CN107823708A - 一种在含有炔基的生物材料表面构建生物活性凝胶膜层的方法 - Google Patents

一种在含有炔基的生物材料表面构建生物活性凝胶膜层的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于组织工程的技术领域，公开了一种在含有炔基的生物材料表面构建生物活性凝胶膜层的方法。方法为：(1)将含有炔基的高分子材料与含有叠氮基的生物活性大分子反应，得到键合有生物活性大分子的高分子材料；(2)将含有炔基的生物活性大分子与键合有生物活性大分子的高分子材料反应，得到键合有活性层的高分子材料；(3)重复步骤(1)或重复步骤(1)～(2)，获得表面键合有不同厚度活性层的高分子材料；(4)将含有叠氮基或炔基的小分子与步骤(3)的高分子材料反应，得到产物。本发明的方法简单、灵活高效，反应条件温和，可以控制生物活性层的厚度，对材料形态结构没有限制，适用范围广，生物活性层与高分子材料结合稳固。

Description

一种在含有炔基的生物材料表面构建生物活性凝胶膜层的 方法
技术领域
本发明属于组织工程的技术领域，具体涉及一种在含有炔基的生物材料表面构建生物活性凝胶膜层的方法。
背景技术
组织工程支架材料作为组织工程的三大要素之一，其为组织工程细胞提供生长的三维环境。生物相容性也极其重要，一方面需要避免引发炎症或致畸反应，另一方面作为细胞的生物载体，需要赋予材料某些生物功能性，如有利于细胞的粘附，为组织修复提供良好的环境等。目前，许多组织工程支架用高分子材料本身缺乏生物活性，不能发挥良好的修复、替代或治疗的作用。由于单一的材料不能很好的满足应用需求，利用现有高分子材料与生物相容性好的天然生物材料进行复合，不仅能克服高分子材料生物活性差的缺点，其良好的机械性能又弥补了天然生物材料的不足，成为组织工程支架材料研究和发展中非常活跃的方向。
理想的支架还需具备较高的孔隙率和比表面积以适于细胞的增殖和生长。采用FDM熔融沉积制造技术、SLS选择性激光烧结技术、静电纺丝技术以及3D打印技术，以及溶剂浇铸法、粒子沥滤法、气体发泡法、纤维网格粘结法、相分离法、熔融成形法、溶液浇铸法和冷冻干燥法等制备三维支架的方法，能够获得不同支架孔径大小，孔隙率的三维支架材料。
由于多孔支架材料结构的复杂性，支架内部材料表面通常只能采用物理吸附的方式进行表面改性，改性分子通过范德华力和表面结合，结合力弱，且容易从表面脱吸附，改性效果差。缺乏一种在支架内部材料表面改性的方法，使改性分子与表面能通过化学键结合在一起。
本发明巧妙利用了点击化学的特点，通过重复的化学点击反应，使得生物材料在水相中以温和的条件在界面发生快速高效的反应，从而得到表面复合生物活性凝胶膜层。水相反应可以保证任何结构的材料内部得到均匀地表面复合，且这种化学键合稳定可靠。同时利用点击化学的灵活性，还可以实现在凝胶层中引入特定结构的生物活性小分子的目标。此外，水凝胶的灵活可控性，甚至可以对生物活性分子的空间及数量进行精准调控。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种在含有炔基的生物材料表面构建生物活性凝胶膜层的方法。本发明通过化学键合的方式在生物材料表面均匀复合生物活性层(凝胶膜层)，所述生物活性层稳定牢固地键合在生物材料表面，并且键合有生物活性层的生物材料结构稳定，生物活性层的引入极大改善生物材料的性能。本发明的方法简单、灵活高效，反应条件温和，可以控制生物活性层(凝胶膜层)的厚度，对材料形态结构没有限制，适用范围广，为组织工程领域复杂结构材料稳固的生物活性改性提供可能。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种在含有炔基的生物材料表面构建生物活性凝胶膜层的方法，包括以下步骤：
(1)在惰性氛围和溶剂中，将含有炔基的高分子材料与含有叠氮基的生物活性大分子通过催化剂的作用进行反应，洗涤，干燥，得到键合有生物活性大分子的高分子材料；叠氮基的摩尔含量≥炔基的摩尔含量，优选叠氮基的摩尔含量＞炔基的摩尔含量；
(2)在惰性氛围和溶剂中，将含有炔基的生物活性大分子与步骤(1)中键合有生物活性大分子的高分子材料通过催化剂的作用进行反应，洗涤，干燥，得到键合有活性层的高分子材料；含有炔基的生物活性大分子中炔基的含量≥
步骤(1)中键合有生物活性大分子的高分子材料中叠氮基的含量，优选炔基含量＞叠氮基的含量；
(3)重复步骤(1)或重复步骤(1)～(2)，键合有活性层的高分子材料表面继续键合有生物活性层，从而获得表面键合有不同厚度活性层的高分子材料；
(4)在惰性氛围和溶剂中，将含有叠氮基或炔基的小分子与步骤(3)中获得的高分子材料在催化剂的作用下进行反应，洗涤，干燥，得到键合有生物活性凝胶膜层的高分子材料；当步骤(3)中获得的高分子材料含有叠氮基时，选用含有炔基的小分子进行反应；当步骤(3)中获得的高分子材料含有炔基时，选用含有叠氮基的小分子进行反应。
在步骤(1)～(4)中，为了使后一步反应顺利进行，前一步反应中高分子材料修饰的炔基或叠氮基含量小于生物活性大分子修饰的叠氮基或炔基的含量，高分子材料修饰的炔基对应生物活性大分子修饰的叠氮基，高分子材料修饰的叠氮基对应生物活性大分子修饰的炔基；
所述含有叠氮基的生物活性大分子是生物活性大分子通过改性引入叠氮基的化合物；所述含有炔基的生物活性大分子是生物活性大分子通过改性引入炔基的化合物；所述含有炔基的高分子材料是指高分子材料通过改性引入炔基，然后加工成型成各种形状；所述含有炔基的小分子是将活性小分子通过改性引入炔基的化合物，通过常规的方法制备得到；所述含有叠氮基的小分子是将活性小分子通过改性引入叠氮基的化合物，通过常规的方法制备得到。这些物质也可以通过购买得到。
所述含有炔基的高分子材料为含有炔基的聚乳酸、含有炔基的聚乙醇酸、含有炔基的聚己内酯或含有炔基的聚氨酯中的一种以上，数均分子量为30000-100000；所述含有炔基的高分子材料是将高分子材料通过改性引入炔基所形成的材料，通过常规的方法制备得到。
所述含有叠氮基的生物活性大分子为含有叠氮基的明胶及其衍生物、含有叠氮基的透明质酸及其衍生生物、含有叠氮基的透明质酸钠及其衍生物、含有叠氮基的壳聚糖及其衍生物、含有叠氮基的PEG及其衍生物、含有叠氮基的PVA及其衍生物、含有叠氮基的PTMC(聚三亚甲基碳酸酯)及其衍生物、含有叠氮基的PHEMA(聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯)及其衍生物、含有叠氮基的PNIPAAm(聚N-异丙基丙烯酰胺)及其衍生物中一种以上；所述含有叠氮基的生物活性大分子还可以为由PEG、PVA、PTMC、PHEMA和/或PNIPAAm的合成单体交联而成的大分子并通过改性修饰有叠氮基的大分子；所述生物活性大分子的数均分子量为2000-100000；所述修饰有叠氮基的生物活性大分子是将生物活性大分子通过改性引入叠氮基所形成的化合物，通过常规的方法制备得到。
所述含有炔基的生物活性大分子为含有炔基的明胶及其衍生物、含有炔基的透明质酸及其衍生生物、含有炔基的透明质酸钠及其衍生物、含有炔基的壳聚糖及其衍生物、含有炔基的PEG及其衍生物、含有炔基的PVA及其衍生物、含有炔基的PTMC(聚三亚甲基碳酸酯)及其衍生物、含有炔基的PHEMA及其衍生物、含有炔基的PNIPAAm及其衍生物中一种以上；所述含有炔基的生物活性大分子还可以为由PEG、PVA、PTMC、PHEMA和/或PNIPAAm的合成单体交联而成的大分子并通过改性修饰有炔基的大分子；所述生物活性大分子的数均分子量为2000-100000；所述修饰有炔基的生物活性大分子是将生物活性大分子通过改性引入炔基所形成的化合物，通过常规的方法制备得到。
所述含有炔基的小分子为修饰有炔基的短肽或修饰有炔基的糖基药物中一种以上；优选为修饰有炔基的RGD、修饰有炔基的TGF-β1、修饰有炔基的七肽、修饰有炔基的RGDfk、修饰有炔基的cRGDfk、修饰有炔基的RGDS、修饰有炔基的HSNGLPL中一种以上；所述修饰有炔基的活性小分子是将活性小分子通过改性引入炔基的化合物，通过常规的方法制备得到，也可通过购买得到。所述活性小分子为含有氨基或羧基官能团的短肽或糖基药物。
所述含有叠氮基的小分子为修饰有叠氮基的短肽或修饰有叠氮的糖基药物中一种以上；优选为修饰有叠氮基的RGD、修饰有叠氮基的TGF-β1、修饰有叠氮基的七肽、修饰有叠氮基的RGDfk、修饰有叠氮基的cRGDfk、修饰有叠氮基的RGDS、修饰有叠氮基的HSNGLPL中一种以上；所述修饰有叠氮基的活性小分子是将活性小分子通过改性引入叠氮基的化合物，通过常规的方法制备得到，也可通过购买得到。
步骤(1)中所述含有炔基的高分子材料中炔基与含有叠氮基的生物活性大分子中叠氮基的摩尔比为(0.1～1):1。
步骤(2)中所述步骤(1)中键合有生物活性大分子的高分子材料中叠氮基与含有炔基的生物活性大分子中炔基的摩尔比为(0.1～1):1。
步骤(4)中所述含有叠氮基或炔基的小分子中叠氮基或炔基与步骤(3)中获得的高分子材料中炔基或叠氮基的摩尔比为(0.1～10):1。
步骤(1)～(4)中所述催化剂为铜线、铜粉、五水硫酸铜/抗坏血酸(钠)/硼酸或CuBr/PMDETA、五水硫酸铜/抗坏血酸钠；所述反应条件为在10～80℃反应2～48h。催化剂的用量为常规用量。所述溶剂为常规溶剂。
本发明的含有炔基的高分子材料可成型后再与含有叠氮基的化合物进行反应。所述成型可以为支架，也可以为膜，还可以为其他形状；所述支架是指通过选择性激光烧结法、静电纺丝法、3D打印技术以及溶剂浇铸法、粒子沥滤法、气体发泡法、纤维网格粘结法、阶段分离法、熔融成形法、溶液浇铸法和冷冻干燥法等方法构建组织工程多孔三维支架。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明通过化学键合的方式，将生物活性材料复合在高分子材料上，使得复合更加牢固可靠；
(2)本发明的方法不仅可以用于形状规则的高分子材料表面凝胶膜层的构建，也可用于复杂外形的高分子材料表面及三维支架内部表面凝胶层的可控构建；
(3)本发明的方法反应条件温和、高效，适用范围广，灵活性强，重复的点击反应在生物材料表面实现可控厚度的生物活性凝胶膜层的共价键合；
(4)本发明的方法中高分子材料表面凝胶层的合成具有时间和空间的可控性，甚至可以实现精确定位和图案化设计。
附图说明
图1为实施例1中含炔基的聚氨酯膜的拉曼(Raman)图谱；
图2为实施例1中键合有PEG凝胶膜层的聚氨酯膜的拉曼(Raman)图谱；
图3为实施例1中含炔基的聚氨酯膜对细胞粘附性能影响的荧光图；
图4为实施例1中键合有生物活性凝胶膜层的聚氨酯膜对细胞粘附性能影响的荧光图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)将含炔基的聚氨酯(Mn＝70000)在玻璃上成膜，质量约0.2g，得到含炔基的聚氨酯膜；
(2)将0.2g含炔基的聚氨酯膜(炔基的含量约为1mmol/g)(2eq)和0.5g修饰有叠氮基的PEG2000(叠氮的含量0.9mmol/g)(2eq)加入到10ml水中，通氮气除氧30min；称取0.002gCuBr/0.002gPMDETA(0.01eq/0.1eq)溶解在0.3ml无氧水中，得到催化剂的水溶液；将催化剂的水溶液加入到反应体系中，氮气保护下30℃反应24h，将聚氨酯膜从反应液中取出，甲醇/水(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的小分子，真空干燥，PEG凝胶膜层复合到聚氨酯材料表面，得到键合有PEG凝胶膜层的聚氨酯膜；(此步骤中含有叠氮基的生物活性大分子中叠氮基的含量满足以下条件：1mol含有叠氮基的生物活性大分子中叠氮基的含量≥2mol)；
(3)将步骤(2)中键合有PEG凝胶膜层的聚氨酯膜与0.5g修饰有炔基的PEG2000(炔基含量约0.9mmol/g)(2eq)加入到10ml水中，通氮气除氧30min；称取0.002gCuBr/0.002gPMDETA(0.01eq/0.1eq)溶解在0.3ml无氧水中，将催化剂的水溶液加入到反应体系中，氮气保护下30℃反应24h，将聚氨酯膜从反应液中取出，甲醇/水(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的小分子，真空干燥，PEG凝胶膜层继续复合到聚氨酯材料表面，得到键合有不同厚度的PEG凝胶膜层的聚氨酯膜；(此步骤中含有炔基的生物活性大分子中炔基的含量满足以下条件：1mol含有炔基的生物活性大分子中炔基的含量≥2mol)；
(4)将步骤(3)中键合有不同厚度的PEG凝胶膜层的聚氨酯膜和200mg修饰有叠氮的RGDS(1eq)(厂家购买：Karebay Biochem，Inc，叠氮含量约0.1mmol/100mg)加入水中，通氮气除氧30min，加入五水硫酸铜0.005g(0.5eq)和抗坏血酸钠0.01(1eq)，在50℃下反应5h，将聚氨酯膜从反应液中取出，EDTA/乙醇(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的小分子，真空干燥，RGDS修饰的PEG生物活性凝胶膜层复合到聚氨酯薄膜材料表面，得到键合有生物活性凝胶膜层的聚氨酯膜。
含炔基的聚氨酯的制备：将PTMG2000在110℃下抽真空2h，然后降至室温；准确称量降至室温的PTMG2000(1eq)，在75℃下抽真空0.5h，然后加入20ml无水DMAc，搅拌均匀后加入HDI(2eq)和0.5％(wt％)二月桂酸二异丁锡催化剂，在氮气保护下75℃反应4h，得到聚氨酯预聚物；向聚氨酯预聚物中加入含炔基扩链剂DPPD(2,2-丙炔基-1,3-丙二醇)(1eq)，将温度升至80℃反应4h，继续升温至90℃熟化2h，最后加入过量乙醇在90℃下反应1h，将未反应的异氰酸酯反应完全；反应结束后用甲醇共沉淀产物，在60℃热风循环烘箱中烘干12h后转移到真空干燥箱中60℃干燥12h进一步除去溶剂，得到含炔基的聚氨酯；
修饰有叠氮基的PEG2000的制备：将PEG2000(2mmol-OH)在甲苯中共沸蒸馏并溶解在15mlTHF中；10min内逐滴滴加溶解在10mlTHF中的4-甲苯磺酰氯(20mmol)，室温反应24h；然后加入饱和NaHCO3水溶液，再搅拌4h，用50mlDCM萃取三次，合并有机相，将合并的有机相用乙醚沉淀，得到PEG-OTs；之后再与溶解在10mlDMF的NaN3(23mmol)混合，30℃下搅拌24h，加入100ml的DCM，然后用盐水洗涤3次，冷却并从冷的二乙醚中沉淀，得到修饰有叠氮基的PEG2000，叠氮含量0.9mmol/g；
修饰有炔基的PEG2000的制备：将PEG2000(1.5mmol)溶于25mlCH2Cl2中，然后依次加入4-戊炔酸(2.25mmol)和DMAP(1.5mmol)，室温下搅拌五分钟后，将DCC(2.25mmol)溶解在15mlCH2Cl2，并加入到反应液中，室温下搅拌过夜，过滤，浓缩，产物通过硅胶柱色谱纯化，并用CH2Cl2/MeOH(10:1)洗脱；最后，将含有炔基的PEG浓缩溶液在乙醚中沉淀并过滤，得到含有炔基的PEG2000；含有炔基的PEG2000中炔基含量约0.9mmol/g。
本实施例中含炔基的聚氨酯膜的拉曼(Raman)图谱如图1所示，键合有PEG凝胶膜层的聚氨酯膜的拉曼(Raman)图谱如图2所示。图1为实施例1中含炔基的聚氨酯膜的拉曼(Raman)图谱；图2为实施例1中键合有PEG凝胶膜层的聚氨酯膜的拉曼(Raman)图谱。从图1和2中可以看出，对比图1，图2中2118cm-1处炔基峰消失，表明点击反应发生且效率很高，修饰有叠氮基的PEG凝胶层成功键合到含炔基的聚氨酯膜表面。
本实施例中含炔基的聚氨酯膜对细胞粘附性能影响的荧光图如图3所示；键合有生物活性凝胶膜层的聚氨酯膜对细胞粘附性能影响的荧光图如图4所示。细胞粘附测试条件：ATDC5细胞，选取H-DMEN作为基础培养基，FBS浓度为10％，以及1％的双抗(青霉素-链霉素混合溶液)，于37℃，95％湿度，5％CO2培养箱中培养；将膜材料与上述培养基、培养液以及ATDC5细胞混合培养48h，随后进行染色处理，测定荧光图。
图3为实施例1中含炔基的聚氨酯膜对细胞粘附性能影响的荧光图；图4为实施例1中键合有生物活性凝胶膜层的聚氨酯膜对细胞粘附性能影响的荧光图。
从图3和图4中可知，对比图3，图4中可以发现细胞数量明显增多，并且细胞形态较为铺展，说明引入的RGDS对细胞的粘附发挥了一定的作用。
实施例2
(1)将含炔基的PAA(Karebay Biochem，Inc，炔基含量约为1mmol/g)(Mn＝65800)进行静电纺丝(六氟异丙醇为溶剂，在纺丝液浓度为6％，电压为12kV，推注速度为1ml/h，极距为10cm)，平均孔径尺寸为400μm，质量1g，得到含有炔基的PAA三维支架；
(2)将1g含有炔基的PAA三维支架(炔基含量约为1mmol/g)(1eq)和1g修饰有叠氮基的壳聚糖(叠氮基含量2mmol/g)(2eq)加入到30ml水中，通氮气除氧40min，加入五水硫酸铜0.008g(0.2eq)和抗坏血酸钠0.03(1eq)，氮气保护下37℃反应10h，将三维支架从反应液中取出，EDTA/乙醇(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的小分子，真空干燥，壳聚糖凝胶层复合到PAA支架材料表面，得到键合有壳聚糖的PAA三维支架；
(3)将步骤(2)中键合有壳聚糖的PAA三维支架和0.75g修饰有炔基的明胶(炔基约2mmol/g)(1.5eq)加入到水中，通氮气除氧40min；称取0.002gCuBr/0.002gPMDETA(0.01eq/0.1eq)溶解在0.3ml无氧水中，将催化剂水溶液加入到反应体系中，氮气保护下50℃反应2h，将三维支架从反应液中取出，EDTA/乙醇(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的小分子，真空干燥，壳聚糖-明胶凝胶层复合到PAA支架材料表面，得到键合有壳聚糖-明胶的PAA三维支架；
(4)将步骤(3)中键合有壳聚糖-明胶的聚己内酯三维支架和300mg修饰有叠氮的HSNGLPL(厂家购买：Karebay Biochem，Inc，叠氮含量约为0.3mmol/300mg)加入到水中，通氮气除氧30min，加入五水硫酸铜0.005g(0.5eq)和抗坏血酸钠0.01(1eq)，在40℃下反应8h，将三维支架从反应液中取出，EDTA/乙醇(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的小分子，真空干燥，得到键合有生物活性凝胶层的PAA三维支架。
修饰有叠氮基的壳聚糖的制备：将1g壳聚糖溶解在50ml乙酸溶液(2wt.％)中，调节PH值到5-7，加入1g2-溴-2甲基丙酸和2.3gEDC，室温搅拌24h，透析并冷冻干燥，得到反应产物；然后将反应产物溶于乙酸溶液(2wt.％)中，调节PH值为中性后加入0.6gNaN3，室温反应24h，透析，冷冻干燥3天，得到修饰有叠氮的壳聚糖。
修饰有炔基的明胶的制备：将1g明胶溶于水中，调节PH值到5-7，然后加入0.9g1-氧代-4-(丙-2-炔基氧基)丁酸和2.3gEDC，在室温下搅拌24h，用大量去离子水透析三天，冷冻干燥，得到修饰有炔基的明胶。
实施例3
(1)将含炔基的聚氨酯(Mn＝35000)进行三维打印(T＝205℃P＝3.5bar)，平均孔径尺寸为400μm，质量5g，得到含有炔基的聚氨酯三维支架；
(2)将5g含有炔基的聚氨酯三维支架(炔基的含量1mmol/g)(1eq)和4g修饰有叠氮基的明胶(叠氮基约2mmol/g)(1.6eq)加入到50ml水中，通氮气除氧30min，加入0.003g铜粉，氮气保护下50℃反应15h，将三维支架从反应液中取出，EDTA/乙醇(V/V＝1:1)洗涤除去铜粉和未反应的小分子，真空干燥，明胶凝胶层复合到聚氨酯支架材料表面，得到键合有明胶的聚氨酯支架；
(3)将步骤(2)中键合有明胶的聚氨酯支架和4g修饰有炔基的明胶(炔基约2mmol/g)(1.6eq)加入到水中，通氮气除氧30min，加入五水硫酸铜0.005g(0.4eq)和抗坏血酸钠0.01(1eq)，在40℃下反应3h，将三维支架从反应液中取出，EDTA/乙醇(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的小分子，真空干燥，得到键合有双重明胶凝胶层的聚氨酯支架；
(4)重复步骤(2)和(3)一次，键合有双重明胶凝胶层的聚氨酯支架上继续键合明胶的凝胶膜层，获得键合有厚度较大的明胶凝胶膜层的聚氨酯支架；
(5)将步骤(4)中键合有厚度较大的明胶凝胶膜层的聚氨酯支架和600mg修饰有叠氮的RGD(厂家购买：Karebay Biochem，Inc，叠氮含量约为0.6mmol/600mg)加入到水中，通氮气除氧30min，加入五水硫酸铜0.005g(0.5eq)和抗坏血酸钠0.01(1eq)，在40℃下反应9h，将三维支架从反应液中取出，EDTA/乙醇(V/V＝1:1)洗涤除去铜离子和未反应的小分子，真空干燥，得到键合有生物活性凝胶层的聚氨酯三维支架。
含炔基的聚氨酯的制备：
将PCL2000在110℃下抽真空2h，然后降至室温；准确称量PCL2000(1eq)，在75℃下抽真空0.5h，然后加入20ml无水DMAc，搅拌均匀后加入MDI(2eq)和0.5％(wt％)二月桂酸二异丁锡催化剂，在氮气保护下75℃反应4h，得到聚氨酯预聚物；向聚氨酯预聚物中加入含炔基扩链剂DPPD(2,2-丙炔基-1,3-丙二醇)(1eq)，将温度升至80℃反应4h，继续升温至90℃熟化2h，最后加入过量乙醇在90℃下反应1h，将未反应的异氰酸酯反应完全；反应结束后用甲醇共沉淀产物，在60℃热风循环烘箱中烘干12h后转移到真空干燥箱中60℃干燥12h进一步除去溶剂，得到含炔基的聚氨酯。
修饰有叠氮基的明胶的制备：将1g明胶溶解在50ml水中，将PH调至5-7，加入1g2-溴-2甲基丙酸和2.3gEDC，溶液室温搅拌24h，透析并冷冻干燥，得到产物；然后将产物溶于水中，加入0.6gNaN3，室温反应24h，透析，冷冻干燥3天，得到修饰有叠氮基的明胶。
修饰有炔基的明胶的制备：将1g明胶溶于水中，调节PH至5-7，然后加入0.9g1-氧代-4-(丙-2-炔基氧基)丁酸和2.3gEDC，在室温下搅拌24h，用大量去离子水透析三天，冷冻干燥，得到修饰有炔基的明胶。
上述实例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，所有原料以及配方均可在可进行点击反应和合成水凝胶理论基础的指导下作出调整，涉及点击反应类型，包括环加成反应、亲核开环反应、非醇醛的羰基化学、碳碳多键的加成反应等等；点击顺序；点击方向；催化类型，包括亚铜催化、无铜催化；催化体系包括铜线、铜粉、五水硫酸铜/抗坏血酸(钠)/硼酸或CuBr/PMDET；生物活性大分子种类；材料结构种类、成型方法；活性小分子种类；以及功能基团的修饰方法。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种在含有炔基的生物材料表面构建生物活性凝胶膜层的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)在惰性氛围和溶剂中，将含有炔基的高分子材料与含有叠氮基的生物活性大分子通过催化剂的作用进行反应，洗涤，干燥，得到键合有生物活性大分子的高分子材料；叠氮基的摩尔含量≥炔基的摩尔含量；
(2)在惰性氛围和溶剂中，将含有炔基的生物活性大分子与步骤(1)中键合有生物活性大分子的高分子材料通过催化剂的作用进行反应，洗涤，干燥，得到键合有活性层的高分子材料；含有炔基的生物活性大分子中炔基的含量≥步骤(1)中键合有生物活性大分子的高分子材料中叠氮基的含量；
(3)重复步骤(1)或重复步骤(1)～(2)，键合有活性层的高分子材料表面继续键合有生物活性层，从而获得表面键合有不同厚度活性层的高分子材料；
(4)在惰性氛围和溶剂中，将含有叠氮基或炔基的小分子与步骤(3)中获得的高分子材料在催化剂的作用下进行反应，洗涤，干燥，得到键合有生物活性凝胶膜层的高分子材料；当步骤(3)中获得的高分子材料含有叠氮基时，选用含有炔基的小分子进行反应；当步骤(3)中获得的高分子材料含有炔基时，选用含有叠氮基的小分子进行反应。
2.根据权利要求1所述在含有炔基的生物材料表面构建生物活性凝胶膜层的方法，其特征在于：所述含有炔基的高分子材料为含有炔基的聚乳酸、含有炔基的聚乙醇酸、含有炔基的聚己内酯或含有炔基的聚氨酯中的一种以上，数均分子量为30000-100000。
3.根据权利要求1所述在含有炔基的生物材料表面构建生物活性凝胶膜层的方法，其特征在于：所述含有叠氮基的生物活性大分子为含有叠氮基的明胶及其衍生物、含有叠氮基的透明质酸及其衍生生物、含有叠氮基的透明质酸钠及其衍生物、含有叠氮基的壳聚糖及其衍生物、含有叠氮基的PEG及其衍生物、含有叠氮基的PVA及其衍生物、含有叠氮基的PTMC及其衍生物、含有叠氮基的PHEMA及其衍生物、含有叠氮基的PNIPAAm及其衍生物中一种以上；所述生物活性大分子的数均分子量为2000-100000。
4.根据权利要求1所述在含有炔基的生物材料表面构建生物活性凝胶膜层的方法，其特征在于：所述含有炔基的生物活性大分子为含有炔基的明胶及其衍生物、含有炔基的透明质酸及其衍生生物、含有炔基的透明质酸钠及其衍生物、含有炔基的壳聚糖及其衍生物、含有炔基的PEG及其衍生物、含有炔基的PVA及其衍生物、含有炔基的PTMC及其衍生物、含有炔基的PHEMA及其衍生物、含有炔基的PNIPAAm及其衍生物中一种以上；所述生物活性大分子的数均分子量为2000-100000。
5.根据权利要求1所述在含有炔基的生物材料表面构建生物活性凝胶膜层的方法，其特征在于：所述含有炔基的小分子为修饰有炔基的短肽或修饰有炔基的糖基药物中一种以上；
所述含有叠氮基的小分子为修饰有叠氮基的短肽或修饰有叠氮的糖基药物中一种以上。
6.根据权利要求5所述在含有炔基的生物材料表面构建生物活性凝胶膜层的方法，其特征在于：所述含有炔基的小分子为修饰有炔基的RGD、修饰有炔基的TGF-β1、修饰有炔基的七肽、修饰有炔基的RGDfk、修饰有炔基的cRGDfk、修饰有炔基的RGDS、修饰有炔基的HSNGLPL中一种以上；
所述含有叠氮基的小分子为修饰有叠氮基的RGD、修饰有叠氮基的TGF-β1、修饰有叠氮基的七肽、修饰有叠氮基的RGDfk、修饰有叠氮基的cRGDfk、修饰有叠氮基的RGDS、修饰有叠氮基的HSNGLPL中一种以上。
7.根据权利要求1所述在含有炔基的生物材料表面构建生物活性凝胶膜层的方法，其特征在于：步骤(1)中所述含有炔基的高分子材料中炔基与含有叠氮基的生物活性大分子中叠氮基的摩尔比为(0.1～1):1；
步骤(2)中所述步骤(1)中键合有生物活性大分子的高分子材料中叠氮基与含有炔基的生物活性大分子中炔基的摩尔比为(0.1～1):1。
8.根据权利要求1所述在含有炔基的生物材料表面构建生物活性凝胶膜层的方法，其特征在于：步骤(1)～(4)中所述催化剂为铜线、铜粉、五水硫酸铜/抗坏血酸(钠)/硼酸或CuBr/PMDETA；所述反应条件为在10～80℃反应2～48h。
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