CN102858845B - 水凝胶前体制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水凝胶前体制剂、其制备方法和包含所述制剂的试剂盒以及利用所述制剂制备水凝胶的方法。所述的前体制剂包含至少一种结构性化合物和至少一种连接体化合物，所述结构性化合物优选为乙烯砜（丙烯酸支化的）聚（乙二醇），所述连接体化合物可以通过亲核试剂与共轭的不饱和键或基团之间的选择性反应聚合。所述的前体制剂是粉末形式的。
Description
本发明涉及水凝胶前体制剂、其制备方法和包含所述制剂的试剂盒以及利用所述制剂制备水凝胶的方法。
三维细胞培养支架已被认为提供基因表达谱和其它细胞活动的可能，所述基因表达谱和其它细胞活动相比于传统的在皿中的二维细胞培养物更接近地模拟活的有机体。
这已经导致了新的合成聚合物水凝胶家族的开发，所述的新的合成聚合物水凝胶通常被称为人工ECM(aECM)，因为它们模拟了细胞外基质的许多方面。一个主要的挑战是提供化学作用，该化学作用使基质在细胞或生物分子存在下能交联以及使得生物分子对基质自身稳定栓接。
近年来，开发了使得在细胞或生物分子存在下形成凝胶的不同机理。例如，建议了基于低分子量构件的自组装的机理，所述低分子量构件如肽(Estroff等人:Watergelation by small organic molecules；Chem.Rev.2004；104(3)；1201-18)或脲基嘧啶酮(ueidopyrmimidinone)(Zhang S.:Fabrication of novel biomaterials throughmolecular self-assembly；Nat.Bio-technol.2003；21(10)；1171-8)以及中等分子量的两性嵌端共聚物(例如，参见Hartgerink等人：Peptide amphiphile nonofibers:Aversatile scaffold for the preparation of self-assembling materials；Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.2002；99(8)；5133-8)。
WO00/454808描述了新的生物材料，特别用于形成水凝胶，其具有基于在亲核试剂和共轭的不饱和键或基团之间Michael型加成反应的交联化学作用，其使得在细胞或生物分子存在下形成凝胶。此外，可以将特异的信号分子通过特异性反应整合到凝胶基质中。
该系统的一个主要缺点是在凝胶化之前它依赖于将至少两种前体组分人工混合。实际上，由于i)粉末形式的不同组分的再悬浮条件、ii)前体溶液的混合比例的无意识变化，使用多组分的溶液可能是误差的源头，由此导致该凝胶组合物的使用复杂以及有重复性上的问题。此外，与将需要单一的溶液来生产凝胶的方法进行放大相比，将需要将几种溶液混合来生产凝胶系统的方法进行放大更为昂贵。
因此，本发明的目的在于避免已知水凝胶制剂的缺点，并且特别地在于提供水凝胶前体，所述的水凝胶前体易于处理并使得能够使用高度可重复的组合物来制备水凝胶。这一目的由根据权利要求1的水凝胶前体解决。
根据本发明的水凝胶前体制剂包含至少一种结构性的(structural)化合物和至少一种连接体化合物，其中所述结构性的化合物与所述连接体化合物可以通过亲核试剂与共轭不饱和键或基团之间选择性的反应来聚合。所述水凝胶前体制剂是未反应的粉末形式。
所述制剂的优点在于所述粉末可以简单地再悬浮，优选地在缓冲溶液中再悬浮，来使凝胶化反应开始。不需要将不同组分进行混合，由此可观地降低了在至少一种结构性化合物与至少一种连接体化合物之间比例出错的可能性。因此，这提高了由这些水凝胶前体制备的水凝胶的可重复性。此外，本发明的水凝胶前体提供了使用上的便利。
本发明的水凝胶制剂是粉末形式的。所述的粉末可以包含任何尺寸和形状的颗粒。供选择地，粉末还可以作为压实的小片或小丸来提供。最优选地，粉末可以以稳定的压实块的形式来提供，例如所述的压实块在容器底部。
所述的粉末是未反应的，意味着几乎没有至少一种结构性化合物已经与至少一种连接体化合物通过选择性反应发生了反应。优选地，大于70％、更优选地大于85％、最优选地大于95％的化合物未曾经历选择性反应。
所述的选择性反应是亲核试剂与共轭的不饱和键或基团之间通过亲核加成的反应。这样的反应也称作Michael型加成反应。
所述结构性化合物的官能度至少为三，但最优选地所述结构性化合物的官能度为四或者更多。“官能度”的意思是在分子上反应性位点的数目。
所述的结构性化合物优选地选自寡聚物、聚合物、生物合成的或天然的蛋白质或肽和多糖。优选地，所述的结构性化合物选自聚乙二醇、聚氧乙烯、聚乙烯醇、乙烯-乙烯醇共聚物、聚丙烯酸、乙烯-丙烯酸共聚物、聚乙烯噁唑啉、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-乙烯吡咯烷酮共聚物、聚马来酸、乙烯-马来酸共聚物、聚丙烯酸酰胺或聚氧化乙烯与聚氧化丙烯的嵌段共聚物或其混合物。更优选地，所述的结构性化合物为聚乙二醇，最优选地为具有三个、四个或更多个臂(arm)的支化聚乙二醇。
所述的连接体化合物的官能度至少为二，并且选自寡聚物、聚合物、生物合成的或天然的蛋白质或肽以及多糖、或它们的混合物。优选地，所述的连接体化合物为肽序列，最优选地其包含粘附位点、生长因子结合位点或蛋白酶结合位点。
所述的亲核试剂优选地为强亲核试剂，例如硫醇或含有硫醇的基团。所述的亲核试剂还可以为本领域已知的任意其它类型的亲核试剂，例如胺，条件是其足够强以进行选择性反应。此外，所述的共轭的不饱和基团优选为丙烯酸、丙烯酰胺、醌或乙烯基吡啶。最优选地，所述不饱和基团为乙烯砜。
此外，本发明的水凝胶前体制剂可以包含至少一种生物活性化合物，优选地包含RGD肽序列，所述生物活性化合物可以通过亲核试剂与共轭的不饱和键或基团之间的选择性反应与结构性化合物缀合。
所述的生物活性化合物可以包括粘附位点，如来自纤连蛋白的RGD序列或来自层粘连蛋白的YISG序列；生长因子结合位点，如肝素结合位点；蛋白酶结合位点或药学活性化合物。优选地，所述的生物活性化合物包含细胞粘附位点，最优选地为RGD序列。
所述的生物活性化合物包括至少一种能够经历自身选择性反应的活性基团。更优选地，所述的生物活性化合物包含至少一种亲核基团，最优选地包含硫醇基团。
所述的生物活性化合物可以通过亲核试剂与共轭的不饱和键或基团之间的自身选择性反应与结构性化合物缀合。最优选地，这一自身选择性反应与在结构性化合物与连接体化合物之间的自身选择性反应，特别地与相同类型的亲核试剂与共轭的不饱和键或基团之间的自身选择性反应是相同的反应。供选择地，在连接体化合物与结构性化合物聚合之前，所述的生物活性化合物可以通过自身选择性反应来与结构性化合物缀合。
所述的结构性化合物优选地为具有官能化的末端基团的多支化聚乙二醇(PEG)。更优选地，所述的末端基团用乙烯砜来官能化。最优选地，所述结构性化合物为PEG-三(乙烯砜)或PEG-四(乙烯砜)。PEG的醇基团的乙烯砜官能化可以通过本领域已知的任何适合的反应来实现。通过使用具有三个、四个或更多个分支的支化聚乙二醇有可能制备出官能度为三、四或者更多的结构性化合物。
优选地，所述的连接体包括至少两种亲核基团，优选地硫醇基团。硫醇是强的亲核试剂，其易于在生理pH下与不饱和键或基团经历Michael型加成。此外，硫醇普遍存在于生物体系中，使得它们的使用不造成毒性问题。
所述的连接体化合物优选地为肽，该肽包含至少两个半胱氨酸，优选地所述的半胱氨酸位于肽的N-端和C-端附近。合成具有两个或更多个半胱氨酸残基的肽是简单易行的。还可能的是，在此肽中引入特异性的蛋白酶位点，以制备可降解的水凝胶，所述的水凝胶例如用于在活体内使用。此外，通过改变临近半胱氨酸的氨基酸，可以改变硫醇基团的pKa值。
优选地，所述的半胱氨酸位于肽的N-端和C-端，从而得到了具有H2N-CXXXXXXXXC-COOH(SEQ ID NO:1)结构的肽，优选地所述的肽具有乙酰化的N-端，Ac；和酰胺化的C-端，NH2；其中C是半胱氨酸的单字母表示，而X代表除了半胱氨酸外的任意氨基酸。该肽可以具有任意长度，因此X(Xn)的数目可以是任何数目。优选地，所述的肽具有16个氨基酸的长度。供选择地，所述的半胱氨酸可能位于从N-端或C-端远离的一个或多个氨基酸处，例如，从而得到了具有一般结构H2N-XmCXnCXp-COOH(SEQ ID NO:2)的肽。这里m、n和p可以是包括零的任意整数。
最优选地，所述的连接体化合物是序列为H2N-GCRE-XXXXXXXX-ERCG-COOH(SEQ IDNO:3)的肽。甘氨酸(G)作为间隔子(spacer)，精氨酸(R)提高了邻近的半胱氨酸的硫醇基团的反应性，并且谷氨酸(E)增强了肽在水溶液中的溶解性。
最优选地，所述的连接体化合物的序列是H2N-GCRE-GPQGIWGQERCG-COOH(SEQ IDNO:4)或者H2N-GCREGDQGIAGFERCG-COOH(SEQ ID NO:5)，还优选地具有乙酰化的N端和酰胺化的C端。
用于连接体化合物和生物活性化合物的肽应当在在酸性溶剂中合成和处理，最优选地，在含有三氟乙酸(TFA)的溶液中合成和处理。在肽合成之后，结合至肽粉末的残留三氟乙酸可以起到使含有相对应肽的水悬浮液的pH值降低至4以下的作用。
结构性化合物和/或连接体化合物进行选择，以使得在混合的条件下，结构性化合物与连接体化合物之间的选择性反应速率被阻止或者大大地减慢。优选地，相比于pH值为7或者在7以上时，此反应的速率在pH值为4或在4以下时被大大地减慢。
如此地选择化合物以提供前体制剂，所述前体制剂在生理条件下会易于发生凝胶化反应，但这使得它的制备能在没有或者几乎没有选择性反应发生的条件下进行。
优选地，对结构性化合物和/或连接体化合物进行选择，从而使得在pH为7.5时的自身选择性反应的反应速率是pH为7时的反应速率的至少2倍。
本发明的另一个目的是提供水凝胶前体制剂的制备方法。这个问题可以通过如权利要求8所述的方法来解决。
所述的方法包括以下步骤：
—提供包含至少一种结构性化合物的第一溶液A；
—提供包含至少一种连接体化合物的第二溶液B；
—将所述溶液A与B混合；并且
—将得到的前体溶液冻干
所述至少一种结构性化合物和所述至少一种连接体化合物可通过亲核试剂与共轭的不饱和键或基团之间的选择性反应聚合。所述溶液A和B两者在阻止所述选择性反应的条件下混合。
所述方法使得能够制备粉末形式的，包含结构性化合物和连接体化合物的水凝胶前体制剂。可以按照阻止自身选择性反应这样的方式来选择混合的条件。这就意味着该反应的速率足够慢，以致溶液A和B中很大部分的化合物在冻干之前没有通过自身选择性反应进行反应。优选地，在两种溶液中大于70％的、更优选地大于85％、最优选地大于90％以上的分子在冻干步骤之前不经历选择性反应。
混合的条件可以通过pH的调节、不同化合物的浓度、制备时间、温度或者溶剂等条件来选择。优选地，在pH为4或者4以下进行混合。特别是，当将硫醇用作亲核试剂时，pH值为4或者4以下充分地阻止了自身选择性反应。混合优选在室温下进行。
因为溶液A的pH大约为7，而溶液B的pH在4以下，所以重要的是将溶液A加入到溶液B中。如果将溶液B加入到溶液A中，那么自身选择性的聚合反应就会在混合步骤过程中开始。当将溶液A加入到溶液B时，得到的溶液的pH将一直在4以下，因此抑制了反应。
溶液A优选地包含5-10％w/v的至少一种结构性化合物。最优选地，溶液A包含7.5％w/v的至少一种结构性化合物。
此外，溶液B优选地包含0.1-2％w/v的至少一种连接体化合物，最优选地，溶液B包含1％w/v的至少一种连接体化合物。连接体化合物的此浓度为化合物在溶液中提供良好的溶解度。
通过对于溶液A和B使用前文所述的结构性化合物和连接体化合物浓度，导致了在冻干之后形成压实粉末。该压实粉末会在容器的底部形成像蛋糕一样的层，这是有利的。此外，在制备过程中，使用两种化合物的这些相对低的溶度可以额外降低在结构性化合物与连接体化合物之间发生不想要的超前反应(pre-mature reaction)的可能性。另外，相比于较高的浓度，在随后的制备步骤中这样的浓度使得材料的损失减少。
此外，溶液A和/或溶液B优选分别为至少一种结构性化合物或者至少一种连接体化合物分别在蒸馏水中的溶液。因此，两种化合物都存在于非缓冲溶液中。由于粘附到溶液B的肽连接体化合物的三氟乙酸，因此该溶液的pH会降低。这使得由溶液A和B得到的混合物的pH优选地为4以下。更优选地，得到的溶液的pH在3.5左右。
供选择地，在与溶液B混合之前，溶液A)可以先与另外的溶液C混合，所述C溶液含有生物活性化合物，所述的生物活性化合物可以通过在亲核试剂与共轭的不饱和键或者基团之间的选择性反应来与结构性化合物二聚化。这种生物活性化合物可以包括粘附位点，比如来自于纤连蛋白的RGD序列或者来自于层粘连蛋白的YISG序列；生长因子结合位点，如肝素结合位点；蛋白酶结合位点或者有治疗活性的化合物。优选地，所述的生物活性化合物包括细胞粘附位点，最优选地包括RGD序列。
优选地，溶液C包含0.1-10％w/v的生物活性化合物。更优选地，溶液C包含0.1-5％w/v的生物活性化合物，最优选地包含0.1-2％w/v的生物活性化合物。
分别改变溶液A中的结构性化合物的量，任选的溶液C中生物活性化合物的量，以及溶液B中连接体化合物的浓度以及性质(例如，氨基酸序列)使得能够制备出具有不同特性的水凝胶前体制剂。
尽管改变溶液A和溶液B中化合物的浓度的可能性很多，但是优选地，选择化合物的浓度以使得亲核试剂与共轭不饱和键或基团的摩尔比率产生最佳的物理化学性质，比如最终凝胶的最大的剪切模量和最小的膨胀特性。通常，亲核试剂与共轭的不饱和键或基团的最佳比率为0.8:1至1.3:1的范围。这保证了几乎所有的活性基团都已经历选择性反应来形成水凝胶，从而使得任何反应性基团的副反应相当大地减少了。
此外，在进行冻干步骤之前，前体溶液可以进行过滤。所述过滤优选为无菌过滤。在进行冻干步骤之前，可以将任何未溶解的化合物以及细菌污染物都从混合物中去除掉。
优选地，在冻干步骤之前，将预混合的前体溶液等分并装入容器中，所述的容器优选地是无菌容器。这使得能够生产出含有特定量水凝胶前体制剂的单一容器。这种容器可以是任何合适的材料的，例如塑料或者玻璃。优选所述的容器是小瓶子。
优选地在冻干步骤之后将容器用无菌氮气填充并立即加盖。这保护了水凝胶前体粉末不与水和/或氧接触，这样的接触可能会导致亲核试剂过早的聚合或氧化。
本发明的另一个目标在于如上所述的水凝胶前体制剂在制备水凝胶中的用途。
本发明的又一个的目标在于提供易于使用的系统，该系统用于制备具有高度地可重现结果的水凝胶。这个问题通过根据权利要求20的试剂盒来解决。
本发明的试剂盒包括至少一个本文所述的水凝胶前体制剂填充的容器和一个具有反应缓冲液的容器。所述的容器优选包括一定量的前体制剂粉末，该粉末当使用定量的反应缓冲液来再悬浮时，将得到具有预定特性的凝胶。
所述的反应缓冲液的pH优选为7以上。更优选地，该反应缓冲液的pH为7至8。该缓冲液优选地包含HEPES，优选地HEPES的浓度为0.3M且pH调节为7至8之间的值。这使得聚合反应足够快地进行。
本发明再一个目标在于提供一种易于使用方法来制备水凝胶。这个目标通过根据权利要求22的方法来实现。
制备水凝胶的此方法包括以下步骤：
—在pH为7的缓冲液中，更优选地在7至8的缓冲液中将本文所述的水凝胶前体制剂再悬浮；
—任选地将细胞培养悬浮液加入至该前体悬浮液；
—使用前体悬浮液来浇注(casting)凝胶前体；和
—将凝胶前体聚合至少30分钟，优选地聚合30-45分钟，优选地在37℃的恒温箱中进行聚合。
本发明的水凝胶前体制剂可以在生理条件下聚合，这使得可以将细胞培养液加入到前体悬浮液中，从而在凝胶化之前，细胞均匀地分布在悬浮液中。这对于任何其他前体系统是不太轻易办到的。
本发明的进一步细节和益处将通过以下的附图和实施例来呈现。
图1：根据本发明的水凝胶前体制剂的制备方法的实施方案的示意图；
图2：根据本发明的水凝胶前体制剂的制备方法的第二实施方案的示意图；
图3：根据本发明的水凝胶前体制剂的制备方法的第三实施方案的示意图。
图1显示了根据本发明的水凝胶前体制剂的制备方法的实施方案的示意图。在混合步骤1中，将包含7.5％w/v的带有4个由乙烯砜官能化的手臂的支化PEG的溶液A加入到包含1％w/v的含有两个半胱氨酸的肽序列的溶液B进行混合步骤1，所述两个半胱氨酸的一个接近C端而另一个接近N端。
例如，将275mL包含7.5％w/v官能化的PEG的溶液A加入到425mL包含1％w/v连接体肽的溶液B中。
溶液A和B通过将相应的化合物分别悬浮在蒸馏水中来制备。对于溶液B来讲，优选地将肽连接体化合物以小部分加入至水中。使用磁力搅拌器以400RPM下持续地搅拌来进行混合。随后，对如此得到的前体溶液4进行无菌过滤步骤5，例如使用具有0.2μm的绝对速率(absolute rating)的，具有PTEE膜的Mini Kleenpak过滤器(PALL Corp.)，得到经过滤的前体溶液6。然后，对该溶液进行冻干步骤7，得到粉末形式的水凝胶前体制剂8。得到的粉末为稳定压实块形式。
冻干步骤7可以通过在架上将溶液在-50℃下进行第一冷冻150分钟，然后在0.26mbar的压力下、-10℃的温度下进行第一干燥570分钟来实施。接着在0.02mbar的压力下、20℃的温度下进行第二干燥步骤180分钟。
图2中显示了根据本发明的水凝胶前体制剂的制备方法的第二实施方案。在该实施方案中，将包含7.5％w/v的带有4个由乙烯砜官能化的手臂的支化PEG的溶液A与包含2％w/v的含有RGD序列的肽溶液C在混合步骤2中混合。
例如，将包含7.5％w/v的四分枝官能化的PEG的275mL溶液A与含有2％w/v生物活性化合物的5mL溶液C混合。然后，将此溶液随即与包含1％w/v的含有两个半胱氨酸的肽连接体溶液B在混合步骤1中混合，所述两个半胱氨酸一个接近于C端而另一个接近于N端。
随后，将如此得到的前体溶液4进行无菌过滤步骤5，得到滤液前体溶液6。然后，对该溶液进行冻干步骤7，得到粉末形式的水凝胶前体制剂8。
图3显示了根据本发明的水凝胶前体制剂的制备方法的第三实施方案。将包含7.5％w/v的带有4个由乙烯砜官能化的手臂支化PEG的溶液A与包含1％w/v含有两个半胱氨酸的肽序列的溶液B在步骤1中混合，所述两个半胱氨酸一个接近C端而另一个接近N端。溶液A和B通过将相应的化合物分别悬浮在蒸馏水中来制备。借助磁力搅拌器优选以400RPM下持续搅拌进行混合。随后，对如此得到的前体溶液4进行无菌过滤步骤5，得到经过滤的前体溶液6。然后将得到的溶液在等分步骤9中等分至容器中。每个容器可以仅含有少量，优选为0.3-0.4mL。容器是可密封的，且优选由玻璃制造。将等分的前体溶液10在冻干步骤7中冻干以得到前体制剂粉末8。
Claims (34)
1.一种水凝胶前体制剂，其包含至少一种结构性化合物和至少一种连接体化合物，其中所述结构性化合物与所述连接体化合物能通过亲核试剂与共轭不饱和键或基团之间的选择性反应来聚合，其特征在于，所述水凝胶前体制剂为未反应的粉末形式，所述未反应的粉末包含稳定的压实块形式的所述结构性化合物和所述至少一种连接体化合物两者，所述水凝胶前体制剂是通过将至少一种结构性化合物的第一溶液A和包含至少一种连接体化合物的第二溶液B在阻止所述选择性反应的条件下混合；并且将得到的前体溶液冻干获得的。
2.如权利要求1的水凝胶前体制剂，其特征在于，所述制剂还包含至少一种生物活性化合物，所述生物活性化合物能通过亲核试剂与共轭不饱和键或基团之间的选择性反应与所述结构性化合物二聚化。
3.如权利要求2的水凝胶前体制剂，其特征在于，所述生物活性化合物包含RGD肽序列。
4.如权利要求1所述的水凝胶前体制剂，其特征在于，所述结构性化合物为具有乙烯砜端基的多支化聚乙二醇。
5.如权利要求4所述的水凝胶前体制剂，其特征在于，所述结构性化合物为PEG-三(乙烯砜)或PEG-四(乙烯砜)。
6.如权利要求1所述的水凝胶前体制剂，其特征在于，所述连接体包含至少两个亲核基团。
7.如权利要求6所述的水凝胶前体制剂，其特征在于，所述连接体包含至少两个硫醇基团。
8.如权利要求1所述的水凝胶前体制剂，其特征在于，所述连接体为肽，所述肽包含至少两个半胱氨酸。
9.如权利要求8所述的水凝胶前体制剂，其特征在于，所述至少两个半胱氨酸位于所述肽的N端和C端附近。
10.如权利要求1所述的水凝胶前体制剂，其特征在于，选择所述结构性化合物和/或所述连接体化合物，从而使得所述选择性反应在pH于4.0或4.0以下时被阻止。
11.如权利要求10所述的水凝胶前体制剂，其特征在于，pH为7.5时的反应速率是pH为7.0时反应速率的至少2倍。
12.一种制备粉末形式的水凝胶前体制剂的方法，所述粉末包含稳定的压实块形式的所述结构性化合物和所述至少一种连接体化合物两者，所述方法包括以下步骤：
--提供至少一种结构性化合物的第一溶液A；
--提供包含至少一种连接体化合物的第二溶液B；
--将溶液A与B混合(1)；和
--将得到的前体溶液冻干(7)；
其中，所述的至少一种结构性化合物与所述至少一种连接体化合物能通过亲核试剂与共轭不饱和键或基团之间的选择性反应来聚合，其特征在于，所述溶液A和B在阻止所述选择性反应的条件下混合(1)。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述溶液在pH 4.0或4.0以下混合(1)。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述溶液在pH 3.5下混合(1)。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述溶液A包含5-10％w/v的所述至少一种结构性化合物。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述溶液A包含7.5％w/v的所述至少一种结构性化合物。
17.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述溶液B包含0.1-2％w/v的所述至少一种连接体化合物。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述溶液B包含1％w/v的所述至少一种连接体化合物。
19.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在所述溶液A和B的混合(1)之前，将溶液C加入(2)到溶液A中，所述溶液C包含至少一种生物活性化合物，所述生物活性化合物能通过亲核试剂与共轭不饱和键或基团之间的选择性反应来与所述结构性化合物二聚化。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述溶液C包含0.1-10％w/v的所述至少一种活性化合物。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述溶液C包含2％w/v的所述至少一种活性化合物。
22.如权利要求12或权利要求19所述的方法，其特征在于，所述溶液A、溶液B和/或溶液C为所述至少一种结构性化合物、所述至少一种连接体化合物或所述至少一种生物活性化合物在蒸馏水中的溶液。
23.如权利要求12所述的方法，其特征在于，选择所述化合物的浓度使得亲核试剂与共轭不饱和键或基团的摩尔比为0.8:1至1.3:1。
24.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在冻干步骤(7)之前，将所述前体溶液过滤(5)。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，将所述前体溶液无菌过滤(5)。
26.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在冻干步骤(7)之前将所述前体溶液等分(9)并装入容器中。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，将所述等分并装入容器中于无菌条件下进行。
28.如权利要求26所述的方法，其特征在于，在冻干步骤(7)之后，将所述容器用无菌氮气填充并立即加盖。
29.如权利要求1所述的水凝胶前体制剂在制备水凝胶中的用途。
30.一种组件试剂盒，其包括至少一个填充有权利要求1所述的水凝胶前体制剂的容器和具有反应缓冲液的容器，所述水凝胶前体制剂为稳定的压实块形式的未反应粉末的形式。
31.如权利要求30所述的组件试剂盒，其特征在于，所述的反应缓冲液的pH至少为7。
32.如权利要求31所述的组件试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液的pH为7至8。
33.制备水凝胶的方法，其包括以下步骤：
—将权利要求1所述的水凝胶前体制剂再悬浮在pH至少为7的缓冲液中，所述水凝胶前体制剂为稳定的压实块形式的未反应粉末的形式；
—任选地将细胞培养悬浮液加入至该前体悬浮液；
—使用该前体悬浮液来浇注至少一种凝胶前体；
—将所述至少一种凝胶前体聚合至少30分钟。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述至少一种凝胶前体的聚合在37℃的恒温箱中进行。
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