド三リン酸（詳細については表２を参照）
（ｃ）１μｌのＴＳプライマー（ＴＲＡＰｅｚｅ テロメラーゼキット、ケミコン）
（ｄ）１μｌのプライマー混合物（ＴＲＡＰｅｚｅ テロメラーゼキット、ケミコン由来の３種の別個のプライマー：Ｋ１順方向プライマー、ＲＰ逆方向プライマーおよびＴＳＫ１内部標準プライマーを含有する）
（ｅ）２単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（ｆ）２μｌの、ＴＲＡＰｅｚｅ テロメラーゼキット（ケミコン）の陽性対照細胞（５００細胞）。この細胞抽出液を調製し、さらにＣＨＡＰＳ緩衝液で希釈した。その成分は、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ ベンズアミジン、５ｍｍ β−メルカプトエタノール、０．５％ ＣＨＡＰＳおよび１０％ グリセロールであった。
（ｇ）各反応液の体積を５０μｌにするのに必要なＰＣＲ等級の水。
反応を、アプライドバイオシステムズＰＣＲ機器で、以下の条件下で実施した：
３０℃ − ３０分間 −保持（３０分間のテロメラーゼ反応の最後に、適切な体積のアジド−ｄＮＴＰを加えて、最終濃度を５０μＭにした。ＰＣＲの工程を、その後で実施した）
３２サイクルの ９５℃ − ３０秒
５９℃ − ３０秒
７２℃ − １分
次いで、４℃ − 無制限。
この反応液を取り出し、ＴＲＡＣＫ−ＩＴ シアン橙色ローディング色素と混合した。１，２，３，４と標識した反応液（図５および表２を参照）を、４〜２０％トリスボレート（Ｔｒｉｓ Ｂｏｒａｔｅ）ＥＤＴＡ−ポリアクリルアミドゲルに供した。このゲルを、１０Ｖで１０分間、１９０Ｖで９０分間流した。次いで、このゲルをカセットから取り出し、ＴＢＥ中のＳＹＢＲ ＧＯＬＤ原液の１：１０，０００倍希釈液を用いて２０〜３０分間染色してから、シグナルについて走査した（励起：４７３、発光：５２０）。
増幅の結果は図５に示してあり、各反応（ゲルのレーン）におけるｄＮＴＰの組合せの一覧を表２に提示する。
（表２）反応におけるｄＮＴＰの組み合わせ
Figure 2010517594
ゲル上で「Ｌ」と標識した最も左のレーンは、１０ｂｐ ｓｓ ＤＮＡラダー（１レーンあたり２００ｎｇ）である。
図５から、Ｎ３−ｄＵＴＰが１００ｎＭ〜５０μＭの範囲内ではテロメラーゼ酵素によって組み込まれないが、それはＴａｑポリメラーゼによって組み込まれること（レーン２〜５）が分かる。しかしながら、Ｎ３−ｄＡＴＰはテロメラーゼおよびＴａｑポリメラーゼの両方によって組み込まれる（レーン６〜９）。
実施例３：「クリック」化学ベースのテロメラーゼ活性アッセイ：Ｎ３−ｄＡＴＰを用いたテロメラーゼアッセイの用量依存性
ＴＲＡＰｅｚｅ（商標）テロメラーゼアッセイ（ケミコンキット Ｓ７７００）を、Ｎ３−ｄＡＴＰを用いて実施した。各反応液は、以下のものを含有していた：
（ａ）１×ＴＲＡＰ反応緩衝液（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３、１．５ ＭｇＣｌ２ ６３ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％ ツイーン２０、１ｍＭ ＥＧＴＡ）
（ｂ）５０μＭの異なる組合せのデオキシヌクレオシド三リン酸（詳細については表３を参照）
（ｃ）１μｌのＴＳプライマー（ＴＲＡＰｅｚｅテロメラーゼキット、ケミコン）
（ｄ）１μｌのプライマー混合物（ＴＲＡＰｅｚｅテロメラーゼキット、ケミコン由来の３種の別個のプライマー：Ｋ１順方向プライマー、ＲＰ逆方向プライマーおよびＴＳＫ１内部標準プライマーを含有する）
（ｅ）２単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（ｆ）２μｌの、ＴＲＡＰｅｚｅテロメラーゼキット（ケミコン）の陽性対照細胞（５００細胞）。この細胞抽出液を調製し、さらにＣＨＡＰＳ緩衝液で希釈した。その成分は、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ ベンズアミジン、５ｍｍ β−メルカプトエタノール、０．５％ ＣＨＡＰＳおよび１０％ グリセロールであった。
（ｇ）各反応液の体積を５０μｌにするのに必要なＰＣＲ等級の水。
反応を、アプライドバイオシステムズＰＣＲ機器で、以下の条件下で実施した：
３０℃ − ３０分間 −保持
３２サイクルの ９５℃ − ３０秒
５９℃ − ３０秒
７２℃ − １分
次いで、４℃ − 無制限。
この反応液を、サイズ排除カラム（クロマスピン（Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ）ＴＥ３０、クロンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））を通して精製した。次いで、その溶出液を、２５％ プロピレングリコール；１ｍＭ 硫酸銅；１０ｍＭ バソキュプロインジスルホン酸（ＢＣＳ）、１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムおよび５０μＭ アルキン−ＴＡＭＲＡの最終濃度を使用するクリック反応に供した。反応を、室温で３０分間実施した。次いでこれを、上記のように、サイズ排除で精製した。この反応液を取り出し、ＴＲＡＣＫ−ＩＴシアン橙色ローディング色素と混合した。この反応液（図６および表３を参照）を、２０％ ＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲルに供した。このゲルを、１０Ｖで１０分間、１９０Ｖで９０分間流した。このゲルをカセットから取り出し、ＴＡＭＲＡについて走査した（励起：５３０ｎｍ、発光：５８０ｎｍ）。次いで、同じゲルをＳＹＢＲ ＧＯＬＤを用いて３０分間染色し、次いで上記のように、走査した。
増幅の結果は図６に示してあり、各反応（ゲルのレーン）におけるｄＮＴＰの組合せの一覧を表３に提示する。
（表３）反応におけるｄＮＴＰの組み合わせ
Figure 2010517594
ゲル上で「Ｌ」と標識した最も左のレーンは、１０ｂｐ ｓｓ ＤＮＡラダー（１レーンあたり２００ｎｇ）である。
図６から、「クリック」反応の用量依存性があり、最良のシグナルは１００％ ５０μＭのＮ３−ｄＡＴＰから生じることが分かる。また、５０μＭのＮ３−ｄＡＴＰを用いたＰＣＲ反応はあまり効率的でなかった。
実施例４：「クリック」化学ベースのテロメラーゼ活性アッセイ：Ｅ−ｄＵＴＰを用いたテロメラーゼアッセイの用量依存性
ＴＲＡＰｅｚｅ（商標）テロメラーゼアッセイ（ケミコンキット Ｓ７７００）を、エチニル−ｄＵＴＰを用いて実施した。各反応液は、以下のものを含有していた：
（ａ）１×ＴＲＡＰ反応緩衝液（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３、１．５ ＭｇＣｌ２ ６３ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％ ツイーン２０、１ｍＭ ＥＧＴＡ）
（ｂ）５０μＭの異なる組み合わせのデオキシヌクレオシド三リン酸（詳細については表４を参照）
（ｃ）１μｌのＴＳプライマー（ＴＲＡＰｅｚｅテロメラーゼキット、ケミコン）
（ｄ）１μｌのプライマー混合物（ＴＲＡＰｅｚｅテロメラーゼキット、ケミコン由来の３種の別個のプライマー：Ｋ１順方向プライマー、ＲＰ逆方向プライマーおよびＴＳＫ１内部標準プライマーを含有する）
（ｅ）２単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（ｆ）２μｌの、ＴＲＡＰｅｚｅテロメラーゼキット（ケミコン）の陽性対照細胞（５００細胞）。この細胞抽出液を調製し、さらにＣＨＡＰＳ緩衝液で希釈した。その成分は、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ ベンズアミジン、５ｍｍ β−メルカプトエタノール、０．５％ ＣＨＡＰＳおよび１０％ グリセロールであった。
（ｇ）各反応液の体積を５０μｌにするのに必要なＰＣＲ等級の水。
反応を、アプライドバイオシステムズＰＣＲ機器で、以下の条件下で実施した：
３０℃ − ３０分間 −保持
３２サイクルの ９５℃ − ３０秒
５９℃ − ３０秒
７２℃ − １分
次いで：４℃ − 無制限。
この反応液を、サイズ排除カラム（クロマスピン ＴＥ３０、クロンテック）を通して精製した。次いで、その溶出液を、２５％ プロピレングリコール；１ｍＭ 硫酸銅；１０ｍＭ ＢＣＳ、１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムおよび５０μＭ アジド−ＴＡＭＲＡの最終濃度を使用するクリック反応に供した。反応を、室温で３０分間実施した。次いでこれを、上記のように、サイズ排除で精製した。この反応液を取り出し、ＴＲＡＣＫ−ＩＴシアン橙色ローディング色素と混合した。この反応液（図７および表４を参照）を、２０％ ＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲルに供した。このゲルを、１０Ｖで１０分間、１９０Ｖで９０分間流した。このゲルをカセットから取り出し、ＴＡＭＲＡについて走査した（励起：５３０ｎｍ、発光：５８０ｎｍ）。次いで、同じゲルをＳＹＢＲ ＧＯＬＤを用いて３０分間染色し、次いで上記のように、走査した。
増幅の結果は図７に示してあり、各反応（ゲルのレーン）におけるｄＮＴＰの組合せの一覧を表４に提示する。
（表４）反応におけるｄＮＴＰの組み合わせ
Figure 2010517594
ゲル上で「Ｌ」と標識した最も左のレーンは、１０ｂｐ ｓｓ ＤＮＡラダー（１レーンあたり２００ｎｇ）である。
図７から、クリック反応の用量依存性があり、最良のシグナルは１００％ ５０μＭのＮ３−ｄＡＴＰから生じることが分かる。また、５０μＭのＥ−ｄＵＴＰを用いたＰＣＲ反応は、天然のｄＮＴＰと同程度に効率的であった。
実施例５：アジドまたはアルキン核酸のＰＣＲ組み込みおよび検出
反応を、アプライドバイオシステムズＰＣＲ機器で、以下の条件下で実施した：
３０℃ − ３０分間 −保持
３２サイクルの ９５℃ − ３０秒
５９℃ − ３０秒
７２℃ − １分
次いで：４℃ − 無制限。
加えて、ＴａｑおよびＰｆｕ−ターボＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを実施した。手短に言えば、１ｐｍｏｌの３６ｂｐ（レーン１／５／１／ｆ）または３８ｂｐ（レーン２／６／ｂ／ｇ）または４４ｂｐ（レーン３／７／ｃ／ｈ）または６０ｂｐ（レーン４／８／ｄ／ｌ）のいずれかの単位複製配列を、１０ｎＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマー、５０μＭ 修飾ｄＮＴＰ（ｅ−ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ）、１×ＴａｑまたはＰｆｕターボ緩衝液および１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｔａｑポリメラーゼについて）を使用して、ＰＣＲによって増幅させた。
この反応液を、サイズ排除カラム（クロマスピン ＴＥ３０、クロンテック）を通して精製した。次いで、その溶出液を、２５％ プロピレングリコール；１ｍＭ 硫酸銅；１０ｍＭ ＢＣＳ、１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムおよび５０μＭ アジド−ＴＡＭＲＡまたは５０μＭ アルキン−ＴＡＭＲＡの最終濃度を使用するクリック反応に供した。反応を、室温で３０分間実施した。次いでこれを、上記のように、サイズ排除で精製した。この反応液を取り出し、ＴＲＡＣＫ−ＩＴシアン橙色ローディング色素と混合した。この反応液（図８および表４を参照）を、２０％ ＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲルに供した。このゲルを、１０Ｖで１０分間、１９０Ｖで９０分間流した。このゲルをカセットから取り出し、ＴＡＭＲＡについて走査した（励起：５３０ｎｍ、発光：５８０ｎｍ）。次いで、同じゲルをＳＹＢＲ ＧＯＬＤを用いて３０分間染色し、次いで上記のように、走査した。
図８は、ＴＡＭＲＡについて走査し（左；励起５３２−発光５８０）、次いでＳＹＢＲ ＧＯＬＤを用いて染色した（右）２０％ ＴＢＥ ＰＡＧＥを示す。レーン１、２、３および４（またはａ、ｂ、ｃ、ｄ）は２μｌのＰＣＲ生成物が充填され、他方、レーン５，６、７および８（またはｆ、ｇ、ｈ、ｌ、ｋ）は６μｌのＰＣＲ生成物が充填された。ラダーまたは３６ｂｐ内部標準バンドをＴＲＡＰアッセイで見ることができるという事実は、テロメラーゼがアジドまたはアルキン修飾化合物を組み込むことができるだけでなく、Ｔａｑポリメラーゼもまた同じことをすることができるということを示す。なぜなら、ＴＲＡＰアッセイにおけるテロメラーゼ反応後の引き続く工程はＰＣＲ工程であるからである。
実施例６：異なるポリメラーゼを用いた等温伸長アッセイにおけるＥ−ｄＵＴＰの組み込み
下に示す一本鎖ＤＮＡオリゴマーを、「クリック可能な」ｄＮＴＰを使用するプライマー伸長アッセイに使用した。使用したオリゴは、配列中のｄＵＴＰを漸増するように設計した。
Figure 2010517594
１００ｐｍｏｌのオリゴ３または４を、５００ｐｍｏｌのＭ１３プライマーとともにアニーリング緩衝液（７ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＮａＣｌ）中でアニーリングした。この反応混合物を、９５Ｃまで５分間、６５Ｃで２０分間加熱し、常温に冷却した。すべての反応液に各々５０μＭのｄＮＴＰを供給した。ｄＮＴＰ混合物は、各々５０μＭのｅ−ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰからなっていた。反応を、ポリメラーゼを加えることにより開始させた。異なる反応液の詳細を、表５に提示する。
（表５）
Figure 2010517594
ＬａおよびＬｂと表したレーンは、２５ｂｐ ＤＮＡラダーである。
伸長したｄｓＤＮＡ生成物を、「クリック」反応に供した。反応生成物の体積を、５０μｌの２５にした。反応成分の最終濃度は、２５％ プロピレングリコール、１ｍＭ 銅（ＩＩ）、１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＢＣＳおよび５０μＭ アジド−ＴＡＭＲＡであった。この反応液を、チューブ振盪機上で室温で３０〜６０分間振盪した。次いで、チューブの内容物を、クロマスピンカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィに供した。次いで、精製したｄｓ ＤＮＡを、１／１０の体積の１０×ブルージュース（ｂｌｕｅ ｊｕｉｃｅ）と混合し、２−％ ＴＢＥ ＰＡＧＥ上に充填し、これを一定の２００Ｖで２時間流した。
泳動の終了後、このゲルをＴＡＭＲＡについて走査し（励起：５３０ｎｍおよび発光：５８０ｎｍ）、その結果を図９の左の部分に示す。ＴＡＭＲＡについて走査したのち、このゲルを、１×ＴＢＥ中のＳＹＢＲ ＧＯＬＤの１：１０，０００倍希釈を用いて染色し、シグナルについて走査した（励起：４７３、発光：５８０）。それを右側に示す。
実施例７：ＴｒＡＰラダー形成を保存するためのＣｕ（Ｉ）キレート剤ＢＣＳの組み込み
ＴＲＡＰｅｚｅ（商標）テロメラーゼアッセイ（ケミコンキット Ｓ７７００）を、ＢＣＳを用いて実施した。各反応液は、以下のものを含有していた：
（ａ）１×ＴＲＡＰ反応緩衝液（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３、１．５ ＭｇＣｌ２ ６３ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％ ツイーン２０、１ｍＭ ＥＧＴＡ）
（ｂ）５０のＮ３−ｄＡＴＰ ＋ ５０μＭのｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ（詳細については表６を参照）
（ｃ）１μｌのＴＳプライマー（ＴＲＡＰｅｚｅ テロメラーゼキット、ケミコン）
（ｄ）１μｌのプライマー混合物（ＴＲＡＰｅｚｅ テロメラーゼキット、ケミコン由来の３種の別個のプライマー：Ｋ１順方向プライマー、ＲＰ逆方向プライマーおよびＴＳＫ１内部標準プライマーを含有する）
（ｅ）２単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（ｆ）２μｌの、ＴＲＡＰｅｚｅ テロメラーゼキット（ケミコン）の陽性対照細胞（５００細胞）。この細胞抽出液を調製し、さらにＣＨＡＰＳ緩衝液で希釈した。その成分は、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ ベンズアミジン、５ｍｍ β−メルカプトエタノール、０．５％ ＣＨＡＰＳおよび１０％ グリセロールであった。
（ｇ）各反応液の体積を５０μｌにするのに必要なＰＣＲ等級の水。
反応を、アプライドバイオシステムズＰＣＲ機器で、以下の条件下で実施した：
３０℃ − ３０分間 −保持
３２サイクルの ９５℃ − ３０秒
５９℃ − ３０秒
７２℃ − １分
次いで：４℃ − 無制限。
この反応液を、サイズ排除カラム（クロマスピン ＴＥ３０、クロンテック）を通して精製した。次いで、その溶出液を、２５％ プロピレングリコール；１ｍＭ 硫酸銅；１０ｍＭ ＢＣＳの存在下または非存在下（表６を参照）、１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムおよび５０μＭ アルキン−ＴＡＭＲＡの最終濃度を使用するクリック反応に供した。反応を、室温で３０分間実施した。次いでこれを、上記のように、サイズ排除で精製した。この反応液をＴＲＡＣＫ−ＩＴシアン橙色ローディング色素と混合し、これを２０％ ＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲルに供した（図１０を参照）。このゲルを、１０Ｖで１０分間、１９０Ｖで９０分間流した。このゲルをカセットから取り出し、ＴＡＭＲＡについて走査した（励起：５３０ｎｍ、発光：５８０ｎｍ）。次いで、同じゲルをＳＹＢＲ ＧＯＬＤを用いて３０分間染色し、次いで４７３ｎｍの励起源を用いて、および５２０ｎｍの発光に関して走査した。
（表６）
Figure 2010517594
増幅の結果は図１０に示してあり、このゲルは、テロメラーゼの活性とは無関係に、ＢＣＳの非存在下で現れる高分子量生成物を示す。しかしながら、アッセイ生成物のＴＲＡＰ「ラダー形成」パターンは、ＢＣＳを添加すると回復した。
実施例８：等温ＤＮＡ増幅技術−ヘリカーゼ依存性増幅を用いる増幅したＤＮＡ生成物のクリック化学ベースの検出（図１１を参照）
８ａ）ヘリカーゼ依存性増幅（図１１を参照）
ａ．ｍＨＤＡ：
４つのｄＮＴＰに加えて（１）アジド−ｄＡＴＰもしくはエチレン−ｄＵＴＰ（ｄＴＴＰの代わり）または（２）アジド−ｄＵＴＰもしくはエチレン−ｄＵＴＰのいずれかを伴うＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシオリゴヌクレオチドプライマーおよびデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物を一緒に加える。この反応混合物を９５℃に５分間加熱し、次いで標的の長さおよび必要とされる最終生成物の量に応じて、反応混合物を３７℃で１〜３時間インキュベートした。
このポリメラーゼ反応が完結した後、増幅したＤＮＡにクリック反応成分を加える。このクリック反応成分は、ＣｕＳｏ４、ＢＣＳ、Ｎａ−アスコルビン酸塩、およびアジド−フルオロフォアまたはアルキン−フルオロフォアのいずれか、である。次いでこの反応液を、直接アガロースゲル上で流すか、または二次マトリクスを用いて検出する。
８ｂ）
ｂ．ｔＨＤＡ：
４つのｄＮＴＰに加えて（１）アジド−ｄＡＴＰもしくはエチレン−ｄＵＴＰ（ｄＴＴＰの代わり）または（２）アジド−ｄＵＴＰもしくはエチレン−ｄＵＴＰのいずれかを伴うＤＮＡヘリカーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｅｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ）由来）、デオキシオリゴヌクレオチドプライマーおよびデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物を一緒に加える。この反応混合物を９５℃で５分間加熱し、次いで標的の長さおよび必要とされる最終生成物の量に応じて、反応混合物を６５℃で１〜２時間インキュベートする。
このポリメラーゼ反応が完結した後、増幅したＤＮＡにクリック反応成分を加える。このクリック反応成分は、ＣｕＳＯ４、ＢＣＳ、Ｎａ−アスコルビン酸塩、およびアジド−フルオロフォアまたはアルキン−フルオロフォアのいずれか、である。次いでこの反応液を、直接アガロースゲル上で流す。
ｃ．環状ＨＤＡ：
ＤＮＡ増幅のこの方法はＴ７ヘリカーゼおよびＴ７ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ローリングサークル型ＤＮＡ増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に類似している。このプラットフォームにおける他のアクセサリータンパク質としては、Ｔ７一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が挙げられる。このプラットフォームは、プラスミドまたは共有結合で閉じた環状ＤＮＡの生体外増幅に使用できる。この技術は、臨床診断および分子生物学において（例えば、ＤＮＡ配列決定および変異原性において）重要な用途を有する。上記のように、アジドまたはアルキン修飾ヌクレオチド三リン酸がＤＮＡ増幅方法中に使用され、次いでアルキン色素分子またはアジド色素分子のいずれかが、新しく合成したＤＮＡ上に標識を作り出すために加えられる。
ｄ．ｒｔ−ＨＤＡ：
この方法は、Ｂｓｔポリメラーゼのポリメラーゼ活性を組み合わせた、一定温度条件下での逆転写酵素の逆転写酵素活性を利用する。この増幅したＤＮＡの検出は、アジドまたはアルキンｄＮＴＰを用いて、上記のように実施され、アジド／アルキン色素は、修飾ｄＮＴＰと色素標識との間でクリック反応を促進させる条件下で増幅反応の最後に添加される。
鎖置換増幅（ＳＤＡ）（図１２を参照）：
ＳＤＡは、等温での核酸増幅方法である。制限部位を含有するプライマーを鋳型にアニーリングする。次いで増幅プライマーを、５’隣接配列にアニーリングし（ニックを形成する）、増幅を一定温度で開始させる。新しく合成したＤＮＡに制限酵素によってニックを入れ、ポリメラーゼが増幅を再び開始し、新しく合成した鎖を置き換える。ＤＮＡの１０９個のコピーを１回の反応で作製することができる。増幅された生成物のより良好な標識および検出のために、アジドまたはアルキンｄＵＴＰを加える。上記酵素は当該技術分野でＴａｑポリメラーゼを用いてアジドまたはアルキン修飾ｄＮＴＰを組み込むことが示されているｐｏｌ Ｉ ＤＮＡポリメラーゼファミリーのメンバーであるため、このアジドまたはアルキンｄＵＴＰは新しく合成した鎖に組み込まれる。この増幅反応が完了すると、重合鎖中のアジドまたはアルキンｄＮＴＰを、クリック反応を促進する条件下でアジドまたはアルキン色素にライゲーションする。
ループ媒介等温ＤＮＡ増幅（Ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：
ＬＡＭＰ（ループ媒介等温増幅（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））法は、標的遺伝子上の６つの明確に異なる領域を認識する４種のプライマー、および等温条件下で反応を実施するための鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する核酸増幅方法である。遺伝子の増幅および検出は、試料、プライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼおよび基質の混合物を６０℃〜６５℃の一定温度でインキュベートすることにより、１回の工程で完了することができる。この方法は、高増幅効率を提供し、ＤＮＡは１５〜６０分間に１０９〜１１０回増幅される。その高特異性に起因して、増幅された生成物の存在が標的遺伝子の存在を示すことができる。これはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼも使用するため、クリック化学は標識を検出するのに使用できる。
ローリングサークル型ＤＮＡ増幅／φ２９ベースのＤＮＡ増幅：
この方法はφ２９ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、高い忠実度および効率でＤＮＡ（直線状または環状）を増幅することができる。工業的および学術的な多くの研究機関は、それを、臨床病理学、学術的研究およびインサイツハイブリダイゼーションからのＤＮＡプローブの調製に使用する。本発明者らは、以下の工程のいずれかを行うことを提案する：
（１）アジド−ｄＵＴＰもしくはエチレン−ｄＵＴＰのいずれかを加えて、反応混合物中のｄＴＴＰを置き換える、または
（２）上記４つのｄＮＴＰに加えてアジド−ｄＵＴＰもしくはエチレン−ｄＵＴＰのいずれかを加える。
ポリメラーゼ反応が完了すると、クリック反応成分をその増幅されたＤＮＡに加える。クリック反応成分は、ＣｕＳｏ４、ＢＣＳ、Ｎａ−アスコルビン酸塩、およびアジド−フルオロフォアまたはアルキン−フルオロフォアのいずれかである。次いでこの反応を、アガロースゲル上で直接流すことができる。
これまでに記載したように、クリック化学は、多置換増幅、転写媒介性増幅などの他の等温ＤＮＡ増幅技術においてＤＮＡを標識および検出するために、アジド／アルキンヌクレオチドとアルキン／アジド色素との間で使用できる。
ＩＳＨ／ＦＩＳＨのためのプローブの調製
インサイツハイブリダイゼーションのためのプローブもまた、「クリック」標識を使用して作製することができる。標準的なポリメラーゼ、例えば、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）（Ｅｘｏ−）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ））またはＢｓｔポリメラーゼ（ラージフラグメント）を用いることにより、プライマーおよびエチニルまたはアジドｄＮＴＰを使用して所与の配列について鋳型鎖を増幅できる。次いで調製したＤＮＡ断片は精製し、標識されたプローブを作り出すためのアジドもしくはアルキン色素またはナノ粒子のいずれかとのクリック反応に供することができる。これは、発色によって検出可能なインサイツハイブリダイゼーションならびに蛍光性（色素およびＱドット）ベースのプローブの両方に適している。
予測される主な利点は、この種の標識が診断アッセイ時または臨床アッセイ時に行えることである。加えて、この応用には、ハイブリダイゼーションの後にクリック反応を行ってシグナルを発生させることができる、ダコ（Ｄａｋｏ）、ベンタナメディカルシステムズ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびビジョンバイオシステムズ（Ｖｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手できる機器のような自動インサイツハイブリダイゼーションプラットフォームが含まれる。
第１の鎖ｃＤＮＡ合成（ＲＴ−ＰＣＲ）
上述のように、エチニル−ｄＵＴＰまたはアジド−ｄＡＴＰは、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）であるテロメラーゼ酵素によって組み込まれる。それゆえ、この方法論は、ＲＴ?ＰＣＲの生成物を検出するのに使用できる。この方法では、ヌクレオチド混合物は、エチニルｄＮＴＰまたはアジドｄＮＴＰのいずれか、および酵素（逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼなど）を含有することができる。かかる実験の生成物は精製され、次いでクリックベースの標識方法に供される。最終の標識された生成物は、沈殿またはサイズ排除クロマトグラフィのいずれかによって精製される。
第２の鎖ｃＤＮＡ合成（プライマー伸長）
上で示した等温ＤＮＡ伸長アッセイを、種々の異なるポリメラーゼを用いて実施した。これは、第２の鎖ｃＤＮＡ合成の例としての役割を果たす。
ＦＩＳＨのためのＲＮＡプローブの調製
現在、ＲＮＡ ＦＩＳＨプローブの調製のために選択した２つの方法は、以下のとおりである：
（１）アミノアリル−ＮＨＳエステル化学のいずれかによって標識することができる小さいＲＮＡオリゴヌクレオチド、
（２）ＲＮＡプローブを生成するための生体外転写系を用いる修飾ヌクレオチドの組み込み。
これらの２つの技術および「クリック可能な」ヌクレオチドについての本発明者らの理解に基づいて、ファージＴ７またはＳＰ６由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、エチニルまたはアジドオリゴヌクレオチドを組み込み、アジドもしくはアルキン蛍光性または発色性標識のいずれかを用いて、クリック化学に供される修飾ＲＮＡプローブを生成する。これを使用して、蛍光発生性または発色性ＲＮＡプローブを生成する。
クリック化学を用いたペプチド−核酸コンジュゲートを調製するための方法：
１つ以上のアミノ酸上にＯ−ＧｌｃＮａｃ修飾を有するペプチドをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚの存在下でＧａｌ Ｔ１反応に供する。これはアジド修飾ペプチドをもたらす。これまでに説明したように、オリゴデオキシヌクレオチドは、アルキン連結ヌクレオチドまたはアジド連結ヌクレオチドのいずれかを使用して作り出すことができる。次いで、アジド連結ペプチドおよびエチニル装飾オリゴヌクレオチドを１ｍＭまたは２ｍＭ 銅、１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムおよび２０ｍＭ ＢＣＳの存在下で反応させることにより、ペプチド−核酸コンジュゲートを作り出す。
実施例９：アポトーシスアッセイ
所望の方法を使用して細胞においてアポトーシスを誘発する。誘導剤の非存在下で細胞をインキュベートすることにより、注目する細胞株を用いて、陰性対照試料を調製することが望ましい場合がある。
１〜２×１０６細胞を０．５ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させる。この細胞懸濁液を５ｍＬのＰＢＳ中の１％（重量／体積）パラホルムアルデヒドに加え、氷上に１５分間置く。この細胞を５分間、３００×ｇで遠心分離し、上清を捨てる。この細胞を５ｍＬのＰＢＳ中で洗浄し、次いで遠心分離によってこの細胞をペレット化する。繰り返す。この細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させる。この細胞を５ｍＬの氷冷した７０％（体積／体積）エタノールに加える。この細胞を氷上または−２０℃の冷凍庫中で最短３０分間静置する。いくつかの生物系では、このアッセイを実施する前に７０％（体積／体積）エタノール中、−２０℃で少なくとも１２〜１８時間細胞を保存すると、最良の結果が得られる。細胞は、使用までに−２０℃で数日間保存することができる。
バイアルを旋回させることによって、陽性対照細胞および陰性対照細胞を再懸濁させる。対照細胞懸濁液の１ｍＬのアリコート（およそ１×１０６細胞／ｍＬ）を取り出し、１２×７５ｍｍフローサイトメトリー遠心分離管に入れる。対照細胞懸濁液を５分間遠心分離し（３００×ｇ）、細胞ペレットを乱さないように注意して７０％（体積／体積）エタノールを吸引によって取り除く。各チューブの対照細胞を、１ｍＬの洗浄緩衝液（モレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）製品Ａ２３２１０の成分Ｈ）を用いて再懸濁させる。５分間３００×ｇで遠心分離し、上清を吸引によって除去しする。繰り返す。ＤＮＡ標識溶液を調製する。各試料につき全体積５０μＬが必要である。１０μＬの反応緩衝液（成分Ｇ、モレキュラープローブ製品Ａ２３２１０）、０．７５μＬのＴｄＴ酵素（末端デオキシヌクレオチジルトランフェラーゼ；成分Ｃ、モレキュラープローブ製品Ａ２３２１０）、８．０μＬのＥｄＵＴＰ（紫色のキャップ）および３１．２５μＬのｄＨ２Ｏを混合する。このＤＮＡ標識溶液はおよそ２４時間活性である。各チューブの対照細胞ペレットを５０μＬのこのＤＮＡ標識溶液に再懸濁する。温度制御した浴中で、３７℃で６０分間、この細胞をＤＮＡ標識溶液中でインキュベートする。この試料を１５分間ごとに振盪して、細胞を懸濁した状態に保つ。対照細胞以外の試料については、３７℃でのインキュベーション時間は、実験試料の特徴に応じて、より長い期間またはより短い期間に調整する必要がある場合がある。対照細胞についてのＤＮＡ標識反応は、２２〜２４℃で一晩実施することもできる。インキュベーション時間の最後に、１．０ｍＬのリンス緩衝液（成分Ｉ、モレキュラープローブ製品Ａ２３２１０）を各チューブに加えて、３００×ｇで５分間遠心分離する。上清を吸引によって取り除く。１．０ｍＬのリンス緩衝液を用いて、細胞のリンスを繰り返す。試料を３００×ｇで遠心分離し、上清を吸引によって取り除く。５．０μＬのアレクサフルオル（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）４８８色素標識されたアジドを上記のような濃度および比率の硫酸銅、アスコルビン酸ナトリウム、およびＢＣＳを含有する９５μＬのリンス緩衝液と混合することによって、各試料について１００μＬのクリック化学標識溶液を調製する。この細胞ペレットを１００μＬのそのクリック化学標識溶液に再懸濁させる。この細胞をこの溶液中で、室温で１〜３時間インキュベートする。インキュベーションの間、試料を光から保護する。０．５ｍＬのヨウ化プロピジウム／ＲＮａｓｅ Ａ染色緩衝液（成分Ｆ、モレキュラープローブ製品Ａ２３２１０）を各試料に加える。室温でさらに３０分間、この細胞をインキュベートする。インキュベーションの間、試料を光から保護する。フローサイトメトリーによってこの試料を分析する。染色手順の完了の３時間以内に試料を分析することを推奨する。顕微鏡観察のために、クリック化学標識染色工程後、ヨウ化プロピジウム／ＲＮａｓｅ処理の前に、細胞をスライド上に載せることを推奨する。アポトーシスを生じた細胞は、フルオレセインにとって適切なフィルターセットを用いて観察したときに、明るく蛍光を発するはずである。接着細胞株については、上清中に存在する剥離した細胞は、接着したまま留まった細胞よりもアポトーシスを起こしている可能性が高い。剥離した細胞は、接着細胞層のトリプシン処理の前に集めるべきである。
実施例１０：ジゴキシンアジド
ジゴキシンの穏和な酸加水分解によって、糖部分は切断され、公知のアルコール誘導体が得られる。このアルコールとホスゲンとの反応、それに続く６−アミノ−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩を用いたアルキル化は、所望のアジド−ジゴキシン類似体を与える。
Figure 2010517594
実施例１１：ジゴキシンアルキン
ジゴキシンの穏和な酸加水分解によって、糖部分は効果的に切断され、公知のアルコール誘導体が得られる。このアルコールとホスゲンとの反応、それに続くプロパルギルアミンを用いたアルキル化は所望のアルキニル−ジゴキシン類似体を与える。
Figure 2010517594
実施例１２：ダポキシル（Ｄａｐｏｘｙｌ）（登録商標）アルキンの合成
ダポキシル（登録商標）アルキンの合成を、以下の反応スキームに示す。
Figure 2010517594
室温のＤＭＦ（０．４ｍＬ）中のダポキシル（登録商標）カルボン酸、スクシンイミジルエステル（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、プロパルギルアミン（４２μＬ、０．６１ｍｍｏｌ）を加えた。最初は透明であった橙色溶液は、黄色になり濁った。室温で約１５分後、この反応は完結した。この溶液を乾固するまで濃縮した。残渣をＨＰＬＣによって精製し、生成物（３６ｍｇ、８４％）を得た。ＴＬＣ（１０％ ＥｔＯＡｃ、ＣＨＣｌ３）Ｒｆ＝０．３０；ＥＳＩ ｍ／ｚ ３４６（Ｍ＋、Ｃ２１Ｈ１９Ｎ３Ｏ２なら３４６となる）。
実施例１３：５−カルボキシテトラメチルローダミンアルキン（５−ＴＡＭＲＡ−アルキン）の合成
５−カルボキシテトラメチルローダミンアルキン（５−ＴＡＭＲＡ−アルキン）の合成を、以下の反応スキームに示す。
Figure 2010517594
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の５−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステル（５−ＴＡＭＲＡ−ＳＥ、０．１０ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、プロパルギルアミン（２５μＬ、０．３８ｍｍｏｌ）およびＨ２Ｏ（０．５ｍＬ）を加えた。この溶液を室温で３０分間撹拌した後、真空中で濃縮した。ＨＰＬＣ（フェノメネックス プロディジ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｐｒｏｄｉｇｙ） ＯＤＳ、内径２１．２ｍｍ、溶離液 ２５ｍＭ ＴＥＡＡ、ｐＨ ４．７中の２５〜４０％ ＣＨ３ＣＮ、１５ｍＬ／分の流量）による精製によって、６８ｍｇの生成物（８２％、赤紫色の固体）を得た。ｔＲ＝２３〜３３分。ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２）Ｒｆ＝０．６７。
実施例１４：ビオチンアルキンの合成
ビオチンアルキンの合成を、以下の反応スキームに示す。
Figure 2010517594
ＤＭＦ（０．１ｍＬ）中のＥＺ−リンク ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（２５ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））の溶液に、プロパルギルアミン（０．１ｍＬ）を加えた。この溶液を室温で９０分間撹拌した後、いくらかの出発物質がまだ観察された。さらにプロパルギルアミン（０．２ｍＬ）を加え、溶液をさらに６０分間撹拌した。この溶液を、真空中で濃縮した。粗生成物をＨＰＬＣによって精製し、１４．４ｍｇ（６４％）の生成物を黄色固体として得た。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、７：１）Ｒｆ＝０．２３；ＥＳＩ ｍ／ｚ ５２９（Ｍ＋、Ｃ２４Ｈ４０Ｎ４Ｏ７Ｓなら５２９となる）。
実施例１５：化合物１の合成
化合物１の合成を、以下の反応スキームに示す。
Figure 2010517594
ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中のアレクサフルオル（登録商標）４８８カルボン酸、スクシンイミジルエステル、ジリチウム塩（混合異性体、５０ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）の溶液に、プロパルギルアミン（５４□Ｌ、０．７９ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で一晩撹拌した。最初は濃い赤色であった溶液は、淡黄色に変わり、透明になった。この溶液を真空中で濃縮し、シリカゲル薄層クロマトグラフィ（分取用プレート、２０％ Ｈ２Ｏ、ＣＨ３ＣＮ）によって精製し、生成物（２０ｍｇ、４４％）を橙色固体として得た。ＴＬＣ（３：１、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ）Ｒｆ＝０．７０；ＥＳＩ ネガティブ ｍ／ｚ ５７０（Ｍ＋、Ｃ２４Ｈ１６Ｎ３Ｏ１０Ｓ２−なら５７０となる）。
実施例１６：化合物２の合成
化合物２の合成を、以下の反応スキームに示す。
Figure 2010517594
ＤＭＦ（２．２ｍＬ）中のアレクサフルオル（登録商標）５３２カルボン酸、スクシンイミジルエステル（５０ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）の溶液に、プロパルギルアミン（１００μＬ、１．４６ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で一晩撹拌した。Ｈ２Ｏ（１．０ｍＬ）をこの溶液に加え、さらに１時間撹拌した。この溶液を真空中で濃縮し、粗生成物をＨＰＬＣによって精製し、生成物（３０ｍｇ、６５％）を得た。ＴＬＣ（８：２、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ）Ｒｆ＝０．５８；ＥＳＩ ｍ／ｚ ６６４（Ｍ＋、Ｃ３３Ｈ３３Ｎ３Ｏ８Ｓ２なら６６４となる）。
実施例１７：化合物３の合成
化合物３の合成を、以下の反応スキームに示す。
Figure 2010517594
ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中のアレクサフルオル（登録商標）６３３カルボン酸、スクシンイミジルエステル、ビス（トリエチルアンモニウム塩）（５０ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）の溶液に、プロパルギルアミン（２８μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で一晩撹拌した。Ｈ２Ｏ（１．０ｍＬ）をこの溶液に加え、さらに１時間撹拌した。この溶液を真空中で濃縮し、生成物（３９ｍｇ、９９％）を得た。ＴＬＣ（８：２、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ）Ｒｆ＝０．６６；ＥＳＩ ｍ／ｚ ９６３（Ｍ＋、Ｃ４０Ｈ３４Ｆ２Ｎ３Ｏ１１Ｓ６なら９６３となる）。
実施例１８：シュタウディンガーライゲーションのためのトリアリールホスフィン−ＴＡＭＲＡ色素の合成
トリアリールホスフィン−ＴＡＭＲＡ色素の合成を、以下の反応スキームに示す。
Figure 2010517594
ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の酸１（参考文献：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００、２８７、２００７−２０１０）（８０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ、７５ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、５ｍｇ）を加えた。この溶液を室温で撹拌した。２．５時間後、アミン２（５０μＬ、０．２６ｍｍｏｌ）を加え、一晩撹拌した。この溶液を、ＣＨＣｌ３（１５ｍＬ）とＨ２Ｏ（５ｍＬ）との間で分配した。有機層を分離し、水層をＣＨＣｌ３（１５ｍＬ）で再抽出した。合わせた有機層を、Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）で１回、次いで飽和ＮａＣｌ水溶液（５ｍＬ）でリンスした。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、傾瀉し、濃縮した。粗生成物をクロマトグラフィ（シリカ、２％ ＭｅＯＨ、ＣＨＣｌ３）によって精製し、生成物（９９ｍｇ、７１％）を透明な黄色油状物として得た。
ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中の３（１０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）の溶液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、０．５ｍＬ）を加え、室温で撹拌した。３０分後、この溶液を濃縮し、トルエン（２×２ｍＬ）から再エバポレートした。残渣（４、０．０１８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．２ｍＬ）およびＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＥＡ、１２□Ｌ、０．７２ｍｍｏｌ）に溶解させ、５−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステル（５−ＴＡＭＲＡ−ＳＥ、９ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で２．５時間撹拌し、濃縮し、シリカゲル（分取用プレート、ＣＨ３ＣＮ中の２０％ Ｈ２Ｏ）によって精製し、生成物（７．４ｍｇ、４８％）を得た。ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ中の２０％ Ｈ２Ｏ）Ｒｆ＝０．２３；ＥＳＩ ｍ／ｚ ５２９（Ｍ＋、Ｃ２４Ｈ４０Ｎ４Ｏ７Ｓなら５２９となる）。
実施例１９：シュタウディンガーライゲーションのためのトリアリールホスフィン−ビオチンの合成
トリアリールホスフィン−ビオチンの合成を、以下の反応スキームに示す。
Figure 2010517594
ＣＨ２Ｃｌ２（１．２ｍＬ）中の３（５．３ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）の溶液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、０．５ｍＬ）を加え、この溶液を室温で撹拌した。２時間後、この溶液を濃縮し、トルエン（２×２ｍＬ）から再エバポレートした。残渣（４、０．０１０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．１ｍＬ）およびＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＥＡ、３□Ｌ、０．０２ｍｍｏｌ）に溶解させ、ＥＺ−リンク ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（７ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１時間撹拌し、飽和ＮＨ４ ＋Ｃｌ−でクエンチし、ＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）とＨ２Ｏ（１ｍＬ）との間で分配した。紫外スポットがＴＬＣによって観察されなくなるまで、水層をＣＨＣｌ３（１回の抽出あたり１０ｍＬ）で繰り返し抽出した。合わせた有機層を濃縮し、シリカゲル（分取用プレート、７：１ ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ）によって精製し、生成物（２．２ｍｇ、２５％）を得た。ＴＬＣ（７：１ ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、３回展開した）Ｒｆ＝０．５０；ＥＳＩ ｍ／ｚ ９０９（Ｍ＋Ｈ＋、Ｃ４６Ｈ６３Ｎ５Ｏ１０ＰＳなら９０９となる）。
実施例２０：Ｃｙ（商標）５．５アジドの合成
Figure 2010517594
ＤＭＦ（０．１ｍＬ）およびＤＩＥＡ（６．０μＬ、０．０３４ｍｍｏｌ）中の６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩（合成についてはスキーム１を参照、０．０３４ｍｍｏｌ）の溶液にＣｙ（商標）５．５スクシンイミジルエステル（５ｍｇ、３．４ｎｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１０分間撹拌した後、反応溶液を真空中で濃縮した。粗生成物をＨＰＬＣによって精製した。
実施例２１：Ｃｙ（商標）３アジドの合成
Figure 2010517594
ＤＭＦ（０．１ｍＬ）およびＤＩＥＡ（９．２μＬ、０．０５２ｍｍｏｌ）中の６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩（合成についてはスキーム１を参照、０．０５２ｍｍｏｌ）の溶液にＣｙ（商標）３スクシンイミジルエステル（５．０ｍｇ、５．２ｎｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１０分間撹拌した後、反応溶液を真空中で濃縮した。粗生成物をＨＰＬＣによって精製した。
実施例２２：Ｃｙ（商標）５．５アルキンの合成
Figure 2010517594
ＤＭＦ（０．１ｍＬ）中のＣｙ（商標）５．５スクシンイミジルエステル（ジーイー・アマルシャム（ＧＥ Ａｍｅｒｓｈａｍ）、５．０ｍｇ、３．７ｎｍｏｌ）の溶液にプロパルギルアミン（２．５μＬ、０．０３７ｍｍｏｌ）およびＨ２Ｏ（０．２ｍＬ）を加えた。この溶液を室温で３０分間撹拌し、次いで真空中で濃縮した。粗生成物をＨＰＬＣによって精製した。
実施例２３：Ｃｙ（商標）３アルキンの合成
Figure 2010517594
ＤＭＦ（０．１ｍＬ）中のＣｙ（商標）３スクシンイミジルエステル（ジーイー・アマルシャム、５．０ｍｇ、５．７ｎｍｏｌ）の溶液にプロパルギルアミン（３．９μＬ、０．０５７ｍｍｏｌ）およびＨ２Ｏ（０．２ｍＬ）を加えた。この溶液を室温で３０分間撹拌し、次いで真空中で濃縮した。粗生成物をＨＰＬＣによって精製した。
実施例２４：スクシンイミジルエステルアジド合成
スクシンイミジルエステルアジドの合成を、以下の反応スキームに示す。
Figure 2010517594
６−（Ｂｏｃ−アミノ）−ヘキサニル−１−ｐ−トルエンスルホネート
Figure 2010517594
ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）中の６−（Ｂｏｃ−アミノ）−１−ヘキサノール（３．０ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＥＡ（３．８ｍＬ、２７．６ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホニルクロリド（３．９ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で一晩撹拌し、ＣＨＣｌ３（２００ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（４×５０ｍＬ）で洗浄し、ブラインでリンスし（１×５０ｍＬ）、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。この溶液を傾瀉し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィ（６．０×４１ｃｍ、２０〜７０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物を白色固体（３．５ｇ、６９％）として得た。ＴＬＣ（３５％ ＥｔＯＡＣ／ヘキサン） Ｒｆ＝０．７２、ＵＶ活性。
６−（Ｂｏｃ−アミノ）−ヘキサニル−１−アジド
Figure 2010517594
ＤＭＦ（２１ｍＬ）中の６−（Ｂｏｃ−アミノ）−ヘキサニル−１−ｐ−トルエンスルホネート（３．２ｇ、８．６３ｍｍｏｌ）の溶液にアジ化ナトリウム（１．１２ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を９５℃で一晩還流させた。室温まで冷却した後、この溶液をＥｔ２Ｏ（１６０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）で洗浄した。水層をＥｔ２Ｏ（１００ｍＬ）で２回抽出し、合わせた有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。傾瀉および濃縮をした後、この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（６×２６ｃｍ、２５〜３０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物を透明な無色の油状物（２．０ｇ、９７％）として得た。ＴＬＣ、（３５％ ＥｔＯＡＣ／ヘキサン） Ｒｆ＝０．７４、ニンヒドリン染色により褐色のスポット。
６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩
Figure 2010517594
ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中の６−（Ｂｏｃ−アミノ）−ヘキサニル−１−アジド（０．２ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）の溶液にＴＦＡ（１．０ｍＬ）を加えた。この溶液を室温で２時間撹拌し、乾固するまでエバポレートし、トルエンから２回再エバポレートした。生成物である６−アミノ−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩（０．８３ｍｍｏｌ）を、さらに精製することなく直接使用した。
（Ｎ−６−アジド−ヘキサニル）グルタルアミド
Figure 2010517594
６−アミノ−ヘキサニル−１−アジド（０．８３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．０ｍＬ）に溶解させ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２９ｍＬ、１．６５ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１０分間撹拌し、次いで無水グルタル酸（０．４７ｇ、４．１３ｍｍｏｌ）を加えた。この淡黄色溶液を室温で一晩撹拌した。反応溶液をＣＨＣｌ３（３０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１０ｍＬ）で希釈し、１％ ＨＣｌを用いてｐＨ １まで酸性にし、有機層を除去した。水層を、ＣＨＣｌ３（２×３０ｍＬ）でもう２回抽出した。合わせた有機層をブラインでリンスし（２×１０ｍＬ）、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。この溶液を傾瀉し、濃縮した。この粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィ（１０％ ＭｅＯＨ／０．１％ ＡｃＯＨを含有するＣＨＣｌ３）によって精製し、生成物を透明な無色の油状物（０．１６ｇ、７５％）として得た。カラムに１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３を充填した。ＴＬＣ（１０％ ＭｅＯＨ／０．１％ ＡｃＯＨを含むＣＨＣｌ３） Ｒｆ＝０．４１、ｐ−アニスアルデヒド染色により桃色、ＵＶ活性なし。
（Ｎ−６−アジド−ヘキサニル）グルタルアミド、スクシンイミジルエステル
Figure 2010517594
ＴＨＦ（４．０ｍＬ）中の（Ｎ−６−アジド−ヘキサニル）グルタルアミド（７５ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の溶液に、ピリジン（１１０μＬ、１．３６ｍｍｏｌ）、次いでスクシンイミジルトリフルオロアセテート（２００ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）を加えた。この透明な無色の溶液を室温で４時間撹拌した。この反応溶液をＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）で希釈し、１％ ＡｃＯＨ（２×５ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２×５ｍＬ）およびブライン（１×５ｍＬ）で順次リンスした。この粗生成物溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、傾瀉し、濃縮し、生成物を透明な無色の油状物（０．１０ｇ、９９％）として得た。ＴＬＣ：（１：１、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）Ｒｆ＝０．６４，ニンヒドリンにより橙色、ＵＶ活性。
実施例２５：スクシンイミジルエステルアルキンの合成
スクシンイミジルエステルアルキンの合成を、以下の反応スキームに示す。
Figure 2010517594
１０−ウンデシン酸スクシンイミジルエステル
Figure 2010517594
ＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）中の１０−ウンデシン酸（０．４０ｇ、２．２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（０．９９ｇ、３．２９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２分間撹拌した後、この反応を１％ ＡｃＯＨでクエンチし、ＣＨＣｌ３（１５０ｍＬ）で希釈した。次いで、この有機溶液を１％ ＡｃＯＨ（１０ｍＬ）で抽出し、Ｈ２Ｏ（２×４０ｍＬ）でリンスし、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥した。この溶液を傾瀉し、濃縮した。定量的収率を仮定し、この物質を直接次の工程に移した。ＴＬＣ（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３） Ｒｆ＝０．９０、ＵＶ活性。
ｔｅｒｔ−ブチルアルキン
Figure 2010517594
ＣＨ３ＣＮ（８ｍＬ）中の１０−ウンデシン酸スクシンイミジルエステル（０．６１ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＨ３ＣＮ（２ｍＬ）中のアミノ−ｄＰＥＧ（商標）２−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．４６ｇ、１．９７ｍｍｏｌ、カンタバイオデザイン（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ））を室温で加えた。２時間後、この溶液をＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）で抽出した。水層をＣＨＣｌ３（２×５０ｍＬ）で再抽出した。合わせた有機物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、傾瀉し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（２．５％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）によって精製し、生成物を透明な淡黄色油状物（０．４８ｇ、５５％）として得た。ＴＬＣ（９：１ ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ） Ｒｆ＝０．８１。
スクシンイミジルエステルアルキン
Figure 2010517594
ＣＨ２Ｃｌ２（２．０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルアルキン（０．４８ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液にＴＦＡ（２．０ｍＬ）を加えた。この溶液を１時間撹拌し、濃縮し、トルエンから再エバポレートした（２×１ｍＬ）。得られた褐色残渣をＣＨ３ＣＮ（５．０ｍＬ）に溶解させ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．８４ｍＬ、４．８３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で２分間撹拌し、次いでＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（０．４７ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を加えた。１５分後、この反応液をクエンチし、１％ ＡｃＯＨでｐＨ ４〜５まで酸性にした。この溶液をＣＨＣｌ３（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をＨ２Ｏ（１×１０ｍＬ）で再抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、傾瀉し、濃縮し、黄褐色固体（０．４６ｇ、８７％）を得た。この粗生成物は、さらに精製することなく試験するのに十分純粋であった。ＴＬＣ（８：２ ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ） Ｒｆ＝０．７９。
実施例２６：ヨードアセトアミドアジド合成
ヨードアセトアミドアジドの合成を、以下の反応スキームに示す。
Figure 2010517594
６−（ヨードアセトアミド）−アミノヘキサニル−１−アジド
Figure 2010517594
ＤＭＦ（０．１ｍＬ）中の６−アミノ−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩（３５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、暗所でヨード酢酸無水物（０．１０ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、反応を停止させ、溶液をＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）とＨ２Ｏ（１０ｍＬ）との間で分配した。有機層を除去し、水層をＣＨＣｌ３（１×１０ｍＬ）で再抽出した。合わせた有機物を飽和ＮａＣｌ（１×５ｍＬ）でリンスし、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、傾瀉し、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィ（２％ ＭｅＯＨ／０．１％ ＡｃＯＨを含有するＣＨＣｌ３）による精製により、生成物（３５ｍｇ、８１％）を黄色油状物として得た。ＴＬＣ（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３） Ｒｆ＝０．７５。
実施例２７：ヨードアセトアミドアルキン合成
ヨードアセトアミドアルキンの合成を、以下の反応スキームに示す。
Figure 2010517594
Ｎ−（ヨードアセトアミド）−プロパルギルアミン
ＤＭＦ中のプロパルギルアミンの溶液に、暗所でヨード酢酸無水物を加えた。２時間後、この反応を停止させ、溶液をＣＨＣｌ３とＨ２Ｏとの間で分配した。有機層を除去し、水層をＣＨＣｌ３で再抽出した。合わせた有機物を飽和ＮａＣｌでリンスし、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、傾瀉し、濃縮した。
実施例２８：マレイミドアルキン合成
マレイミドアルキンの合成を、以下の反応スキームに示す。
Figure 2010517594
プロパルギルアミンマレイミド
ＴＥＡの存在下でプロパルギルアミンと無水マレイン酸とを反応させた後、中間体の酸を無水酢酸および酢酸ナトリウムの存在下、７０℃で環化させて、所望のプロパルギルアミンマレイミドを得た。
実施例２９：マレイミドアジド合成
マレイミドアジドの合成を、以下の反応スキームに示す。
Figure 2010517594
Ｎ−（６−アジド−アミノヘキシル）マレイミド
ＴＥＡの存在下で６−アミノ−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩と無水マレイン酸を反応させた後、中間体の酸を無水酢酸および酢酸ナトリウムの存在下、７０℃で環化して、所望のＮ−（６−アジド−アミノヘキシル）マレイミドを得た。
実施例３０：アジド色素
Figure 2010517594
５−ＴＡＭＲＡアジド
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）およびＤＩＥＡ（３３μＬ、０．１９ｍｍｏｌ）中の６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩（合成についてはスキーム１を参照，０．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、５−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステル（５−ＴＡＭＲＡ−ＳＥ、５０ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１０分間撹拌した後、反応溶液を真空中で濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（分取用プレート、９：１ ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ）によって精製し、生成物を桃色の固体として得た（４５．６ｍｇ、８７％）。ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２） Ｒｆ＝０．６１、桃色の蛍光性スポット；ＥＳＩ−ポジティブ ｍ／ｚ ５５５ Ｍ＋、Ｃ３１Ｈ３５Ｎ６Ｏ４（５５５となる）。
スクシンイミジルエステルを含む任意のレポーター分子は、本願明細書に記載する方法を用いて、アジド修飾できると想定される。非限定的な例を以下に提示する。
Figure 2010517594
ＰＥＧ−ビオチンアジド
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）およびＤＩＥＡ（６０μＬ、０．３４ｍｍｏｌ）中の６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩（合成についてはスキーム１を参照、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（ピアース、５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で一晩撹拌した後、真空中で濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（７：１ ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ）によって精製し、生成物を濁った白色残渣（１２．３ｍｇ、１２％）として得た。ＴＬＣ（７：１、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、８：２） Ｒｆ＝０．５４、かすかなＵＶ活性なスポット、ビオチンに浸けることで桃色に染色；ＥＳＩ−ポジティブ ｍ／ｚ ６１６ Ｍ＋、Ｃ２７Ｈ４９Ｎ７Ｏ７Ｓ（６１６となる）。
Figure 2010517594
ローダミングリーン（商標）アジド（５−異性体および６−異性体の混合物）
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）およびＤＩＥＡ（５０μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）中の６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩（合成についてはスキーム１を参照，０．２０ｍｍｏｌ）の溶液に、ローダミングリーン（商標）カルボン酸、スクシンイミジルエステル、塩酸塩（５−異性体および６−異性体の混合物、５０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で２時間撹拌した後、真空中で濃縮した。ＨＰＬＣ（フェノメネックス プロディジ ＯＤＳ、内径２１．２ｍｍ、溶離液 ２５ｍＭ ＴＥＡＡ、ｐＨ＝４．７中の５〜５０％ ＣＨ３ＣＮ（６０分間にわたる）、２０ｍＬ／分の流量）により、２１．１ｍｇの生成物（４３％）を得た。ｔＲ＝４３〜４７分；ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ：ＡｃＯＨ、８：１：１） Ｒｆ＝０．７４、蛍光性黄色スポット；ＥＳＩ−ポジティブ ｍ／ｚ ４９９（Ｍ＋Ｈ、Ｃ２７Ｈ２７Ｎ６Ｏ４なら４９９となる）。
Figure 2010517594
アレクサフルオル（登録商標）４８８アジド（５異性体）
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．１１ｍＬ、０．８８ｍｍｏｌ）中の６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩（合成についてはスキーム１を参照，０．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、アレクサフルオル（登録商標）４８８ ５−カルボン酸、２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステル、ビス（トリエチルアンモニウム塩）（２００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１時間撹拌した後、真空中で濃縮した。ＨＰＬＣ（フェノメネックス プロディジ ＯＤＳ、内径２１．２ｍｍ、溶離液 ２５ｍＭ ＴＥＡＡ、ｐＨ＝４．７の０〜６０％ ＣＨ３ＣＮ（３０分にわたる）、２０ｍＬ／分の流量）により、５８．１ｍｇの生成物（３０％）を得た。ｔＲ＝２３〜２７分；ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２） Ｒｆ＝０．５８、蛍光性黄色スポット；ＥＳＩ−ネガティブ ｍ／ｚ ６５７（Ｍ−、Ｃ２７Ｈ２５Ｎ６Ｏ１０Ｓ２ −なら６５７となる）。
Figure 2010517594
アレクサフルオル（登録商標）５４６アジド
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）およびＤＩＥＡ（３２μＬ、０．１９ｍｍｏｌ）中の６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩（合成についてはスキーム１を参照，０．０９３ｍｍｏｌ）の溶液に、アレクサフルオル（登録商標）５４６カルボン酸、スクシンイミジルエステル（５０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で２時間撹拌した後、真空中で濃縮した。
ＨＰＬＣ（フェノメネックス プロディジ ＯＤＳ、内径２１．２ｍｍ、溶離液 ２５ｍＭ ＴＥＡＡ、ｐＨ＝４．７中の１０〜６０％ ＣＨ３ＣＮ（６０分にわたる）、２０ｍＬ／分の流量）により２７．２ｍｇの生成物（５４％）を得た。ｔＲ＝４８〜５２分；ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、９：１） Ｒｆ＝０．２４、蛍光性桃色スポット；ＥＳＩ−ネガティブ ｍ／ｚ １０８４（Ｍ−、Ｃ４６Ｈ５５Ｃｌ３Ｎ７Ｏ１１Ｓ３ −なら１０８４となる）。
Figure 2010517594
アレクサフルオル（登録商標）５９４アジド（５異性体）
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）およびＤＩＥＡ（４２μＬ、０．２４ｍｍｏｌ）中の６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩（合成についてはスキーム１を参照、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、アレクサフルオル（登録商標）５９４カルボン酸、スクシンイミジルエステル＊５−異性体＊（５０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で２時間撹拌した後、真空中で濃縮した。ＨＰＬＣ（フェノメネックス プロディジ ＯＤＳ、内径２１．２ｍｍ、溶離液 ２５ｍＭ ＴＥＡＡ、ｐＨ＝４．７中の２５〜６０％ ＣＨ３ＣＮ（３０分にわたる）、２０ｍＬ／分の流量）により、１６．５ｍｇの生成物（３２％）を得た。ｔＲ＝２３〜２５分；ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、９：１）Ｒｆ＝０．３６、蛍光性赤色スポット；ＥＳＩ−ネガティブ ｍ／ｚ ８４５（Ｍ−、Ｃ４１Ｈ４５Ｎ６Ｏ１０Ｓ２ −なら８４５となる）。
Figure 2010517594
ダポキシルアジド
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）およびＤＩＥＡ（４３μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）中の６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジドトリフルオロ酢酸塩（合成についてはスキーム１を参照，０．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ダポキシル（登録商標）カルボン酸、スクシンイミジルエステル（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で１時間撹拌した後、真空中で濃縮した。ＳＰＥ（Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｃ１８ ＤＳＣ）によって精製し、４１．６ｍｇの生成物（７８％）を得た；ＥＳＩ−ポジティブ ｍ／ｚ ４３３（Ｍ＋、Ｃ２４Ｈ２８Ｎ６Ｏ２なら４３３となる）。
Figure 2010517594
アレクサフルオル（登録商標）５６８−アジド
ＤＭＦ（０．２ｍＬ）およびＤＩＥＡ（７μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）中の６−（アミノ）−ヘキサニル−１−アジド（合成についてはスキーム１を参照、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、アレクサフルオル（登録商標）５６８カルボン酸、スクシンイミジルエステル（異性体の混合物、２５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で２．５時間撹拌した後、Ｈ２Ｏ（０．２ｍＬ）を加え、真空中で濃縮した。ＨＰＬＣ（フェノメネックス プロディジ ＯＤＳ、内径２１．２ｍｍ、溶離液 ２５ｍＭ ＮＨ４Ａｃ、ｐＨ ４．７中の２０〜３５％ ＣＨ３ＣＮ、１５ｍＬ／分の流量）により１５．３ｍｇの生成物（９９％）を得た。ｔＲ＝２４〜３０分；ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２） Ｒｆ＝０．６３、蛍光性桃色スポット；ＥＳＩ−ネガティブ ｍ／ｚ ８１７（Ｍ−２、Ｃ３９Ｈ４１Ｎ６Ｏ１０Ｓ２ −なら８１７となる）。
実施例３１：アルキン色素
Figure 2010517594
オレゴングリーン（登録商標）４８８−アルキン
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のオレゴングリーン（登録商標）４８８カルボン酸、スクシンイミジルエステル（５０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）の溶液に、プロパルギルアミン（０．２６μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＨ２Ｏ（０．１ｍＬ）を加えた。室温で１５分間撹拌した後、この溶液を濃縮した。ＨＰＬＣ（フェノメネックス プロディジ ＯＤＳ、内径 ２１．２ｍｍ、溶離液 ２５ｍＭ ＴＥＡＡ ｐＨ ４．７中の１５〜３０％ ＣＨ３Ｃｎ、１５ｍＬ／分の流量）により、４４．５ｍｇの生成物（９９％）を得た。ｔＲ＝５〜１３分；ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２）Ｒｆ＝０．６０、蛍光性黄色スポット；ＥＳＩ−ネガティブ ｍ／ｚ ４４８（Ｍ−Ｈ＋、Ｃ２４Ｈ１２Ｆ２ＮＯ６ −なら４４８となる）。
スクシンイミジルエステルを含む任意のレポーター分子は、本願明細書に記載する方法を用いてアルキン修飾できると想定される。さらなる非限定的な例を以下に提示する。
Figure 2010517594
アルキニル−ＰＥＧ−ビオチン
室温のＤＭＦ（０．１ｍＬ）中のＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（ピアース、２５ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）の溶液にプロパルギルアミン（０．３ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を加えた。３時間撹拌した後、この溶液を真空中で濃縮し、トルエンから２回再エバポレートした。ＨＰＬＣ（フェノメネックス プロディジ ＯＤＳ、内径 ２１．２ｍｍ、溶離液 ２５ｍＭ ＮＨ４Ａｃ、ｐＨ６．５中の３５〜５０％ ＭｅＯＨ、１５ｍＬ／分の流量）により１４．４ｍｇ（６４％、白色固体）を得た。ｔＲ＝２６〜３０分；ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、７：１）Ｒｆ＝０．２０、ＵＶ活性スポット；ＥＳＩ ｍ／ｚ ５２９（Ｍ＋Ｈ＋、Ｃ２４Ｈ４０Ｎ４Ｏ７Ｓなら５２９となる）。
Figure 2010517594
５−ＴＡＭＲＡ−アルキン
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の５−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステル（５−ＴＡＭＲＡ−ＳＥ、０．１０ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、プロパルギルアミン（２５μＬ、０．３８ｍｍｏｌ）およびＨ２Ｏ（０．５ｍＬ）を加えた。この溶液を室温で３０分間撹拌した後、真空中で濃縮した。ＨＰＬＣ（フェノメネックス プロディジ ＯＤＳ、内径 ２１．２ｍｍ、溶離液 ２５ｍＭ ＴＥＡＡ、ｐＨ ４．７中の２５〜４０％ ＣＨ３ＣＮ、１５ｍＬ／分の流量）により６８ｍｇの生成物（８２％、赤紫色の固体）を得た。ｔＲ＝２３〜３３分；ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２） Ｒｆ＝０．６７、蛍光性橙色スポット；ＥＳＩ ｍ／ｚ ４６９（Ｍ＋Ｈ＋、Ｃ２８Ｈ２６Ｎ３Ｏ４なら４６９となる）。
Figure 2010517594
オレゴングリーン（登録商標）４８８−アルキン
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のオレゴングリーン（登録商標）４８８カルボン酸、スクシンイミジルエステル（５０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）の溶液に、プロパルギルアミン（０．２６μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＨ２Ｏ（０．１ｍＬ）を加えた。室温で１５分間撹拌した後、この溶液を濃縮した。ＨＰＬＣ（フェノメネックス プロディジ ＯＤＳ、内径 ２１．２ｍｍ、溶離液 ２５ｍＭ ＴＥＡＡ ｐＨ ４．７中の１５〜３０％ ＣＨ３Ｃｎ、１５ｍＬ／分の流量）により、４４．５ｍｇの生成物（９９％）を得た。ｔＲ＝５〜１３分；ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２） Ｒｆ＝０．６０、蛍光性黄色スポット；ＥＳＩ−ネガティブ ｍ／ｚ ４４８（Ｍ−Ｈ＋、Ｃ２４Ｈ１２Ｆ２ＮＯ６ −なら４４８となる）。
Figure 2010517594
アレクサフルオル（登録商標）５３２−アルキン
ＤＭＦ（４．０ｍＬ）中のアレクサフルオル（登録商標）５３２カルボン酸、スクシンイミジルエステル（５１ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の溶液にプロパルギルアミン（０．１ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１．０ｍＬ）を加えた。この溶液を室温で１時間撹拌し、次いで真空中で濃縮し、粗生成物を得た。ＨＰＬＣ（フェノメネックス プロディジ ＯＤＳ、内径 ２１．２ｍｍ、溶離液 ２５ｍＭ ＮＨ４Ａｃ、ｐＨ ４．７中の２５〜４０％ ＣＨ３ＣＮ、１５ｍＬ／分の流量）により３０ｍｇの生成物（６５％、赤色固体）を得た。ｔＲ＝２３〜３０分；ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、１：１）Ｒｆ＝０．５８、蛍光性赤色スポット；ＥＳＩ ｍ／ｚ ６６４（Ｍ＋、Ｃ３３Ｈ３４Ｎ３Ｏ８Ｓ２なら６６４となる）。
Figure 2010517594
アレクサフルオル（登録商標）４８８−アルキン
ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中のアレクサフルオル（登録商標）４８８カルボン酸、スクシンイミジルエステル、ジリチウム塩、混合異性体（５１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液に、プロパルギルアミン（５４μＬ、０．８０ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で４時間撹拌し、次いで真空中で濃縮した。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、８：２）によって精製し、２０ｍｇ（４４％、橙色固体）を得た。ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ、３：１） Ｒｆ＝０．６８；ＥＳＩ−ネガティブ ｍ／ｚ ５７０（Ｍ−２、Ｃ２４Ｈ１６Ｎ３Ｏ１０Ｓ２ ２−なら５７０となる）。
実施例３２：トリアリールホスフィン色素
スキーム４
Figure 2010517594
５−ＴＡＭＲＡ−トリアリールホスフィン
ＣＨ２Ｃｌ２（１．０ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−トリアリールホスフィン−アミン（合成についてはスキーム２を参照、１０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）の溶液にＴＦＡ（０．５ｍＬ）を加えた。この反応溶液を室温で３０分間撹拌し、真空中で濃縮し、トルエンから２回再エバポレートした。粗生成物アミン（０．０１８ｍｍｏｌ、９９％）を、それ以上精製することなく次の反応で直接使用した。
ＤＭＦ（０．２ｍＬ）およびＤＩＥＡ（１２μＬ、０．０８９ｍｍｏｌ）中のトリアリールホスフィン−アミン（０．０１８ｍｍｏｌ）の溶液に、５−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステル（５−ＴＡＭＲＡ−ＳＥ、９ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で２．５時間撹拌した後、真空中で濃縮した。ＨＰＬＣ（フェノメネックス ルナ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ）Ｃ１８（２）、内径 １０ｍｍ、溶離液 ２５ｍＭ ＮＨ４Ａｃ、ｐＨ＝７中の４０〜５５％ ＣＨ３ＣＮ、５．０ｍＬ／分の流量）により、４．１ｍｇの生成物（２７％）を得た。ｔＲ＝３２〜３４分；ＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３、１：９） Ｒｆ＝０．６７、蛍光性桃色スポット；ＥＳＩ ｍ／ｚ ８４８（Ｍ＋Ｈ＋、Ｃ５０Ｈ４８Ｎ４Ｏ７Ｐなら８４８となる）。
実施例３３：
ガラススライドなどの固体シリカガラス表面を、アルキル（トリアルコキシ）シランをガラスに共有結合で結合させるための標準的な条件を使用して、３−アジドプロピル（トリエトキシ）シランで誘導体化した。残留した標識試薬を徹底的にリンスし、アジド誘導体化したガラスを抑制した光の下で保存した。このアジド官能化ガラス表面を、水または有機溶媒（メタノールなど）中で、過剰のアセチレン官能化パートナー（低分子、色素、ペプチド、タンパク質、酵素、および核酸など）とともに、暗所で、過剰のＢＣＳおよびＣｕ（Ｉ）（これは、硫酸銅およびアスコルビン酸ナトリウムからその場で形成させた）の存在下において１〜２日間インキュベートした。この誘導体化したガラス表面を、水で徹底的にリンスし、結合したパートナーの寿命を最適化するために、乾燥させた状態あるいは溶液に懸濁させた状態で冷所に保存した。
Figure 2010517594
実施例３４：
ガラススライドなどの固体シリカガラス表面を、アルキル（トリアルコキシ）シランをガラスに共有結合で結合するための標準的な条件を使用して、３−アルキニルプロピル（トリエトキシ）シランで誘導体化した。残留した標識試薬を徹底的にリンスし、アルキン誘導体化したガラスを冷所で保存した。このアルキン官能化ガラス表面を、水または有機溶媒（メタノールなど）中で、過剰のアジド官能化パートナー（低分子、色素、ペプチド、タンパク質、酵素、および核酸など）とともに、暗所で、過剰のＢＣＳおよびＣｕ（Ｉ）（これは、硫酸銅およびアスコルビン酸ナトリウムからその場で形成させた）の存在下において１〜２日間インキュベートした。この誘導体化したガラス表面を、水で徹底的にリンスし、結合したパートナーの寿命を最適化するために、乾燥させた状態あるいは溶液に懸濁させた状態で冷所に保存した。
Figure 2010517594
実施例３５：電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
このアッセイは、所与のｄｓまたはｓｓのＤＮＡ／ＲＮＡ分子上のタンパク質結合部位の特異性の測定および同定に使用する。現在、この手法には放射性標識されたＤＮＡが使用されるが、これは骨の折れるうんざりする作業であり、かつ高いレベルの安全性を必要とする。ＤＮＡ標識におけるクリック化学の出現で、同じ手法が非常に容易かつ便利に実施できる。
５’ Ｅ−ｄＵＭＰおよびエンドユーザーが注目するそれに続く配列を有するｓｓまたはｄｓの核酸オリゴは、例えば、ＩＤＴまたはインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはシグマ（Ｓｉｇｍａ）が合成できる。このオリゴは、アジドフルオルフォア（Ｆｌｕｏｒｐｈｏｒｅ）を用いて標識でき、さらに注目するタンパク質への結合、次いでＰＡＧＥおよびＥＭＳＡに使用できる。あるいは、そのタンパク質が結合するＤＮＡの推定配列は、ただ１つのアジドまたはアルキンヌクレオチドを有するように設計できる。タンパク質がその配列に結合する場合は、アジド色素またはタグへの接近がブロックされ、標識をもたらさないであろう。タンパク質がその配列に結合しないのであれば、ＤＮＡは、クリック反応で直ちに標識され、明快な結果を与えるであろう。
実施例３６：ＰＣＲによるクリック標識
反応を以下のように設定した。
２×ＳＹＢＲグリーナーマスターミックスを使用した。市販の混合物（Ｔａｑポリメラーゼ、緩衝液、ＭｇＣｌ２、ＳＹＢＲグリーナー色素）と同じ成分を用いたがｄＮＴＰおよびパッシブリファレンス（ｐａｓｓｉｖｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）色素ＲＯＸを用いずにそれを調製した。この反応液混合物を以下の表に従って調製した。
Figure 2010517594
使用した鋳型は、以下に示すヒトＢアクチンＣＤＳを有するプラスミドの５０，０００，０００（５Ｅ７）個のコピーを含有するインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｑＰＣＲ標品、であった。この試料を３回繰り返して実行した。プライマーの位置を図１６に示す。予測通りの単位複製配列サイズ２９３ｂｐを与えた。
サイクル条件は以下のとおりであった：
初期変性およびＴａｑの活性化：
９５Ｃ １０分間
増幅：
１）９５Ｃ １５秒
２）６０Ｃ ３０秒、蛍光をこの工程の最後に捕捉、
４５サイクルを繰り返した。
融解曲線：
単位複製配列を、５５Ｃから９５Ｃへ２Ｃ／分のステップで加熱し、蛍光を各ステップで捕捉した。ＳＢＲグリーンおよびＲＯＸバンド通過フィルターを使用して、蛍光をＭＸ３０００Ｐ機（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））で測定した。
結果：
データを図１１および図１２に示す。図１１に示した直線的な増幅プロットは、クリック修飾ｄＵＴＰ混合物の指数関数的増幅または閾値サイクル（ＣＴ）の開始が、非修飾ｄＵＴＰ混合物について示したプロットと非常に類似していることを示している。クリックｄＵＴＰの平均ＣＴは、非修飾ｄＵＴＰの１０．９７に対して９．７８である。
図１２の融解曲線のデータは、オリゴヌクレオチドのＴｍを高めるための方法として、クリック修飾ヌクレオチドのための適用の可能性を示唆する。例えば、Ａ−Ｔリッチな領域のＰＣＲプライマーを設計する場合、この修飾は、プライマーのＴｍを上昇させるのに使用することができ、その結果、より長いプライマーと同じ融解温度を示すより短いプライマーを作製することができる。
より高いＴｍは、ランダムプライミングを介してｃＤＮＡライブラリを生成するのに使用することができる。通常、ランダムな６〜８量体が使用される。これらは、もともとは非常に低いＴｍを有するであろう。しかしながら、このクリック修飾ランダムプライマーは、より優れた特異性のためにより高い温度で使用することが可能であろう。研究者らは、ランダムプライミング中により長くかつより特異的な読み取りを得るために８量体を使用しているが、上記クリック修飾オリゴは、より長いオリゴを求めることなく高められた特異性を提供することができるであろう。従って、短いオリゴを使用する利点（より多いマッチ）を、高められたハイブリダイゼーション安定性と組み合わせることができる。
実施例３７：リアルタイムＰＣＲ生成物の標識
リアルタイムＰＣＲ実験からの生成物を、「クリック」条件の存在下で、アジド−ＴＡＭＲＡを用いて直接的または間接的に標識した（ＰＣＲ生成物は、クリックに先立ちインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＰＣＲ精製キットを用いて精製した）。この標識反応液は、２５％ プロピレングリコール；２ｍＭ 銅（ＩＩ）；１０ｍＭ ＢＣＳ、１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムおよび５０μＭ アジド−ＴＡＭＲＡの最終濃度で構成されていた。この反応を室温で６０分間実施した。これに続いて、３Ｍ 酢酸ナトリウム、担体としてのグルカゴンおよび１００％ エタノールを用いてＤＮＡを沈殿させた。最終のＤＮＡペレットを７０％ エタノールで２回洗浄した。次いで、このペレットを５０μｌの１０ｍＭ ＴＥ緩衝液 ｐＨ ８．０に溶解させた。このＤＮＡ溶液を、ＤＮＡペレットの溶解を高めるために加温した。２７μｌのこの溶液を３μｌの１０×ブルージュースローディング緩衝液（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と混合した。６μｌの試料を、４〜２０％ ＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲルに充填した。このゲルを１０Ｖで１０分間、１９０Ｖで９０分間流した。このゲルをカセットから取り出し、ＴＡＭＲＡ（励起：５３０ｎｍ、発光：５８０ｎｍ）について走査した。これを図１３の左図として示す。次いで同じゲルをＳＹＢＲ ＧＯＬＤで３０分間染色し、上記のように走査した。これを図１３の右図に示す。レーン１およびレーン２は、エチニルｄＵＴＰおよび他のｄＮＴＰを用いて生成したＰＣＲ生成物である。Ｌは２５ｂｐ ラダーＤＮＡマーカーである。矢印は、約３００ｂｐの標識された生成物を指している。図１３はまた、シグナルの消光がないことを示す。
実施例３８：無ＰＣＲテロメラーゼアッセイ
ＴＲＡＰｅｚｅＴＭ テロメラーゼアッセイ ケミコンキット Ｓ７７００。この実験を、図２２に総括した。
３つの異なる反応変数の各々について２５０μｌの反応混合物（５×）を、以下のように構成した。２５μｌの１０×Ｔｒａｐ緩衝液を、５０μＭのｅ−ｄＮＴＰ（５０μＭのエチニルｄＵＴＰ＋５０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ）、および３４４ｎＭのＴＳプライマーまたはビオチン化ＴＳプライマーのいずれかと混合した。５μｌのプライマー混合物は、ＴＲＡＰｅｚｅテロメラーゼキット、ケミコン由来の３種の別個のプライマー：Ｋ１順方向プライマー、ＲＰ逆方向プライマーおよびＴＳＫ １内部標準プライマーを含有する。テロメラーゼの供給源は、ケミコン ＴＲＡＰｅｚｅ（商標）テロメラーゼアッセイキットとともに供給された１０００個の陽性対照細胞であった。Ｓａｕ３細胞を陰性対照として使用した。これは、Ｓａｕ３細胞がテロメラーゼ酵素をまったく発現しないからである。この３つの反応液の各々は、１０単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼも含有していた。１×ＴＲＡＰ反応緩衝液（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３、１．５ ＭｇＣｌ２ ６３ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％ ツイーン２０、１ｍＭ ＥＧＴＡ）。
この３つの異なる反応は、（ａ）＋ｖｅ対照細胞を伴うＴＳプライマー、（ｂ）＋ｖｅ対照細胞を伴うビオチン化ＴＳプライマー、（ｃ）Ｓａｕ３細胞を伴うビオチン化プライマーに基づいていた。
これら３種の反応液を設定した後、この反応液の各々の１／５の体積を、これまでに考察したＰＣＲ支援テロメラーゼアッセイに供した。この３種の反応液の各々の残りの４／５の体積を、３００Ｃで３０分間インキュベートし、次いで９５０Ｃで１０分間加熱した。上記のフローチャートに示したように、３種の反応液の各々の半分を、サイズ排除「クロマスピン（Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ）」カラムを用いて精製した。次いで溶出液を、２５％ プロピレングリコール；２ｍＭ 銅（ＩＩ）；１０ｍＭ ＢＣＳ、１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムおよび５０μＭ アジド−ＴＡＭＲＡの最終濃度を用いるクリック反応に供した。この反応を室温で３０分間実施した。これに続いて、上記のように、サイズ排除上で精製した。ＴＡＭＲＡ標識したｄｓＤＮＡ（ＰＣＲ支援テロメラーゼ生成物）またはｓｓＤＮＡ（無ＰＣＲテロメラーゼ生成物）を、バイオダイン（Ｂｉｏｄｙｎｅ）プラス核酸結合膜上にブロットした。この膜を、ＴＡＭＲＡシグナルについて走査した。
上記３種の反応液の他の半分を、２５μｌのストレプトアビジンをコーティングしたポリスチレンビーズ（スフェロテック（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｋ））とともにインキュベートし、４０Ｃで一晩インキュベートした。このビーズを、５０ｍＭのトリス ｐＨ８．０で５回洗浄した。クリック化学を、上記とまったく同じ反応組成および条件を用いて、上記ビーズに結合したオリゴ上で実施した。インキュベーション後、標識したビーズを、５０ｍＭのトリス ｐＨ８．０で５回洗浄した。このビーズを、スピードバック（ｓｐｅｅｄ ｖａｃ）中で半ば乾燥し、ＴＡＭＲＡについて走査した。
図１４に示すように、ビオチン化ＴＳプライマーでコーティングしたビーズを含むチューブは、ＴＡＭＲＡについてシグナルを示し、他方、ＴＳプライマーまたは陰性対照細胞のいずれかを有するチューブは、シグナルを示さなかった。
加えて、図１５に示すように、ＰＣＲ支援＋ｖｅ対照およびＴＳビオチン化プライマー上のスポットはバイオダイン核酸膜上でＴＡＭＲＡシグナルを示した。ＰＣＲ陽性対照由来のシグナル強度は、無ＰＣＲテロメラーゼアッセイよりもはるかに大きい。
実施例３９：ヌクレオチド類似体を用いるタグ化リンタンパク質
リンタンパク質は、アルキンまたはアジドタグ化ヌクレオチドを用いて、生体内または生体外で標識され、これによってアジドまたはアルキン部分がγ−リン酸上に置かれる。例えば、以下に示すヌクレオチドのうちの１つが、タンパク質キナーゼおよびキナーゼ標的分子を含有する反応混合物に加えられる。タグ化後、この分子は、定量化、視覚化、または富化のため、適切なアルキンもしくはアジド検出または親和性試薬との反応に供される。一例としての反応では、修飾ヌクレオチド基質は、タグ化γ−リン酸分子を細胞の高分子（タンパク質を含む）に代謝によって組み込むために、培養した細胞に直接加てもよい。このプロセスは、リン酸化の動力学の変化を検出するために、薬理作用のある物質で細胞を処理する工程を含んでもよい。生きた培養細胞へのかかる化合物の投入は、透過性をもたらす官能基でヌクレオチドを修飾することにより、または細胞透過剤（ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の同時添加によって、高めることができるであろう。別の例としての反応では、このキナーゼ反応は、細胞抽出物をキナーゼおよび基質の供給源として使用して、生体外で実施することができるであろう。この修飾ヌクレオチドは、反応混合物に加えられ、その反応混合物は、注目する薬理作用のある物質を添加するかまたはそれを添加しないでインキュベートされる。生体外の反応は、必要に応じて、外因性キナーゼまたは基質供給源をヌクレオチド類似体とともに細胞抽出物に添加することを伴う。別の適用では、この方法は、精製したキナーゼおよびキナーゼ基質を用いて、細胞抽出物なしに生体外で使用される。開示された例のすべてにおいて、反応混合物は、注目する特定のキナーゼのために最適化された緩衝液、キナーゼ供給源、金属イオン供給源、グリセロール、ヌクレオチドＡＴＰ類似体、およびＡＴＰを含んでいてもよい。アルキンプローブを用いるこの「クリック」検出反応は、銅（Ｉ）、もしくは銅（ＩＩ）還元剤の存在下での銅（ＩＩ）、銅（Ｉ）キレート剤、および最適のｐＨ条件を維持するための適切な緩衝液の存在下で実施されてもよい。
Figure 2010517594
Figure 2010517594
上記実施例で用いた試薬は、市販されているか、または当該技術分野で公知の市販されている計装設備、方法、または試薬を使用して調製することができる。上記の実施例は、本発明および本発明の方法の実施の種々の態様を例証する。この実施例は、本発明の多くの異なる実施形態を全て記載している訳ではない。従って、上記の発明を理解を明快にするために図示および実施例によっていくらか詳細に説明してきたが、当業者は、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、多くの変更および修正をなすことができることを直ちに理解するであろう。
本願明細書において引用された参考文献の各々は、参照によって、あたかもそれが本願明細書において完全に示されたかの如くに、本願明細書に援用される。

Claims (34)

  1. 核酸コンジュゲートを形成する方法であって、
    ａ）ＤＮＡ増幅酵素の存在下で、アジド修飾ヌクレオチドヌクレオチドを少なくとも１種の他のヌクレオチドと接触させることにより、前記アジド修飾ヌクレオチドを核酸ポリマーに組み込み、アジド修飾核酸ポリマーを形成する工程、および
    ｂ）前記アジド修飾核酸ポリマーを、活性化もしくは末端アルキンまたはホスフィン部分を含む、レポーター分子、担体分子または固体支持体と接触させて、核酸ポリマー−レポーター分子、担体分子、固体支持体コンジュゲートを形成する工程
    を含む、方法。
  2. 核酸コンジュゲートを形成する方法であって、
    ａ）ＤＮＡ増幅酵素の存在下で、末端アルキン修飾ヌクレオチドヌクレオチドを少なくとも１種の他のヌクレオチドと接触させることにより、前記末端アルキン修飾ヌクレオチドを核酸ポリマーに組み込み、末端アルキン修飾核酸ポリマーを形成する工程、および
    ｂ）前記末端アルキン修飾核酸ポリマーを、アジド部分を含む、レポーター分子、担体分子または固体支持体と接触させて、核酸ポリマー−レポーター分子、担体分子、固体支持体コンジュゲートを形成する工程
    を含む、方法。
  3. 核酸コンジュゲートを形成する方法であって、
    ａ）ＤＮＡ増幅酵素の存在下で、ホスフィン修飾ヌクレオチドヌクレオチドを少なくとも１種の他のヌクレオチドと接触させることにより、前記ホスフィン修飾ヌクレオチドを核酸ポリマーに組み込み、ホスフィン修飾核酸ポリマーを形成する工程、および
    ｂ）前記ホスフィン修飾核酸ポリマーを、アジド部分を含む、レポーター分子、担体分子または固体支持体と接触させて、核酸ポリマー−レポーター分子、担体分子、固体支持体コンジュゲートを形成する工程
    を含む、方法。
  4. アジド、アルキンまたはホスフィン修飾核酸ポリマーを作製する方法であって、
    核酸増幅酵素の存在下で、少なくとも１種のアジド、アルキンまたはホスフィン修飾ヌクレオチドをインキュベートして、アジド、アルキンまたはホスフィン修飾核酸ポリマーを形成する工程
    を含む、方法。
  5. 前記核酸酵素がＤＮＡポリメラーゼである、請求項４記載の方法。
  6. 前記核酸酵素がＲＮＡポリメラーゼである、請求項４記載の方法。
  7. 前記アジド、アルキンまたはホスフィン修飾核酸ポリマーの融解温度が高められる、請求項４記載の方法。
  8. 前記レポーター分子が、キサンテン、シアニン、クマリン、ボラポリアザインダセンまたはピレン色素である、請求項１記載の方法。
  9. 前記レポーター分子が酵素基質またはハプテンである、請求項１記載の方法。
  10. 前記担体分子が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖類、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、ソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、合成ポリマー、ポリマー微粒子、生物細胞またはウイルスである、請求項１記載の方法。
  11. 前記担体分子が、抗体もしくはその断片、アビジンもしくはストレプトアビジン、ビオチン、血液成分タンパク質、デキストラン、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、ＩｇＧ結合タンパク質、蛍光タンパク質、増殖因子、レクチン、リポ多糖、微生物、金属結合タンパク質、金属キレート化部分、非生物微粒子、ペプチド毒素、ホスファチジルセリン−結合タンパク質、構造タンパク質、低分子薬物、またはチラミドを含む、請求項１記載の方法。
  12. 前記固体支持体が、微小流体チップ、シリコンチップ、顕微鏡スライド、マイクロプレートウェル、シリカゲル、ポリマー膜、粒子、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、多糖類、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、ラテックスビーズ、電磁ビーズ、常磁性ビーズ、または超常磁性ビーズである、請求項１記載の方法。
  13. 前記固体支持体が、セファロース、ポリ（アクリレート）、ポリスチレン、ポリ（アクリルアミド）、ポリオール、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、デンプン、ＦＩＣＯＬＬ、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロースまたはデンプンである、請求項１記載の方法。
  14. アジド修飾核酸ポリマーを検出する方法であって、
    ａ）末端アルキン部分を含むレポーター分子と、
    アジド修飾核酸ポリマーと
    を含むアジド−アルキン環化付加反応混合物を形成する工程、
    ｂ）前記アジド−アルキン環化付加反応混合物を、十分な時間量の間インキュベートして、核酸ポリマー−レポーター分子コンジュゲートを形成する工程、
    ｃ）前記核酸ポリマー−レポーターコンジュゲートを、核酸ポリマー−レポーター−レポーター分子コンジュゲートの大きさおよび／または重量によって分離して、分離された核酸ポリマー−レポーター−レポーター分子コンジュゲートを形成する工程、
    ｄ）前記分離された核酸ポリマー−レポーター−レポーター分子コンジュゲートを、適切な波長で照射して、照射された核酸ポリマー−レポーター−レポーター分子コンジュゲートを形成する工程、
    ｅ）前記照射された核酸ポリマー−レポーター−レポーター分子コンジュゲートを観察する工程であって、ここで前記核酸ポリマーが検出される工程
    を含む、方法。
  15. 前記工程ａ）が、
    ａ．銅イオンと、
    ｂ．少なくとも１種の還元剤と、
    ｃ．銅キレート剤と
    をさらに含む、請求項１４記載の方法。
  16. 前記レポーター分子が、キサンテン、シアニン、クマリン、ボラポリアザインダセンまたはピレン色素である、請求項１４記載の方法。
  17. 前記レポーター分子が、酵素基質、蛍光タンパク質またはハプテンである、請求項１４記載の方法。
  18. 前記銅キレート剤が銅（Ｉ）キレート剤である、請求項１５記載の方法。
  19. 前記銅キレート剤が、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）、ＥＤＴＡ、ネオクプロイン、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、ピリジン−２，６−ジカルボン酸（ＰＤＡ）、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システイン（ＳＣＭＣ）、１，１０フェナントロリン、もしくはその誘導体、トリエンチン、グルタチオン、ヒスタジン（ｈｉｓｔａｄｉｎｅ）、ポリヒスタジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔａｄｉｎｅ）またはテトラエチレンポリアミン（ＴＥＰＡ）である、請求項１５記載の方法。
  20. 前記銅キレート剤が、１，１０フェナントロリン、バソフェナントロリンジスルホン酸（４，７オジフェニル（ｏｄｉｐｈｅｎｙｌ）−１，１０−フェナントロリンジスルホン酸）またはバソキュプロインジスルホン酸（２，９−ジメチル−４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホネート）である、請求項１５記載の方法。
  21. 前記還元剤が、アスコルベート、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ＴＣＰ（２，４，６−トリクロロフェノール）、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオサルフェート、２−メルカプトエタノール、ジチオトレオトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｏｔｏｌ）、グルタチオン、システイン、金属銅、キノン、ヒドロキノン、ビタミンＫ１、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、または印加電位である、請求項１５記載の方法。
  22. 前記還元剤がアスコルベートである、請求項１５記載の方法。
  23. 前記分離する工程が、クロマトグラフィまたは電気泳動を含む、請求項１４記載の方法。
  24. 前記クロマトグラフィが、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、またはアフィニティークロマトグラフィのうちの１つ以上を含む、請求項２３記載の方法。
  25. 前記電気泳動が、ゲル電気泳動、一次元（１Ｄ）ゲル電気泳動、二次元（２Ｄ）ゲル電気泳動、未変性ゲル電気泳動、変性ゲル電気泳動、等電点電気泳動、またはキャピラリー電気泳動を含む、請求項２３記載の方法。
  26. 末端アルキン部分を含むレポーター分子、
    アジド修飾核酸、
    銅イオン、
    少なくとも１種の還元剤、および
    銅キレート剤
    を含む、アジド−アルキン環化付加反応混合物。
  27. 固定化されたアジド修飾核酸を検出する方法であって、
    ａ）前記アジド修飾核酸を、固体または半固体マトリクスに固定化して、固定化されたアジド修飾核酸を形成する工程、
    ｂ）前記固定化されたアジド修飾核酸を、アジド反応性基を含有するレポーター分子と接触させて、接触されたアジド修飾核酸を形成する工程、
    ｃ）前記接触されたアジド修飾核酸を、十分な量の時間インキュベートして、レポーター分子−核酸コンジュゲートを形成する工程、
    ｄ）前記レポーター分子−核酸コンジュゲートを、適切な波長で照射して、照射されたレポーター分子−核酸コンジュゲートを形成する工程、
    ｅ）前記照射されたレポーター分子−核酸コンジュゲートを観察する工程であって、それにより前記固定化されたアジド修飾核酸が検出される工程
    を含む、方法。
  28. 固定化されたアルキン修飾核酸を検出する方法であって、
    ａ）前記アルキン修飾核酸を、固体または半固体マトリクスに固定化して、固定化されたアルキン修飾核酸を形成する工程、
    ｆ）前記固定化されたアルキン修飾核酸を、アジド基を含有するレポーター分子と接触させて、接触されたアルキン修飾核酸を形成する工程、
    ｇ）前記接触されたアルキン修飾核酸を、十分な量の時間インキュベートして、レポーター分子−核酸コンジュゲートを形成する工程、
    ｈ）前記レポーター分子−核酸コンジュゲートを、適切な波長で照射して、照射されたレポーター分子−核酸コンジュゲートを形成する工程、
    ｉ）前記照射されたレポーター分子−核酸コンジュゲートを観察する工程であって、それにより前記固定化されたアルキン修飾核酸が検出される工程
    を含む、方法。
  29. 前記固体または半固体支持体が、スライド、アレイ、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、ヒドロゲル、ポリマー粒子またはガラスである、請求項２８記載の方法。
  30. アジドまたはアルキン−ｄＵＴＰと、
    テロメラーゼ酵素と、
    アジドもしくはアルキン反応性レポーター分子、担体分子または固体支持体と
    を含む、キット。
  31. アジド、アルキンまたはホスフィン部分を含む少なくとも１種のヌクレオチド類似体と、
    アジド、アルキンもしくはホスフィン部分を含む、レポーター分子、担体分子または固体支持体と
    を含む、核酸ポリマーを標識するためのキット。
  32. 核酸増幅酵素をさらに含む、請求項３１記載のキット。
  33. テロメラーゼ酵素活性を測定する方法であって、
    ａ）細胞を、有効量の、アジド基を含むｄＮＴＰヌクレオチドおよびテロメラーゼ酵素と接触させ、前記ｄＮＴＰヌクレオチドが少なくとも１種の核酸ポリマーに組み込まれるようにする工程、
    ｂ）前記核酸ポリマーを、アルキンまたはホスフィン部分を含むレポーター分子と接触させ、アジド修飾核酸ポリマーレポーター分子コンジュゲートを形成する工程、
    ｃ）前記アジド修飾核酸ポリマーレポーター分子コンジュゲートを、レポーター分子を含まない核酸ポリマーから分離する工程、ならびに
    ｄ）前記アジド修飾核酸ポリマーレポーター分子コンジュゲートを照射して、テロメラーゼ活性を決定する工程
    を含む、方法。
  34. テロメラーゼ酵素活性を測定する方法であって、
    ａ）細胞を、有効量の、アルキンまたはホスフィン基を含むｄＮＴＰヌクレオチドおよびテロメラーゼ酵素と接触させ、前記ｄＮＴＰヌクレオチドが少なくとも１種の核酸ポリマーに組み込まれるようにする工程、
    ｂ）前記核酸ポリマーを、アジド部分を含むレポーター分子と接触させ、アルキンまたはホスフィン修飾核酸ポリマーレポーター分子コンジュゲートを形成する工程、
    ｃ）前記アルキンまたはホスフィン修飾核酸ポリマーレポーター分子コンジュゲートを、レポーター分子を含まない核酸ポリマーから分離する工程、ならびに
    ｄ）前記アルキンまたはホスフィン修飾核酸ポリマーレポーター分子コンジュゲートを照射して、テロメラーゼ活性を決定する工程
    を含む、方法。
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