CN109642207A - 水凝胶前体制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水凝胶前体制剂，其为未反应的粉末形式。其包含：活化酶，优选凝血酶；交联酶，优选转谷氨酰胺酶，更优选因子XIII转谷氨酰胺酶，其中所述交联酶在有或没有缓冲剂的水中可被所述活化酶活化；和至少一种结构化合物A。所述结构化合物可通过所述交联酶介导的选择性反应交联以形成水凝胶，其中所述交联酶被活化。

Description

水凝胶前体制剂及其用途
本发明涉及根据独立权利要求的前序部分的水凝胶前体制剂，用于制备水凝胶前体制剂的方法、试剂盒和用于制备水凝胶的方法。
已经认识到三维细胞培养支架实现了比在培养皿中的常规二维细胞培养更接近地模仿活生物体的基因表达和其他细胞活动的模式。
这导致了新的合成聚合物水凝胶家族的发展，其通常被称为人工ECM(aECM)，因为它们模仿细胞外基质的许多方面。一个主要挑战是提供实现基质在细胞或生物分子的存在下的交联以及生物分子稳定地束缚到基质本身的化学。
近年来，开发了实现在细胞或生物分子的存在下形成凝胶的不同机制。例如，提出了基于低分子量结构单元，如肽(Estroff等人：Water gelation by small organicmolecules；Chem.Rev.2004；104(3)；1201-18)或脲基嘧啶酮(ureidopyrmimidinone)(Zhang S.：Fabrication of novel biomaterials through molecular self-assembly；Nat.Bio-technol.2003；21(10)；1171-8)和中等分子量两亲性嵌段共聚物(例如参见Hartgerink等人：Peptide-amphiphile nonofibers：A versatile scaffold for thepreparation of self-assembling materials；Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.2002；99(8)；5133-8)的自组装的机制。
可以基于位于水凝胶前体分子中的官能团的共价交联，或者通过非酶促机制或者酶促机制制备水凝胶。酶促机制被定义成使得共价交联由催化官能团之间的交联反应的交联酶介导。由凝血系统已知的交联酶属于例如转谷氨酰胺酶类，其在钙离子的存在下催化胺基，如蛋白-/肽-结合的赖氨酸和蛋白-/肽-结合的谷氨酰胺的酰基之间的异肽键的形成。转谷氨酰胺酶的用途在过去适用于制备水凝胶。
例如，在Sanborn等人的“In situ cross-linking of a biomimetic peptide-PEG hydrogel via thermally triggered activation of factor XIII”(Biomaterials23(2002)，2703-2710)中公开了本领域已知的水凝胶。Sanborn等人使用钙离子的控制释放，通过热触发负载钙的脂质体来活化hr因子(hrFactor)XIII。在钙释放时，凝胶组分通过hr因子XIII交联。因此，整个凝胶系统可以在室温下在水溶液中储存，而没有过早胶凝。
WO2014/180970A1公开了使用基于PEG的前体分子和凝血酶活化因子XIIIa制备水凝胶。由冻干粉末重新构成因子XIII，并用凝血酶在37℃下活化30分钟。将活化的因子XIIIa的等分试样储存在-80℃下以供进一步使用。在含有50mM氯化钙的Tris-缓冲液(TBS，50mM，pH 7.6)中制备形成水凝胶的前体溶液。通过添加凝血酶活化的因子XIIIa并剧烈混合引发交联反应。该方法的一个缺点是在凝胶形成步骤之前分开进行因子XIIIa的活化。
因此，本发明的目的是避免已知的水凝胶前体制剂的缺点，并且具体是提供可再现地形成水凝胶的水凝胶前体制剂。该目的采用根据权利要求1所述的水凝胶前体制剂实现。
本发明涉及呈未反应的粉末形式的水凝胶前体制剂。未反应的粉末包含活化酶，优选凝血酶；和交联酶，优选转谷氨酰胺酶，更优选因子XIII转谷氨酰胺酶。交联酶在含有或不含缓冲剂的水中可被活化酶活化，优选在含有或不含缓冲剂的电导率＜5μS/cm的水中可被活化酶活化，和/或在pH优选为5至8，更优选为6至8，最优选为6.5至8的水中可被活化酶活化。此外，粉末包含至少一种结构化合物A，优选包含两种不同的结构化合物A和B。所述结构化合物可通过交联酶介导的选择性反应交联以形成水凝胶，其中所述交联酶优选以50至100％，优选为75至100％，更优选为基本上100％的活化度被活化。100％活化意味着100％的因子XIII被活化成因子XIIIa；75％活化意味着75％的因子XIII被活化成因子XIIIa。50％活化意味着50％的因子XIII是活化的因子XIIIa，50％仍然是因子XIII。
因此，水凝胶前体制剂包含制备水凝胶所需的必要组分。这是有利的，因为最终使用者不必对各个组分称重和/或混合。称重和混合是误差源，其通过根据本发明的制剂减少。最终使用者将水凝胶前体制剂重悬在合适的缓冲液中，该缓冲液提供用于形成水凝胶的条件，例如pH和/或离子强度。因此，提高了由水凝胶前体制剂制备的水凝胶的再现性，并简化了水凝胶的制备。
令人惊讶的是，活化的因子XIII在制备混合物中稳定达至少24小时。这意味着无论产生水凝胶的制备混合物(包含活化的因子XIII)例如在室温下，在制备水凝胶或冷冻干燥之前保持的持续时间如何(下文中称为“制备时间”)，得到的水凝胶的物理化学性质(例如胶凝时间、剪切模量G′、溶胀Q)都没有变化。因此，水凝胶的最终凝胶物理化学性质的稳定性与制备混合物的制备时间无关。这说明在这些条件下没有观察到交联酶和/或活化酶的活性损失。
术语“室温”涉及20至25℃的温度。然而，升高的温度，例如在热带国家没有空调的实验室中，升高的温度可以被认为是室温。
更优选地，交联酶在含有或不含缓冲剂的电导率≤5μS/cm和/或钙离子＜10ppm和/或镁离子＜10ppm的水中可被活化酶活化。
水凝胶前体制剂的未反应的粉末可以包含具有任何尺寸和形状的颗粒。供选择地，粉末也可以作为压制片剂或丸剂提供。最优选地，粉末以稳定的压实的饼，例如，在容器底部的稳定的压实的饼的形式提供。当粉末位于容器底部时，这样简化了前体制剂的处理。不必在溶解粉末之前离心以将粉末集中在底部。这改善了凝胶形成的再现性。
该粉末是未反应的，意味着至少一种结构化合物A几乎没有一种与参与选择性反应的对应物反应以形成交联。优选大于70％，更优选大于85％，最优选大于95％的化合物未经历选择性反应。
结构化合物A优选具有至少三个官能度，优选四个或更多个官能度。“官能度”是指在分子上的反应性位点，例如反应性基团的数量。
前体制剂可以基本上不含一价离子，其中如果最终使用者不添加一价离子，则一价离子浓度可以优选在1至60mM，优选在10至30mM的范围内。当用不含一价离子的水凝胶前体制剂制备水凝胶时，形成的水凝胶中的一价离子的量最小化。因此，形成的水凝胶中的一价离子的量可以通过最终使用者根据最终应用添加的缓冲剂来调节。一价离子可能对最终使用者嵌入水凝胶中的细胞有影响。一价离子的存在对诸如细胞生长或活力的性质无负面影响。因此，水凝胶前体制剂得到对嵌入的细胞表现出的负面作用降低的水凝胶。
前体制剂可以基本上不含二价离子，优选不含钙离子，其中所述二价离子浓度可以优选＜10μM，更优选＜1μM，最优选＜10ppm。存在于水凝胶前体制剂中的二价离子，特别是钙离子的减少获得在添加二价离子之前不形成水凝胶的制剂。凝血酶活化的因子XIII的催化活性需要钙离子。因此，在添加钙离子之前，不发生包括凝血酶活化的因子XIII的前体制剂的自发胶凝。与已知的水凝胶前体制剂相比，自发胶凝显著减少。因此，通过使用基本上不含二价离子，优选不含钙离子的水凝胶前体制剂控制或可以控制水凝胶的胶凝。可以选择钙离子的量，使得在Tris-缓冲剂盐水(0.65mM Tris，1.5mM NaCl，pH 7.5)中，在20U/ml因子XIII、0.2U/ml凝血酶和5％w/v结构化合物的存在下，在室温下最多30小时，优选最多100小时实现不胶凝。
此外，至少一种结构化合物A可以包含至少两种不同的反应性基团。不同的反应性基团可以是相容的基团，意味着它们彼此键合，例如交联，以通过活化的交联酶催化的化学反应形成水凝胶。供选择地，前体制剂包含结构化合物A和结构化合物B，其中结构化合物A和结构化合物B的大小和/或官能度和/或官能团/反应性基团不同。水凝胶前体制剂可以包含结构化合物A和接头化合物。“接头化合物”是指化合物分别在结构化合物的两个分子之间或两种结构化合物的两个分子之间形成接头。接头化合物对水凝胶的3D性质没有贡献，因为它是线性/非支化分子。“结构化合物”被定义为支化分子，因此它们有助于水凝胶的3D结构。
所述至少一种结构化合物A可以包含酰基部分，优选两个酰基部分，更优选三个酰基部分，和胺部分，优选两个胺部分，优选三个胺部分。酰基部分可以是谷氨酰胺，胺部分可以是赖氨酸。
如果在制剂中配制两种结构化合物A和B，则二者均可以包含至少谷氨酰胺和至少赖氨酸。供选择地，两种结构化合物A和B之一包含至少一个谷氨酰胺或至少一个赖氨酸；第二结构化合物通过分别包含至少一个谷氨酰胺或至少一个赖氨酸包含相容的反应性基团。
水凝胶前体制剂可以包含至少一种另外的水凝胶化合物，优选至少一种可交联的生物活性化合物。所述至少一种另外的水凝胶化合物，优选至少一种可交联的生物活性化合物，可以通过与水凝胶的两个子单元的交联反应共价结合在水凝胶网络中。另外的水凝胶化合物可以包含谷氨酰胺和/或赖氨酸。如果另外的化合物仅包含一个谷氨酰胺或一个赖氨酸，则另外的化合物将作为所谓的悬挂分子结合在凝胶中，这意味着另外的化合物的结合限定了链的末端。这里，另外的子单元不能连接。
生物活性化合物可以包含RGD肽序列，例如，TG-RGDGln肽，如NQEQVSPLGRGDSPG-NH2，或TG-RGDLys肽，如Ac-FKGGRGDSPG-NH2，或来自纤连蛋白的RGD序列，或来自层粘连蛋白的YISG序列；生长因子结合位点，如肝素结合位点；蛋白酶结合位点或治疗活性化合物。优选地，生物活性化合物包含细胞粘附位点，最优选RGD序列。
生物活性化合物包含至少一种能够进行选择性反应的活性基团。优选地，生物活性化合物包含至少一个赖氨酸和/或一个谷氨酰胺。
生物活性化合物可以通过选择性反应与结构化合物缀合。优选地，该选择性反应是与用于形成水凝胶的选择性反应相同的反应。供选择地，可以在形成水凝胶之前通过选择性反应将生物活性化合物与结构化合物缀合。
结构化合物可以是多支化聚乙二醇，优选8臂聚乙二醇。优选地，8臂聚乙二醇的尺寸为30至50kDa，优选为35至45kDa，更优选为40kDa。结构化合物的每个分支优选包含官能团。
本发明的另外的方面涉及用于制备呈未反应的粉末形式的水凝胶前体制剂的方法。制备方法包括步骤a)、b)和任选的c)。
步骤a)包括在含有或不含缓冲剂的水中，优选在含有或不含缓冲剂的电导率＜5μS/cm，和/或pH优选为5至8，更优选为6至8，最优选为6.5至8的水中混合活化酶、交联酶和至少一种结构化合物A。交联酶可以被所述水中的活化酶活化。
活化酶优选为凝血酶。交联酶优选为转谷氨酰胺酶，更优选为因子XIII转谷氨酰胺酶。优选地，在步骤a)中混合两种不同的结构化合物A和B。
步骤b)可以在步骤a)之前或之后进行。它包括孵育交联酶和活化酶足够长的时间，使得凝胶特性独立于制备时间的持续时间而保持基本恒定，所述凝胶特性如由水凝胶前体制剂制备的凝胶的胶凝时间、剪切模量G′和溶胀Q。基本恒定是指凝胶特性随时间的变化小于15％，优选小于10％，更优选小于5％。实验已经表明，通过充分孵育，达到了上述特性的平台(见下文)，这意味着特性未改变，无论制备时间如何。选项i)在下文中涉及步骤b)在步骤a)之后进行。选项ii)在下文中涉及步骤b)在步骤a)之前进行。
优选地，交联酶和活化酶孵育足够的时间并在一定条件下孵育，使得当在4至37℃的温度下在pH为6.5至8.5的包含1至200mM，优选10至100mM的钙离子的缓冲液中使用1至20％w/v结构化合物、0.1至100U/ml交联酶和0.001至20U/ml活化酶时，可以用前体制剂制备或用前体制剂制备的水凝胶的胶凝时间优选为0.5至30分钟，更优选为1至20分钟，最优选为2至10分钟。
优选地，交联酶和活化酶孵育足够的时间并在一定条件下温育，使得当在4至37℃的温度下在pH为6.5至8.5的包含1至200mM，优选为10至100mM的钙离子的缓冲液中使用1至20％w/v结构化合物、0.1至100U/ml交联酶和0.001至20U/ml活化酶时，可以用前体制剂制备或用前体制剂制备的水凝胶的剪切模量G′优选在100至15′000Pa，更优选在200至5′000Pa的范围内。
优选地，交联酶和活化酶孵育足够的时间并在一定条件下温育，使得当在4至37℃的温度下在pH为6.5至8.5的包含1至200mM，优选10至100mM的钙离子的缓冲液中使用1至20％w/v结构化合物、0.1至100U/ml交联酶和0.001至20U/ml活化酶时，可以用前体制剂制备或用前体制剂制备的水凝胶的溶胀比Q优选在10至100，更优选在20至80的范围内。
任选的步骤c)包括在步骤a)或b)的后者(the later)之后的混合物的冷冻干燥。
结构化合物可通过交联酶介导的选择性反应交联。在步骤a)中在阻碍交联酶介导的交联反应的条件下混合组分。
根据本发明的水凝胶前体制剂的制备方法是有利的，因为或者i)所有组分，如交联酶、活化酶和结构化合物(多种结构化合物)被混合并制备成即用型粉末(根据选项i)，步骤b)在a)之后)，或者ii)交联酶在含有或不含缓冲剂、优选具有所示的最小电导率的水中活化，之后与剩余的凝胶化合物(多种凝胶化合物)混合(根据选项ii)，步骤b)在a)之前)。
选项i)简化了水凝胶前体制剂的制备过程，因为凝胶组分的混合仅在一个步骤中进行。当即用型粉末重悬在缓冲液中时，水凝胶的形成也被简化，并且不需要将交联酶添加到水凝胶前体。总之，改善了上述方法的再现性。在选项i)中，孵育时间等于制备时间。
选项ii)使得水凝胶系统适应最终使用者的需要，因为用于形成水凝胶的交联酶的最终浓度可以自由选择。此处，交联酶的最终浓度与水凝胶前体的干质量无关，因为活化的交联酶可以在形成水凝胶之前添加到水凝胶化合物。在选项ii)中，水凝胶前体和活化的交联酶可以预混合或在单独的容器中冻干。
举例来说，根据选项ii)，在37℃下在不存在钙离子的情况下，在pH为6至8的电导率＜5μS/cm的水中或在Tris-缓冲盐水(例如，0.9mM Tris，13mM NaCl，pH 7.6)中通过活化酶凝血酶活化交联酶因子XIII 30分钟。有趣的是，当在制备混合物中在室温下混合长达24小时时，活化的因子XIII是稳定的。这意味着无论产生水凝胶的制备混合物(包含活化的因子XIII和水凝胶前体)在冷冻干燥之前在室温下保持的持续时间如何，得到的水凝胶的物理化学性质(胶凝时间、剪切模量G′、溶胀Q)都没有变化。因此，最终凝胶物理化学性质的稳定性与制备时间无关。这说明在这些条件下没有观察到交联酶和/或活化酶的活性损失。
步骤a)中获得的混合物的孵育可以在4至37℃，优选10至25℃的温度下，更优选在室温下进行至少0.5小时，优选小于24小时，更优选2至4小时。
如果根据选项ii)，步骤b)在步骤a)之前进行，则步骤b)中的混合物的孵育优选在37℃下进行15分钟至1小时，特别是30分钟。如果根据选项i)，步骤b)在步骤a)之后进行，则步骤b)中的混合物的孵育优选在20℃下进行2至4小时或在37℃下进行1至2小时，以达到其中由水凝胶前体制剂制备的水凝胶的凝胶性质(胶凝时间、剪切模量G′、溶胀Q)基本恒定的平台。在选项i)中，孵育时间基本上等于制备时间。
在步骤b)之后，交联酶可以具有50至100％，优选75至100％，更优选基本上100％的活化度。
此外，在步骤a)中可以添加至少一种另外的水凝胶化合物，优选至少一种可交联的生物活性化合物。至少一种另外的水凝胶化合物，优选至少一种可交联的生物活性化合物可以通过与水凝胶的至少一种子单元的选择性交联反应共价结合到水凝胶网络中。另外的水凝胶化合物可以包含谷氨酰胺和/或赖氨酸。如果另外的化合物仅包含一个谷氨酰胺或一个赖氨酸，则另外的化合物将作为所谓的悬挂分子结合在凝胶中，这意味着另外的化合物的结合限定了缀合的子单元的链的末端。这里，另外的子单元不能连接。
用于制备水凝胶前体制剂的方法可以使用步骤a)中的混合物，其包含1至100U/ml，优选2至50U/ml，更优选4至25U/ml的交联酶，和/或0.01至10U/ml，优选0.02至5U/ml，更优选0.04至0.7U/ml的活化酶。
该方法可以使用步骤a)中的混合物，其包含0.5至25％w/v，优选1至20％w/v，更优选2至10％w/v的至少一种结构化合物A。
该方法可以使用步骤a)中的混合物，其包含0.005至10％w/v，优选0.01至2％w/v的可交联的生物活性化合物，如肽。供选择地，步骤a)中的混合物可以包含0.005至5mg/ml，优选0.2至2.5mg/ml的可交联的生物活性化合物，如重组蛋白或由人或动物组织纯化的蛋白。示例性蛋白是层粘连蛋白。
在用于制备根据本发明的水凝胶前体制剂的方法中使用的缓冲组合物可以包括使游离二价离子，特别是游离钙离子的浓度最小化的措施。这些措施是例如螯合剂，如EDTA或EGTA。根据细胞类型和暴露时间，100至500μM的EDTA浓度可能对细胞有毒性。然而，当细胞被包封在水凝胶中并置于培养基中时，EDTA浓度被稀释3至10倍。EDTA可以通过改变培养基来去除，例如冲洗去除。
此外，在用于根据本发明的水凝胶的制备的方法中，包含水凝胶前体的混合物可以包括在冷冻干燥之前的混合物的过滤，优选无菌过滤。这样得到了不含污染和可能有害的组分，例如细菌的前体制剂。
步骤a)中获得的混合物可以被无菌过滤和/或等分，以处理成可用于下游加工的体积。
冷冻干燥后，可以通过将制剂储存在惰性气体气氛如氮中来降低前体制剂的氧含量。这样使前体制剂中由氧诱导的氧化过程最小化，因此增加了制剂的可储存性。
本发明的另外的方面涉及水凝胶前体制剂，其可通过所讨论的根据本发明的方法获得或通过所讨论的根据本发明的方法获得。
本发明的另外的方面涉及试剂盒，其包含至少一个填充有所讨论的水凝胶前体制剂的容器、具有反应缓冲液的容器，并且任选的使用说明书。该试剂盒提供了用于制备水凝胶的所有必要组分，以便于最终使用者快速、直接地制备水凝胶。
试剂盒的反应缓冲液可以包含1至200mM，优选10至100mM，更优选20至100mM的钙离子。交联酶，优选转谷氨酰胺酶，更优选因子XIII转谷氨酰胺酶的活性所必需的钙离子由反应缓冲液提供，因此通过在反应缓冲液中重悬水凝胶前体制剂的粉末来触发水凝胶的形成。反应缓冲液优选为盐水缓冲溶液，更优选为Tris-缓冲盐水溶液(TBS)。
此外，反应缓冲液的pH可以为5至8，优选为6至8，更优选为6.5至8。
本发明的另外的方面涉及制备水凝胶的方法，包括在反应缓冲液中重悬如所讨论的水凝胶前体制剂的步骤，所述反应缓冲液优选包含钙离子，并任选地添加细胞培养悬液。
在制备水凝胶的方法中，可以用水凝胶前体溶液浇注至少一种凝胶。
在4至37℃，优选10至30℃，更优选15至25℃的温度下，凝胶前体溶液的胶凝时间可以为1至20分钟，优选为2至10分钟，更优选为2至7分钟。胶凝时间是在胶凝发生之前，凝胶前体溶液是液体的时间。
在4至37℃，优选37℃的温度下，凝胶前体溶液的聚合时间可以为10至60分钟，优选为15至45分钟。聚合时间是从胶凝时间结束开始并持续直到凝胶聚合完成的时间。
凝胶前体溶液的聚合优选在37℃下和/或在用于细胞培养的潮湿气氛中进行。
聚合后可以添加细胞培养基或缓冲液。
化合物
结构化合物优选地选自低聚物、聚合物、生物合成的或天然蛋白质或肽和多糖。优选地，结构化合物是选自以下的聚合物：聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯-共-乙烯醇)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-丙烯酸)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯-共-乙烯基吡咯烷酮)、聚(马来酸)、聚(乙烯-共-马来酸)、聚(丙烯酰胺)或聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物或其混合物。结构化合物更优选为具有三条、四条或更多条臂的支化聚(乙二醇)，最优选为八臂聚(乙二醇)。
根据以下给出的附图和实施例，本发明的另外的方面和细节将变得显而易见，其显示：
图1：作为时间(制备时间)的函数的水凝胶的性质，在此期间，在冷冻和冷冻干燥之前处理包含溶液中的凝胶前体、因子XIII和凝血酶的制备混合物；随后将粉末重悬以形成水凝胶并测量其性质；
图2：与WO2014/180970A1中描述的水凝胶相比，由根据本发明的水凝胶前体制剂制备的水凝胶的性质；
图3：取决于制备混合物的制备时间的水凝胶的性质，所述制备混合物在冷冻和冷冻干燥之前包含溶液中的凝胶前体、因子XIII和具有不同浓度的凝血酶；随后将粉末重悬以形成水凝胶并测量其性质；
图4：用于单组分凝胶(C；D)和双组分凝胶(A；B)的水凝胶前体；
图5：与WO2014/180970A1中描述的水凝胶相比，由根据本发明的水凝胶前体制剂制备的水凝胶的性质随制备时间增加的变化；
图6：根据本发明，制备混合物中因子XIII的活化范围随时间的变化；
图7：液体凝胶滴的胶凝时间终点的照片。
图1显示了作为时间(制备时间，即“制备过程的时间”)的函数的水凝胶的性质的图，在此期间，包含溶液中的凝胶前体、因子XIII和凝血酶的混合物在冷冻和冷冻干燥之前保持在室温下。
如图6所概述的制备根据本发明的水凝胶(根据选项i)，步骤a)，然后是步骤b)和步骤c))。这些性质涉及胶凝时间(A)，剪切模量G′(B)和溶胀Q(C)。制备不含钙离子的包含5％w/v结构化合物A(用含谷氨酰胺的底物官能化)和B(用含赖氨酸的底物官能化)、20U/ml的因子XIII和0.2U/ml的凝血酶的混合物并置于在室温(20至25℃)下。在不同时间点，用混合物填充小瓶，在-80℃下冷冻并随后冷冻干燥。冷冻干燥后，将小瓶密封、加盖并储存在-20℃下。此后，使用小瓶通过将冻干的混合物重悬在含有50mM钙离子的适宜的缓冲液(Tris-缓冲液，50mM；pH 7.6)中以诱发由终浓度为10U/ml活化的因子XIII催化的胶凝，与2.5％w/v的结构化合物形成凝胶。图1的图A、B和C显示大约在2至4小时的制备时间之后达到最终水凝胶性质的水平平台。这意味着，超过2小时的制备过程对最终的水凝胶性质没有影响。当制备时间超过2小时时，水凝胶特性(水凝胶性质)保持基本恒定。
图2显示了根据选项i)根据本发明的方法(A、B和C中左边的条)和根据WO2014/180970A1的现有技术方法(A、B和C中右边的条)制备的水凝胶的性质的比较。如图1所述制备根据本发明的混合物，其中制备时间导致最终水凝胶性质的水平平台(此处水凝胶性质保持基本恒定)。WO2014/180970A1公开了在冷冻活化的因子XIII之前，在含钙缓冲液中在37℃下通过凝血酶分开活化因子XIII 30分钟，然后将其添加到水凝胶前体溶液用于水凝胶形成。数据的比较表明，在没有分开预活化因子XIII的情况下，根据本发明的方法制备的水凝胶令人惊讶地表现出与本领域已知的水凝胶类似的胶凝时间、剪切模量G′和溶胀Q。然而，由本发明的方法得到的产品对于最终使用者来说更容易处理，因为可以通过添加适宜的缓冲液直接使用冻干粉末以进行交联反应，而无需称重并且混合步骤更少，称重和混合步骤可能引起误差。
图3显示了取决于制备时间的水凝胶性质的比较，其中在冷冻和冷冻干燥之前，将包含溶液中的凝胶前体、因子XIII和具有不同浓度的凝血酶的混合物保持在室温下。混合物中存在的凝血酶在得到的凝胶中达到的最终浓度为0.1U/ml、0.3U/ml和1U/ml。图A、B和C说明通过在混合物中使用更高浓度的凝血酶，更快地达到代表最终凝胶性质(胶凝时间、剪切模量G′、溶胀Q)的水平平台。如图1所示(根据选项i))制备混合物，针对每种凝血酶浓度的制备时间显示在图的横轴(X轴)中。
图4显示了可用于根据本发明的水凝胶前体制剂或水凝胶前体制剂的制备方法的凝胶组分。显示了单组分凝胶(G、D)和双组分凝胶(A、B)的结构化合物。功能分子，如用于因子XIII交联的被称为X的含Gln的底物和用于因子XIII交联的被称为Y的含有Lys的底物与聚(乙二醇)臂偶联。图4C显示了作为结构组分的4臂聚(乙二醇)，其包含两个谷氨酰胺和两个赖氨酸残基。图4D显示作为结构组分的8臂聚(乙二醇)，其包含四个谷氨酰胺和四个赖氨酸残基。因此，图4C和4D的结构组分在钙离子存在下在由因子XIII催化交联时形成聚合物网络，例如水凝胶。
双组分凝胶需要两种不同类型的分子，其中例如，结构组分是包含至少三个谷氨酰胺残基的多臂聚(乙二醇)和包含两个赖氨酸残基的接头化合物(图4A)。在钙离子存在下，接头化合物在由因子XIII催化交联时共价偶联结构化合物的单个分子。然而，接头化合物不直接有助于水凝胶的3D性质，支化结构化合物有利于该性质。
在图4B中，显示了两种结构化合物A和B的方案。结构化合物A和B基于用含谷氨酰胺的底物(结构化合物A)和含赖氨酸的底物(结构化合物B)官能化的8臂聚(乙二醇)。在钙离子存在下，两种结构化合物在由因子XIII催化交联时有助于形成的水凝胶的3D性质。
图5
图5显示了与WO2014/180970A1中所述的水凝胶相比，由根据本发明，即选项ii)(步骤b)在步骤a)之前，接着是步骤c))的水凝胶前体制剂制备的水凝胶的性质(即胶凝时间、剪切模量G′、溶胀Q)随制备时间的增加的变化。
由根据本发明的水凝胶前体制剂制备的水凝胶如下制备：
如前所述使用乙烯基砜基团(8臂-PEG-VS)进行多臂-PEG(8臂-PEG-OH，Mn＝40kDa，Nektar，Huntsville，AL，USA)的官能化(Ehrbar M，Rizzi SC，Hlushchuk R，DjonovV，Zisch AH等人(2007)Enzymatic formation of modular cell-instructive fibrinanalogs for tissue engineering.Biomaterials 28：3856-3866.；Bott K，Upton Z，Schrobback K，Ehrbar M，Hubbell JA，Lutolf MP，Rizzi SC，The effect of matrixcharacteristics on fibroblast proliferation in 3D gels，Biomaterials.2010 Nov；31(32)：8454-64)。简言之，含有用于FXIII催化的交联的互补底物的肽(Bachem.Switzerland)NQEQVSPLERCG-NH2(TG-Gln)或Ac-FKGGGPQGIWGQERCG-NH2(W-Lys)通过末端官能化的PEG的乙烯基砜基团和肽半胱氨酸残基的硫醇之间的Michael型共轭加成与8臂-PEG-VS偶联，分别产生水凝胶前体TG-PEG 8-臂(结构化合物A)和Lys-PEG 8臂(结构化合物B)。在偶联反应后，用超纯ddH2O对溶液充分透析，随后冷冻干燥。W-Lys肽还包括基质金属蛋白酶(MMP)底物，以使最终的水凝胶易于蛋白水解降解。通过相应地修饰氨基酸序列，还可以使凝胶具有其他类型的动力学和/或对其他蛋白酶的敏感性。
根据本发明的方法制备用于图5的测试的水凝胶，根据选项ii)，包括步骤：步骤a)，在步骤a)之前的步骤b)，和步骤c)。
如上所述制备使用的化合物。简言之，将FXIII(172或200U/mL终浓度)和凝血酶(1.72或2U/mL终浓度)在水或缓冲液(含有15mM NaCl的1mM Tris-缓冲液，不存在Ca2+)中混合并在37℃下预孵育30分钟(步骤b)。因此，在步骤a)中使用之前，因子XIII被完全活化。随后，将该FXIII/凝血酶溶液在室温下与具有化学计量平衡的反应基团的含有结构化合物A和B二者的水溶液(电导率＜5μS/cm)混合(步骤a)。当需要时，可交联的生物活性化合物，例如TG-RGDGln也可以添加到制备混合物。当需要时，可交联的生物活性化合物，例如TG-RGDGln也可以添加到制备混合物。在步骤a)之后的特定时间点(如图中x轴所示)，将样品等分，冷冻并进行步骤c)。将未反应的粉末预混合物(包含活化酶、凝血酶、交联酶、FXIII和结构化合物A和B，以及任选的生物活性化合物TG-RGDGln)用适宜的缓冲液重悬后(见下文)，所得凝胶具有与下面现有技术中描述的凝胶相同的最终组成和特性。
现有技术方法一使用现有技术方法形成并用作本申请中描述的新方法制备的水凝胶的基准的FXIII催化的基于PEG的水凝胶(凝胶)
为了将因子XIII(FXIII)预活化成FXIIIa，如现有技术中所述活化FXIII(Behring，Switzerland)以形成FXIIIa(Ehrbar M，Rizzi SC，Hlushchuk R，Djonov V，Zisch AH等人.(2007)Enzymatic formation of modular cell-instructive fibrinanalogs for tissue engineering.Biomaterials 28：3856-3866.；WO2014/180970A1；Bott K，Upton Z，Schrobback K，Ehrbar M，Hubbell JA，Lutolf MP，Rizzi SC，The effectof matrix characteristics on fibroblast proliferation in 3D gels，Biomaterials.2010 Nov；31(32)：8454-64)。简言之，将由冻干粉末重新构成的FXIII(172.41或200U/mL)用人凝血酶(Sigma，1.72或2U/mL)在37℃下在含有15mM NaCl和2.5mMCaCl2的1mM Tris-缓冲液(pH 7.6)中活化30分钟。随后，将FXIIIa的等分试样储存在-80℃下并用于形成如下所述的凝胶。
简言之，通过如上所述制备的化学计量平衡的TG-PEG 8臂(结构组分A)和Lys-PEG8臂(结构组分B)的FXIII催化的交联形成凝胶。例如，100uL凝胶(2.5％w/v干质量)含有1.22mg结构组分A和1.28mg结构化合物B。凝胶形成反应通常发生在含有50mM氯化钙和终浓度为10U/mL的FXIIIa的Tris-缓冲液(TBS，50mM，pH 7.6)中，所述FXIIIa在结构化合物A和B混合后，作为最后一步添加。当需要时，在添加FXIIIa之前，还在凝胶形成反应中添加可交联的生物活性化合物，例如细胞粘附肽RGD(TG-RGDGln，氨基酸序列：NQEQVSPL-GRGDSPG-NH2；Bachem，Switzerland)(在凝胶中50μM的终浓度)。然后将交联反应混合物在37℃下和在5％CO2潮湿气氛中孵育30至45分钟。
水凝胶机械和溶胀测试
胶凝时间是最终使用者处理凝胶前体溶液以使凝胶在变成固体之前保持液态，并开始成为不能再用液体处理装置处理的凝胶的时间。简言之，当未反应的粉末预混合物(如本发明所述制备的并含有所有制备凝胶的化合物)由最终使用者用适宜的缓冲液重悬时，开始交联反应(即胶凝)，并且测量时间直到液体溶液1形成粘附在移液管尖端3的“小细丝”2，如图7所示。细丝2表明该硬化的凝胶溶液1不再能够由最终使用者用液体处理装置处理。然后继续形成最终凝胶的聚合反应直至反应基团被消耗。对用现有技术方法制备的凝胶进行相同的测量，并且在这种情况下，当最终使用者将预活化的FXIII(FXIIIa)作为最后成分添加到含有所有凝胶化合物的溶液以开始交联反应时，胶凝时间测量开始。
如上所述以不同的制备方案制备凝胶(例如2.5％w/v干质量)。将硬化前的凝胶液滴(80μL体积)夹在具有1mm厚的垫片的无菌疏水玻璃显微镜载玻片(涂覆有SigmaCote，Sig-ma，USA)之间，并在37℃下和在5％CO2潮湿气氛中胶凝45分钟。在完成胶凝并在PBS中溶胀24小时后，使用活检穿孔器制备直径为8mm的凝胶盘，然后在机械测量之前将其储存在相同的缓冲液中。
使用(MCR 302，Anton Paar)进行流变学测量。将凝胶置于流变仪的两个平行板之间并压缩至最多达其原始厚度的80％以避免滑动。进行恒定频率的应变扫描以确认在水凝胶的线性粘弹性行为范围内进行测量。在恒定应变下记录作为频率的函数的弹性剪切模量(G′)。将每个溶胀的盘样品的G′值计算为在0.1和0.2Hz之间测量的G′值的平均值。所有测量均在室温(22℃)下进行。溶胀Q(＝ws/wd)计算为在PBS中膨胀平衡时的水凝胶(ws)与其的理论干质量(wd)的重量比(Bott K，Upton Z，Schrob-back K，Ehrbar M，Hubbell JA，Lutolf MP，Rizzi SC，The effect of matrix characteristics on fibroblastproliferation in 3D gels，Biomaterials.2010 Nov；31(32·)：8454-64)。
图5显示了与如上所述的现有技术方法相比，使用根据本发明的方法(选项ii)获得的结果。
根据选项ii)的方法对应于包括以下步骤的制备方法：步骤b)，然后是步骤a)和步骤c)。简言之，将交联酶和活化酶预混合并在37℃下预孵育30分钟(步骤b))。随后，将结构化合物在室温下添加到酶预混合物(制备混合物开始)(步骤a))并无菌过滤，然后在0.6小时、1小时、2小时、4小时、6小时和21.8小时，将制备混合物的等分试样冷冻干燥(步骤c))。
在37℃下进行在Ca2+不存在的情况下的FXIII与凝血酶的预孵育30分钟，然后与剩余的前体溶液(包含结构化合物)混合以产生制备混合物。这种预孵育方式是有益的，因为FXIII似乎已经被活化至100％(和/或类似于现有技术)。随后，无论制备混合物在冷冻干燥前置于室温下的持续时间(制备时间)如何，最终凝胶性质都不改变。图5中的图表A、B和C说明最终的凝胶性质(胶凝时间、剪切模量G′、溶胀Q)在制备时间内是稳定的，该制备时间即在冷冻干燥之前制备混合物保持在室温下的时间。此外，最终的凝胶性质与用现有技术方法获得的性质相似。
图6
图6显示了根据本发明(选项i)，制备混合物中的因子XIII的活化随时间的变化。
根据本发明的方法制备的水凝胶，根据选项i)，包括步骤：步骤a)，在步骤a)之后的步骤b)，和步骤c)。
在下文中，举例说明如何制备包含活化酶(凝血酶)、交联酶(FXIII)、结构化合物A和B和任选的生物活性化合物TG-RGDGln的未反应的粉末预混合物。然后，最终使用者使用这些冻干的预混合物以形成2.5％w/v干质量的凝胶。最终的2.5％w/v凝胶含有与用图5所概述的现有技术方法制备的2.5％w/v凝胶完全相同的结构(和生物活性)化合物，FXIII和凝血酶的浓度。
在电导率＜5的水中制备5％w/v的结构化合物A和B二者的溶液(如上所概述的制备)，并与化学计量平衡的反应基团混合。将FXIII和凝血酶(二者均溶于分开的容器中的水中)与5％w/v结构化合物混合物混合，以分别达到约为20U/mL和0.2U/mL的最终浓度。单位FXIII与单位凝血酶的比例保持在100比1，以模拟现有技术条件下的交联酶和活化酶的比例。
当需要时，可交联的生物活性化合物，例如，TG-RGDGln也可以添加到制备混合物。制备混合物的制备在不存在Ca2+的情况下进行，并且该过程在室温下进行。制备混合物的pH范围为6.5-8。
在如上所述混合所有化合物之后，使用例如孔径为0.22μm的常规针筒过滤器对制备混合物进行无菌过滤。随后，将无菌溶液装入为冷冻干燥而制备的容器中，以获得即用型未反应粉末。
一般而言，在特定时间点(制造混合物在室温下孵育0.25至25小时之间；参见图1和6)将等分试样冷冻并冷冻干燥以产生包含制备凝胶所需的所有化合物的未反应的粉末(在容器的底部)。由在室温下停留超过2至4小时的这样的制备混合物制备的凝胶的凝胶特性(胶凝时间、剪切模量G′)保持稳定(见下文)。
通过重悬含有制备凝胶所需的所有化合物的冷冻干燥的未反应粉末制备凝胶
将未反应的粉末(在孵育不同时间后通过冷冻干燥制备混合物制备的，步骤c))重悬于含有50mM氯化钙的Tris-缓冲液(Tris 50mM，pH 7.6)中以形成凝胶，所述凝胶具有2.5％w/v的结构化合物干质量，以及分别为10U/mL和0.1U/mL的因子XIII和凝血酶的终浓度(类似于如图5所概述的现有技术方法制备的凝胶)。典型的重悬体积范围为50至1000uL。如下所示测量这些凝胶的物理化学特征，并用如下所示的现有技术方法制备的凝胶作为基准。
制备根据现有技术的凝胶并如图5所示测试。测试包括10U/mL(作为100％活化基准)和5U/mL(作为50％活化基准)的完全活化的FXIII(按照现有技术方法的FXIIIa)的浓度。为了制作图6a，随后用描绘胶凝时间的作为制备时间(如图1所示制备的)的函数的图1A的值绘制这些数据。基于胶凝时间(图6A)，制备混合物中的FXIII看起来在大约1小时和4小时的制备时间后分别具有与50％和100％活化基准相当的活性。
将相同样品的G′绘制在图6B中，并且在约2小时的制备时间之后已经获得类似于现有技术凝胶(100％活化基准)的G′。这表明冷冻干燥之前制备混合物中的FXIII未被完全活化(即与100％活化基准相比)，因为当用适宜的缓冲液(50mM Tris-缓冲液，50mM CaCl2，pH 7.6)重悬冷冻干燥的粉末时，FXIII活化可以在胶凝期间继续和/或完成。然而，优选的是制备混合物中FXIII的活化接近100％。
优选的实施方案
表1

Claims (17)

1.一种未反应的粉末形式的水凝胶前体制剂，其包含：
-活化酶，优选凝血酶，
-交联酶，优选转谷氨酰胺酶，更优选因子XIII转谷氨酰胺酶，其中所述交联酶在含有或不含缓冲剂的水中可被所述活化酶活化，优选在含有或不含缓冲剂的电导率＜5μS/cm的水中可被所述活化酶活化，和/或在pH优选为5至8，更优选为6至8，最优选为6.5至8的水中可被所述活化酶活化，
-至少一种结构化合物A，优选两种不同的结构化合物A和B，
其中所述结构化合物可通过所述交联酶介导的选择性反应交联以形成水凝胶，其中所述交联酶优选以50至100％，优选75至100％，更优选基本上100％的活化度被活化。
2.根据权利要求1所述的水凝胶前体制剂，其中所述前体制剂基本上不含二价离子，优选基本上不含钙离子，其中所述二价离子浓度优选<10μΜ，更优选<1μΜ，最优选<10ppm。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的水凝胶前体制剂，其中所述至少一种结构化合物包含至少两种不同的反应性基团。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的水凝胶前体制剂，其中所述至少一种结构化合物包含酰基部分，优选两个酰基部分，和胺部分，优选两个胺部分。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的水凝胶前体制剂，其中所述水凝胶前体制剂包含至少一种另外的水凝胶化合物，优选至少一种可交联的生物活性化合物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的水凝胶前体制剂，其中所述结构化合物为多支化聚乙二醇，优选8臂聚乙二醇。
7.一种用于制备未反应的粉末形式的水凝胶前体制剂的方法，优选地，一种用于制备根据权利要求1至6所述的未反应的粉末形式的水凝胶前体制剂的方法，其包括以下步骤：
a)在含有或不含缓冲剂的水中，优选在含有或不含缓冲剂的电导率＜5μS/cm的水中，和/或在pH优选为5至8，更优选6至8，最优选6.5至8的水中混合：
-活化酶，优选凝血酶，
-交联酶，优选转谷氨酰胺酶，更优选因子XIII转谷氨酰胺酶，其中所述交联酶在水中可被所述活化酶活化，
-至少一种结构化合物A，优选两种不同的结构化合物A和B，
b)在步骤a)之前或之后孵育所述交联酶和活化酶足够的时间，使得凝胶特性独立于制备时间的持续时间而保持基本恒定；
c)任选地在步骤a)或b)之后冷冻干燥所述混合物，
其中所述结构化合物可通过所述交联酶介导的选择性反应交联，并且其中在a)中在阻碍所述交联酶介导的交联反应的条件下混合所述组分。
8.根据权利要求7所述的方法，其中在4至37℃，优选10至25℃的温度下，更优选在室温下，对a)中获得的混合物的孵育至少0.5小时，优选小于24小时，优选2至4小时。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中在步骤b)之后，所述交联酶具有50至100％，优选75至100％，更优选基本上100％的活化度。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中在步骤a)中添加至少一种另外的水凝胶化合物，优选至少一种可交联的生物活性化合物。
11.一种水凝胶前体制剂，其可通过根据权利要求7至10中任一项所述的方法获得或通过根据权利要求7至10中任一项所述的方法获得。
12.一种试剂盒，其包括至少一个填充有如权利要求1至6中任一项所述的水凝胶前体制剂的容器、具有反应缓冲液的容器，并且任选的使用说明书。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述反应缓冲液包含在1至200mM，优选10至100mM，更优选20至100mM范围内的钙离子。
14.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其中所述反应缓冲液的pH为5至8，优选6至8，更优选7至8。
15.一种水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：
a)将根据权利要求1至6所述的水凝胶前体制剂重悬于反应缓冲液中，所述反应缓冲液优选包含钙离子，
b)任选地添加细胞悬液。
16.根据权利要求15所述的方法，其中使用所述水凝胶前体溶液浇注至少一种凝胶。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中在4至37℃，优选10至30℃，更优选15至25℃的温度下，所述凝胶前体溶液的胶凝时间在1至20分钟，优选2至10分钟，更优选2至7分钟的范围内。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114728097A (zh) * 2019-09-06 2022-07-08 精准癌症技术公司 用于获得健康肠类器官的方法
CN115058383A (zh) * 2022-06-20 2022-09-16 广东旺合生物科技有限公司 三维重编USCs、其培养方法及其在抗糖尿病和降血压中的应用

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9719068B2 (en) 2010-05-06 2017-08-01 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation
CA2949834A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 James Macormack Wells Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation
JP6804438B2 (ja) 2014-10-17 2020-12-23 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 多能性幹細胞を使用するヒト小腸のｉｎ ｖｉｖｏモデル、並びにそれを作製、及び使用する方法
CA3016641A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Children's Hospital Medical Center Methods for the in vitro manufacture of gastric fundus tissue and compositions related to same
CN110062764A (zh) 2016-12-05 2019-07-26 儿童医院医学中心 结肠类器官及其制备和使用方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5834232A (en) * 1996-05-01 1998-11-10 Zymogenetics, Inc. Cross-linked gelatin gels and methods of making them
CN102858845A (zh) * 2010-04-22 2013-01-02 Q吉尔股份有限公司 水凝胶前体制剂及其制备方法
US20160116453A1 (en) * 2013-05-08 2016-04-28 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Arrays of discrete cell culture microenvironments, method of making such arrays and uses thereof
WO2016091336A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) A method for building a structure containing living cells

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5834232A (en) * 1996-05-01 1998-11-10 Zymogenetics, Inc. Cross-linked gelatin gels and methods of making them
CN102858845A (zh) * 2010-04-22 2013-01-02 Q吉尔股份有限公司 水凝胶前体制剂及其制备方法
US20160116453A1 (en) * 2013-05-08 2016-04-28 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Arrays of discrete cell culture microenvironments, method of making such arrays and uses thereof
WO2016091336A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) A method for building a structure containing living cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADRIAN RANGA等: "Hyaluronic Acid Hydrogels Formed in Situ by Transglutaminase-Catalyzed Reaction", 《BIOMACROMOLECULES》 *
TRACY J. SANBORN等: "In situ crosslinking of a biomimetic peptide-PEGhydrogel via thermally triggered activation of factor XIII", 《BIOMATERIALS》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114728097A (zh) * 2019-09-06 2022-07-08 精准癌症技术公司 用于获得健康肠类器官的方法
CN114728097B (zh) * 2019-09-06 2024-01-30 精准癌症技术公司 用于获得健康肠类器官的方法
CN115058383A (zh) * 2022-06-20 2022-09-16 广东旺合生物科技有限公司 三维重编USCs、其培养方法及其在抗糖尿病和降血压中的应用

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