具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请,并不用于限定本申请。
尿源性干细胞(urine-derived stem cells USCs)的分离及鉴定
1、材料及方法
1.1、尿液收集及USCs的分离和传代培养
收集签署知情同意书的志愿者中间段尿液50mL,转移至50mL离心管中,于400g离心6min,再用20mL PBS洗一遍,最后向每个离心管中加入3mL肾细胞增殖培养基(CC-3190REGM BulletKit,Lonza),轻轻重悬细胞,获得USCs悬浮液。
一个USCs的原代培养的实施例中,取上述2.5mL USCs重悬液,取铺有0.1%明胶的12孔板培养细胞,培养4天时,用传代培养基进行全量换液后培养,每2天换一次液。培养12d时,细胞约长满整个孔面积。
一个传代培养基的配制实施例为:向100mL DMEM/F12培养液(Gibco公司)中加入2.5mL 10%胎牛血清溶液(FPS,Gibco公司)、15μg庆大霉素(Pure Chemistry ScientificInc.)、7.5ng两性霉素(大连美仑生物技术有限公司)、0.50mL人表皮生长因子(hEGF,100mM,购自Lonza公司)、0.50mg胰岛素(Insulin,P3376-100IU,Beyotime公司)、0.50mL皮质醇(购自Syntechem Co.,Ltd)、0.5mL转铁蛋白(简称为transferrin,10mg/mL,货号:CC-4205,Lonza公司)、0.50mL三碘甲状腺氨酸(Triiodothyronine,5mg/mL,上海一基公司),5μg肾上腺素(江西瑞威尔生物科技有限公司)。
一个USCs的传代培养的实施例中,对细胞长满整个孔面积进行USCs细胞传代,先用PBS洗一遍,接着用胰酶(Gibco公司)消化3min,其次用l×Defined Trypsin inhibit(Gibco公司)终止消化,收集细胞并计数,铺过0.1%明胶的六孔板每孔接种1×105个USCs,标记为第1代,置于37℃培养箱中培养至长满整个孔面积后重复上述步骤进行传代4次,得到第四代USCs。
1.2、鉴定
用含有秋水仙素终浓度为0.05μg/mL的培养液消化处理10h,收集消化的USCs,用现配的0.075mol/L KCl重悬细胞,置于37℃处理30min;接着用现配且4℃预冷的固定液(冰醋酸:甲醇=1:3)室温固定30min。然后用4℃预冷的固定液再重复固定两次。接着取出在-20℃预冷的干净载玻片,用200μL移液枪悬于1.5cm高度进行滴片,并室温晾干。再用吉姆萨染液进行染色,染色30min后漂洗并晾干。最后,用显微镜观察和拍照。
1.3、流式细胞分析第4代USCs表面标志物
取上述第4代尿源性干细胞,胰蛋白酶消化离心后,细胞沉淀中加入PBS液重悬细胞,调整细胞密度为1×105cells/mL,以100μL分装于EP管中,加入CD73、CD90、CD105、CD34、CD45单克隆抗体液(购自BD Pharmingen公司),4℃冰上孵育30min,PBS液洗涤后,重悬细胞上机检测,以Flowjo软件进行数据分析。
2、结果
经上述实施例分离得到尿源性干细胞是终末分化的,更换培养基后可将其去除,如图1所示,原代细胞培养4-5d后可明显看到放射状细胞集落,细胞胞浆丰富,胞核大,核仁清晰可见。如图2所示,第4代细胞在2~3d达到90%以上的融合,细胞保持长梭形形态,细胞间紧密贴合,呈旋涡状排列。流式细胞仪检测所培养的第4代细胞的表面标志物CD73,CD90,CD105,CD45,CD34的表达情况。结果发现,P4代细胞中CD73、CD90、CD105都有极高的表达率,而CD45、CD34的表达率极低,表明分离得到的细胞为USCs。
表1
细胞 |
CD73 |
CD90 |
CD105 |
CD45 |
CD34 |
P4 |
97.35 |
94.61 |
97.64 |
0.06 |
0.13 |
三维基质的合成
1、材料与方法
人血管生成素相关生长因子(AGF)的RGD多肽的(Arg-Gly-Asp-Ser),其为AGF其中一个粘附序列,通过与细胞表面的特定整合素结合介导细胞的粘附和移行,在AGF发挥胚胎发育、伤口愈合以及肿瘤的发生和转移等生物学过程中起到关键作用(参见Pienimake,J.P.,Rilla,K.,Fulop,C.et al.Epidermal growth factor activates HyaluronanSynthase 2inepidermal keratinocytes and increases pericellular andintracellular hyaluronan.J.Biol Chem.2001,276:20428-35.)。
1.1、叠氮RGD合成:
1)使用2-氯三苯甲基氯树脂(上海微蒙生物科技有限公司)和侧链被tert-buty基团保护且氨基被Fmoc保护的氨基酸(无锡亚肽生物科技公司)合成Arg的C端接枝在树脂上,接载率为0.6mmol/g;用20%的哌啶的DMF溶液淋洗接枝后的数值,用于脱除氨基酸的Fmoc保护基团;
2)在缩合剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU,康宝泰)和催化剂N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)的共同作用下,Gly的羧基与游离的氨基结合;依次重复以上步骤,将Asp和Ser分别连接成多肤链;
3)叠氮化己酸的合成:6-溴己酸乙酯与叠氮化纳在DMF中反应,之后用氢氧化钠处理,得到叠氮化的己酸;
4)最后将上一步的叠氮化己酸用同样的步骤2)连接到多肽链的氨基上;
5)用DMF反复冲洗连有多肽链和叠氮化已酸的树脂(5min,5次),之后再用二氯甲烷DCM冲洗(1min,3次);
6)压干溶液,用三氟乙酸TFA处理干燥的树脂,将多肽从树脂上脱离,转移进入TFA溶液中;
7)收集溶液旋干,得到浓缩溶液;用冰冻乙醚处理,离心,得到沉淀;
8)将沉淀溶于二甲基亚砜DMSO,使用制备级别高效液相色谱纯化得到带叠RGD。
1.2、炔基-壳聚糖(alk-CS)合成
1)将壳聚糖(CS,西安康诺化工有限公司)溶解于蒸馏水中,向其中加入戊炔酸,利用1M盐酸(HCL)和1M氢氧化钠(NaOH)溶液调节PH值使CS完全溶解,得到CS溶液;
2)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC,吉尔生化(上海)有限公司)按照EDC:戊炔酸=3:1的比例分3次加入CS溶液中,每30min加1次,置于冰浴处理反应24h;
3)于4℃条件对产物进行透析,依次采用5mM HCl和1wt%NaCL的混合溶液透析2天;3mM HCL透析1天、1mMHCL透析2天和去离子水透析3天,冻干,即可获得炔基-壳聚糖;炔基基团连接在壳聚糖的氨基侧链上。
1.3、壳聚糖-叠氮-RGD(CS-N3-RGD)合成
于氮气氛围中,用10mL去离子水溶解alk-CS 2.5g,溶液中加入6.72g叠氮-RGD、3.87g硫酸铜和3.07g抗坏血酸钠(加料摩尔比例依次为1:0.2:0.4),在37℃条件下,反应24h,即可得到CS-N3-RGD;将产物用去离子水透析7天,期间可多次更换去离子水,冻干,即可获得CS-N3-RGD。
1.4、壳聚糖-叠氮-RGD-卡托普利(CS-N3-RGD-Cap)的合成
将3.367g卡托普利(Captopril,北京百灵威科技有限公司)、0.081gHBTU、0.115gDIPEA混合于100mL三颈烧瓶中,用3m L DMF蒸馏水溶解,25℃搅拌活化4h;取11.27gCS-N3-RG溶解在100mL去离子水中,加入至上述三颈烧瓶中充分混合,反应48h,产物用去离子水透析7天,期间可更换去离子水,冷冻干燥,即可得到CS-N3-RGD-Cap。
1.5、傅里叶红外光谱分析
使用傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津公司),以衰减全反射光谱技术检测CS、CS-N3-RGD和CS-N3-RGD-Cap的化学结构,光谱分辨率为8cm-l。
2、结果
将上述制备的CS、CS-N3-RGD和CS-N3-RGD-Cap三种产物分别作为对比例1、对比例2和实施例1得到的凝胶前体物质,三者的FTIR图谱如图3所示,三者结构分别如图4-6所示。
如图3所示,结果显示,alk-CS出现了炔基的特征性波峰(3082cm-1≡CH延伸,2102cm-1C≡C延伸),而在CS-N3-RGD和CS-N3-RGD-Cap中均消失,这表明alk-CS与叠氮-RGD成功连接。并且在CS-N3-RGD中出现了2831cm-1和1172cm-1的波峰,这些波峰均为RGD中亚甲基和甲基的C-H延伸,以及轻基的C-O延伸的吸收峰;2127.39cm-1出现了叠氮环的吸收峰。
在CS-N3-RGD-Cap的图谱中出现了2972cm-1、2657cm-1、1716cm-1和1683cm-1均为Cap的吸收峰,表明CS-N3-RGD-Cap合成成功。
USCs三维重编程培养
1、材料与方法
1.1、培养过程
将上述的CS、CS-N3-RGD和CS-N3-RGD-Cap分别作为凝胶前体,以对USCs进行重编程培养,具体步骤如下:
1)取上述实施例得到的第4代USCs,接种涂覆有0.2%明胶的12孔板上,并每孔加入2mL凝胶前体溶液,使得孔板中USCs不低于1×104个。其中,凝胶前体溶液包含50mMTris、50mM氯化钙、10U/mL凝血酶激活因子XIIIa(广州方舟生物技术有限公司)和100mM的凝胶前体,该凝胶前体为CS、CS-N3-RGD或CS-N3-RGD-Cap。
2)再向每孔中滴入2Mβ-甘油磷酸钠水溶液(β-GP,化夏化学),每孔1滴,大约30μl每滴,迅速转至37℃的加湿培养箱中进行处理30min,即可在显微镜下可见三维凝胶微粒;
3)24h后,更换每孔中的溶液为传代培养基进行重编程培养,每48小时更换一次新鲜传代培养基,共更换3~5次。
1.2、三维重编培养后USCs的分离
通过在37℃下的TrypLTMExpress温和胰酶(Gibco)处理上述包装在三维基质中的USCs 10min,即可得到将USCs从中分离出来,转移至传代培养基中培养至少48h后,进行细胞相关指标的分析。
1.3、多向分化能力鉴定:
用特定培养方案诱导USCs向成骨细胞和脂肪细胞2个方向分化,利用Vonkossa染色和油红O染色分别鉴定是否被诱导成骨及成脂,以证实USCs的多向分化能力。
成骨诱导与Vonkossa染色:
取经三维重编培养的USCs(40cells/cm2)接种于6孔板,第2天即替换成骨诱导液(低糖DMEM,10%FBS,100nM地塞米松,10mMβ-甘油磷酸钠,50mM左旋抗坏血酸-2-磷酸),每3天换诱导液1次,28天后按试剂盒说明书行Vonkossa染色鉴定是否成骨。
成脂诱导和油红O染色:
取经三维重编培养的USCs(40Cells/cm2)接种于6孔板,加入基础培养液培养,24h后替换成成脂诱导液(DMEM,10%FBS,1μM地塞米松,500μM IBMX,10μg/mL胰岛素,100μM吲哚美辛),每3天换诱导液1次,28天后行油红O染色鉴定是否成脂。用PBS温柔冲冼3次,10%甲醛固定10min,60%异丙醇冲洗,油红O染液染色30min,70%乙醇冲洗,苏木精复染5min,倒置显微镜下观察并拍照。
1.4、细胞活性检测
取分离的第4代USCs,接种于涂覆有0.2%明胶的12孔板中,每孔加入2mL凝胶前体溶液,使得每孔中USCs不低于1×104个。其中,凝胶前体溶液包含50mMTris、50mM氯化钙、10U/mL凝血酶激活因子XIIIa和100mM的凝胶前体,该凝胶前体为CS、CS-N3-RGD或CS-N3-RGD-Cap。或者凝胶前体溶液包含5mM、20mM、50mM、75mM的凝胶前体溶液。
再向每孔中滴入2M(0.1M、0.4M、1.0M或1.5M)β-甘油磷酸钠水溶液(β-GP,化夏化学),每孔1滴,大约30μl每滴,迅速转至。在37℃的加湿培养箱中进行交料处理30min,即可在显微镜下可见凝胶微粒;24h后,更换每孔中的溶液为传代培养基进行重编程培养,每48小时进行一次新鲜传代培养基,共更换2次后;
吸取培养孔中的培养基,用PBS洗涤细胞后,加入1.25mL 1000被稀释的染色剂(含1‰v/v乙锭二聚体-1(Ethidium homodimer-1,上海懋康生物科技有限公司)、1‰v/v钙绿素-AM(calcein-AM,AAT Bioquest)的PBS溶液),将孔板放入温箱(37℃)孵育30min;直接置于倒置荧光显微镜下观察,活细胞被钙绿素-AM染成绿色,死细胞被乙锭二聚体-1染成红色。拍照、计数活细胞所占比例(即为细胞活性)并进行统计分析。1.5、流式细胞学技术检测细胞凋亡
为了评价本申请实施例提供的三维基质对于USCs的细胞凋亡的保护作用,本申请进一步使用双氧水诱导USCs损伤,并使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(中国Abcam)检测细胞凋亡,方法如下:
诱导H2O2损伤:选用经过三维基质培养后的USCs和未经三维基质培养的USCs细胞(对比例5)作为实验样品,吸去孔板中的细胞培养基,PBS洗涤2次;将双氧水工作液(100mMH2O2的基本培养基)加入到孔板中,作用2h;损伤结束后,吸取每组的上清,用PBS洗涤孔板,使用胰酶消化细胞,并转移至离心管。
将诱导H2O2损伤后的细胞进行Annexin V-FITC/PI染色,再进行流式细胞检测。
1.7、RT-PCR
利用RT-PCR法检测USCs中促血管新生基因的表达以及血管紧张素转换酶2(ACE2)基因的表达检测。
1)总RNA提取
吸取经过三维重编培养后的细胞液,用TRIzoI试剂盒(赛默飞)提取细胞中总RNA,使用NanoDrop仪器检测RNA浓度。
2)cDNA合成
在PCR管中,依次加入总RNA 1μg,Anchored Oligo(dT)1μL(赛默飞),10μL 2×TSReaction Mix(TransGen),1μL TransScript RT/RI Enzyme Mix(TransGen)补水至20μL;轻轻混匀各组分,42℃孵育30min;再将其置于于85℃加热5min以使TransScript RT失活;即可得到cDNA,置于于-20℃备用。
3)实时定量PCR
将合成的cDNA稀释成的约1000ng/μL的终浓度,采用Transgen的qPCR kiT进行实验,PCR反应体系为:10μL qPCRmix、1μL上下游引物、1μL cDNA、8μL双蒸水,反应程序为94℃5min,94℃30s,60℃25s,72℃25s,40个循环。
表2
引物名 |
序列 |
GAPDH-F |
ttgtctcctgcgacttcaac,如SEQ ID NO.1所示 |
GAPDH-R |
gtcataccaggaaatgagcttg,如SEQ ID NO.2所示 |
ACE2-F |
ggccaagacatttttggaga,如SEQ ID NO.3所示 |
ACE2-R |
gatattccactctgctgcaa,如SEQ ID NO.4所示 |
PDGF-BB |
atccagggagcagcgagcca,如SEQ ID NO.5所示 |
PDGF-BB |
cagggccgccttgtcatggg,如SEQ ID NO.6所示 |
CCL5-F |
tgcccacgtcaaggagtatttc,如SEQ ID NO.7所示 |
CCL5-R |
aacccacttcttctctgggttg,如SEQ ID NO.8所示 |
Caspase-3-F |
ggcacaaagcgactggatg,如SEQ ID NO.9所示 |
Caspase-3-R |
ctgccgtggtacagaactgg,如SEQ ID NO.10所示 |
Caspase-9-F |
atctggctcggggttactg,如SEQ ID NO.11所示 |
Caspase-9-R |
ctgcgtggtggtcattctc,如SEQ ID NO.12所示 |
Bax-F |
tgagcactcccgccacaaa,如SEQ ID NO.13所示 |
Bax-R |
caggatgcgtccaccaagaa,如SEQ ID NO.14所示 |
Bad-F |
tgatggctgctgctggttg,如SEQ ID NO.15所示 |
Bad-R |
cccagagtttgagccgagtg,如SEQ ID NO.16所示 |
Fas-F |
tggaggacagggcttatgg,如SEQ ID NO.17所示 |
Fas-R |
gcatctggaccctcctacct,如SEQ ID NO.18所示 |
VEGF-A-F |
actggaccctggctttac,如SEQ ID NO.19所示 |
VEGF-A-R |
tctgctctccttctgtcgtg,如SEQ ID NO.20所示 |
HIF-1a-F |
gtgcaccctaacaagccgggg,如SEQ ID NO.21所示 |
HIF-1a-R |
agcaccaagcacgtcatgggt,如SEQ ID NO.22所示 |
PLGF-F |
cttctgagtcgctgtagtgg,如SEQ ID NO.23所示 |
PLGF-R |
tcctttctgcctttgtcg,如SEQ ID NO.24所示 |
bFGF-2-F |
gcatcacctcgcttcccgca,如SEQ ID NO.25所示 |
bFGF-2-R |
cgcaggaagaagccgccgtt,如SEQ ID NO.26所示 |
目的基因引物见上表所示,均由上海生工公司合成。
2、结果
如图7-9分别为实施例1、对比例1和对比例2提供的三维重编培养后分离的USCs,可见实施例1获得的USCs细胞数量大,而对比例1、2的USCs细胞数量较小,但是二者的细胞形态差别不大。
如图7所示,实施例1中,三维重编培养分离的USCs在成骨细胞诱导培养基中诱导7d后,开始出现钙质结节,用0.1%茜素红染色,矿化结节呈现红色,表明有钙盐形成,说明细胞具有成骨分化的潜能。如图8、9所示,而在对比例1和2中对三维重编培养分离的USCs在成骨细胞诱导培养基中诱导7d后,红色矿化结节较少,其成骨分化潜能不及实施例1。
如图10所示,实施例1中,三维重编培养分离的USCs在成脂细胞诱导培养基中诱导7d后,油红O染色可见大量细胞内红色脂滴。而如图11、12所示,在对比例1和2中对三维重编培养分离的USCs在成骨细胞诱导培养基中诱导7d后,细胞中红色脂滴较少,成脂分化效果不及实施例1。
如表2、3所示,为了评价本申请提供的三维基质对USCs的细胞相容性,本申请进一步提供了不同浓度以及不同种类的凝胶前体溶液在形成三维基质中对USCs的细胞活性,以及USCs的抗凋亡能力的影响。
表2
表3
由表3的结果可知,实施例1-5在经过三维编程培养后的细胞活性较高,并且联系培养21天后的细胞活性仍然较高;而对比例1-4细胞活性在三维重编培养后的细胞活性低于实施例1-5,并且连续培养细胞活性也显著下降,生物相容性劣于实施例1-5。
进一步地,本申请还在体外利用双氧水对三维编程培养后的USCs细胞进行诱导损伤,评价各实施例和对比例对凋亡细胞的保护作用。如表3所示,实施例1-5中USCs的凋亡数量显著低于对比例1-4。由此说明,本申请实施例1-5提供的三维基质能够帮助USCs对抗氧化环境的凋亡,对其具有保护作用。
表4凋亡基因的相对表达量
本申请实施例进一步利用RT-PCR对凋亡相关基因进行了检测,相对于GAPDH基因,实施例1-5培养的USCs细胞相对于对比例5(未进三维基质重编培养)的USCs细胞凋亡基因表达量显著降低,说明本申USCs进行三维基质重编培养能够对抗凋亡,提高对细胞的保护作用。而对比例1-4虽然采用了三维基质培养,但是其三维基质对USCs对抗凋亡的保护作用有限,劣于实施例1-5。
表5血管相关基因的相对表达量
实施方式 |
ACE2 |
PDGF-BB |
CCL5 |
实施例1 |
1.32±0.21a |
1.65±0.17a |
0.97±0.33c |
实施例2 |
1.05±0.34b |
1.69±0.22a |
1.06±0.28c |
实施例3 |
1.07±0.23b |
1.45±0.17ab |
1.15±0.28c |
实施例4 |
0.92±0.16b |
1.35±0.26ab |
1.47±0.35c |
实施例5 |
0.89±0.24bc |
1.42±0.15ab |
1.52±0.21c |
对比例1 |
0.00±0.00 |
0.00±0.00 |
0.00±0.00 |
对比例2 |
0.00±0.00 |
0.88±0.27b |
5.92±0.23a |
对比例3 |
0.36±0.14d |
0.78±0.34b |
5.79±0.41b |
对比例4 |
0.24±0.06d |
0.86±0.45b |
5.35±0.52b |
对比例5 |
0.00±0.00 |
0.00±0.00 |
0.00±0.00 |
表6血管相关基因的相对表达量
表5和表6列出了各实施例和对比例中USCs中相关基因的表达情况,可知,对比例1和对比例5中各基因均未表达,这表明其得到USCs并未产生相关的有血管新生基因的分化趋势,这可能由于USCs仅仅通过传代培养或者仅通过壳聚糖三维基质重编培养并不能产生相关的分化趋势有关;还可能由于实施例1-5和对比例2-4中使用的壳聚糖三维基质连接有RGD多肽,其对于USCs重编向血管新生基因的分化起到决定作用。
对于ACE2基因,对比例2即使进行了CS-N3-RGD的三维基质培养,其USCs细胞中也并未出现该基因的表达,而其他实施例1-5和对比例3、4中均出现了该基因的表达,这表明三维基质中出现Cap基团对于重编USCs向表达ACE2基因分化至关重要。
同时,表5和表6中,实施例1-5对应的USCs各基因mRNA的表达量均显著高于对比例,这表明本申请实施例提供的三维基质对于重编USCs向相关方向分化具有更显著的作用。
其中,PDGF-BB为血小板衍生因子相关基因,是一种重要的促有丝分裂因子,具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力。VEGF-A为血管内皮生长因子,其可促进血管内皮细胞增殖,增加血管通透性。HIF-1a为低氧诱导因子,具有诱导细胞迁移和增殖能力。PLGF为胎盘生长因子,可诱导内皮细胞增殖、迁移,抗内皮细胞凋亡,并能增加血管的通透性,促进血管生成作用。bFGF-2为碱性成纤维细胞生长因子,可提供细胞的促凋亡作用,促进细胞纤维化。综合这些基因的表达情况,可见经过实施例的三维基质重编,对USCs的相关生长能力产生了重大变化,分泌多种与其细胞分裂增殖、对抗凋亡、以及促进血管生成的多种细胞因子和生长因子,改变了其自身的细胞属性。
动物实验
为进一步阐明本申请提供的这种三维基质重编USCs后,其能够产生的体内作用,本申请还进行了如下动物实验。
1、材料与方法
实验动物:健康Wistar大鼠,体重为200~250g,SPF级,雄性,南通特洛菲饲料科技有限公司。将实验动物分为两组,分别用于建立糖尿病创面模型鼠和高血压模型鼠。
1.1、糖尿病创面模型鼠的建立及实验
避光用pH=4.0柠檬酸钠缓冲液配置2wt%的链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ,购自北京索莱宝科技有限公司)溶液,将Wistar大鼠禁食(自由饮水)12h后,称其体重,以150mg/kg的剂量腹腔注射STZ,1周后尾静脉取血用血糖仪测定Wistar大鼠血糖浓度,当血糖浓度>16.7mmol/L且出现多食、多饮、多尿和体重减少典型症状时,即表明糖尿病模型造模成功。在模型鼠的背部切取直径4cm的全层皮肤,形成创面。
分组实验:将糖尿病创面模型鼠分为模型组和给药组。
给药组,将上述建立的糖尿病创面模型鼠的创面四周,以皮内注射方式移植注入10~100μl上述实施例1-5和对比例1-5分别制备的USCs悬液,其中,USCs含量不低于1×106个。表面敷以无菌油纱和普通纱布,5d后打开敷料,露创面,Wistar大鼠继续饲养、观察10d,期间监测血糖情况,必要时给予胰岛素皮下注射,保证动物存活。而模型组不进行相关USCs注射。
1.2、高血压模型鼠的建立及实验
取健康Wistar大鼠喂食高盐饲料(HD007低铁饲料EDTA酪蛋白,Biotech-HD),每周测量大鼠血压和体重,至第六周左右动物血压明显增高并稳定在200mmHg左右,表明造模成功。
进行分组实验,分为模型组、给药组和对照组。对照组为健康Wistar大鼠。模型组不进行处理。给药组,将上述的高血压模型鼠给药血液注射上述各实施例和对比例分离的USCs,每只大鼠注射剂量为50uL,调整注射剂中USCs含量为的105个/mL的浓度。
1.3、创面愈合率
取两组裸鼠背面新生创面处切取圆形全层皮肤(直径2cm),4%多聚甲醛固定后行HE染色,显微镜下观察创面组织变化、表皮层分化、表皮厚度等,并计算创面愈合率。创面愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面×100%。
1.4、血压测定
以间接测压法测量大鼠尾动脉血压,并记录测量结果。
1.4、数据分析
实验数据采用Excel 2013和SPSS 22.0统计软件进行数据分析进行统计整理,每个数据均测量多次,并通过平均值与其标准偏差进行表示,并以SPSS 22.0分别进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和DunCan’s多重比较,并进行显著性差异标记。
表7
由表7可知,实施例1-5制备的USCs给药糖尿病创面模型鼠的创面四周后,10天的创面愈合率显著高于对比例1-5,并且创面的上皮化厚度亦显著高于对比例1-5,表明本申请实施例提供的三维重编的USCs具有愈合大鼠糖尿病创面的作用。
另外,表7中,实施例1-5制备的USCs给药高血压模型鼠中,10天的收缩压和舒张压均相对于模型鼠有了显著降低,恢复到与对照组中的健康鼠相当;而对比例1和2给药后并未产生降血压效果,而对比例3-5的降血压效果有限。
结合表5、6的数据可知,对比例1在对USCs进行重编培养时使用的三维基质为CS,对比例5为未USCs进行三维重编培养,对比例1和5得到的USCs细胞并未出现血管相关基因的表达,而对比例2-4使用了其他类型三维基质重编USCs,导致其血管相关基因的表达量有限,这些因素均导致其对于糖尿病创面模型鼠的创面修复和愈合作用不佳。
而对比例2实验CS-N3-RGD对USCs进行三维重编,该三维基质中不含有Cap,导致其三维培养时并未诱导产生ACE2基因的表达,而这可能是其不能对高血压模型鼠产生降血压作用的根本原因。而ACE2为血管紧张素转移酶2,ACE2对肠道运输中性氨基酸起到协调作用;另有研究表明,ACE2同样能参与肠道葡萄糖的转运,催化血管紧张素I转化为血管紧张素II,使缓激肽失活,对血管具有舒张作用,从而产生降低血压的功能。
综上所述,本申请实施例通过合成了一种连接有RGD多肽和卡托普利的三维基质,并利用该三维基质对人尿源性干细胞进行重编培养,使得该细胞具有超强的增殖能力、抗凋亡能力,并能够一定量表达血管促生相关基因和血管紧张素转移酶2基因的分化功能,并且通过动物实验证实了三维重编后的人尿源性干细胞具有愈合糖尿病创面模型鼠的创面和降低高血压的功能,为其作为糖尿病创面愈合和降压相关药品的应用领域提供广泛的应用前景。
以上所述,仅为本申请较佳的具体实施方式,但本申请的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 广州旺合生物科技有限公司
<120> 三维重编USCs、其培养方法及其在抗糖尿病和降血压中的应用
<141> 2022-06-17
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ttgtctcctg cgacttcaac 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gtcataccag gaaatgagct tg 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggccaagaca tttttggaga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gatattccac tctgctgcaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atccagggag cagcgagcca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cagggccgcc ttgtcatggg 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tgcccacgtc aaggagtatt tc 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
aacccacttc ttctctgggt tg 22
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ggcacaaagc gactggatg 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ctgccgtggt acagaactgg 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
atctggctcg gggttactg 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ctgcgtggtg gtcattctc 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
tgagcactcc cgccacaaa 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
caggatgcgt ccaccaagaa 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tgatggctgc tgctggttg 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
cccagagttt gagccgagtg 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
tggaggacag ggcttatgg 19
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
gcatctggac cctcctacct 20
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
actggaccct ggctttac 18
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
tctgctctcc ttctgtcgtg 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
gtgcacccta acaagccggg g 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
agcaccaagc acgtcatggg t 21
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
cttctgagtc gctgtagtgg 20
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
tcctttctgc ctttgtcg 18
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
gcatcacctc gcttcccgca 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
cgcaggaaga agccgccgtt 20