MX2012012248A - Formulacion del precursor de hidrogel y proceso de produccion del mismo. - Google Patents
Formulacion del precursor de hidrogel y proceso de produccion del mismo.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a una formulación del precursor de hidrogel, su proceso de producción así como un kit que comprende tal formulación y un método de producción de un hidrogel usando tal formulación. La formulación del precursor comprende al menos un compuesto estructural, preferiblemente vinil sulfona (ramificada acrilada) poli(etilen glicol), y al menos un compuesto de ligadura, preferiblemente un péptido con dos cisteínas, en donde el compuesto estructural y el compuesto de ligadura son polimerizables por una reacción selectiva entre un nucleófilo y un grupo o enlace insaturado conjugado. La formulación del precursor está en la forma de un polvo.
Description
FORMULACIÓN DEL PRECURSOR DE HIDROGEL Y PROCESO DE PRODUCCION
DEL MISMO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una formulación del precursor de hidrogel, su proceso de producción asi como un kit que comprende tal formulación y un método de producción de un hidrogel usando tal formulación.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La estructura ' de soporte de cultivo celular tridimensional se ha reconocido para permitir patrones de expresión de gen y otras actividades celulares que imitan más cercanamente a organismos vivos que los cultivos celulares bi-dimensionales convencionales en placas de cultivo.
Esto ha llevado al desarrolló de novedosas familias de hidrogeles de polímeros sintéticos, que son frecuentemente llamados ECMs (aEC ) artificiales, ya que imitan muchos aspectos de la matriz extracelular . Un reto mayor es el de proporcionar una química que permita el reticulado de la matriz en presencia dé células o biomoléculas así como una fijación estable de biomoléculas a la matriz por sí misma.
En años recientes, diferentes mecanismos se desarrollaron permitiendo la formación de geles en la presencia de células o biomoléculas . Por ejemplo, mecanismos basados en el auto-ensamble de bloques de construcción de bajo peso molecular como péptidos (Estroff et al.: Water gelation by small organic molecules; Chem. Rev. 2004; 104 (3) ; 1201-18 ) o u'reidopirimidinona (Zhang S.: Fabrication of novel biomaterials though molecular self-assembly; Nat. Bio-technol. 2003; 21(10); 1171-8)) y copolímeros de bloque anfifílicos de peso molecular moderado se propusieron (por ejemplo, ver Hartgerink et al.: Peptide-amphiphile nonofibers: A versail.e scaffold for the preparation of self-assembling materials; Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. A. 2002; 99(8) ; 5133-8) .
La WO 00/454808 describe biomateriales novedosos, especialmente para la formación de hidrogeles, que tienen una química de reticulado basada en una reacción de adición de tipo Michael entre un nucleófilo y un enlace o grupo insaturado conjugado, que permite la formación del gel en presencia de células o biomoléculas. Por otra parte, las moléculas de señal específica se pueden integrar en la matriz de gel por una reacción específica.
Una mayor desventaja de este sistema es que se basa en mezclar de forma manual al menos dos componentes precursores juntos antes de la gelación. En la práctica, el uso de múltiples soluciones de componentes pueden ser una fuente de error debido a las variaciones no intencionales de i) las condiciones de re-suspensión de los diferentes componentes en forma de polvo, ii) las relaciones de mezcla de la soluciones precursoras, llevando asi a más uso de complejo y problemas de reproducibilidad de las composiciones del gel. Adicionalmente, el costo del proceso de un proceso de fabricación de un sistema de gel que requiere la mezcla de diversas soluciones es más caro que el costo del proceso de un proceso de fabricación de un gel que requiere un simple.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Es por lo tanto un objetivo de la presente invención evitar las desventajas de las formulaciones de hidrogel conocidas y específicamente proporcionar una formulación de precursor de hidrogel que sea fácil de manejar y que permita la producción de hidrogeles con composiciones altamente reproducibles . Éste objetivo se resuelve con un precursor de hidrogel de conformidad con la reivindicación 1.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Los detalles y beneficios adicionales de la presente invención serán evidentes de las siguientes figuras y ejemplos:
Fig. 1: Representación esquemática de una modalidad de un proceso de fabricación de una formulación del precursor de hidrogel de acuerdo con la presente invención
Fig. 2: Representación esquemática de una segunda modalidad de un proceso de fabricación de una formulación del precursor de hidrogel de acuerdo con la presente invención
Fig. 3: Representación esquemática de una tercera modalidad de un proceso de fabricación de una formulación del precursor de hidrogel de acuerdo con la presente invención
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La formulación de precursor de hidrogel de acuerdo con la presente invención comprende al menos un compuesto estructural y al menos un- compuesto de ligadura. El compuesto estructural y el de ligadura son polimerizables por una reacción selectiva entre un nucleófilo y un enlace o grupo insaturado conjugado. La formulación de precursor de hidrogel está en la forma de un polvo sin reaccionar.
La formulación tiene la ventaja de que el polvo puede simplemente re-suspenderse, preferiblemente en una solución amortiguadora, para comenzar la reacción gelificante. La mezcla de diferentes componentes no¦ se requiere, por lo tanto reducir considerablemente la probabilidad de relaciones erróneas entre al menos un- compuesto estructural y al menos un compuesto de ligadura. Asi, esto incrementa la reproducibilidad de los hidrogeles producidos de estos precursores de hidrogel. . Por otra parte, el precursor de hidrogel de la presente invención proporciona facilidad de uso .
La formulación de precursor de hidrogel de la presente invención está en la forma de un polvo. El polvo puede comprender partículas que tienen cualquier tamaño o forma. Alternativamente, el polvo también se puede proporcionar como una pildora o comprimido prensado. Más preferiblemente, el polvo se proporciona en la forma de una torta compacta estable, por ejemplo, en el fondo- de un recipiente.
El polvo está sin reaccionar, lo que significa que casi ninguno de al menos un compuesto estructural ha reaccionado con al menos un compuesto de ligadura por medio de la reacción selectiva. Preferiblemente más del 70%, más preferiblemente más del 85%, y más preferiblemente más del 95% de los compuestos no han experimentado la reacción selectiva .
La reacción selectiva es una reacción entre un nucleófilo y un grupo o enlace insaturado conjugado por adición nucleofílica . Tales reacciones también se conocen como reacciones de adición tipo Michael.
El compuesto estructural tiene una funcionalidad de al menos tres, pero más preferiblemente el compuesto estructural tiene una funcionalidad de cuatro o más. Por "funcionalidad" se entiende el número de sitios reactivos en una molécula.
El compuesto estructural preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de oligómeros, polímeros, proteínas biosintéticas o naturales o péptidos y polisacáridos. Preferiblemente, el compuesto estructural es un polímero seleccionado del grupo que consiste de poli (etilenglicol ) , poli (óxido de etileno) , poli (alcohol de vinilo) , poli (alcohol de etilen-co-vinilo) , poli (ácido acrílico) , poli (ácido de etilen-co-acrílico) , poli (etiloxazolina) , poli (pirrolidona de vinilo), poli (pirrolidona de etilon-co-vinilo) , poli (ácido maleico) , poli (ácido etilen-co-maleico) , poli (acrilamida) , o bloques de copolímeros poli (óxido de etileno) -co-poli (óxido de propileno) o mezclas de los mismos. Más preferiblemente, el compuesto estructural es un poli (etilenglicol ) , más preferiblemente un poli (etilenglicol ) ramificado con tres, en cuatro o más ramificaciones.
El compuesto . de ligadura tiene una funcionalidad de al menos dos y se selecciona del grupo que consiste de oligómeros, polímeros, proteínas bio-sintéticas o naturales o péptidos y polisacáridos . o mezclas de los mismos. Preferiblemente, el compuesto de ligadura es una secuencia de péptido, más preferiblemente que contiene un sitio de adhesión, un sitio de enlace de factor de crecimiento, o un sitio de enlace de proteasa.
El nucleófilo preferiblemente es un nucleófilo fuerte, tal como un tiol o un grupo que contiene tiol. El nucleófilo también podría ser cualquier otro tipo de nucleófilo conocido en la técnica, siempre y cuando sea lo suficientemente fuerte para experimentar la reacción selectiva, por ejemplo, tal como una amina. Además, el grupo insaturado conjugado preferiblemente es un acrilato, una acrilamida, una quinona o un vinilpiridinio .. Más preferible, el grupo insaturado es una vinil sulfona.
Adicionalmente , la formulación de precursor de hidrogel de la presente invención puede comprender al menos un compuesto bioactivo, preferiblemente que comprende una secuencia de péptido RGD, que es- conjugable con el compuesto estructural a través de¦ una reacción selectiva entre un nucleófilo y un enlace insaturado conjugado o grupo.
El compuesto bioactivo puede comprender un sitio de adhesión, tal como la secuencia RGD de fibronectina o la secuencia YISG de . la laminina; un sitio de enlace de factor de crecimiento, tal como un sitio de enlace de la heparina; un sitio de enlace de la proteasa o un compuesto terapéuticamente activo. Preferiblemente, el compuesto bioactivo comprende . un sitio adhesión celular, más preferiblemente una secuencia RGD.
El compuesto bioactivo comprende al menos un grupo activo capaz de experimentar la reacción auto selectiva. Más preferiblemente, el compuesto bioactivo comprende al menos un grupo nucleofilico, y más preferiblemente un grupo tiol.
El compuesto bioactivo es conjugable con el compuesto estructural a través de una reacción auto selectiva entre un nucleófilo y un grupo o enlace insaturado conjugado. Más preferiblemente, esta reacción auto selectiva es la misma reacción como la reacción auto selectiva entre el compuesto estructural y el compuesto de. ligadura, especialmente entre el mismo tipo de nucleófilo y grupo o enlace insaturado conjugado. Alternativamente, el compuesto bioactivo se puede conjugar al compuesto estructural a través de una reacción auto selectiva antes de la .polimerización del compuesto de ligadura con el compuesto estructural.
El compuesto estructural preferiblemente es un poli (etilenglicol) (PEG) multi-ramificado con grupos terminales funcionalizados . Más preferiblemente, los grupos terminales son funcionálizados con vinil sulfona. Más preferiblemente, · el compuesto estructural es un PEG-tri (vinil sulfona) o PEG-tetra (vinil sulfona). La funcionalización de vinil sulfona de los grupos de alcohol de PEG se pueden llevar a cabo con cualquier reacción adecuada conocida en la técnica. Al usar un PEG ramificado con tres, cuatro o más ramificaciones es posible producir compuestos estructurales con una funcionalidad de tres, cuatro o más.
Preferiblemente, la ligadura comprende al menos dos grupos nucleofilicos, preferiblemente grupos tiol. Los tioles son nucleófilos fuertes que experimentan fácilmente reacciones de adición tipo Michael con enlaces o grupos insaturados con un pH fisiológico. Además, los tioles son comúnmente encontrados en¦ sistemas biológicos, por lo que su uso no tiene problemas con respecto a la toxicidad.
El compuesto de ligadura preferiblemente es un péptido que comprende al menos dos cisteinas, preferiblemente localizadas cerca de -los términos N- y C- del péptido. Sintetizar péptidos con dos o más residuos de cisteina es sencillo. Además es posible introducir sitios de proteasa específicos en el péptido con el fin de producir hidrogeles degradables, por ejemplo, para uso in-vivo. Adicionalmente, al variar los aminoácidos cercanos a las cisteinas, es posible cambiar el valor pKa del grupo tiol.
Preferiblemente, las cisteinas están localizadas en los términos N- y C- del péptido, resultando en péptidos con la estructura H2N-CXXXXXXXXC-COOH (SEQ ID NO: 1), preferiblemente con un¦ término N acetilado, Ac; y un término C amidado, NH2; donde C es la representación de una letra de la cisteina y X representa cualquier aminoácido excepto cisteína. El péptido puede ser de cualquier longitud, por lo que el número de X (Xn) puede ser cualquier número. Preferiblemente, el péptido · tiene una longitud de 16 aminoácidos. Alternativamente, las cisteinas pueden estar localizadas en uno o más aminoácidos lejos del término N- o C-, por ejemplo, resultando en péptidos con la estructura general H2N-XmCXnCXp-COOH (SEQ ID NO:2), donde m, n y p pueden ser cualquier entero, incluyendo cero.
Más preferiblemente, el compuesto de ligadura es un péptido con la secuencia NH2-GCRE-XXXXXXXX-ERCG-COOH (SEQ ID NO: 3) . La Glicina (G) sirve como espaciador, la Arginina (R) aumenta la reactividad del grupo tiol de la cisteina cercana, y el ácido glutámico (E) mejora la solubilidad del péptido en soluciones acuosas.
Más preferiblemente, la secuencia del compuesto de ligadura es NH2-GCRE-GPQGIWGQERCG-COOH [SEQ ID NO: 4] o NH2-GCREGDQGIAGFERCG-COOH [SEQ' ID NO: 5], de nuevo preferiblemente con un término N acetilado y un término C amidado .
Los péptidos para los compuestos de ligadura y bioactivos se deben sintetizar y procesar en solventes ácidos, más preferiblemente en soluciones que contienen trifluoroacetato (TFA) . El TFA residual enlazado al polvo de péptido después de la síntesis de péptido tiene el efecto de disminuir el pH de una suspensión de agua que contiene el péptido respectivo debajo de 4.
El compuesto estructural y/o el compuesto de ligadura se seleccionan de tal manera que la velocidad de reacción de la reacción selectiva entre el compuesto estructural y el compuesto de ligadura se dificulta o reduce altamente en las condiciones de mezclado. Preferiblemente, la velocidad de reacción se reduce altamente a un pH de 4 o debajo comparado con un pH de 7 o arriba.
Una selección de los compuestos de esta manera permite proporcionar una formulación de precursor que experimentará fácilmente una reacción de gelación en condiciones fisiológicas, pero que permitirá su preparación bajo condiciones tales que ninguna o casi ninguna reacción selectiva ocurra.
Preferiblemente, el compuesto estructural y/o de ligadura se seleccionan de tal manera que la velocidad de reacción de la reacción auto selectiva es al menos dos veces más rápida con un pH de 7.5 comparado con un pH de 7.0.
Otro objetivo de la presente invención es el de proporcionar un proceso de producción para una formulación de precursor de hidrogel. Este problema es resuelto por un proceso de conformidad como se reivindica en la reivindicación 8.
El proceso comprende las etapas de:
- proporcionar una primera solución A que comprende al menos un compuesto estructural;
- proporcionar una segunda solución B que comprende al menos un compuesto de ligadura;
- mezclar las . soluciones A y B; y
- liofilización de la solución de precursor resultante. Al menos un compuesto estructural y al menos un compuesto de ligadura son polimerizables por una reacción selectiva entre un nucleófilo y un enlace o grupo insaturado conjugado. Ambas soluciones A y B se mezclan bajo condiciones que detienen la reacción selectiva.
Este proceso permite la producción de una formulación de precursor de hidrogel en forma de un polvo que comprende tanto de un compuesto estructural como el compuesto de ligadura. Las condiciones de mezclado han de seleccionarse de tal manera, que la reacción auto selectiva -sea detenida. Esto significa que la velocidad de reacción es suficientemente baja, que una fracción muy grande de los compuestos de ambas soluciones A y B no reacciona a través de la reacción auto selectiva anterior a la liofilización . Preferiblemente, más del 70%, más preferiblemente más del 85%, más preferible más del 90% de las moléculas en ambas soluciones no ha experimentado la reacción selectiva antes de la etapa de la liofilización .
Las condiciones de mezclado se deben seleccionar por el ajuste del pH, concentración de los diferentes compuestos, tiempo del proceso, temperatura o condiciones del solvente. Más preferiblemente, el mezclado se. lleva a cabo con un pH de 4 o menor. Especialmente cuando un tiol es utilizado como nucleófilo, un PH de 4 o menor suficientemente detiene la reacción auto selectiva. El mezclado preferiblemente se realiza a temperatura ambiente.
Es importante que la solución A se agregue a la solución B, ya que el pH de la solución A es alrededor de 7, mientras que el pH de la solución B está por debajo de 4. Si la solución B se agregó a la solución A, la reacción de polimerización auto selectiva empezaría durante la etapa de mezclado. Cuando se agrega la solución A a la solución B, el pH de la solución resultante siempre será menor a 4, por lo que detendrá la reacción. .
La solución A preferiblemente comprende 5-10% p/v de al menos un compuesto estructural. Más preferiblemente, la solución A comprende 7.5% p/v de al menos un compuesto estructural.
Adicionalmente, la solución B preferiblemente comprende 0.1-2% p/v de al menos un compuesto de ligadura. Más preferiblemente, la solución B comprende 1% p/v de al menos un compuesto de ligadura.. Esta concentración del compuesto de ligadura proporciona una buena solubilidad del compuesto en la solución.
Usando las concentraciones de los compuestos estructural y de ligadura como se menciona arriba para ambas soluciones A y B lleva a la formación de un polvo compacto después de la etapa de liofilización . Este polvo compacto formará una capa tipo torta en el fondo de un recipiente, que es favorable. Adicionalmente, usando estas concentraciones relativamente bajas de ambos compuestos durante el proceso de producción adicionalmente reduce · la probabilidad de reacciones prematuras indeseadas entre los compuestos estructural y ligadura. Adicionalmente, las pérdidas de material en las etapas de producción subsecuentes se reducen con estas concentraciones comparadas con concentraciones altas.
Además, la solución A y/o solución B preferiblemente son soluciones de al menos un compuesto estructural o al menos un compuesto de ligadura, respectivamente, en agua destilada. Asi, ambos compuestos se presentan en una solución no amortiguada. Debido a la adhesión del ácido trifluoroacético al compuesto de ligadura¦ de péptido de la solución B, el pH de esta solución se reducirá. Esto lleva a un pH que es preferiblemente menor a 4 para la mezcla resultante de las soluciones A y B. Más preferiblemente, el pH de la solución resultante es alrededor de 3.5.
Alternativamente, antes de mezclar con la solución B, la solución A se puede mezclar con una solución adicional C que comprenda un compuesto biológicamente activo que es dimerizable con el compuesto estructural por una reacción selectiva entre un nucleófilo y un enlace o grupo insaturado conjugado. Este compuesto bioactivo puede comprender un 'sitio de adhesión, tal como la secuencia RGD de la fibronectina o la secuencia YISG de la laminina; un sitio de enlace de factor de crecimiento, tal como un sitio de enlace de heparina; un sitio de enlace de proteasa o un compuesto terapéuticamente activo. Preferiblemente, el compuesto bioactivo comprende un sitio de adhesión celular, más preferiblemente una sequencia RGD.
Preferiblemente, la solución C comprende un 0.1 hasta 10% p/v del compuesto biológicamente activo. Más preferiblemente, la solución C comprende entre un 0.1 y un 5%, más preferiblemente entre un 0.1 y 2% del compuesto biológicamente activo.
La variación de las cantidades respectivas del compuesto estructural en la solución A y el compuesto biológicamente activo en la solución opcional C asi como la concentración y naturaleza (por ejemplo, secuencia de aminoácidos) del compuesto de ligadura en la solución B permite la producción de las formulaciones de precursor de hidrogel con características diferentes.
Aunque las posibilidades de variación de la concentración de los compuestos en cada una de la solución A y B son muchas, se prefiere que la concentración de los compuestos se seleccione de tal manera que la relación molar del nucleófilo al grupo o enlace insaturado conjugado resulta en propiedades fisicoquímicas óptimas, como módulo de corte máximo y características de engrosamiento mínimas de . los geles finales. Normalmente la relación óptima del nucleófilo al grupo o enlace insaturado conjugado está dentro del intervalo de 0.8:1 hasta 1.3:1. Esto asegura la formación de un hidrogel donde casi todos los grupos activos han experimentado la reacción selectiva, de modo que las reacciones secundarias de cualquiera de los grupos reactivos se reducen considerablemente.
Además la solución precursora se puede someter a filtración antes de la etapa de liofilización . La filtración preferiblemente es una filtración estéril. Cualquiera de los compuestos sin disolver así como contaminaciones bacterianas se pueden remover de la mezcla antes de la etapa de liofilización .
Preferiblemente, la solución precursora pre-mezclada se procesa en alícuotas y se llena en recipientes, preferiblemente recipientes estériles, antes de la etapa de liofilización . Esto permite la- producción de recipientes simples que contienen . una cantidad definida de una formulación del precursor de hidrogel. Los recipientes pueden ser de cualquier material adecuado, tal como plástico o vidrio. Preferiblemente los recipientes son viales.
Los recipientes se llenan preferiblemente con gas de nitrógeno estéril y tapado inmediatamente después de la etapa de liofilización . Esto protege el polvo del precursor de hidrogel a partir del contacto con humedad y/u oxigeno, que puede llevar a polimerización prematura u oxidación de los nucleófilos.
Otro objeto de la presente invención es el uso de una formulación del precursor de hidrogel como se describe en la presente para la fabricación de un hidrogel..
Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un simple, a usar sistema para la producción de hidrogeles con resultados altamente reproducibles . Este problema se soluciona con un kit de acuerdo con la reivindicación 20.
El kit de la presente invención comprende al menos un recipiente llenado con una formulación del precursor de hidrogel como se describe en la presente y un recipiente con una solución amortiguadora de reacción. El recipiente contiene preferiblemente una cantidad de polvo de formulación de precursor, que resultará, en un gel con características predefinidas cuando se re-suspende con una cantidad definida de solución amortiguadora de reacción.
La solución amortiguadora de ' reacción preferiblemente tiene un pH arriba de 7. Más preferiblemente la solución amortiguadora de reacción tiene un pH entre 7 y 8. La solución amortiguadora preferiblemente comprende HEPES, preferiblemente en concentración 0.3M con el pH ajustado a un valor entre 7 y 8. Esto permite una reacción de polimerización suficientemente rápida.
Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método fácil de usar para producir un hidrogel. Este objetivo se alcanza con un método de conformidad con la reivindicación 22.
El método de producción de un hidrogel comprende las etapas de:
- Re-suspender una formulación del precursor de hidrogel como se describe en la presente en una solución amortiguadora que tiene pH 7, más preferiblemente con una solución amortiguadora que tiene un pH entre 7 y 8;
Opcionalmente agregar una suspensión de cultivo celular a la suspensión del precursor;
- Fundir un precursor de gel con la suspensión del precursor; y
- Polimerización del precursor de gel por al menos 30 minutos, preferiblemente por 30 hasta 45 minutos, preferiblemente en una incubadora a 37 °C
La formulación del precursor de hidrogel de la presente invención es polimerizable' bajo condiciones fisiológicas, que permiten la adición, de un cultivo celular a la suspensión del precursor de modo que las células se pueden distribuir uniformemente en la suspensión antes de la gelación. Esto no seria fácilmente posible con cualquier otro sistema de precursor ..
La Figura 1 muestra una representación esquemática de una modalidad de un proceso de fabricación de una formulación del precursor de hidrogel de acuerdo con la presente invención. La solución A que comprende 7.5% p/v de PEG ramificado con 4 ramificaciones funcionalizadas con vinil sulfona se agrega a la solución B que comprende 1% p/v de una secuencia de péptido con dos cisteinas, . una cerca de la terminal C y la otra cerca de la N, en la etapa de mezclado 1.
Por ejemplo, 275 mL de la solución A que comprende 7.5% p/v de PEG funcionalizado se agrega a 425 mL de la solución B que comprende 1% p/v de un péptido de ligadura.
Las soluciones A y B se preparan al suspender los compuestos respectivos en agua destilada. Para la solución B, el compuesto de ligadura de péptido se agrega preferiblemente al agua en porciones pequeñas. El mezclado se lleva a cabo bajo agitación continua con un agitador magnético a 400 RPM. La solución precursora asi obtenida 4 se somete posteriormente a una etapa de filtración estéril 5, por ejemplo, usando un filtro Mini Kleenpak (PALL Corp.) con una membrana PTFE con una clasificación absoluta de 0.2µ?t?, proporcionando la solución precursora filtrada 6. Esta solución se somete luego a la etapa de liofilización 7, resultando en la formulación del precursor de hidrogel 8 en forma de un polvo. El polvo resultante es en la forma de una torta compacta estable.
La etapa de liofilización 7 se puede llevar a cabo al congelar primero la solución en un anaquel a -50°C por 150 min, seguido por una primera etapa de secado a -10°C por 570 min en una presión de 0.26 mbar. Una segunda etapa de secado sigue a una temperatura de 20°C por 180 min en una presión de 0.02 mbar.
En la Figura 2 una segunda modalidad de un proceso de fabricación de una formulación del precursor de hidrogel de acuerdo con la presente invención se representa esquemáticamente. En esta modalidad la Solución A que comprende 7.5% p/v de un PEG ramificado con 4 ramificaciones funcionalizadas con vinil sulfona se mezcla con la Solución C que comprende 2% p/y de un péptido que comprende una secuencia RGD en la etapa de mezclado 2.
Por ejemplo, 275mL de la Solución A que comprende 7.5% p/v de un PEG ramificado de cuatro funcionalizado se mezcla con 5mL de la Solución C que comprende 2% p/v de un compuesto bioactivo. Esta solución entonces, se mezcla posteriormente con la solución B que comprende 1% p/v de un ligadura de péptido que comprende dos cisternas, una cerca de la terminal C y la otra cerca de la terminal N, en la etapa de mezclado 1.
La solución precursora asi obtenida 4 se somete posteriormente a una etapa de filtración estéril 5, proporcionando la solución precursora filtrada 6. Esta solución se somete, luego a la etapa de liofilización 7, resultando en la formulación del precursor de hidrogel 8 en forma de un polvo.
La Figura 3 muestra una tercera modalidad de un proceso de fabricación de una formulación del precursor de hidrogel de acuerdo con la presente invención. La Solución A que comprende 7.5% p/v de PEG ramificado con 4 ramificaciones funcionalizadas con vinil sulfona se mezcla con la Solución B que comprende 1% p/v. de una secuencia de péptido de ligadura con una cisteína cerca de la terminal C y N, en la etapa de mezclado 1. Las soluciones A y B se preparan al suspender los compuestos respectivos en agua destilada. La mezcla se lleva a cabo bajo agitación continua con un agitador magnético, preferiblemente a 40? RPM. La solución precursora asi obtenida 4 se somete posteriormente a una etapa de filtración estéril 5, proporcionando la solución precursora filtrada 6. Esta solución luego se procesa por alícuotas en recipientes etapa de procesar por alícuotas 9. Cada recipiente puede contener únicamente una cantidad pequeña, preferiblemente 0.3-0.4 ral. Los recipientes son sellables y se hacen preferiblemente de vidrio. La solución precursora procesada por alícuotas 10 es lo liofilizado en la etapa de liofilización 7 para producir el polvo de formulación de precursor 8.
Claims (22)
1. Una formulación del precursor de hidrogel que comprende al menos un compuesto estructural y al menos un compuesto de ligadura, en donde el compuesto estructural y el compuesto de ligadura son polimerizables por una reacción selectiva entre un nucleófilo y un grupo o enlace insaturado conjugado, caracterizada porque la formulación del precursor de hidrogel está en la forma de un polvo sin reaccionar.
2. Una formulación del precursor de hidrogel de conformidad como se reivindica en la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación adicionalmente comprende al menos un compuesto bioactivo, que preferiblemente comprende una secuencia de péptido RGD, que es dimerizable con el compuesto estructural a través de una reacción selectiva entre un nucleófilo y un grupo o enlace insaturado conjugado.
3. Una formulación del precursor de hidrogel de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque el compuesto estructural es un polietilenglicol multi-ramificado con grupos terminales de vinil sulfona, preferiblemente PEG-tri (vinil sulfona) o PEG-tetra (vinil sulfona) .
4. Una formulación del precursor de hidrogel de conformidad con cualesquiera de . las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizada porque la ligadura comprende al menos dos grupos nucleofílicos, preferiblemente grupos tiol.
5. Una formulación del precursor de hidrogel de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizada porque la ligadura es un péptido que comprende al menos dos cisteínas, preferiblemente ubicadas cerca de la terminal N y C del péptido.
6. Una formulación del precursor de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizada porque el compuesto estructural y/o el compuesto de ligadura se seleccionan de tal manera que la reacción selectiva se obstaculiza en o por debajo de pH 4.0.
7. Una formulación del precursor de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la velocidad de reacción es al menos dos veces tan rápida a un pH 7.5 comparada con pH 7.0.
8. El proceso para la producción de una formulación del precursor de hidrogel en forma de un polvo, en particular de conformidad con las reivindicaciones 1 hasta 7, que comprende las etapas de: - proporcionar ' una primera solución A de al menos un compuesto estructural; - proporcionar una segunda solución B que comprende al menos un compuesto de ligadura; - mezclar las soluciones A y B; y - liofilización de la solución precursora resultante en donde al menos un compuesto estructural y al menos . un compuesto de ligadura son polimerizables por una reacción-selectiva entre un nucleófilo y un grupo o enlace insaturado conjugado, caracterizado porque las soluciones A y B se mezclan bajo condiciones que obstaculizan la reacción selectiva .
9. El proceso de conformidad como se reivindica en la reivindicación 8, caracterizado porque las soluciones se mezclan en o por debajo de un pH de 4.0, preferiblemente a un pH de 3.5.
10. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 8 o 9, caracterizado porque la solución A comprende 5-10% p/v de al menos un compuesto estructural, preferiblemente 7.5% p/v.
11. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 8 hasta 10, caracterizado porque la solución B comprende 0.1-2% p/v de al menos un compuesto de ligadura, preferiblemente 1% p/v.
12. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 8 hasta 11, caracterizado porque una Solución C que comprende al menos un compuesto biológicamente activo que es dimer'izable con el compuesto estructural por una reacción selectiva entre un nucleófilo y un grupo o enlace insaturado conjugado se .agrega a la solución A antes de la mezcla de las soluciones A y B.
13. El proceso de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la solución C comprende 0.1-10% p/v de al menos un compuesto activo, preferiblemente 2%.
14. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 8 hasta 13, caracterizado porque la solución A, solución B y/o la solución C son una solución de al menos un compuesto estructural, el al menos un compuesto de ligadura o al menos un compuesto biológicamente activo en agua destilada.
15. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 8 hasta 14, caracterizado porque la concentración de los compuestos se selecciona de tal manera que la relación molar del nucleófilo al grupo o enlace insaturado conjugado está en el intervalo de 0.8:1 hasta 1.3:1.
16. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 8 hasta .15, caracterizado porque la solución precursora se somete a filtración antes de la etapa de liofilización, preferiblemente para filtración estéril.
17. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 8 hasta 16, caracterizado porque la solución precursora se procesa en alícuotas y es llenada en recipientes, preferiblemente bajo condiciones estériles antes de la etapa de liofilización .
18. El proceso de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque los' recipientes se llenan con gas de nitrógeno estéril y se · tapan inmediatamente después de la etapa de liofilización.
19. El uso de una formulación del precursor de hidrogel de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7 para la producción de. un hidrogel.
20. El kit de las partes caracterizado porque comprende al menos un recipiente llenado con una formulación del precursor de hidrogel de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7 y un recipiente con una solución amortiguadora de reacción.
21. El kit de las partes de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la solución amortiguadora de reacción tiene un pH de al menos 7, preferiblemente la solución amortiguadora de reacción tiene un pH entre 7 y 8.
22. El método de producción de un hidrogel caracterizado porque comprende las etapas de - Re-suspender una formulación del precursor de hidrogel como se reivindica en las reivindicaciones 1 hasta 7 en una solución amortiguadora que tiene al menos pH 7 Opcionalmente agregar una suspensión de cultivo celular a la suspensión del precursor - Fundir al menos un gel con la suspensión del precursor - Polimerización de al menos un precursor de gel por al menos 30 minutos, preferiblemente en una incubadora a 37 °C.
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