KR20220110255A - 세포 성장을 위한 방법 및 키트 - Google Patents

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제레미 투아티
줄리아 프레그니
피사노 카라 뷰캐넌
프랑크 쿠마유
에마누엘레 가우디엘로
소피 크레타즈
니콜라스 샤르티에
매튜 휴롯
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프리시젼 캔서 테크놀로지스 인크.
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Abstract

본 발명은 하나의 조직 유형을 이용하여 수행되는 방법으로서, 하이드로겔 특징의 특정 조합이 테스트될 상기 하나의 조직 유형에 대해 사전 선택된 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법을 수행하기 위한 부품 키트에 관한 것이다.

Description

세포 성장을 위한 방법 및 키트
본 발명은 약물 발견 및 개발뿐만 아니라 기초과학 연구, 정밀 의학, 재생 의학 및 포유동물, 바람직하게는 인간에게 이식하기 위한 세포의 전달을 위한 상당히 개선된 도구를 제공하는 세포 성장을 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.
세포 성장 및 약물 스크리닝을 위한 하이드로겔
생체외 분석 분야에서, 최근 수년 동안 진전이 이루어졌다. 특히, 3차원(3D) 하이드로겔 매트릭스의 개발은 생체내 조건과 충분히 유사하지 않은 2차원 세포 배양 시스템에 비해 상당한 이점을 제공하였다.
먼저, Matrigel®과 같은 천연 유래 3D 세포 배양 시스템이 사용되었다. 그러나, 이러한 시스템은 불충분하게 한정된(defined) 조성을 갖고 뱃치 간 편차(batch to batch variation)를 보여주는데, 이는 체계적인 방식으로 이들의 특성을 변경할 수 없고 이들의 주요 매트릭스 매개변수를 독립적으로 제어할 수 없게 만든다. 또한, 다중웰 어레이를 사용하는 스크리닝 목적의 경우, 이러한 천연 유래 3D 세포 배양 시스템은 매우 적합하지 않은데, 그 이유는 이들의 불충분한 한정으로 인해 어레이들 간의 세포 거동의 변화가 이러한 어레이에 제공된 세포외 매트릭스(extracellular matrix) 조건의 특정 변형에 정확히 기인할 수 없기 때문이다.
또한, Matrigel®과 같은 동물 유래 매트릭스의 뱃치 간 편차 및 미한정된 조성은 인간에서의 사용에 대한 규제 승인을 금지한다. 인간 사용을 위해 한정 및 승인되고 확장가능하고 바람직하게는 이종물질-무함유(xeno-free)인(즉, 동물 기원 성분이 없는) 지지 매트릭스 및 배양 배지의 개발이 요구된다.
그러나, 최근에는 상기 목적에 훨씬 더 적합한 완전 한정된 반합성 또는 완전 합성 하이드로겔 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 문헌[Ehrbar et al.(Ehrbar, M., Rizzi, S.C., Schoenmakers, R.G., Miguel, B.S., Hubbell, J.A., Weber, F.E., and Lutolf, M.P., Biomolecular hydrogels formed and degraded via site-specific enzymatic reactions, Biomacromolecules 8 (2007), 3,000-3007)]에 상세히 설명된 가교결합 메커니즘에 의해 생리학적 조건 하에 트롬빈-활성화 인자 XIIIa를 사용하거나 문헌[Lutolf et al.(Lutolf, M.P., and Hubbell, J.A., Synthesis and physicochemical characterization of end-linked poly(ethylene glycol)-co-peptide hydrogels formed by Michael-type addition, Biomacromolecules 4, 713-722 (2003))]에 상세히 설명된 바와 같은 가교결합 메커니즘에 의한 온화한 화학 반응을 통해 가교결합가능한 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 전구체 분자로 구성된 PEG계 하이드로겔이 설명되었다. 이러한 PEG 하이드로겔은 이의 특성 및 생체적합성과 관련하여 조정될 수 있다.
이러한 완전 한정된 반합성 또는 완전 합성 하이드로겔 시스템의 적용 예는 예를 들어 암 연구에서 인간으로의 이식, 기초 연구, 정밀 의학, 약물 발견 및 개발 분야에 있다.
암 연구 및 진료소에서, 종양 세포의 치료적 치료에 대한 내성(예를 들어, 세포독성 물질을 이용한 화학요법 및/또는 면역요법 및/또는 표적화 요법에 대한 내성)은 하나의 주요 도전 과제이다.
화학요법에 대한 종양 세포의 약물 내성은 일반적으로 유전자 변이 및 클론 유전적 불균질성(clonal genetic heterogeneity)에 기인하였다. 그러나, 암 세포에서 약물 내성을 유발하는 메커니즘은 여러 가지(예를 들어, 약물 비활성화, 세포 사멸 억제, DNA 손상 복구, 약물 표적 변경, 상피-간엽 전이, 약물 유출, 물리적 장벽 등)이며 독립적으로 또는 조합하여 작용할 수 있으며 또한 암 세포의 후성 유전적 변화 및 종양 미세환경의 영향에 의존할 수 있다(Holohan C, et al., 13,　714-726(2013)).
실제로, 종양은 일반적으로 전이를 시작하는 이의 능력 및 항암 요법에 대한 이의 민감성이 다양한 다수의 표현형 하위집단으로 구성된다(Flavahan et al., Epigenetic plasticity and the hallmarks of cancer, Science 357, 266 (2017); Baylin et al., Nat Rev Cancer, 11(10), 726-734 (2011)). 많은 경우에, 세포는, 유전자 돌연변이와 독립적이지만 대신 종양-간질 세포(stromal cell), 혈관계, 면역계 및 세포외 매트릭스(ECM) 조성에 의해 영향을 받는 신호전달 및 유전자 발현 프로그램의 가역적 변화를 통해 이러한 하위집단들 사이의 전이를 나타낸다(Juntilla et al., Nature, 501(7467):346-54 (2013)).
표적화 요법에 대한 내성은 내재적 내성, 적응 내성 및 후천적 내성으로 하위 분류될 수 있다. 내재적 내성은 요법은 둔감한 드라이버 돌연변이(driver mutation) 때문일 수 있다. 적응 내성은 치료에 대한 부분적인 초기 반응 후에 암 세포가 요법 후 이의 생존을 가능하게 하는 적응 변화를 겪을 때 발생한다. 후천적 내성은 불균질 하위집단에서 기존의 돌연변이에 대한 선택(즉, 처음에는 종양의 모든 암 세포가 표적에 의존적이지 않다)과 요법에 의해 가해지는 선택적인 압력으로 인한 새로운 변이(표현형적 또는 유전적)의 획득 둘 다의 결과일 수 있다. 내성의 메커니즘은 다른 생존 및/또는 성장 경로를 유도하여 표적을 우회할 수 있는 약물 또는 다른 신호전달 이벤트의 1차 표적을 포함할 수 있다(Rotow-Bivona et al., Nature Reviews Cancer, 17(11) 637-658(2017)).
따라서, 특정 암의 시험관내 배양을 위해 단일 조건을 사용하는 것은 상이한 약물 반응 및 이에 따른 약물 내성을 초래할 수 있는 상이한 유전적 및 표현형 종양 세포 특성을 생체외에서 나타내는 데 필요한 불균질성을 유지하기에 충분하지 않을 수 있다.
초기에 수동 지지체인 것으로 사료되었던 ECM은 이의 테더링된 생물활성 도메인과 함께 가용성 사이토카인의 저장소로서, 악성 개시, 진행에 있어 그리고 화학요법에 대한 암 세포 민감성, 예를 들어 내화학성에 영향을 미치는 핵심 플레이어로서 부상하고 있다(Senthebane et al., Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1586). ECM 구조 및 조성은 간질(stroma) 내의 다수의 세포 유형에 의해 조절되며 종양 세포 거동의 수많은 측면에 영향을 미친다. 유전적 요인과 비유전적 요인 둘 다 종양 내 표현형 다양성에 실질적으로 기여하지만, 모든 이들의 상대적 기여를 결정적으로 해결할 수 있는 접근법은 없다.
생물활성 펩티드로 변형된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 주로 구성된 합성 중합체 기반 지지체의 사용이 폐 선암종 세포주의 연구 모델에 적용되었다(Gill et al., Cancer Res; 72(22) November 15, 2012). 다양한 탄성 및 부착성 리간드 농도를 갖는 변형된 PEG-RGD 및 MMP-민감성 하이드로겔은 상피 형태발생에서 ECM 유래의 차이를 조사하고 연구하기 위해 유리 기판에 디스크로서 적용되었다.
바이오하이브리드 인 시츄-형성 하이드로겔(biohybrid in situ-forming hydrogel)(starPEG)은 유방암 세포 거동에 대한 뼈 세포-분비형 인자의 잠재적 역할을 연구하기 위해 사용되었다(Bray et al., Cancers 2018, 10, 292). starPEG는 또한 미세환경 내에서 세포의 생존력, 형태특징(morphology) 및 이동을 연구하기 위해 콜라겐 I 유래 펩티드가 첨가되거나 첨가되지 않은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)-절단가능한 펩티드 링커와 접합되었다.
ECM 단백질과 약물 내성 사이의 상호작용과 관련하여, ECM 조성은 피브로넥틴, 라미닌 또는 사이클릭 세포 부착 펩티드 RGD(cRGD)가 보충된 히알루론산(HA) 하이드로겔에서 약물 내성을 조절하는 것으로 이미 설명되었다(Blehm et al., Biomaterials. 2015 July ; 56: 129-139). 이 논문은 종양-ECM 환경의 조성 및 구조가 약물 효능에 직접적으로 영향을 미친다는, 즉 ECM 특징이 상이한 약물에 대한 암 세포 민감성에 영향을 미친다는 첫 번째 증거였다.
유사하게, 상이한 강성을 가진 콜라겐 I형에 기반한 생체모방성(biomimetic) 하이드로겔을 사용하여, Lam 등(Mol. Pharmaceutics 2014, 11, 2016 - 2021)은 전이성 유방 종양 세포의 증식성 성장과 침윤 및 약물 치료 결과에 미치는 매트릭스 강성 효과를 이미 비교하였다.
최근에는, ECM의 주요 생물물리학적 및 생화학적 특징이 약물 반응을 어떻게 매개하는지를 조사하기 위해 3D 생체재료 환경에서 배양된 세포에서 약물 반응을 스크리닝하는 접근법이 개발되었다(Schwartz et al., Integr. Biol., 2017, 9, 912-924). cRGD를 함유하는 3D PEG-말레이미드(PEG-MAL) 하이드로겔은 매트릭스-매개 적응 내성을 분석하기 위해 강성, 차원(즉, 2D 대 3D) 및 세포-세포 접촉을 체계적으로 변경시키는 데 사용되었다. 그들은 단 하나의 스크리닝 환경, 즉 단일 배양 조건을 사용하거나 시스템 생물학 분석 없이는 실현되지 않았을 MEK 억제제와 소라페닙 병용 요법의 상관 효능을 식별하였다. 상기 논문에서, 유전적으로 균질한 것으로 알려진 세포주로부터의 단일 조직 유형이 사용되었다(특정 환자 종양으로부터 유래된 세포가 아님). 특정 환자 종양의 세포 또는 상이한 환자 종양의 세포의 불균질성을 포착하기 위해 겔 선택을 사용할 필요성은 상기 논문으로부터 도출할 수 없다.
WO 2014/180970 A1에는, 어레이 및 이를 통해 수행되는 조합적 방법이 기재되어 있다. 다중웰 플레이트의 이산 용적(discrete volume)에서, 상이한 세포외 매트릭스 조건은 하이드로겔 전구체 분자, 가교결합제 및 상기 하이드로겔 전구체 분자에 부착된 생물활성제의 종류 및/또는 양을 변화시켜 자동화된 방식으로 제공되었다.
문헌[Touati et al. (2018년 4월 14일 내지 18일에 시카고에서 개최된 AACR 2018 연례 회의에서 포스터 발표)]은 A549 폐 선암종 세포주의 형태특징에 미치는 상이한 ECM 조성의 영향에 대해 보고하였으며 약물 노출에 대한 상이한 민감성을ECM-유도된 세포 표현형과 상관시켰다.
환자의 약물 치료 결과를 보다 정확하게 예측하기 위해, 환자의 상이한 질환 특성을 포착할 수 있는 약물 스크리닝/테스트를 위한 생체외 세포 배양 조건을 확립하는 시스템이 필요하다. 보다 구체적으로, 특정 질환을 앓고 있는 환자의 치료를 보조하고 개선하기 위해 용이하게 사용될 수 있는 방법 및 키트가 필요하다.
오가노이드의 제조
본 발명은 오가노이드, 튜머로이드(tumoroid), 다세포 종양 스페로이드, 세포 스페로이드, 세포 클러스터, 종양구(tumorosphere), 조직 유래 종양 구 또는 언급된 세포 구조의 단편과 같은 임의의 종류의 세포 구조를 포함하는 3차원 세포 배양 모델에 관한 것이다. 이하, 용어 "세포"는 이러한 임의의 종류의 세포 구조를 지칭하고자 한다.
세포 스페로이드 또는 클러스터를 포함한 오가노이드는 생체내 상황과 유사한 방식으로 세포 분류 및 공간적으로 제한된 계통 결정(lineage commitment)을 통해 발달하고 자가-조직화(또는 자가-패턴)하는 줄기 세포, 장기-특이적, 조직-특이적 또는 질환-특이적 세포 유형의 세포 3차원 구조이다. 따라서, 오가노이드는 세포의 고유한 생리학을 나타내며 고유한 장기, 조직 및/또는 이환된 세포 및 조직 상황(예를 들어, 암, 낭포성 섬유증, 염증성 장 질환)을 모방하는 세포 조성(남아있는 줄기 세포 및/또는 상이한 분화 단계에 있는 특수화된 세포 또는 조직 유형을 포함) 및 해부 구조를 갖는다. 정상 및/또는 이환된 세포(예를 들어, 암 세포)는 오가노이드 또는 암 오가노이드(튜머로이드로도 불림)와 같은 임의의 세포 구조 또는 임의의 조직으로부터 단리될 수 있다. 오가노이드가 생성되는 세포는 자가-조직화되어 생체내에서 장기(즉, 세포 분화) 또는 이환된 조직(예를 들어, 종양의 다세포 불균질성)과 매우 유사한 구조를 형성하는 다수의 세포 유형을 나타내는 장기-유사 또는 질환-유사 조직(예를 들어, 암, 낭포성 섬유증, 염증성 장 질환)을 형성하도록 성장 및/또는 분화할 수 있다. 따라서, 오가노이드는 생체내 상황과 매우 유사한 시스템에서 인간 장기, 인간 장기 발달, 암 및 기타 질환을 연구하기 위한 우수한 모델이다. 오가노이드는 또한 재생 및 개인화 의학과 같은 임상 적용을 위해 세포를 성장 및 증대(expand)시키는 데 사용된다.
임상 적용의 다른 예는 환자를 위한 개인화된 치료 옵션을 식별하기 위해 약물을 테스트하기 위해 질환을 나타내는 오가노이드를 생체외에서 배양하는 개인화 의학에 대한 것이다. 간단히 말하면, 이환된 조직 생검 또는 조직 절편으로부터 수거된 환자 유래 세포의 사용은 오가노이드 및/또는 임의의 다른 종류의 세포 구조로서 생체외에서 성장하고 증대된다. 후속적으로, 잠재적인 치료적 치료 옵션(예를 들어, 약물, 약물의 조합)을 이용하는 테스트가 실제로 환자가 치료되기 전에 이러한 환자 오가노이드에 대해 수행될 수 있다. 환자 세포를 이용한 이러한 생체외 약물 테스트의 결과는 의사가 환자에게 어떤 치료를 제공할지에 대한 이들의 결정을 지원하는 데 사용될 수 있다.
상기 언급한 잠재적인 임상 적용을 위한 선행 기술에서, 오가노이드로서 성공적인 생체외 환자 세포 성장 및 증대는 동물 유래 매트릭스(예컨대, Matrigel®)의 사용에 의존하였다.
그러나, Matrigel®과 같은 동물 유래 매트릭스의 기원의 성질, 내재하는 뱃치 간 편차 및 미한정된 조성은 인간에서의 사용 또는 인간에서 후속 이식을 위해 생체외에서 세포를 증대하는 것에 대한 규제 승인을 금지한다. 또한, 이러한 문제들은 정밀 의학에서 임상 진단을 위해 오가노이드 약물 테스트를 사용하는 것에 대한 규제 승인에 요구될 수 있는 오가노이드 배양의 표준화에 주요 장애물이 될 수 있다. 이와 같이, 오가노이드의 사용을 임상 적용(예를 들어, 정밀 의학, 재생 의학 등)으로 전환하기 위해서는, 오가노이드 배양의 몇가지 측면이 변형될 필요가 있다. 이것은 인간 사용을 위해 한정 및 승인되고 확장가능하고, 바람직하게는 이종물질-무함유인 지지체 매트릭스 및 배양 배지의 개발을 포함한다.
문헌[Broguiere et al., Growth of Epithelial Organoids in a Defined Hydrogel, Adv. Mater. 2018, 1801621]에서, 라미닌-111이 보충된, 한정되었지만 합성이 아닌(즉, 알로-무함유(allo-free) 또는 이종물질-무함유가 아닌) 피브린 하이드로겔이 인간 소장 상피, 간, 췌장 및 췌장관 선암종(PDAC)으로부터 유래된 오가노이드주의 성장을 지지하는 것으로 나타났다.
Gjorevski(Gjorevski et al., Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture, Nature, Vol 539, 24 November 2016, 560-56; Gjorevski et al., Synthesis and characterization of well-defined hydrogel matrices and their application to intestinal stem cell and organoid culture, Nature protocols, Vol. 12, no.11, 2017, 2263-2274; WO 2017/036533 A1 및 WO 2017/037295 Al)는 1차 마우스 및 인간 소장 오가노이드 및 인간 결장직장암 오가노이드의 성장을 위해, 작용화된 RGD 펩티드 및 특이적 효소 분해를 포함하는 상이한 분해 동역학뿐만 아니라 제어된 자가분해 동역학(PEG-아크릴레이트의 가수분해)을 갖는 효소적으로(인자 XIII) 가교결합된 8-암(arm) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 하이드로겔을 개발하였다. 오가노이드 분화를 지지하기 위해 마우스 조직으로부터 정제된 라미닌-111(전체 단백질)의 첨가가 필요하였다.
이 접근법의 일부 성공이 마우스 세포로부터의 증대 및 오가노이드 형성에 대해 나타났지만, 상기 시스템은 인간의 생검으로부터 갓 단리되거나 동결된 인간 세포로부터의 증대 및 오가노이드 형성에 적합하지 않은 것으로 나타났다(오히려 문헌[Gjorevski 2017, p. 2265]에서 의문시됨). 또한, 인자 XIII와의 효소적 가교결합 반응에 기반하는 유일하게 테스트된 시스템은 비용이 많이 들고, 상업적 목적으로 규모-확대하고/하거나 자동화하기 어려우며, 또한 재현하기 어려운 것으로 입증되었다.
Cruz-Acuna(Cruz-Acuna et al., Synthetic hydrogels for human intestinal organoid generation and colonic wound repair, Nature cell biology, advanced online publication published online 23 October 2017; DOI: 10.1038/ncb3632, 1-23; Cruz-Acuna et al., PEG-4MAL hydrogels for human organoid generation, culture, and in vivo delivery, Nature protocols, Vol. 13, september 2018, 2102 - 2119; 및 WO 2018/165565 A1)에 의해 설명된 작업은 인간 배아 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell)를 사용하여 장 오가노이드를 성장시키기 위해 RGD로 작용화되고 프로테아제-분해가능한 펩티드 GPQ-W와 가교결합된 완전 합성 4-암 PEG-말레이미드 하이드로겔에 기반한다. 이후, 이러한 합성 겔에서 증대된 오가노이드는 개념 증명 연구로서 마우스 결장 손상 모델에 주사되어 장 오가노이드 이식의 치료 잠재성을 입증하였다.
이 시스템을 이용해서는 환자의 생검으로부터 갓 단리되거나 동결된 세포를 증대시켜 오가노이드를 형성할 수 없는 것으로 나타났다. 이 시스템의 경우, 가교결합제 성분이 효소적으로 분해될 필요가 있다.
현재, 생체외 오가노이드 배양의 확립을 위한 표준은 먼저 "최적 표준(gold standard)" Matrigel®(Matrigel®은 기저막 추출물(BME)의 상업적으로 이용가능한 제품 중 하나이다)에서 (조직으로부터) 갓 단리된 세포를 캡슐화하고 여러 계대 동안 세포를 성장시켜 이를 증대시키는 것(즉, 세포 수를 증가시키는 것)을 포함한다. BME(예를 들어, Matrigel®)는 마우스 육종 추출물로부터 유래된 겔로서, 이미 상기 언급한 바와 같이 뱃치 간 일관성이 불량하고, 미한정된 조성을 가지므로 임상 전환 적용(clinical translational application)에서 사용될 수 없어서, 규제 승인을 얻는 것이 까다롭거나 불가능할 수 있다(Madl et al., Nature 557(2018), 335-342).
오가노이드의 확립을 위해 미한정된 이종물질 구성요소 또는 인간 구성요소를 갖는 겔의 사용을 제거하는 것은 재생 의학, 정밀 의학, 약물 테스트 또는 환자 계층화와 같은 임상 적용에서 오가노이드를 사용하는 주요 장애 중 하나를 극복할 것이다.
완전 한정된(완전 합성이 아님) 매트릭스에서 배양된 생검으로부터 갓 단리된 세포의 개념 증명이 문헌[Mazzocchi et al., In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening, Scientific reports (2018) 8:2886; Votanopoulos et al., Appendiceal Cancer Patient-Specic Tumor Organoid Model for Predicting Chemotherapy Efcacy Prior to Initiation of Treatment: A Feasibility Study, Ann Surg Oncol (2019) 26:139-147; 및 WO 2018/027023 A1]에 의해 제공되었다. 간략하게 말하면, 약물 반응 예측을 위한 플랫폼을 개발하기 위해 중피종 및 충수암 환자로부터 유래된 세포가 히알루론산/콜라겐 기반 하이드로겔에서 배양되었다. 그러나, Matrigel®과 마찬가지로, 콜라겐도 천연 유래 매트릭스이며 유사한 문제를 겪고 있다.
지금까지, 생검 또는 조직 절편으로로부터 갓 단리되거나 동결된 인간 세포(즉, 인간으로부터 직접 수득되었고 다른 시스템에서 사전 배양 또는 사전 확립되지 않은 세포)의 성공적인 증대 및 이로부터 Matrigel® 또는 콜라겐과 같은 천연 유래 매트릭스가 아닌 완전 한정된 및/또는 완전 합성 하이드로겔 매트릭스에서의 후속적인 오가노이드의 형성에 대한 보고는 없었다. 상기 논의된 선행 기술에서 언급된 바와 같이, 이러한 접근법이 명백히 필요함에도 불구하고, 지금까지 최적 표준은 여전히 Matrigel®을 세포 증대의 적어도 첫 번째 단계에 사용하는 것이다. 이것은 반합성 또는 완전 합성 3차원 하이드로겔 시스템이 작동하게 만드는 것과 관련된 어려움에 대한 증거이다.
따라서, 생검으로부터 갓 단리되거나 동결된 인간 세포의 증대 및 이로부터 후속적인 오가노이드의 형성을 위한 방법이 또한 필요하며, 상기 방법은 Matrigel®과 같은 천연 유래 매트릭스의 사용을 완전히 피하고 임상 적용에 적합하고 상업적으로 실현가능한 방식으로, 즉 비용-효과적이고, 신뢰할 수 있으며, 재현가능하고, 자동화가능하고 규모확대가능한 방식으로 생성된 오가노이드를 제공한다.
환자에 대한 약물 치료 결과를 보다 정확하게 예측하기 위해, 환자의 상이한 종양 특성을 포착할 수 있는 약물 스크리닝/테스트를 위한 생체외 세포 배양 조건을 확립하기 위한 최적의 시스템은 또한 생검 또는 절편으로부터 갓 단리되거나 동결된 인간 세포를 증대시키고 이로부터 후속적으로 오가노이드를 형성하는 능력을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 방법은 Matrigel®과 같은 천연 유래 매트릭스의 사용을 완전히 피한다.
보다 구체적으로, 소정 질환을 앓고 있는 환자의 치료를 보조하고 개선하기 위해 용이하게 사용될 수 있는 방법 및 키트가 필요하며, 여기서 상기 방법은 Matrigel®과 같은 천연 유래 매트릭스의 사용을 완전히 피한다.
본 발명은 소정 질환 또는 건강한 조직에 대해 구체적으로 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 포함하는 세포 성장 키트를 제공함으로써 상기 논의된 선행 기술에 대해 부연 설명하며 따라서 상기 특정 질환에 대한 약물 요법 또는 상기 특정 건강한 조직에 대한 독성의 결과를 보다 정확하고 효율적으로 예측할 수 있다. 상기 선행 기술에서, 이러한 완전 한정된(완전 합성을 포함) 3차원 하이드로겔의 잠재성은 인식되지 않았다.
이전에 수행된 실험 및/또는 지식에 기반하여, 암 세포 또는 정상/건강한 세포와 같은 특정 조직 유형의 성장 및 후속 테스트에 적합한 조건을 추정하는 것이 가능하다. 그러나, 이것이 각 조직 유형의 소정 특성을 다룰 수 있지만, 예를 들어 암 세포의 경우, 전이를 개시하는 이의 능력 및 항암 요법에 대한 민감성이 다양한 조직 유형의 다수의 표현형 하위집단을 다루기에는 여전히 충분하지 않다. 따라서, 특정 조직 유형의 성장에 적합한 것으로 이전에 확립된 단일 생체외 배양 조건 하에 상기 특정 조직 유형으로 분석을 수행하더라도, 소정 질환을 앓고 있는 환자의 원하는 최적의 지원 및 치료 개선이 제공되지 않는다.
본 발명은 소정 조직 유형에 적합한 것으로 확립된 세포외 매트릭스 조건의 사전 선택에 기반하는 세포외 매트릭스(생체외 배양) 조건의 어레이를 제공하지만, 상기 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건의 변형을 제공한다. 이 접근법을 사용하면, 훨씬 더 집중된 분석이 수행될 수 있다. 반면에, 사전 선택되지 않은 세포외 매트릭스 조건(예를 들어, 세포외 매트릭스 조건의 통상적인 스크리닝)을 사용한 통상적인 분석에서 상기 분석에 사용된 소정 수의 세포외 매트릭스 조건은 적합하지 않을 것이고, 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 사용하는 본 발명의 방법에서는 모든 세포외 매트릭스 조건이 기본적으로 의도된 목적에 적합하며, 치료될 환자의 소정 조직 유형의 특정 표현형 하위집단을 위한 최적의 세포외 매트릭스 조건을 식별하는 것이 훨씬 더 집중된 방식으로 가능하다. 따라서, 본 발명은 개인화 의학에 대한 개선을 제공한다.
따라서, 본 발명은 임의로 간질 세포 또는 면역 세포와 같은 다른 세포와 조합된 하나의 조직 유형을 이용한 방법으로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 존재 하에, 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 임의로 적어도 1종의 가교결합제 및 테스트될 조직 유형의 세포를, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 가교결합시켜, 이산 용적을 갖는 완전 한정된 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제공하는 단계;
b) 상기 세포를 하나 이상의 상이한 배양 배지의 존재 하에 상기 하이드로겔 매트릭스 어레이의 상기 이산 용적에서 성장하고 증대되도록 하는 단계;
c) 상기 하이드로겔 매트릭스 어레이의 상기 이산 용적에서 성장한 세포를 이용하여 작업을 수행하는 단계
를 포함하고,
하이드로겔 특징의 특정 조합이 테스트될 상기 하나의 조직 유형에 대해 사전 선택된 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 방법의 단계 b)에서 세포는 충분한 양의 세포에 도달할 때까지 성장 및 증대된다. 충분한 양의 세포에 도달하면, 단계 c)에서 원하는 작업(예를 들어, 약물 테스트 또는 세포 저장소/바이오뱅크의 생성/확립)이 수행될 수 있다. 바람직하게는, 단계 b)(세포 증대)는 수동으로 수행되며, 여기서 각 계대 후 세포 수를 증가시키는 것이 중요하다. 그러나, 단계 b)를 자동으로 및/또는 소형화된 방식으로 수행하는 것도 가능하다.
상기 방법은 조합적 방법, 즉 생체외 조건(세포외 매트릭스 조건 등)과 약물의 복수 조합을 동시에 검사하는 방법일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 하이드로겔 매트릭스 어레이의 상기 이산 용적에서 성장한 세포를 이용하여 수행될 상기 작업은 상기 하이드로겔 매트릭스 어레이의 상기 이산 용적에 1종 이상의 약물을 첨가하는 것일 수 있다. 상기 실시양태에 따르면, 방법은 테스트된 조직 유형으로부터의 세포와 관련된 병태를 치료하기에 적합한 1종 이상의 약물을 식별하기 위한 약물 스크리닝 테스트이다. 이것은 개인화 의학 분야에서 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 조직 유형이 특정 환자로부터 유래된 것, 예를 들어 상기 환자의 생검 또는 절편으로부터 갓 단리되거나 동결된 세포인 경우, 상기 약물 스크리닝 테스트는 상기 소정 환자에게 가장 적합한 치료를 정확하게 식별하는 데 도움이 되기 때문에 정밀 및/또는 개인화 의학에 대한 개선이다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 방법의 수행에 이용되는 상기 조직 유형은 암 세포뿐만 아니라 간질 세포, 예를 들어 암 관련 섬유아세포(CAF) 또는 면역 세포를 포함하는 다른 세포 유형 둘 다를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 조직 유형은 c-Met를 과발현하는 폐암, 바람직하게는 비소세포 폐암이고, 하이드로겔 매트릭스는 비-자가분해가능한 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되며, 여기서 가교결합제 및 상기 임의적 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는다. 바람직하게는, 상기 실시양태에서 사용되는 배양 배지는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 조직 유형은 췌장관 선암종(PDAC) 세포이고, 하이드로겔 매트릭스는 50 내지 3,000 Pa, 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 및 가장 바람직하게는 50 내지 1,000 Pa 범위의 강성을 갖는 비-자가분해가능한 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되고, 여기서 가교결합제 중 적어도 1종 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함한다. 바람직하게는, 상기 실시양태에서 사용될 배양 배지는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 조직 유형은 결장직장암(CRC) 세포이고, 하이드로겔 매트릭스는 적어도 50 내지 2,000 Pa 범위의 초기 강성을 갖는 PEG 하이드로겔이고, 임의로 라미닌, 바람직하게는 라미닌-111 또는 라미닌-511 및 특히 바람직하게는 천연 마우스 라미닌-111 또는 재조합 인간 라미닌-511을 포함하는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 추가로 포함하는 것으로 사전 선택되고, 여기서 가교결합제 중 적어도 1종 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함한다. 바람직하게는, 상기 실시양태에서 사용될 배양 배지는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 조직 유형은 유방암 세포이고, 하이드로겔 매트릭스는 바람직하게는 효소-분해가능한 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되며, 여기서 가교결합제 중 적어도 1종은 바람직하게는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함하며 상기 하이드로겔은 임의로 라미닌, 바람직하게는 라미닌-111 및 특히 바람직하게는 천연 마우스 라미닌-111을 포함하는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 실시양태에서 사용될 배양 배지는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 조직 유형은 건강한/정상 대응물(예를 들어, 상피 및/또는 간질 세포)보다 생체외에서 더 느리게 성장하는 암 세포, 바람직하게는 전립선암 세포이고, 하이드로겔 매트릭스는 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 범위의 강성을 갖는 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되며, 여기서 상기 가교결합제 및 상기 임의적 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 조직 유형은 간질 세포, 바람직하게는 섬유아세포와 조합된 암 세포, 바람직하게는 췌장관 선암종(PDAC) 세포이고, 하이드로겔 매트릭스는 바람직하게는 50 내지 3,000 Pa, 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 및 가장 바람직하게는 50 내지 1,000 Pa 범위의 강성을 갖는 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되고, 여기서 가교결합제 중 적어도 1종은 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함하고, 가교결합제 중 적어도 1종 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함한다. 바람직하게는, 상기 실시양태에서 사용될 배양 배지는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제 및 더욱 바람직하게는 또한 FBS(소태아 혈청)를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 하이드로겔 매트릭스 어레이의 상기 이산 용적에서 성장한 세포를 이용하여 수행될 상기 작업은 특히 정밀 의학 분야에서 건강한 오가노이드 세포에서의 약물 스크리닝/테스트일 수 있다. 바람직한 실시양태에 따르면, 건강한/정상 오가노이드(예를 들어, 결장 또는 장 오가노이드, 정상/건강한 전립선 세포, 또는 다른 장기의 건강한 세포)는 동일한 장기의 이환된 세포를 이용한 약물 테스트에서 대조군 조건 및/또는 세포독성 분석(예를 들어, 약물의 독성을 테스트하기 위한)으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 건강한/정상 결장 또는 장 오가노이드는 약물을 예를 들어 암 오가노이드 또는 동일한 환자의 낭포성 섬유증 조직으로부터의 오가노이드에서 테스트하는 약물 테스트에서 대조군 조건으로서 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 상기 하이드로겔 매트릭스 어레이의 상기 이산 용적에서 성장한 세포를 이용하여 수행될 상기 작업은 기초 과학 연구에서 상기 3D 세포 구조를 사용하기 위해 또는 재생 또는 개인화 의학의 목적으로 상기 세포를 인간에게 이식하기 위해 성장한 세포(본원에서 오가노이드로 지정됨)의 단리일 수 있다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시양태의 중요한 이점은 Matrigel®과 같은 천연 유래 매트릭스의 사용을 완전히 피할 수 있다는 것이다. 놀랍게도, 당업계에서 오랫동안 계속되고 있는 이러한 필요성은 이하에 설명된 바와 같이 구체적으로 사전 선택된 조건을 사용함으로써 달성될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 완전 한정된 세포외 매트릭스 조건 하에 전체 방법을 수행하는 것은 약물의 임의의 다양한 거동이 특정 세포외 매트릭스 조건에 명확하게 기인할 수 있기 때문에 약물 스크리닝에 대한 보다 정확한 결과를 제공한다. 또한, 완전 한정된 세포외 매트릭스 조건 하에 전체 방법을 수행하는 것은 선행 기술에서 수행되는 방법과 달리 개인화 및 재생 의학에 대한 규제 승인 요건을 충족한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 조직 유형에서 또는 하나 이상의 조직 유형을 이용한 작업을 수행하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 완전 한정된 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서,
상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자,
- 임의로 적어도 1종의 가교결합제,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하는 구성요소,
b) 하나 이상의 상이한 배양 배지
를 포함하고,
하이드로겔 특징의 특정 조합이 테스트될 조직 유형에 대해 사전 선택된 것인, 키트에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 키트는 c-Met를 과발현하는 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 것이며, 하이드로겔 매트릭스는 비-자가분해가능한 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되며, 여기서 가교결합제 및 상기 임의적 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않고, 상기 배양 배지는 바람직하게는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 키트는 췌장관 선암종(PDAC) 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 것이며, 하이드로겔 매트릭스는 50 내지 3,000 Pa, 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 및 가장 바람직하게는 50 내지 1,000 Pa의 범위의 강성을 갖는 비-자가분해가능한 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되고, 여기서 가교결합제 중 적어도 1종 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하고, 상기 배양 배지는 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 키트는 결장직장암(CRC) 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 것이며, 하이드로겔 매트릭스는 적어도 50 내지 2,000 Pa의 범위의 초기 강성을 갖는 PEG 하이드로겔이고, 임의로 라미닌, 바람직하게는 라미닌-111 또는 라미닌-511, 특히 바람직하게는 천연 마우스 라미닌-111 또는 재조합 인간 라미닌-511을 포함하는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 추가로 포함하는 것으로 사전 선택되고, 여기서 가교결합제 중 적어도 1종 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하고, 상기 배양 배지는 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 키트는 유방암 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 것이고, 하이드로겔 매트릭스는 바람직하게는 효소-분해가능한 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되며, 여기서 가교결합제 중 적어도 1종은 바람직하게는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함하고, 상기 하이드로겔은 임의로 라미닌, 바람직하게는 라미닌-111 및 특히 바람직하게는 천연 마우스 라미닌-111을 포함하는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 추가로 포함하고, 상기 배양 배지는 바람직하게는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 키트는 건강한/정상 대응물(예를 들어, 상피 및/또는 간질 세포)보다 생체외에서 더 느리게 성장하는 암 세포, 바람직하게는 전립선암 세포를 성장시키고 이에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 것이다. 하이드로겔 매트릭스는 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 범위의 강성을 갖는 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되며, 여기서 상기 가교결합제 및 상기 임의적 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 키트는 특정 조직 유형으로부터 유래하는 세포용으로 지정되며, 상기 조직 유형에서의 작업 또는 상기 조직 유형을 이용한 작업, 예컨대 상기 조직 유형에서의 약물 영향의 테스트, 또는 재생 의학의 목적 또는 약물 개발/발견 또는 세포 저장소/바이오뱅크의 생성을 위해 성장한 세포를 기초 과학 연구, 개인화 의학에서 사용하거나 인간에게 상기 세포를 이식하기 위한 상기 성장한 세포의 단리를 수행하기 위해 쉽게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 예를 들어 상기 키트와 함께 제공된 지침서에 의해, 상기 키트가 사용될 상기 특정 조직 유형용이라는 것이 상응하게 표시된다.
정의
본 발명은 단일 세포, 오가노이드, 튜머로이드, 다세포 종양 스페로이드, 세포 스페로이드, 세포 클러스터, 종양구, 조직 유래 종양 구 또는 언급된 세포 구조의 단편과 같은 임의의 종류의 세포 구조를 포함하는 3차원 세포 배양 모델에 관한 것이다.
이하, 용어 "세포"는 이러한 임의의 종류의 세포 구조를 지칭하고자 한다.
어레이는 소정 방식으로, 예를 들어 행 및/또는 열로 배열될 수 있는 여러 이산 용적의 세트이다. 예를 들어, 전형적으로 사용되는 웰 플레이트(예를 들어, 48웰 플레이트)는 8개의 열과 6개의 행으로 배열된 48개의 이산 용적을 제공하며, 이 예에서 각 열은 6개의 이산 용적으로 구성된다. 이 예에서 이러한 각 열은 본 발명에 따라 어레이로서 간주된다. 대안적으로, 이 예에서 8개의 이산 용적으로 구성된 각 행도 어레이로서 간주될 수 있다.
세포 스페로이드 또는 클러스터를 포함한 오가노이드는 생체내 상황과 유사한 방식으로 세포 분류 및 공간적으로 제한된 계통 결정을 통해 발달하고 자가-조직화(또는 자가-패턴)하는 줄기 세포, 장기-특이적, 조직-특이적 또는 질환-특이적 세포 유형의 세포 3차원 구조이다. 따라서, 오가노이드는 세포의 고유한 생리학을 나타내며 고유한 장기, 조직 및/또는 이환된 세포 및 조직 상황(예를 들어, 암, 낭포성 섬유증, 염증성 장 질환)을 모방하는 세포 조성(남아있는 줄기 세포 및/또는 상이한 분화 단계에 있는 특수화된 세포 또는 조직 유형을 포함) 및 해부 구조를 갖는다. 정상 및/또는 이환된 세포(예를 들어, 암 세포)는 오가노이드 또는 암 오가노이드(튜머로이드로도 불림)와 같은 임의의 조직 또는 임의의 세포 구조로부터 단리될 수 있다. 오가노이드가 생성되는 세포는 자가-조직화되어 생체내에서 장기(즉, 세포 분화) 또는 이환된 조직(예를 들어, 종양의 다세포 불균질성)과 매우 유사한 구조를 형성하는 다수의 세포 유형을 나타내는 장기-유사 또는 질환-유사 조직(예를 들어, 암, 낭포성 섬유증, 염증성 장 질환)을 형성하도록 성장 및/또는 분화할 수 있다. 따라서, 오가노이드는 생체내 상황과 매우 유사한 시스템에서 인간 장기, 인간 장기 발달, 암 및 기타 질환을 연구하기 위한 우수한 모델이다. 오가노이드는 또한 재생 및 개인화 의학과 같은 임상 적용을 위해 세포를 성장 및 증대시키는 데 사용된다.
본 발명에 따르면, 용어 "조직 유형"은 유사한 구조를 갖고 함께 작용하여 특정 기능을 수행하는 세포의 군을 지칭한다. 동물에서는, 결합 조직, 근육 조직, 신경 조직 및 상피 조직의 4가지 상이한 조직 유형이 있다. 본 발명에 따르면, 동일한 조직 유형으로부터의 세포는 건강한 세포일 때 함께 작용하여 특정 기능을 수행하는 세포들의 앙상블이다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 동일한 조직 유형의 세포는 인체에서 동일한 기원을 갖는다(예를 들어, 유방 세포).
본 발명에 따르면, 동일한 조직 유형은 건강한 세포(또는 정상으로도 불림)와 암 세포와 같은 이환된 세포 둘 다를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 동일한 조직 유형으로부터의 세포는 상이한 세포 집단(예를 들어, 종양의 다세포 불균질성)과 같은 상이한 세포 유형/아형을 함유할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 방법의 수행에 사용되는 상기 조직 유형은 암 세포뿐만 아니라, 간질 세포, 예를 들어 암 관련 섬유아세포(CAF) 또는 면역 세포를 포함하는 다른 세포 유형 둘 다를 포함할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해 사용되는 조직 유형의 예는 c-Met를 과발현하는 폐암, 바람직하게는 비소세포 폐암; 췌장관 선암종(PDAC) 세포(바람직하게는 간질 세포, 바람직하게는 섬유아세포와 조합), 결장직장암(CRC) 세포, 유방암 세포, 또는 건강한/정상 대응물(예를 들어, 상피 세포 및/또는 간질 세포)보다 생체외에서 더 느리게 성장하는 암 세포, 바람직하게는 전립선암 세포이다.
발명에 따르면, 용어 "생검 또는 조직 절편으로부터 갓 단리된 동결된 인간 세포"는 언급된 절차 중 어느 하나에 의해 인간으로부터 직접 수득되고 오가노이드, 스페로이드, 세포 클러스터 또는 임의의 세포 구조를 형성하는 방법에 사용되기 전에 다른 시스템에서 사전 배양 또는 사전 확립되지 않은 세포를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 신선한 세포는 즉시 또는 최대 3 내지 4일의 기간 내에 수집되어 본 발명의 방법에 사용된다. 세포가 수집 후에 즉시 사용되지 않은 경우, 이들은 통상적으로 사용되는 조건 하에 보관 목적으로 동결될 수 있다. 수집된 세포는 해리된 세포, 선와 및 조직 조각을 포함하는, 단일 세포 및/또는 세포의 "클러스터"일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 상피 세포가 사용된다.
본 발명에 따르면, 용어 "오가노이드의 드 노보 형성"은 생체외에서(즉, 원래의 유기체 외부에서) 최초로 성장한 갓 단리되거나 동결된 인간 세포(예컨대, 인간 생검 또는 조직 절제)를 지칭한다. 용어 "첫 번째 생체외 세포 성장" 또는 "계대 0(P0)"은 동의어로 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "사전 확립된 오가노이드"는 본 발명의 하이드로겔에 적용되기 전에 다른 시스템(예컨대, Matrigel®, 2D 또는 3D 시스템, 생체내에서 환자 유래 이종이식편(PDX)으로서)에서 성장한 세포, 단일 세포 및/또는 세포 클러스터(예를 들어, 세포 응집체, 오가노이드 등)를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "세포 성장"은 세포의 성공적인 성장을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "세포 계대" 또는 "계대" 또는 "세포 분할" 또는 "오가노이드 계대"는 하나의 겔로부터 세포를 추출하고 이러한 세포를 이전 겔과 동일하거나 상이한 특징을 갖는 다른 겔에 시딩(seeding)하고 성장시키는 단계를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "세포 증대" 또는 "오가노이드 증대"는 세포 성장 및 세포 수 증가(예를 들어, 동일한 계대 내에서 또는 하나의 계대로부터 다음 계대까지)의 단계를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "오가노이드 분화"는 오가노이드에서의 세포 분화의 성공적인 유도를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "완전 한정된 하이드로겔"은 완전 합성 또는 반합성 하이드로겔, 즉 그의 합성 및 그의 합성 경로에 사용된 전구체 분자의 공지된 성질로 인해 완전 한정된 구조 및/또는 조성을 갖는 하이드로겔로 이루어진 군에서 선택된 하이드로겔을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "완전 합성 하이드로겔"은 합성 전구체로부터 독점적으로, 즉 천연 라미닌-111과 같은 천연 유래 전구체의 부재 하에 형성된 하이드로겔을 지칭한다 .
본 발명에 따르면, 용어 "완전 한정된 반합성 하이드로겔"은 천연 라미닌-111과 같은 적어도 하나의 천연 유래 전구체를 포함하지만, 그의 합성에 사용된 전구체 분자의 공지된 성질로 인해 완전 한정된 구조 및/또는 조성을 갖는 하이드로겔을 지칭한다. 따라서, 완전 한정된 반합성 하이드로겔은 미지의 구조 및/또는 조성을 갖는 Matrigel®과 같은 천연 유래 하이드로겔과 상이하다.
본 발명에 따르면, 용어 "세포 배양 미세환경에 캡슐화된" 또는 유사한 표현은 세포(들)가 매트릭스에 의해 완전히 둘러싸이는 방식으로 세포(들)가 상기 매트릭스에 매립됨으로써 천연 발생 세포 성장 조건을 모방하는 것을 의미한다.
본원에서 이해되는 바와 같이, 용어 "미세환경" 또는 "미세환경의 용적"은 각각 고처리량 테스트 기기, 특히 다중웰 플레이트에 적합한 용적을 의미한다. 다중웰 플레이트에서 분석되는 전형적인 용적은 약 100nl 내지 약 500μl, 바람직하게는 약 2μl 내지 약 50μl의 범위이다.
용어 "이산 용적"은 어레이 내에서 공간적으로 분리된 스폿 또는 영역과 관련된다. 분리된 스폿 또는 영역은 서로 접촉하고 있을 수 있거나, 바람직하게는 예를 들어 플라스틱 장벽에 의해 서로 분리될 수 있다. 이러한 각각의 이산 용적 내로 또는 상으로, 원하는 조직 유형의 세포가 이들이 서로 분리되는 방식으로 배치될 수 있다. 이들은 실험 시작부터 서로 접촉하지 않고 시간 경과에 따라 그대로 유지됨으로써, 인접 용적과 독립적으로, 오직 이들의 세포 배양 미세환경(생체외 배양)의 영향 하에서만 성장한다.
용어 "가교결합제"는 2개 이상의 하이드로겔 전구체 부분을 서로 연결시키기 위해 하이드로겔 전구체 분자의 기능성 모이어티와 반응할 수 있는 적어도 2개의 작용기를 포함하는 화학 물질을 지칭한다. 예는 시스테인 모이어티와 같은 적어도 2개의 작용기를 포함하는 펩티드, 또는 티올 기와 같은 적어도 2개의 작용기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, 말단 티올 모이어티를 갖는 2-암 또는 다중-암 PEG)이다.
용어 "세포-적합성 반응(들)에 의해 가교결합가능한"(또는 유사한 용어)은 (i) a) 바람직하게는 활성화된 트랜스글루타미나제 인자 XIIIa에 의존하는 효소 촉매 반응; 및 b) 비-효소 촉매 및/또는 비촉매 반응, 바람직하게는 마이클 첨가 반응(Michael addition reaction)으로 이루어진 군에서 선택된 공유결합 형성; 및/또는 ii) 비공유결합 형성(예를 들어, 소수성 상호작용, H-결합, 반데르발스 또는 정전기 상호작용에 기초하여; 특히 온도 변화 또는 완충액의 이온 강도 변화에 의해 유도됨) 둘 다에 기반하는 반응을 포함한다. 이러한 반응은 서로 반응할 수 있는 작용기를 포함하는 2개의 하이드로겔 전구체 분자 사이에서 또는 적어도 하나의 하이드로겔 전구체 분자와 서로 반응할 수 있는 작용기를 포함하는 가교결합제 사이에서 발생할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "성장한 세포를 이용하여 작업을 수행하는"은 상기 하이드로겔 매트릭스 어레이의 상기 이산 용적에 1종 이상의 약물을 첨가하는 것을 포함한다. 따라서, 방법은 테스트된 조직 유형으로부터의 세포와 관련된 병태를 치료하기에 적합한 1종 이상의 약물을 식별하기 위한 약물 개발 또는 약물 스크리닝 테스트를 위한 것일 수 있다. 이것은 개인화 의학 분야에서 사용될 수 있다. 이 방법은 또한 약물 발견을 위해, 세포독성 분석으로서 또는 재생 의학에서 사용될 수 있다. 용어 "성장한 세포를 이용하여 작업을 수행하는"은 또한, 예를 들어 NGS(차세대 시퀀싱)와 같은 DNA 또는 RNA 시퀀싱 방법을 이용하여 세포 자체 또는 세포로부터의 부산물을 분석하는 작업뿐만 아니라 이러한 세포의 생성물을 분석하거나(예를 들어, 상청액 분석) 세포 유래 생성물(예컨대, 세포 계대 또는 세포 증대의 생성물)을 추가 사용을 위해(예를 들어, 바이오뱅크 또는 세포 저장소의 확립을 위해 또는 오가노이드 확립을 위해) 단리하는 작업을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "사전 선택된"은 세포외 매트릭스 조건, 즉 상기 하이드로겔 전구체 분자, 상기 임의적 가교결합제, 상기 임의적 생물활성제 및 바람직하게는 상기 배양 배지 중 적어도 하나, 바람직하게는 이들 중 적어도 2개 및 가장 바람직하게는 이들 모두가, 하이드로겔 특징들의 특정 조합이 사전 선택되도록 테스트될 조직 유형에 대해 선택되는 것을 의미한다. 하이드로겔 특징은 하이드로겔의 구조 및/또는 기능을 한정하는 특징이다. 예는 하이드로겔의 화학 구조(전구체 및 사용되는 임의적 가교결합제 및 임의적 생물활성제에 의해 좌우됨), 하이드로겔의 강성 또는 분해 특성(예를 들어, 가수분해 또는 효소 반응에 의함)이다. 논의된 선행 기술 방법과 비교하여, 본 발명에 따르면 세포외 매트릭스 조건은 무작위로 선택되지 않는다. 이전에 수득되었거나 이용가능한 정보에 기반하여, 테스트될 특정 조직 유형의 성장 및 관심대상 표현형 특성의 발현에 적합한 것으로 이미 알려진 세포외 매트릭스 조건이 선택된다. 세포외 매트릭스 조건을 사전 선택하는 방법은 하기에서 설명할 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 방법에 사용된 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건의 변형도 "사전 선택된" 것으로 이해되어야 하는데, 그 이유는 이러한 변동이 무작위가 아니라 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건에 기반하기 때문이다.
본 발명에 따르면, 용어 "사전 선택된 세포외 매트릭스(생체외 배양) 조건의 변형"은 사전 선택된 조건과 유사하지만, 하이드로겔 특징(예를 들어, 강성, 분해), 배양 배지의 구성요소, 세포외 매트릭스 조건의 구성요소 양, 세포외 매트릭스 내의 생물활성제 등과 같은 적어도 하나의 매개변수, 바람직하게는 1 내지 3개의 매개변수가 상이한 조건을 포괄한다. 일반적으로, 상이한 매개변수는 생물학적 특성(예를 들어, RGD 모티프의 존재 또는 부재), 생물물리학적 특성(예를 들어, 하이드로겔의 강성) 및/또는 생화학적 특성(예를 들어, 효소 분해)이다.
본 발명에 따르면, 용어 "자가분해가능한"은 하이드로겔이 분해 효소의 영향 없이 시간 경과에 따라 분해되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 자가분해는 물과 반응하기 쉬운 하이드로겔 내의 결합의 가수분해로 인해 발생한다. 일례로서, PEG-Acr 전구체 분자(즉, 말단 아크릴레이트 기를 갖는 PEG 분자를 함유하는 전구체 분자)에서 아크릴레이트 기의 반응에 의해 형성된 에스테르 결합이 언급될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "비-자가분해가능한"은 하이드로겔이 분해 효소의 영향 없이 시간 경과에 따라 분해되지 않는 것을 의미한다. 비-자가분해가능한 하이드로겔은 물과 반응하기 쉬운 하이드로겔 내의 결합을 포함하지 않는다. 일례로서, PEG-VS 전구체 분자(즉, 말단 비닐설폰 기를 갖는 PEG 분자를 함유하는 전구체 분자)로부터 형성된 하이드로겔이 언급될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "RGD" 또는 "RGD 서열"은 최소의 생물활성 RGD 서열로서, 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 서열이며 피브로넥틴에 대한 세포 결합을 모방하고/하거나 부착-의존성 세포(anchorage-dependent cell)의 부착을 촉진하기에 충분한 가장 작은(최소의) 피브로넥틴 유래 아미노산 서열을 지칭한다. 더욱이, RGD와 같은 리신- 또는 아르기닌-함유 아미노산 서열은 예를 들어 겔 해리를 위해 사용되는 트립신-유사 효소와 같은 프로테아제에 적합한 기질이다. 적합한 RGD 모티프의 예는 RGD, RGDS, RGDSP, RGDSPG, RGDSPK, RGDTP, RGDSPASSKP, PHSRNSGSGSGSGSGRGDSPG, 또는 사이클로(RGDfC)와 같은 임의의 사이클릭 RGD 모티프이지만, 하이드로겔 및 세포 배양 분야에 공지되어 있고 성공적으로 사용된 임의의 RGD 서열이 주로 사용될 수 있다.
하이드로겔의 전단 계수는 하이드로겔의 강성 계수, G, 탄성 계수 또는 탄성과 동등하다. 전단 계수는 전단 응력 대 전단 변형률의 비로서 정의된다. 하이드로겔의 전단 계수는 레오미터를 사용하여 측정될 수 있다. 간략하게 말하면, 두께가 1 내지 1.4 mm인 사전 형성된 하이드로겔 디스크를 완전 세포 배양 배지에서 적어도 3시간 동안 팽윤시키고, 후속적으로 레오미터의 평행한 플레이트 사이에 샌드위치시킨다. 겔의 기계적 반응은 실온에서 일정한 변형률(0.05) 모드에서 주파수 스위프(0.1 내지 10 Hz) 측정을 수행함으로써 기록된다. 전단 계수(G')는 겔 기계적 특성의 척도로서 보고된다.
하이드로겔 매트릭스 어레이의 제조 방법
본 발명에 따른 하이드로겔 매트릭스 어레이는 일반적으로 WO 2014/180970 A1에 설명된 바와 같이 제조될 수 있다.
간략하게, 상기 바람직한 방법은
a) 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자, 및 임의로 적어도 1종의 가교결합제를 제공하는 단계;
b) 단계 a)에 따른 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 및 임의로 적어도 1종의 가교결합제를 조합하고 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 자동화된 방식으로 분배하는 단계;
c) 상기 이산 용적에 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 첨가하고, 상기 분자를 존재하는 하이드로겔 전구체 분자 또는 단계 e)에서 형성된 하이드로겔 중 적어도 하나에 부착시키거나 이들이 자유롭게 확산되도록 하는 단계;
d) 세포를 기판의 상기 이산 용적 상으로/내로 첨가하는 단계; 및
e) 상기 하이드로겔 전구체 분자를 효소 촉매 반응 또는 마이클 첨가 반응과 같은 세포-적합성 가교결합 반응에 의해 가교결합시켜 하이드로겔 매트릭스를 형성하는 단계
를 포함한다.
하이드로겔 전구체 분자를 가교결합시켜 수득되는, 사용된 하이드로겔은 주로 당업계에 공지된 임의의 유형의 잘 한정된 합성 또는 반합성 하이드로겔로부터 선택될 수 있다. 예는 하이드로겔을 형성하기 위해 라디칼 매개된 티올-노르보르넨(티올-엔) 광중합을 통한 반응 메커니즘을 사용하여 제조되는 하이드로겔과 같은 광가교결합가능한 하이드로겔(Anseth et al., Adv Mater. 2009 December 28; 21(48): 5005-5010; Nature scientific reports 2015, 5:17814) 또는 클릭(click)-화학(예컨대, 마이클 첨가 반응), 물리적 가교결합 또는 효소적 가교결합에 의해 제조되는 하이드로겔이다.
하이드로겔 전구체 분자를 가교결합시켜 수득되는, 사용된 하이드로겔은 바람직하게는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)계 중합체와 같은 친수성 중합체, 가장 바람직하게는 세포-적합성 가교결합 반응에 의해 가교결합되는 다중암 PEG계 중합체이다. 사용될 특정 하이드로겔은 특정 조직 유형에 대한 사전 선택의 결과에 의존하며 하기 바람직한 실시양태에서 논의될 것이다.
바람직하게는, 문헌[Ehrbar et al. (Ehrbar, M., Rizzi, S.C., Schoenmakers, R.G., Miguel, B.S., Hubbell, J.A., Weber, F.E., and Lutolf, M.P., Biomolecular hydrogels formed and degraded via site-specific enzymatic reactions, Biomacromolecules 8 (2007), 3,000-3007)]에 상세히 설명된 가교결합 메커니즘에 의해 생리학적 조건 하에 트롬빈-활성화 인자 XIIIa를 사용하거나 예를 들어 문헌[Lutolf et al.(Lutolf, M.P., and Hubbell, J.A. , Synthesis and physicochemical characterization of end-linked poly(ethylene glycol)-co-peptide hydrogels formed by Michael-type addition, Biomacromolecules 4, 713-722)]에 상세히 설명된 바와 같은 가교결합 메커니즘에 의한 온화한 화학 반응을 통해 가교결합가능한 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 전구체 분자로 구성된 PEG계 하이드로겔이 사용된다.
본 발명의 바람직한 하이드로겔은 전구체 분자로서 비닐설폰 및/또는 아크릴레이트 모이어티로 이루어진 군에서 선택된 에틸렌계 불포화 기를 함유하는 다중암 PEG(폴리(에틸렌 글리콜))에 기반한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 다중암 PEG는 2 내지 12개의 암, 바람직하게는 4-암 또는 8-암을 갖는 PEG로 이루어진 군에서 선택되며, 즉 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG이다. PEG는 1,000-1,000,000, 1,000-500,000, 1,000-250,000, 1,000-150,000, 1,000-100,000, 1,000-50,000, 5,000-100,000, 5,000-50,000, 10,000-100,000, 10,000-50,000, 20,000-100,000, 20,000-80,000, 20,000-60,000, 20,000-40,000, 또는 40,000-60,000의 분자량을 가질 수 있다. 상기 분자량은 예를 들어 GPC 또는 MALDI와 같은 방법에 의해 결정되는 Da. 단위의 평균 분자량이다.
이러한 PEG는 당업계에 공지되어 있으며 상업적으로 이용가능하다. 이들은 4-암 PEG의 경우에 펜타에리트리톨일 수 있고 8-암 PEG의 경우에 트리펜타에리트리톨 또는 헥사글리세롤일 수 있는 코어로 구성된다:
Figure pct00001
4-암 PEG-VS 또는 8-암 PEG-VS에서, 상기 4-암 PEG 또는 8-암 PEG의 말단 유리 OH 기는 당업계에 공지된 조건 하에 비닐설폰 기로 전환되어, 상기 식에서 R은 예를 들어 하기가 된다.
Figure pct00002
4-암 PEG-Acr 또는 8-암 PEG-Acr에서, 상기 4-암 PEG 또는 8-암 PEG의 말단의 유리 OH 기는 당업계에 공지된 조건 하에 아크릴레이트 기로 전환되어 상기 식에서 R은 예를 들어 하기가 된다.
Figure pct00003
바람직하게는, 상기 4-암 PEG 또는 8-암 PEG의 모든 말단의 유리 OH 기는 비닐설폰 또는 아크릴레이트 모이어티로 전환된다.
비닐설폰 또는 아크릴레이트 모이어티는 마이클 첨가 반응을 통해 PEG 전구체 분자를 가교결합시키는 데 적합한 에틸렌계 불포화 기이다. 마이클 첨가 반응은 적합한 친핵성 모이어티와 적합한 친전자성 모이어티와의 반응을 포함하는 잘 알려진 화학 반응이다. 예를 들어, 아크릴레이트 또는 비닐설폰 모이어티는 적합한 마이클 공여체(즉, 친핵체)로서 예를 들어 티올 모이어티와 반응하는 적합한 마이클 수용체(즉, 친전자체)이다.
하이드로겔(겔)은 친수성 중합체 사슬의 네트워크를 포함하는 매트릭스이다. 생체기능성 하이드로겔은 생체접착성(또는 생물활성) 분자 및/또는 살아있는 세포와 상호작용하여 세포 생존력 및 원하는 세포 표현형을 촉진하는 세포 신호전달 분자를 함유하는 하이드로겔이다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에 따른 하이드로겔을 수득하기 위해, 상기 PEG 전구체 분자는 마이클 첨가 반응에서 상기 다중암 PEG의 상기 에틸렌계 불포화 기와 반응할 수 있는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 친핵성 기를 함유하는 가교결합제 분자와 반응한다. 가교결합제 분자는 상기 PEG 전구체 분자 중 적어도 2개를 서로 연결시키는 분자이다. 상기 목적을 위해, 가교결합제 분자는, 하나의 친핵성 기가 제1 PEG 전구체 분자와 반응하고 다른 친핵성 기가 제2 PEG 전구체 분자와 반응하도록 상기 친핵성 기 중 적어도 2개, 바람직하게는 2개를 보유해야 한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 가교결합제 분자는 적어도 2개의 RGD 모티프 및 적어도 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩타이드이다. 시스테인은 티올 기, 즉 마이클 공여체 모이어티를 포함하는 아미노산이다.
하이드로겔 전구체 분자의 가교결합은 세포가 하이드로겔 매트릭스에 의해 캡슐화되는, 즉 별개의 세포 배양 미세환경에 상주하는 방식으로, 어레이의 이산 용적에서 연구될 조직 유형의 존재 하에 수행된다.
본 발명에 따른 3차원 하이드로겔 매트릭스의 기계적 특성은 세포 배양 미세환경의 중합체 함량뿐만 아니라 중합체 겔 전구체의 분자량 및/또는 작용성(가교결합에 이용가능한 부위의 수)을 변경함으로써 변화될 수 있다. 따라서, 예를 들어 전단 계수(G')로 표시되는 매트릭스의 강성은 연질 겔의 경우 10 내지 10,000 Pa, 바람직하게는 50 내지 1,000 Pa, 중간 정도 겔의 경우 1,000 내지 2,000 Pa 또는 경질 겔의 경우 2,000 내지 3,000 Pa로 다양할 수 있다. 하이드로겔의 전단 계수는 강성 계수 G, 하이드로겔의 탄성 계수 또는 탄성과 동일한다. 전단 계수는 전단 응력 대 전단 변형률의 비로서 정의된다. 하이드로겔의 전단 계수는 레오미터를 사용하여 측정될 수 있다. 간략하게 말하면, 두께가 1 내지 1.4 mm인 사전 형성된 하이드로겔 디스크를 수용액(예를 들어, 완충액 또는 완전 세포 배양 배지)에서 적어도 3시간 동안 팽윤시키고, 후속적으로 레오미터의 평행한 플레이트 사이에 샌드위치시킨다. 겔의 기계적 반응은 실온에서 일정한 변형률(0.05) 모드에서 주파수 스위프(0.1 내지 10 Hz) 측정을 수행함으로써 기록된다. 전단 계수(G')는 겔 기계적 특성의 척도로서 보고된다.
또한, 시간 경과에 따른 매트릭스의 물리화학적 특성은 매트릭스-메탈로프로테이나제(MMP), 플라스민 또는 카텝신 K와 같은 세포-분비형 프로테아제에 대한 상이한 민감성을 갖는 펩티드의 매트릭스 내로의 혼입을 통해 겔 매트릭스에 분해 특성을 부여함으로써 변화될 수 있다. 이것은 하이드로겔 매트릭스를 "효소적으로 분해가능"하게 만든다. 프로테아제가 세포에 의해 분비될 때 프로테아제에 대한 감수성 및 결과적인 매트릭스의 물리화학적 특성의 변화는 3차원 매트릭스에서 효율적인 세포 증식 및 이동을 가능하게 한다. 단백질분해성 분해에 대한 감수성이 상이한 하이드로겔 매트릭스의 기계적 특성을 일치시키기 위해, 매트릭스의 전구체 함량은 매트릭스의 중합체 전구체 함량, 중합체 겔 전구체의 분자량 및/또는 작용성(가교결합에 이용가능한 부위의 수)을 변경함으로써 미세 조정될 수 있다. 따라서, 원하는 강성 범위는 하이드로겔 내의 중합체(PEG) 함량과 가교결합제 함량의 합계를 바람직하게는 1.0 내지 10% w/v로 고정함으로써 달성된다. PEG계 하이드로겔 매트릭스에서, 프로테아제에 대한 감수성은 예를 들어 세포-분비형 프로테아제에 대한 상이한 민감성을 갖는 상이한 펩티드 서열을 매트릭스 전구체 분자 내로 혼입시킴으로써 변화될 수 있다.
세포 배양 미세환경의 생물학적 특성은 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 매트릭스에 첨가하여 조정될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 이러한 생물학적 활성 분자는 예를 들어
(i) 세포외 매트릭스 유래(생체외 배양) 인자;
(ii) 세포-세포 상호작용 인자; 및/또는
(iii) 세포 신호 인자
의 군에서 선택될 수 있다.
사용되는 세포외 매트릭스 유래 인자(i)는, 예를 들어, 라미닌, 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴 또는 엘라스틴과 같은 ECM 단백질, 헤파린 설페이트 또는 콘드로이틴 설페이트와 같은 프로테오글리칸, 히알루론산과 같은 비-프로테오글리칸 다당류, 또는 피불린, 오스테오폰틴, 페리오스틴, SPARC 패밀리 구성원, 테나신 또는 트롬보스폰딘과 같은 모세포 단백질일 수 있다. 이러한 ECM 인자는 전체 길이 버전으로 또는 펩티드 및 올리고당, 또는 히알루론산(히알루로난으로도 불림)과 같은 글리코사미노글리칸과 같이 더 작은 기능적 빌딩 블록으로 사용될 수 있다.
주로 막횡단 단백질인, 사용되는 세포-세포 상호작용 단백질(ii)은 카드헤린, 셀렉틴 또는 Ig 슈퍼패밀리(ICAM 및 VCAM)에 속하는 세포 부착 분자(CAM), 또는 노치(Notch) 리간드 델타-유사 및 재기드(Jagged)와 같은 막횡단 세포 신호전달 시스템의 구성요소와 같은, 세포-세포 접착에 관여하는 단백질일 수 있다.
사용되는 세포 신호전달 인자(iii)은 다음의 패밀리의 것과 같은 성장 인자 또는 발달상 모르포젠(developmental morphogen)일 수 있다: 아드레노메둘린(AM), 안지오포이에틴(Ang), 자가분비 운동성 인자, 골 형성 단백질(BMP), 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 표피 성장 인자(EGF), 에리스로포이에틴(EPO), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 교세포주 유래 신경영양 인자(GDNF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포, 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 성장 분화 인자-9(GDF9), 간세포 성장 인자(HGF), 간암 유래 성장 인자(HDGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 백혈병 억제 인자(LIF), 이동 자극 인자, 미오스타틴(GDF-8), 신경 성장 인자(NGF) 및 기타 뉴로트로핀, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 트롬보포이에틴(TPO), 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β) 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), Wnt 신호전달 경로, 태반 성장 인자(PlGF), 또는 사이토카인 또는 케모카인의 대분류의 구성원.
세포외 매트릭스 유래 인자(i) 및 세포-세포 상호작용 인자(ii)는 가교결합 전 또는 동안 하이드로겔 매트릭스에 부위 특이적으로 부착될 수 있다. 생물학적 활성 분자에 의한 겔 작용화는 생체분자의 유리 작용기(예를 들어, 아민 또는 티올 기) 또는 가교결합 효소(예를 들어, 트랜스글루타미나제)를 위한 펩티드 기질과 겔 네트워크 사이의 직접적인 공유 결합 형성에 의해, 또는 키메라/태그된 단백질의 도메인과 겔에 부착된 보조 단백질 사이의 친화성 결합을 통해 달성될 수 있다. 태그된 단백질은 예컨대 단백질A(또는 단백질G, 단백질A/G), 스트렙타비딘(또는 뉴트르아비딘) 또는 NTA에 결합될 수 있는 Fc-태그, 비오틴-태그 또는 His-태그를 갖는 것들을 포함한다.
대안적으로, 이들 인자는 가교결합제의 일부일 수 있고, 본원에 설명된 가교결합 반응에 의해 하이드로겔 중합체 내로 혼입될 수 있다.
생체분자는 하이드로겔 네트워크에 대한 상이한 겔-테터링(tethering) 전략을 필요로 할 수 있다. 더 큰 생체외 배양물 유래 또는 생체외 배양물-모방 단백질 및 펩티드는 바람직하게는 선형, 이종이작용성 링커를 사용하는 비특이적 테터링에 의해 하이드로겔에 부착된다. 이러한 링커의 하나의 작용기는 중합체 사슬의 말단에 부착된 작용기, 바람직하게는 티올에 반응성이다. 링커의 다른 작용기는 이의 아민 기를 통해 관심대상의 생체분자에 비특이적으로 테터링할 수 있다. 후자 작용기는 석신이미딜 활성 에스테르, 예를 들어, N-하이드록시석신이미드(NHS), 석신이미딜 알파-메틸부타노에이트, 석신이미딜 프로피오네이트; 알데하이드; 티올; 티올-선택적 기, 예를 들어, 아크릴레이트, 말레이미드 또는 비닐-설폰; 피리딜티오에스테르 및 피리딜디설피드로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는 NHS-PEG-말레이미드 링커는 생체분자에 부착된다.
세포 신호전달 인자(iii)는 공간적으로 분리된 영역에서 가용성 형태로 세포를 캡슐화하는 가교결합된 하이드로겔 매트릭스에 첨가될 수 있고, 따라서 매트릭스 내로 자유롭게 확산되어 세포에 도달하는 것이 가능하다. 대안적으로, 이들은 세포외 매트릭스 유래 인자(i) 및 세포-세포 상호작용 인자(ii)에 대해 상기 설명한 바와 동일한 방식으로 매트릭스에 테터링될 수 있다.
상기 설명한 바람직한 방법의 단계 b)는 다수의 상이한 세포 배양 미세환경을 갖는 3D 세포-함유 매트릭스를 제형화하는데 필요한 수준의 다양성을 달성하고 또한 필요한 반복을 달성하기 위해, 자동화된 겔 제작 방법 및 소형화된 샘플을 사용하여 수행된다. 이를 위해, 상업적으로 이용가능한 액체 핸들링 로봇은 바람직하게는 삼중으로, 완전하게 자동화된 방식으로, 유리 슬라이드와 같은 기판 상으로 또는 바람직하게는 표준 1536웰 플레이트와 같은 다중웰 플레이트 내로, 바람직하게는 단계 a)에 따른 전구체 분자의 고유한 혼합물 각각의 100 내지 500 나노리터 만큼 낮은 용적을 정확하게 합성하는 데 사용된다. 후자 형식은 선택되는 하이드로겔 액적에 이상적인 표면적 대 용적 비를 나타내고 다양한 실험 설정에 맞게 개조될 수 있는 표준 형식을 나타내기 때문에 바람직하다. 일단 3D 하이드로겔 매트릭스가 생성되면, 시스템은 다중 판독이 평행하게 수득될 수 있는 다중모드 분석 플랫폼으로서 기능할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 최종 하이드로겔을 구성하는 성분은 동결건조되고 미반응 분말로서 제공되며, 이는 하이드로겔을 형성하기에 적절한 완충제와 함께 핸들링 로봇을 사용하여 수동으로 또는 자동으로 재가용화된다. 원하는 세포 현탁액은 겔화가 발생하기 전에 첨가되고, 3D 하이드로겔 매트릭스는 상기와 같이 생성된다.
단계 e)에서 3차원 하이드로겔 매트릭스를 형성하는 하이드로겔 전구체 분자의 가교결합은 적어도 1종의 가교결합제를 사용하여 달성될 수 있다. PEG계 전구체 분자가 사용되는 경우, 예를 들어 화학적 반응성 이작용성 펩티드가 가교결합제로서 선택될 수 있다. 예는 문헌[Lutolf et al. (Lutolf, M.P., and Hubbell, J.A. , Synthesis and physicochemical characterization of end-linked poly(ethylene glycol)-co-peptide hydrogels formed by Michael-type addition, Biomacromolecules 4, 713-722 (2003))]에 상세히 설명된 가교결합 메커니즘에 의한 온화한 화학 반응이다. 그러나, 가교결합은 서로를 향해 쉽게 반응성인 2가지의 상이한 전구체 분자의 조합 시 즉시 발생할 수 있다는 것도 생각할 수 있다(예를 들어, 마이클형 첨가 반응과 같은 고도로 선택적인 소위 클릭 화학 또는 기타 화학 반응에 의해).
가교결합은 효소와 같은 촉매의 존재 하에, 서로를 향해 반응성인 2가지의 상이한 전구체 분자 또는 서로를 향해 반응성인 상이한 종류의 모이어티들을 갖는 한 가지 유형의 전구체 분자의 조합 시 발생할 수 있는 것도 생각할 수 있다. 예는 문헌[Ehrbar et al. (Ehrbar, M., Rizzi, S.C., Schoenmakers, R.G., Miguel, B.S., Hubbell, J.A., Weber, F.E., and Lutolf, M.P., Biomolecular hydrogels formed and degraded via site-specific enzymatic reactions, Biomacromolecules 8 (2007), 3,000-3007)]에 상세히 설명된 가교결합 메커니즘에 의해 생리학적 조건 하에 트롬빈-활성화 인자 XIIIa를 사용하여 가교결합될 수 있는 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 전구체 분자이다. 간단히 말하면, 적합한 하이드로겔 전구체를 생성하기 위해, 8-암 PEG-VS 및/또는 8-암 PEG-Acr 매크로머를 활성화된 트랜스글루타미나제 인자 XIII(FXIIIa)의 기질 역할을 하는 리신- 및 글루타민-제시 펩티드로 말단-작용화한다. 매크로머의 가교결합 및 결과적인 겔 형성은 두 펩티드 기질 사이의 ε-(α-글루타밀)리신 이소펩티드 측쇄-가교의 FXIIIa-매개 형성을 통해 발생하였다.
분배된 하이드로겔 전구체의 어레이는 저장되고 후속 시점에서 사용될 수 있다(즉, 스크리닝 실험을 위해 세포와의 접촉이 야기된다). 저장은 바람직하게는 다중웰 플레이트(예를 들어, 96웰, 384웰 또는 1536웰 플레이트)에서 수행되고, 용액(가교결합제를 아직 함유하지 않음) 중의 전구체 또는, 그렇지 않으면 동결건조된 전구체, 즉 분말을 사용하여 수행될 수 있다. 분말은 미반응한 채로 남아 있고 유지된다. 예를 들어, 완충액이 첨가되면, 동결건조된 전구체는 용해된 다음, 서로 반응할 수 있다.
사전 선택
본 발명에 따르면, 사용될 생체외 조건(예를 들어, 세포외 매트릭스 조건)은 테스트될 조직 유형에 대해 사전 선택된다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 사전 선택은 WO 2014/180970 A1에 기재된 방법에 의해 수행될 수 있다.
보다 상세하게, 바람직한 실시양태에 따르면, 사용될 특정 조직 유형의 세포는, 무작위로 선택된 생체외 조건을 이용하는 방법으로서,
a) 세포 배양 미세환경을 구축하기 위해, 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자 및 임의로 적어도 1종의 가교결합제를 제공하는 단계;
b) 단계 a)에 따른 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합 및 임의로 적어도 1종의 가교결합제를 조합하고 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 바람직하게는 자동화된 방식으로 분배하는 단계;
c) 상기 기판의 상기 이산 용적에 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 추가로 첨가하고, 상기 분자를 존재하는 하이드로겔 전구체 분자 또는 단계 e)에서 형성된 하이드로겔 중 적어도 하나에 부착시키거나 이들이 자유롭게 확산되도록 하는 단계;
d) 특정 조직 유형의 세포를 기판의 상기 이산 용적 상으로/내로 첨가하는 단계; 및
e) 상기 하이드로겔 전구체 분자를 효소 촉매 반응 또는 마이클 첨가 반응과 같은 세포-적합성 가교결합 반응에 의해 가교결합시켜 하이드로겔 매트릭스를 형성하는 단계;
f) 특정 조직 유형의 상기 세포를 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장하도록 하는 단계;
g) 특정 조직 유형의 상기 세포를 단계 f) 동안 시간 경과에 따라 모니터링하는 단계;
h) 상이한 세포 배양 미세환경에 대한 거동을 결정하는 단계;
i) 상기 특정 조직 유형으로부터 상이한 세포 집단의 성장에 적합한 조건을 제공하는 특정 세포 배양 미세환경 또는 세포 배양 미세환경의 범위를 식별하는 단계
를 포함하는 방법에 적용된다.
상기 단계 i)에서 식별된 특정 세포 배양 미세환경 또는 세포 배양 미세환경의 범위는 본 발명의 방법을 위한 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건으로서 사용된다.
본원에 설명된 바와 같이, 본 발명의 방법에서 하이드로겔 매트릭스 어레이에는 상기 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건 및 상기 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건의 변형이 제공된다. WO 2014/180970 A1에 기재된 방법과 비교하여, 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건 및 상기 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건의 변형을 사용함으로써, 특정 치료 방법의 식별 및/또는 예를 들어 조직 유형의 다수의 표현형 및/또는 유전자형 하위집단의 상이한 거동을 가능하게 하는 보다 집중되고 정확한 분석이 수행될 수 있다.
선행 기술로부터 적합한 생체외 조건(예를 들어, ECM 조건)이 이미 알려진 경우, WO 2014/180970 A1에 설명된 방법이 수행될 필요는 없고, 대신 알려진 적합한 생체외 조건(예를 들어, 세포외 매트릭스 조건)이 본 발명의 방법 및 키트에서 직접 사용될 수 있다.
부품 키트
본 발명의 일 측면에 따르면, 하나의 특정 조직 유형에 대해 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 포함하는 부품 키트가 제공될 수 있다. 따라서, 이러한 부품 키트는 최적의 조건 하에 상기 특정 조직 유형을 이용한 작업을 수행하는 데 쉽게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 하나의 조직 유형에서 또는 하나 이상의 조직 유형을 이용한 작업을 수행하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 완전 한정된 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서,
상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자,
- 임의로 적어도 1종의 가교결합제,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하는 구성요소,
b) 하나 이상의 상이한 배양 배지
를 포함하고,
하이드로겔 특징의 특정 조합이 테스트될 조직 유형에 대해 사전 선택된 것인, 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 키트는 특정 조직 유형용으로 지정되며, 상기 특정 조직 유형에서의 작업 또는 상기 특정 조직 유형을 이용한 작업, 예컨대 상기 특정 조직 유형에서의 약물 영향의 테스트, 또는 개인화 또는 재생 의학의 목적으로 성장한 세포(예를 들어, 3D 세포 구조)를 기초 과학 연구에서 사용하거나 인간에게 상기 세포를 이식하기 위한 상기 성장한 세포의 단리를 수행하기 위해 쉽게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 예를 들어 상기 키트와 함께 제공된 지침서에 의해, 상기 키트가 사용될 상기 특정 조직 유형용이라는 것이 상응하게 표시된다.
부품 키트는 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 이들은 패키지 내에 상기 정의된 구성요소가 개별적으로 또는 함께 저장되어 있는 하나 이상의 용기를 포함한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 미반응 분말 형태의 하이드로겔 전구체 제형이 부품 키트의 하나의 용기에 제공된다. 상기 미반응 분말은 적절한 완충액에서 사용하기 위해 재현탁될 수 있고, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 분배될 수 있다. 미반응 분말 형태의 상기 하이드로겔 전구체 제형은 본 발명에 따른 하이드로겔의 형성에 필요한 모든 구성요소, 즉 상기 논의된 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자, 적어도 하나의 임의적 가교결합제 분자 및 하나 이상의 임의적 생물활성제를 포함한다.
상기 하이드로겔 전구체 제형의 상기 미반응 분말의 제공은 예를 들어 WO 2011/131642 A1로부터 당업계에 공지되어 있으며, 여기서 동결건조는 상기 분말을 제공하기 위한 수단으로서 사용되었다.
예시적인 실시양태
본 발명은 이제 비제한적인 예시적인 실시양태 및 도면을 참조하여 하기에서 설명될 것이다.
도 1a는 상이한 생체외 실시예에서의 c-met 발현 및 상이한 겔에서 성장한 c-met을 과발현하는 비소세포 폐암 세포를 이용한 약물 테스트 실험의 결과를 도시한다.
도 1b는 본 발명에 따른 실시예에서 SoC 처리 및 c-met 억제제로의 처리의 효과를 도시한다.
도 1c는 비교 실시예(Matrigel®)에서 SoC 처리 및 c-met 억제제로의 처리의 효과를 도시한다.
도 1d는 상이한 생체외 실시예에서 c-met 및 EGFR 발현의 결과를 도시한다.
도 1e는 본 발명에 따른 실시예에서 SoC 처리 및 EGFR 억제제로의 처리의 효과를 도시한다.
도 2a는 상이한 겔에서 PDX 췌장관 선암종(PDAC) 세포의 성장을 도시한다.
도 2b는 상이한 겔에서 PDX 췌장관 선암종(PDAC) 세포의 약물 민감성을 도시한다.
도 2c는 연질 겔 및 중간정도 겔에서 PDX 췌장관 선암종(PDAC) 세포의 성장을 도시한다.
도 3은 상이한 겔에서 33% PDAC 세포와 67% 섬유아세포를 공동배양한 결과의 명시야(Brightfield) 이미지를 도시한다.
도 4는 인간 결장암 오가노이드가 0일 및 11일 동안 성장한 결과의 명시야 이미지를 도시한다.
도 5는 HER2+ 또는 삼중 음성 유방암(TNBC) 환자 4명으로부터의 인간 원발성 또는 전이성(Mets) 유방암 세포(환자 유래 이종이식편 모델로부터)의 성장 결과의 명시야 이미지를 도시한다.
도 6a는 인간의 건강한 전립선 세포가 1일 및 14일 동안 성장한 결과의 명시야 이미지를 도시한다.
도 6b는 인간 전립선암 세포가 1일, 13일 및 20일 동안 성장한 결과의 명시야 이미지를 도시한다.
폐암 요법
잘 특성규명되고 환자 세포로부터 유래된 전임상 모델은 종양발생의 분자 경로를 식별하고 잠재적인 치료제를 평가하는 것을 포함하여 신뢰할 수 있는 전환 암 연구를 수행하는 데 필수적인 구성요소이다.
종양 세포주는 조사를 위한 편리한 플랫폼으로 오랫동안 존재해 왔으며 수많은 세포주가 잘 특성규명되고 동물 모델(이종이식편 종양)에서 종양을 확립하기 위해 사용되었다. 그러나, 세포주 유래 이종이식편 종양은 인간 시험에서의 반응과 비교할 때 전임상 모델에서 치료 반응들 사이의 예측 가능한 관계의 부족을 겪고 있으며 인간의 종양 미세환경을 정확하게 재현하지 않는다(Johnson et al., British Journal of Cancer (2001) 84(10), 1424-1431).
환자 유래 종양 이종이식편 모델(PDX)은 전환 암 연구를 위해 빈번하게 사용되며 연속 계대를 걸쳐 일관되게 거동하는 것으로 가정된다. 원래 환자 샘플 및 PDX 모델의 조직병리학적 특성과 유전자형 특성 사이의 상관관계는 잘 입증되어 있다(Rubio-Viqueira et al., Clin. Cancer Res. 2006, 12(15), 4652). 또한, 다수의 계대에 걸쳐 성장한 PDX 모델은 원래의 인간 종양 치료 반응과 이러한 동일한 환자로부터 유래된 PDX에서의 반응 사이의 상관관계를 유지한다. 그러나, PDX 기반 스크리닝 모델의 처리량은 낮고 게다가 이러한 스크리닝 테스트는 비용이 많이 든다.
본 발명은 암 연구를 위한 개선된 방법을 제공한다. 본 발명은 매우 비용 효율적인 방식으로 고처리량 스크리닝을 가능하게 하는 PDX 모델에 대한 개선된 대안을 제공한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 암 세포 성장에 적합한 세포외 매트릭스 조건의 사전 선택은 PDX로부터의 세포를 사용하고 상기 "사전 선택" 섹션에서 설명한 바와 같이 이들을 분석함으로써 수행될 수 있다. 이러한 조건 하에 생체외에서 성장한 세포의 조직병리학적 및 유전자형 특성은 생체내 확립된 PDX 모델의 것과 상관될 수 있으며, 이러한 PDX 모델로부터 유래된 PDX 종양 치료 반응은 어떤 세포외 매트릭스 조건이 생체내 암 세포 거동을 재현할 수 있는가를 평가하기 위한 생체내 기준점으로서 사용될 수 있다.
상기 문헌에 제시된 바와 같이, 미세환경(즉, 세포외 매트릭스 조건)은 생체내 및 생체외 둘 다에서 암 세포가 약물 치료에 반응하는 방식에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하면, 환자의 약물 치료 결과를 보다 정확하게 예측하기 위해, 상이한 환자 종양 특성(예를 들어, 상이한 암 아형)을 포착할 수 있는 약물 스크리닝/테스트를 위한 생체외 세포 배양 조건을 확립할 수 있다.
이것은 사전 선택된 범위의 미세환경에서 배양된 환자 자신의 세포를 사용하여, 세포를 성장시키고 생체외에서 성장한 세포에서 가능한 약물 치료를 테스트하는 것으로 구성된다. 본 발명의 방법을 사용하여, 약물 반응의 종양내 및 종양간 환자 불균질성(표적화 요법에 대한 내성을 포함)을 포착할 수 있다.
현재, 선행 기술에서 확립된 방법은 여전히 환자 조직으로부터 추출된 세포를 예를 들어 최적 표준 Matrigel®로 구성된 단일 배양 조건을 사용하여 성장시키는 것이다. 이러한 단일 조건은 원래 환자 종양의 모든 특징 및 가능한 불균질성이 포착되는 방식으로 환자 세포를 성장시키는 것을 항상 허용하지는 않는다. 또한, 때때로 미한정된 매트릭스의 일부 구성요소가 테스트된 세포에서의 약물 반응을 방해할 수 있다.
본 발명에 의해, 원래 환자 종양에서 일어나는 일을 더 잘 반영하는 약물 치료(및 기본 메커니즘)에 대한 민감성 및 잠재적 내성(예를 들어, 종양 불균질성, 약물 반응)을 밝히기 위해 세포를 배양하고 그 다음에 상이한 약물 치료에 이를 노출시키는 것이 가능하다. 본 발명에 의해, 암 환자에 대한 약물 치료의 선택 또는 배제를 돕고/거나 이전 치료(들)에 대한 내성을 극복하기 위한 2차 치료의 선택을 도울 수 있다.
이러한 접근법 후에, c-Met를 과발현하는 비소세포 폐암(NSCLC) 세포에 미치는 c-Met 억제제의 효과를 테스트하기에 적합한 사전 선택된 조건이 하이드로겔 내의 RGD 부착 모티프의 부재를 특징으로 하는 것으로 나타날 수 있다(하기 실시예 1 참조).
이는 선행 기술로부터 반대의 결과(세포외 매트릭스 조건에서 RGD 부착 모티프의 존재의 필요성)가 예상되었을 것이기 때문에 특히 놀랍다. 문헌[Mitra et al. (Oncogene 2011, March 31; 30(13): 1566-1576)]에서, c-Met는 α5β1-인테그린의 피브로넥틴-매개 활성화를 통해 이의 리간드(HGF)와 독립적으로 활성화되어 c-Met 수용체와 상호작용을 유도할 수 있는 것으로 나타났다. α5β1-인테그린의 억제는 시험관내 및 생체내(난소암 세포주) 둘 다에서 c-Met의 인산화를 감소시켰다. NSCLC의 경우에 인테그린 β1과 c-Met 사이의 크로스토크(crosstalk)도 문헌[Ju et al. (Cancer Cell International 2013, 13:15)]에서 조사되었다. 상기 논문은 인테그린 β1과 c-Met의 상호작용이 c-Met 활성화(즉, 인산화)를 유도하고 EGF 경로를 우회함으로써 EGFR 수용체 억제에 민감한 암 세포가 EGFR 표적 약물에 내성을 갖도록 한다는 것을 보여주었다. 두 논문 모두 c-Met가 알려진 RGD 링커인 인테그린 β1과 상호작용할 수 있음을 보여준다. 그들은 또한 이러한 상호작용이 c-Met 인산화 및 이의 다운스트림 경로(FAK, AKT)의 활성화를 초래하여 세포 증식 및 생존 증가를 유도한다는 것을 입증하고 있다. 요약하면, 두 논문 모두 c-Met 수용체와 피브로넥틴 사이의 관계를 명확하게 강조하고 있다.
그러나, 본 발명에 따르면, 하이드로겔 매트릭스 내 RGD 모티프의 존재는 NSCLC 세포에서 c-Met 수용체의 하향조절 및 활성화된 c-Met 수용체(즉, 인산화된 수용체)의 부재를 유도하여 c-Met 억제제로의 처리에 대한 내성을 초래한 것으로 나타날 수 있다. 하이드로겔 내의 임의의 RGD 부착 모티프의 부재는 활성화된 c-met 수용체를 나타내는 NSCLC 암 세포에 대한 적합한 약물 후보를 식별하기 위한 정확한 사전 선택된 조건을 제공였다는 것이 본 발명의 중요한 발견이었다. 한편, RGD 모티프의 존재 하에 성장하는 NSCLC 암 세포는 활성화된 c-met 수용체를 보유하지 않고 활성화된 c-met 수용체에 의존하지 않으며, 이는 이들이 c-met 억제제 이외의 다른 약물 후보(가능하게는 c-met 억제제와 함께)로 치료되어야 할 수도 있음을 나타낸다. "사전 선택된 성장 조건"을 사용하지 않았다면, 이러한 세포가 c-Met 이외의 다른 성장 메커니즘에 의존할 수 있다는 것을 이해할 수 없었을 것이다. 선행 기술에서 사용된 단일 성장 조건과 비교하여 상기 "사전 선택된 성장 조건"을 사용하는 것의 주요 부가 가치 중 하나는, 특정 암 조직 및 암 유형의 불균질성(예를 들어, 유전적, 표현형)뿐만 아니라 상기 암을 치유하는 데 필요한 치료의 더 우수한 가능한 범위를 밝힐 수 있다는 것이다. 이는 개인화 의학뿐만 아니라 약물 개발 적용과 관련이 있다.
따라서, 이 실시양태에 따르면, 본 발명은 c-Met를 과발현하는 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포에 미치는 c-Met 억제제의 영향을 테스트하는 방법으로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 존재 하에 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 적어도 1종의 가교결합제 및 상기 폐암 세포를, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 가교결합시킴으로서 제조된 이산 용적을 갖는 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 포함하는 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 제공하는 단계;
b) 상기 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포를 바람직하게는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는, 특히 바람직하게는 FGF-7, FGF-10, HGF 및 TGF-β 억제제를 또한 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지의 존재 하에 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장하도록 하는 단계;
c) 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 c-Met 수용체 또는 c-Met 경로를 표적화하는 약물을 첨가하는 단계
를 포함하고, 상기 가교결합제 및 상기 임의적 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는 방법에 관한 것이다.
매우 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명은 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포에 미치는 c-Met 억제제 및 기타 약물의 영향을 테스트하는 방법으로서,
a) 기판의 제1 어레이에, 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 존재 하에 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 적어도 1종의 가교결합제 및 상기 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포를, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 가교결합시킴으로써 제조된 이산 용적을 갖는 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 포함하는 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 제공하고, 여기서 상기 가교결합제 및 상기 임의적 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않고,
기판의 제2 어레이에, 상기 가교결합제 및/또는 상기 임의적 생물활성제 내의 RGD 모티프의 존재에 의해 제1 어레이의 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건과 상이한 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 제공하는 단계;
b) 상기 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포를, 바람직하게는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는, 특히 바람직하게는 FGF-7, FGF-10 및 TGF-β 억제제를 또한 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지의 존재 하에 제1 어레이 및 제2 어레이 내의 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장하도록 하는 단계;
c) c-Met 수용체 또는 c-Met 경로를 표적화하는 약물을 제1 어레이 및 제2 어레이 내의 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 첨가하는 단계;
d) 적어도 하나의 다른 약물, 바람직하게는 EGFR-수용체 억제제를 제1 어레이 및 제2 어레이 내의 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에, c-Met 수용체 또는 c-Met 경로를 표적화하는 약물이 첨가되지 않은 웰 내로 첨가하는 단계
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 하이드로겔 매트릭스 어레이는 50-2,000 Pa 범위의 연질 강성 또는 중간 강성을 갖는다.
바람직하게는, 상기 PEG 하이드로겔 전구체 분자는 PEG-VS(말단 비닐설폰 모이어티를 갖는 폴리에틸렌 글리콜), 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS이다.
보다 바람직하게는, 상기 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS를 가교결합제로서 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드와 가교결합시킴으로써 제조되고, 여기서 상기 가교결합제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는다. 특히 바람직하게는, 생물활성 리간드는 하이드로겔 매트릭스에 부착되지 않는다.
임의적 생물활성 리간드로서, 임의의 RGD 부착 모티프를 제외한 생물활성 모티프를 포함하는 리간드가 사용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 임의적 생물활성 리간드는 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 특히 마우스 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군에서 선택된다. 적합한 재조합 라미닌 이소형의 예는 라미닌-111, 라미닌-211, 라미닌-332, 라미닌-411, 라미닌-511 또는 라미닌-521이다.
임의적 생물활성 리간드로서, 히알루론산 및 히알루로난과 같은 글리코사미노글리칸을 포함하는 리간드가 사용될 수 있다. 히알루론산의 예는 히알루론산 50k, 히알루론산 1000k, 히알루로네이트 티올 50k 또는 히알루로네이트 티올 1000k이다.
바람직하게는, 상기 배양 배지는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제의 존재를 특징으로 한다. 바람직한 실시양태에 따르면, 문헌[Sachs et al. (The EMBO Journal e 100300|2019)]에 설명된 배지로부터 개조된 배양 배지가 사용될 수 있다. 바람직한 배양 배지는 글루타민, 노긴(Noggin), EGF, 섬유아세포 성장 인자 7 및 10[FGF7 및 FGF10], HGF, R-스폰딘-조정 배지(R-spondin-conditioned medium), 프리모신(Primocin), 페니실린/스트렙토마이신, N-아세틸-L-시스테인, 니코틴아미드, A83-01, SB202190(p38-억제제), Y-27632(rock 억제제), B27 보충제 및 HEPES가 보충된 AdDMEM/F12 배지를 포함한다. 문헌[Lancaster et al. (Nat Bi otechnol 2017 35(7): 659-666)]에 설명된 것과 같은 기타 배지 또는 PromoCell(작은 기도 상피 세포 성장 배지(C-39175)) 또는 Invitrogen(StemPro™ hESC SFM)로부터의 상업적으로 이용가능한 배양 배지가 사용될 수 있다.
특히 바람직하게는, c-Met를 과발현하는 상기 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포는 인간의 생검 또는 조직 절편 또는 환자 유래 이종이식편(PDX) 조직으로부터 갓 단리되거나 동결된 인간 세포로부터의 것이다.
상기 방법을 사용하여, 상기 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포를 생체내에서 관찰된 약물 결과를 재현하는 세포외 매트릭스 조건 하에, 선택된 배지에서 성장시키고 증대시키고 후속적으로 테스트할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에 따르면, 세포외 매트릭스 조건은 Matrigel®과 같은 천연 유래 매트릭스의 사용이 완전히 회피될 수 있도록 선택된다.
본 발명은 완전 한정된 또는 바람직하게는 완전 합성 하이드로겔 매트릭스를 사용하여 폐암 세포, 바람직하게는 NSCLC 세포의 성장뿐만 아니라 증대를 지속시키는 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 이용한 방법을 제공한다. 본 방법은 PDX 폐 모델에서 생체내에서 관찰되었지만 Matrigel®로는 달성되지 않은 표적 발현 및 약물 반응의 재현을 가능하게 할 수 있다. 상이한 생체외 조건이 상이한 약물 반응을 촉진할 수 있고, 이는 단일 배양 조건의 사용이 원래 환자 종양에서 일어나는 것을 반영하지 않을 수 있음을 확인시켜 주기 때문에, 사전 선택이 중요하다.
이 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 c-Met를 과발현하는 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포에 미치는 c-Met 억제제의 영향을 테스트하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 상기 가교결합제 및 상기 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는 구성요소;
b) 바람직하게는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지
를 포함하는 키트에 관한 것이다.
이 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 c-Met를 과발현하는 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포에 미치는 c-Met 억제제의 영향을 테스트하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 상기 가교결합제 및 상기 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는 구성요소,
b) 바람직하게는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지,
c) 임의로, 동일한 세포외 매트릭스 조건을 사용하여 생성된 세포 저장소/바이오뱅크로부터의 세포
를 포함하는 키트에 관한 것이다.
이 실시양태의 또 다른 바람직한 변형에 따르면, 본 발명은 또한 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포에 미치는 c-Met 억제제 및 기타 약물 영향을 테스트하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 상기 가교결합제 및 상기 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는 구성요소;
b) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 상기 가교결합제 및/또는 상기 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하는 구성요소;
c) 바람직하게는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지
를 포함하는 키트에 관한 것이다.
이 실시양태의 또 다른 바람직한 변형에 따르면, 본 발명은 또한 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포에 미치는 c-Met 억제제 및 기타 약물의 영향을 테스트하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 상기 가교결합제 및/또는 상기 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는 구성요소;
b) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 상기 가교결합제 및/또는 상기 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하는 구성요소;
c) 바람직하게는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지;
d) 임의로, 동일한 세포외 매트릭스 조건을 사용하여 생성된 세포 저장소/바이오뱅크로부터의 세포
를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 방법 및 키트를 사용하여, 상이한 질환 특징(예를 들어, 상이한 폐암 아형, EGFR, KRAS 또는 PI3 키나제 돌연변이와 같은 돌연변이)을 보유하는 추가의 폐암 세포에서 배양하고 약물을 테스트하는 것이 또한 가능하다. 상기 설명한 것과 동일한 방식으로, 다른 세포에 대한 세포외 매트릭스 조건이 사전 선택될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에 따르면, 하이드로겔은 임의의 RGD 결합 부위를 포함하지 않으며, 특히 바람직하게는 인테그린 결합 부위를 전혀 포함하지 않는다.
하기에서 논의되는 실시예 1 및 관련 도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, c-Met를 과발현하는 비소세포 폐암 세포에 대한 약물의 활성을 테스트할 때 정확한 조건의 사전 선택이 가장 중요하다. Matrigel®, 즉 선행 기술의 표준 매트릭스를 사용해서는, c-Met를 표적화하는 약물 후보를 식별하는 것이 가능하지 않다. 비교 실시예 1에서 밝혀진 바와 같이, 이는 아마도 Matrigel®을 사용하는 조건 하에서는 약물 표적 c-Met가 충분히 발현되지 않고 활성화되지 않기 때문일 것이다. 따라서, Matrigel®을 사용하는 조건 하에서는 이러한 폐암 세포의 가장 중요한 표적, 즉 과발현된 c-Met에 대해 작용하는 적합한 약물 후보를 식별하는 것이 가능하지 않다.
또한, 하기에서 논의되는 실시예 1 및 관련 도 1에서, c-Met를 표적화하는 것이 실제로 c-Met를 과발현하는 비소세포 폐암 세포의 성장을 억제하기 위한 핵심 특징인 것으로 나타났다.
또한, 본 발명의 이 실시양태의 사전 선택된 조건을 사용하여, 특정 환자를 위한 최적의 치료 레짐(treatment regime)을 더 잘 식별하는 것도 가능하다. 소정 환자는 c-met 억제제 단독을 이용한 약물 치료에 반응하지 않는 것으로 밝혀졌는데, 이는 아마도 이러한 환자가 c-met 억제를 보완할 수 있는 세포 표현형을 가졌기 때문일 것이다. 본 발명의 이 실시양태의 사전 선택된 조건을 사용하여, 또 다른 약물 유형과 함께 c-met 억제제를 사용하는 약물 조합 치료에 대한 스크리닝이 가능하다. 상기 논의한 바와 같이, 이것은 Matrigel®을 사용하는 선행 기술 조건에서는 가능하지 않다. 본 발명은 환자 반응에 대한 더 우수한 예측 가능성을 제공한다.
이 실시양태의 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건은 또한 암 환자를 위한 요법의 효율성을 테스트하는 방법으로서,
a) 암 환자의 생검 또는 조직 절편로부터 갓 단리되거나 동결된 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 세포로부터 오가노이드를 확립하고 증대시키고, 1종 이상의 약물을 상기 기재된 방법에 의해 상기 오가노이드에 적용하는 단계;
c) 단계 b)에서 적용된 1종 이상의 약물의 활성을 단계 b)에서 적용된 상기 약물 중 하나로 상기 환자를 치료한 결과와 비교하는 단계;
d) 및/또는 환자 오가노이드에서의 약물 활성 결과 및 질환의 해당 유전적 및 표현형 데이터를 제공하여 의사가 환자를 치료하는 방식에 대한 결정을 내리는 것을 지원하는 단계
를 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
단계 b)에서 오가노이드를 확립하기 위한 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포폐암(NSCLC) 세포의 단리 전용의 환자 생검 또는 절편은 표준 진단 절차 동안 수집되고 후속적으로 b) 단계가 수행될 위치로 이송될 수 있다.
이 방법의 단계 b)는 상기 설명한 바와 같이, 즉 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 존재 하에 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 적어도 1종의 가교결합제 및 상기 폐암 세포를, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 가교결합시킴으로써 제조되고 50 내지 2,000 Pa 범위의 강성을 갖는 이산 용적을 갖는 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 포함하는 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 제공하고;
상기 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포를 바람직하게는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는, 특히 바람직하게는 FGF-7, FGF-10, HGF 및 TGF-β 억제제를 또한 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지의 존재 하에 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장하도록 하고;
상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 1종 이상의 약물을 첨가함으로써
수행되고, 여기서 상기 가교결합제 및 상기 임의적 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는다.
상기 하이드로겔 매트릭스의 이산 용적에서 성장한 세포에 첨가된 1종 이상의 약물은 환자의 항암 표준 관리(standard of care: SoC) 치료에 사용되는 약물(들)을 포함한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 생검 또는 절편은 참조 기준선을 확립하기 위한 조직학적 분석 및/또는 체학(omics) 테스트(예를 들어, NGS)를 위해 추가로 가공처리될 수 있다. 이러한 추가 분석의 결과는 또한 상기 생체외 및 생체내 테스트를 비교하고/하거나 상관시키는 데 사용될 수 있다.
이 방법에 기반하여, 적용된 항암 표준 관리(SoC) 치료가 적합한지 또는 상기 설명한 바와 같이 생체외에서 테스트된 상이한 약물 치료 레짐이 더 유망할 수 있는지 여부를 신뢰성 있게 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해, 암 치료는 개인화되고 최적화될 수 있다. 의료 제공자의 치료 결정의 정확도를 높일 수 있는 기능적 시험관내 데이터가 생성될 수 있다.
정밀 의학에서 환자 유래 오가노이드(PDO)
암은 비정상적인 증식으로 이어지는 정상 세포의 유전적 형질전환과 후성적 형질전환 둘 다로 인해 발생하는 다인성 질환이다. 통상적인 암 치료는 외과적 절제, 방사선요법, 비특이적 또는 표적화 화학요법, 및 세포 분열을 억제하거나 암 세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유도하는 면역요법을 포함한다.
상이한 암 유형은 상이한 방식으로 치료에 반응하므로 일부 암 유형은 다른 유형보다 더 잘 치료될 수 있다. 강력한 화학치료제 및 종양유전자-특이적 표적화 약물의 개발에도 불구하고, 이 질환의 내구성이 있거나 장기간 지속되는 치유는 많은 환자에 대해 달성되지 않았다.
최근 DNA 시퀀싱 기술의 개선은 종양의 분자 프로파일에 기반하여 암 요법을 맞춤화할 수 있는 잠재력으로 환자 종양의 특정 게놈 돌연변이를 빠르게 식별할 수 있도록 한다. 백혈병, 폐 및 흑색종 암의 치료에서 상당한 개선이 나타났다(Druker et al. (N Engl J Med, Vol. 344, No. 14 (2001), 1031), Lynch et al. (N Engl J Med 350; 21 (2004), 2129), Flaherty et al. (N Engl J Med 2010;363:809-19). 그러나, 게놈-안내된 정밀 의학의 임상적 이점은 여전히 매우 논쟁의 여지가 있다(Le Tourneau et al. (www.thelancet.com/oncology, Published online September 3, 2015, http://dx.doi.org/10.1016/S1470-2045(15)00188-6), Prasad (Nature 537 (2016), S63), Letai (NATURE MEDICINE, VOLUME 23 | NUMBER 9 | SEPTEMBER 2017, 1028). 고형 종양 환자를 표적화 요법에 배정하는 비율을 평가한 최근 임상 시험은 이들 중 일부(10 내지 50%)만이 이용가능한 임상적으로 검증 및 승인된 요법에 맞는 돌연변이를 보유하고 있음을 보여주었다(Letai 2017, Sicklick (Nature Medicine https://doi.org/10.1038/s41591-019-0407-5 (2019)). 이 외에도 2가지 근본적인 생물학적 측면은 게놈-안내된 정밀 의학의 효율성을 손상시킨다:
- 암 세포의 환자내 유전적 및 표현형 불균질성으로 인한 특정 요법에 대한 내성(분기된(divergence) 서브클론의 존재)(Tannock et al. (N Engl J Med 375;13 (2016), 1289), Flavahan et al ., (Science 357, 266 (2017));
- 약물 반응을 조절하는 데 있어 종양 미세환경 효과에 대한 불충분한 생물학적 이해(Friedmann et al. (Nature Reviews Cancer AOP, published online 5 November 2015; doi:10.1038/nrc4015 2015)).
환자 유래 세포에 대한 약물 스크리닝(기능적 정밀 의학)은 이러한 한계를 해결하고 유전체학 및 병리학 데이터를 보완하여 환자 결과의 예측을 지원하고 따라서 의사 결정 요법 과정을 안내할 수 있다.
환자 유래 오가나이드(PDO)와 같은 생체내 종양 미세환경을 재현하는 신규 시험관내 종양 생물학 모델은 3D 환경에서 성장시키고 원래 조직의 공간 구조를 재현한다는 이점을 갖고 있다. 오가노이드는 원래의 건강한 또는 이환된 조직의 주요 특징과 기능을 모방하는 환자 유래 세포로부터 성장한 소형 3D 시험관내 구조이다. 결장직장암(Sato et al. (Nature vol. 469 (2011), 415), van de Wetering et al. (Cell 161 (2015), 933-945), 췌장관 선암종(Boj et al. (Cell 160, 324-338, January 15, 2015), Huang et al. (Nature medicine, published online 26 October 2015; doi:10.1038/nm.3973), 유방암(Sachs et al. (Cell 172 2018, 1-14) 및 폐암(Sachs et al. (The EMBO Journal e 100300|2019)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 종양에 대한 다양한 PDO가 확립되었다. 전반적으로, 이들 연구는 PDO가 원발성 종양에서 식별된 동일한 유전적 드라이버 돌연변이를 유지할 수 있음을 보여주었다.
최근에는, 동일한 종양의 상이한 위치로부터 유래된 환자 오가노이드를 사용하여 종양내 불균질성의 성질과 정도를 연구하고 약물 패널에 대한 이의 반응을 평가하였다(Roerink et al. Nature 556, 457-462, 2018). 동일한 종양의 밀접하게 관련된 세포들 사이에 약물에 대한 반응의 상당한 차이가 관찰되었다.
임상에서 기능적 진단 도구로서 오가노이드의 전향적 사용은 직장암(Ganesh et al., Nature Medicine, 10, 1067-1614(2019)) 전이성 결장직장암(Vlachogiannis et al., Science 359, 920 - 926 (2018) 및 Ooft et al., Science Translational Medicine, 11, (2019), DOI: 10.1126/scitranslmed.aay2574), 췌장암(Tiriac, CANCER DISCOVERY, SEPTEMBER 2018, DOI: 10.1158/2159-8290.CD-18-0349) 및 충수암(Votanopoulos et al., Ann Surg Oncol (2019) 26:139-147)에 대해 이미 밝혀졌다. 이들 연구에서, PDO의 약물 반응은 오가노이드가 유래된 환자에서의 동일한 치료의 결과와 상관관계가 있다.
해당 환자 결과와 일치하는 PDO 약물 반응의 이러한 유망한 결과에도 불구하고, 이들 연구는 제한된 수의 환자에 국한되며, 사용된 방법은 Matrigel®과 같은 미한정된 조성 및 뱃치 간 편차를 갖는 기저막 추출물(BME)에 의존한다. 이는 임상적으로 관련된 적용으로의 전환을 위한 PDO의 표준화에 있어 상당한 제한을 나타낸다. 또한, 상이한 세포외 매트릭스 조건을 필요로 할 수 있는 바이오마커 발현을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유전적 및/또는 표현형 종양 특징의 가능한 차이에 관계없이, 각 유형의 암에 대해 단일 배양 조건만이 사용되었다. 이것은 특정 세포 집단의 성장을 선호하거나 생체외 세포 증대 동안 일부 표현형의 발현만을 유도할 수 있으며(WO 2010/090513 A2; WO 2016/015158 A1; WO 2015/173425 A1), 따라서 생체내 종양 특성 및 약물 반응을 모방하지 못한다. 이것은 c-Met를 과발현하는 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포와 관련하여 상기 개략적으로 설명되었다.
Matrigel®과 같은 천연 유래 매트릭스의 한계를 극복하기 위해, 마우스 및 인간 기원의 장 및 결장 오가노이드(Gjorevski et al., Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture, Nature, Vol 539, 24 November 2016, 560-56, WO 2017/037295 A1; 또는 Cruz-Acuna et al., Synthetic hydrogels for human intestinal organoid generation and colonic wound repair, Nature cell biology, advanced online publication published online 23 October 2017; DOI: 10.1038/ncb3632, 1-23, WO 2018/165565 A1) 및 보다 최근에 충수암, 췌장암 및 중피종암 환자 세포(Votanopoulos 2019 (상기), Broguiere et al., Adv. Mater. 2018, 1801621 (2018), Mazzocchi et al., SCIENTIFIC Reports (2018) 8:2886 DOI:10.1038/ s41598-018-21200-8)로부터의 오가노이드를 포함하는 다양한 조직을 성장시키기 위한 완전 한정된 및 또한 합성 하이드로겔이 이미 조사되었다.
이러한 연구 중 일부는 완전 한정된 또는 완전 합성 매트릭스를 사용하고 있지만, 종양 특징에 관계없이 단일 배양 조건의 사용에 여전히 의존한다.
췌장암
본 발명에 의해, 환자 췌장 세포, 바람직하게는 췌장관 선암종(PDAC) 세포를 이들 세포의 성장 및 증대를 지속시키는 조건 하에 배양하는 것이 가능하다. 후속적으로, 세포는 암 환자를 위한 효율적인 약물 치료를 선택하기 위해 상이한 약물 치료에 노출된다.
본 발명에 따르면, PDAC 세포는 적어도 하나의 RGD 부착 모티프를 포함하는 완전 한정된 연질(50-1,000 Pa 강성) 또는 중간정도(1,000-2,000 Pa) 또는 경질(2,000-3,000 Pa) 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스, 및 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함하는 배양 배지의 조합을 사용하여 잘 배양되고 테스트될 수 있는 것으로 나타날 수 있다.
따라서, 이 실시양태에 따르면, 본 발명은 췌장관 선암종(PDAC) 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하는 방법으로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 존재 하에 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 적어도 1종의 가교결합제 및 상기 췌장관 선암종 세포를, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 가교결합시킴으로써 제조되고 50 내지 3,000 Pa, 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 및 가장 바람직하게는 50 내지 1,000 Pa 범위의 강성을 갖는 이산 용적을 갖는 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 포함하는 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 제공하는 단계;
b) 상기 췌장관 선암종 세포를 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지의 존재 하에 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장하도록 하는 단계;
c) 상기 하이드로겔 매트릭스의 이산 용적에서 성장한 세포에 1종 이상의 약물을 첨가하는 단계
를 포함하고, 가교결합제 중 적어도 1종 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 PEG 하이드로겔 전구체 분자는 PEG-VS(말단 비닐설폰 모이어티를 갖는 폴리에틸렌 글리콜), 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS이다.
보다 바람직하게는, 상기 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS를 가교결합제로서 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드와 가교결합시킴으로써 제조되고, 여기서 상기 가교결합제는 RGD 모티프를 포함할 수 있다.
임의적 생물활성 리간드로서, RGD 부착 모티프를 포함하는 생물활성 모티프를 포함하는 리간드가 사용될 수 있다. 적합한 RGD 모티프의 예는 RGD, RGDS, RGDSP, RGDSPG, RGDSPK, RGDTP, RGDSPASSKP, PHSRNSGSGSGSGSGRGDSPG, 또는 사이클로(RGDfC)와 같은 임의의 사이클릭 RGD 모티프이지만, 하이드로겔 및 세포 배양 분야에 공지되어 있고 성공적으로 사용된 임의의 RGD 서열이 주로 사용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 임의적 생물활성 리간드는 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 특히 마우스 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군에서 선택된다. 적합한 재조합 라미닌 이소형의 예는 라미닌-111, 라미닌-211, 라미닌-332, 라미닌-411, 라미닌-511 또는 라미닌-521이며, 라미닌-511이 바람직하다.
임의적 생물활성 리간드로서, 콜라겐 펩티드 모티프를 포함하는 생물활성 모티프를 포함하는 리간드가 사용될 수 있다. 적합한 콜라겐 펩티드의 예는 DGEA이다.
임의적 생물활성 리간드로서, 히알루론산 및 히알루로난과 같은 글리코사미노글리칸을 포함하는 리간드가 사용될 수 있다. 히알루론산의 예는 히알루론산 50k, 히알루론산 1000k, 히알루로네이트 티올 50k 또는 히알루로네이트 티올 1000k이다.
바람직하게는, 상기 배양 배지는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제의 존재를 특징으로 한다. 바람직한 실시양태에 따르면, 문헌[Boj et al. (Cell 160, 324-338, January 15, 2015), p. 335, right col., 2nd para] 또는 문헌[Huang et al. (Nature medicine, published online 26 October 2015; doi:10.1038/nm.3973)]에 설명된 배양 배지가 사용될 수 있다. HEPES, 글루타맥스, 페니실린/스트렙토마이신, B27, 프리모신, N-아세틸-L-시스테인, Wnt3a-조정 배지[50% v/v] 또는 재조합 단백질[100 ng/ml], RSPO1-조정 배지[10% v/v] 또는 재조합 단백질[500ng/ml], 노긴-조정 배지[10% v/v] 또는 재조합 단백질[0.1 ㎍/ml], 표피 성장 인자[EGF, 50 ng/ml], 가스트린[10 nM], 섬유아세포 성장 인자 10[FGF10, 100 ng/ml], 니코틴아미드[10 mM], 프로스타글란딘 E2[PGE2, 1 μM] 및 A83-01[0.5 μM]가 보충된 AdDMEM/F12 배지를 포함하는, 문헌[Boj et al.]으로부터 개조된 배양 배지가 특히 바람직하다.
특히 바람직하게는, 상기 췌장관 선암종 세포는 인간의 생검 또는 조직 절편 또는 환자 유래 이종이식편(PDX) 조직으로부터 갓 단리되거나 동결된 세포로부터 것이다.
상기 방법을 사용하여, 상기 췌장관 선암종 세포를 생체내에서 관찰된 약물 결과를 재현하는 세포외 매트릭스 조건 하에 선택된 배지에서 성장시키고 증대시키고 후속적으로 테스트할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에 따르면, 세포외 매트릭스 조건은 Matrigel®과 같은 천연 유래 매트릭스의 사용이 완전히 회피될 수 있도록 선택된다.
이 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 췌장관 선암종 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 50 내지 3,000 Pa, 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 및 가장 바람직하게는 50 내지 1,000 Pa 범위의 강성을 갖는 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 적어도 하나의 상기 가교결합제 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하는 구성요소;
b) 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지
를 포함하는 키트에 관한 것이다.
이 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 췌장관 선암종 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 50 내지 3,000 Pa, 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa, 가장 바람직하게는 50 내지 1,000 Pa 범위의 강성을 갖는 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 적어도 하나의 상기 가교결합제 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하는 구성요소;
b) 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지;
c) 임의로, 동일한 세포외 매트릭스 조건을 사용하여 생성된 세포 저장소/바이오뱅크로부터의 세포
를 포함하는 키트에 관한 것이다.
이 실시양태의 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건은 또한 암 환자를 위한 요법의 효율성을 테스트하기 위한 방법으로서,
a) 암 환자의 생검 또는 조직 절편로부터 갓 단리되거나 동결된 췌장관 선암종 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 세포로부터 오가노이드를 확립하고 증대시키고, 1종 이상의 약물을 상기 기재된 방법에 의해 상기 오가노이드에 적용하는 단계;
c) 단계 b)에서 적용된 1종 이상의 약물의 활성을 단계 b)에서 적용된 상기 약물 중 하나로 상기 환자를 치료한 결과와 비교하는 단계;
d) 및/또는 환자 오가노이드에서의 약물 활성 결과 및 질환의 해당 유전적 및 표현형 데이터를 제공하여 의사가 환자를 치료하는 방식에 대한 결정을 내리는 것을 지원하는 단계
를 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
단계 b)에서 오가노이드를 확립하기 위한 췌장관 선암종(PDAC) 세포의 단리 전용의 환자 생검 또는 절편은 표준 진단 절차 동안 수집되고 후속적으로 b) 단계가 수행될 위치로 이송될 수 있다.
이 방법의 단계 b)는 상기 설명한 바와 같이, 즉 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 존재 하에 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 적어도 1종의 가교결합제 및 상기 폐암 세포를, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 가교결합시킴으로써 제조되고 50 내지 3,000 Pa, 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 및 가장 바람직하게는 50 내지 1,000 Pa 범위의 강성을 갖는 이산 용적을 갖는 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 포함하는 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 제공하고;
상기 췌장관 선암종 세포를 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지의 존재 하에 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장하도록 하고;
상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 1종 이상의 약물을 첨가함으로써
수행되고, 여기서 적어도 하나의 상기 가교결합제 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함한다.
상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 첨가된 1종 이상의 약물은 환자의 항암 표준 관리(SoC) 치료에 사용되는 약물(들)을 포함한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 생검 또는 절편은 참조 기준선을 확립하기 위한 조직학적 분석 및/또는 체학 테스트(예를 들어, NGS)를 위해 추가로 가공처리될 수 있다. 이러한 추가 분석의 결과는 또한 상기 생체외 및 생체내 테스트를 비교하고/하거나 상관시키는 데 사용될 수 있다.
이 방법에 기반하여, 적용된 항암 표준 관리(SoC) 치료가 적합한지 또는 상기 설명한 바와 같이 생체외에서 테스트된 상이한 약물 치료 레짐이 더 유망할 수 있는지 여부를 신뢰성 있게 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해, 암 치료는 개인화되고 최적화될 수 있다. 의료 제공자의 치료 결정의 정확도를 높일 수 있는 기능적 시험관내 데이터가 생성될 수 있다.
PDAC 세포의 공동배양
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 암 세포 및 바람직하게는 췌장관 선암종(PDAC) 세포는 간질 세포, 바람직하게는 섬유아세포와 조합하여 공동배양될 수 있다. 이 실시양태의 경우, 하이드로겔 매트릭스는 50 내지 3,000 Pa, 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 및 가장 바람직하게는 50 내지 1,000 Pa 범위의 강성을 갖는 바람직하게는 비-자가분해가능한 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되며, 여기서 적어도 1종의 가교결합제는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함하고, 여기서 가교결합제 중 적어도 1종 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함한다.
바람직하게는, 상기 실시양태에서 사용되는 배양 배지는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제 및 바람직하게는 추가로 FBS를 포함한다.
따라서, 이 실시양태에 따르면, 본 발명은 간질 세포, 바람직하게는 섬유아세포와 공동배양된 암 세포, 바람직하게는 췌장관 선암종(PDAC) 세포를 테스트하는 방법으로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 존재 하에 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 적어도 1종의 가교결합제 및 상기 간질 세포, 바람직하게는 섬유아세포를, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 가교결합시킴으로써 제조되고 50 내지 3,000 Pa, 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 및 가장 바람직하게는 50 내지 1,000 Pa 범위의 강성을 갖는 이산 용적을 갖는 완전 한정된, 바람직하게는 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 포함하는 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 제공하는 단계;
b) 상기 췌장관 선암종 세포 및 간질 세포를 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제 및 바람직하게는 추가로 FBS를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지의 존재 하에 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장하도록 하는 단계;
c) 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 1종 이상의 약물을 첨가하는 단계
를 포함하고, 적어도 1종의 가교결합제는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함하고, 가교결합제 중 적어도 1종 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에 따르면, 상기 방법은 적어도 2개의 상이한 어레이가 제공되도록 수행되며, 여기서 어레이는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프의 존재 또는 부재와 관련하여 상이하다. 상기 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프가 존재하는 어레이에서, PDAC 세포는 간질 세포, 바람직하게는 섬유아세포와 공동배양될 수 있다. 상기 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프가 존재하지 않는 어레이에서, PDAC 세포는 섬유아세포와 같은 간질 세포의 성장을 손상시키는 단일 배양으로 성장된다.
바람직하게는, 상기 PEG 하이드로겔 전구체 분자는 PEG-VS(말단 비닐설폰 모이어티를 갖는 폴리에틸렌 글리콜), 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS이다. 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 자가분해가능한 PEG는 하나 이상의 PEG-Acr 전구체 분자로부터 제조될 수 있고 단독으로 또는 PEG-VS 전구체 분자와 조합하여 사용될 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 완전 한정된, 바람직하게는 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS를 가교결합제로서 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드와 가교결합시킴으로써 제조되고, 여기서 상기 가교결합제는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함하고, 추가로 RGD 모티프를 포함할 수 있다.
임의적 생물활성 리간드로서, RGD 부착 모티프를 포함하는 생물활성 모티프를 포함하는 리간드가 사용될 수 있다. 적합한 RGD 모티프의 예는 RGD, RGDS, RGDSP, RGDSPG, RGDSPK, RGDTP, RGDSPASSKP, PHSRNSGSGSGSGSGRGDSPG, 또는 사이클로(RGDfC)와 같은 임의의 사이클릭 RGD 모티프이지만, 하이드로겔 및 세포 배양 분야에 공지되어 있고 성공적으로 사용된 임의의 RGD 서열이 주로 사용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 임의적 생물활성 리간드는 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 특히 마우스 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군에서 선택된다. 적합한 재조합 라미닌 이소형의 예는 라미닌-111, 라미닌-211, 라미닌-332, 라미닌-411, 라미닌-511 또는 라미닌-521이며, 라미닌-511이 바람직하다.
임의적 생물활성 리간드로서, 콜라겐 펩티드 모티프를 포함하는 생물활성 모티프를 포함하는 리간드가 사용될 수 있다. 적합한 콜라겐 펩티드의 예는 DGEA이다.
임의적 생물활성 리간드로서, 히알루론산 및 히알루로난과 같은 글리코사미노글리칸을 포함하는 리간드가 사용될 수 있다. 히알루론산의 예는 히알루론산 50k, 히알루론산 1000k, 히알루로네이트 티올 50k 또는 히알루로네이트 티올 1000k이다.
바람직하게는, 상기 배양 배지는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제의 존재 및 바람직하게는 추가로 FBS를 특징으로 한다. 바람직한 실시양태에 따르면, 문헌[Boj et al. (Cell 160, 324-338, January 15, 2015), p. 335, right col., 2nd para] 또는 문헌[Huang et al. (Nature medicine, published online 26 October 2015; doi:10.1038/nm.3973)]에 설명된 배양 배지가 사용될 수 있다. HEPES, 글루타맥스, 페니실린/스트렙토마이신, B27, 프리모신, N-아세틸-L-시스테인, Wnt3a-조정 배지[50% v/v] 또는 재조합 단백질[100 ng/ml], RSPO1-조정 배지[10% v/v] 또는 재조합 단백질[500ng/ml], 노긴-조정 배지[10% v/v] 또는 재조합 단백질[0.1 ㎍/ml], 표피 성장 인자[EGF, 50 ng/ml], 가스트린[10 nM], 섬유아세포 성장 인자 10[FGF10, 100 ng/ml], 니코틴아미드[10 mM], 프로스타글란딘 E2[PGE2, 1 μM] 및 A83-01[0.5 μM]가 보충된 AdDMEM/F12 배지를 포함하는, 문헌[Boj et al.]으로부터 개조된 배양 배지가 특히 바람직하다.
특히 바람직하게는, 상기 췌장관 선암종 세포는 인간의 생검 또는 조직 절편 또는 환자 유래 이종이식편(PDX) 조직으로부터 갓 단리되거나 동결된 인간 세포 또는 임의로 Matrigel®과 같은 BME에서 사전 확립된 환자 유래 오가노이드(PDO)로부터의 것이다.
바람직하게는, 상기 간질 세포는 환자로부터 단리된다. 특히 바람직하게는, 상기 간질 세포는 섬유아세포이다.
상기 방법을 사용하여, 상기 췌장관 선암종 세포를 생체내에서 관찰된 약물 결과를 재현하는 세포외 매트릭스 조건 하에 선택된 배지에서 간질 세포와의 공동배양물로서 성장시키고 증대시키고 후속적으로 테스트할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에 따르면, 세포외 매트릭스 조건은 Matrigel®과 같은 천연 유래 매트릭스의 사용이 완전히 회피될 수 있도록 선택된다.
이 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 간질 세포, 바람직하게는 섬유아세포와 공동배양된 암 세포, 바람직하게는 췌장관 선암종(PDAC) 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 50 내지 3,000 Pa, 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 및 가장 바람직하게는 50 내지 1,000 Pa 범위의 강성을 갖는 완전 한정된, 바람직하게는 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 가교결합제 중 적어도 1종은 바람직하게는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함하고, 가교결합제 중 적어도 1종 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하는 구성요소;
b) 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제, 바람직하게는 추가로 FBS를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지
를 포함하는 키트에 관한 것이다.
이 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 간질 세포, 바람직하게는 섬유아세포와 공동배양된 암 세포, 바람직하게는 췌장관 선암종(PDAC) 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 50 내지 3,000 Pa, 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 및 가장 바람직하게는 50 내지 1,000 Pa 범위의 강성을 갖는 완전 한정된, 바람직하게는 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 가교결합제 중 적어도 1종은 바람직하게는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함하고, 가교결합제 중 적어도 1종 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하는 구성요소;
b) 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제, 바람직하게는 추가로 FBS를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지
c) 임의로, 동일한 세포외 매트릭스 조건을 사용하여 생성된 세포 저장소/바이오뱅크로부터의 세포
를 포함하는 키트에 관한 것이다.
이 실시양태의 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건은 또한 암 환자를 위한 요법의 효율성을 테스트하기 위한 방법으로서,
a) 암 환자의 생검 또는 조직 절편로부터 갓 단리되거나 동결된 암 세포, 바람직하게는 췌장관 선암종 세포를 제공하고 환자로부터 단리된 간질 세포를 제공하여 공동배양 시스템을 확립하는 단계;
b) 상기 공동배양 시스템으로부터 세포를 확립하고 증대시키고, 1종 이상의 약물을 상기 기재된 방법에 의해 상기 세포에 적용하는 단계;
c) 단계 b)에서 적용된 1종 이상의 약물의 활성을 단계 b)에서 적용된 상기 약물 중 하나로 상기 환자를 치료한 결과와 비교하는 단계;
d) 및/또는 환자 오가노이드에서의 약물 활성 결과 및 질환의 해당 유전적 및 표현형 데이터를 제공하여 의사가 환자를 치료하는 방식에 대한 결정을 내리는 것을 지원하는 단계
를 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
단계 b)에서 오가노이드를 확립하기 위한 췌장관 선암종(PDAC) 세포의 단리 전용의 환자 생검 또는 절편은 표준 진단 절차 동안 수집되고 후속적으로 b) 단계가 수행될 위치로 이송될 수 있다.
이 방법의 단계 b)는 상기 설명한 바와 같이, 즉 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 존재 하에 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 적어도 1종의 가교결합제 및 간질 세포, 바람직하게는 섬유아세포와 공동배양된 상기 암 세포, 바람직하게는 췌장관 선암종 세포를, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 가교결합시킴으로써 제조되고 50 내지 3,000 Pa, 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 및 가장 바람직하게는 50 내지 1,000 Pa 범위의 강성을 갖는 이산 용적을 갖는 완전 한정된, 바람직하게는 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 포함하는 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 제공하고;
상기 암 세포, 바람직하게는 췌장관 선암종 세포 및 상기 간질 세포, 바람직하게는 섬유아세포를 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제, 바람직하게는 추가로 FBS를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지의 존재 하에 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장하도록 하고;
상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 1종 이상의 약물을 첨가함으로써
수행되고, 여기서 가교결합제 중 적어도 1종은 바람직하게는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함하고, 가교결합제 중 적어도 1종 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함한다.
상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 첨가된 1종 이상의 약물은 환자의 항암 표준 관리(SoC) 치료에 사용되는 약물을 포함한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 생검 또는 절편은 참조 기준선을 확립하기 위한 조직학적 분석 및/또는 체학 테스트(예를 들어, NGS)를 위해 추가로 가공처리될 수 있다. 이러한 추가 분석의 결과는 또한 상기 생체외 및 생체내 테스트를 비교하고/하거나 상관시키는 데 사용될 수 있다. 이 방법에 기반하여, 적용된 항암 표준 관리(SoC) 치료가 적합한지 또는 상기 설명한 바와 같이 생체외에서 테스트된 상이한 약물 치료 레짐이 더 유망할 수 있는지 여부를 신뢰성 있게 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해, 암 치료는 개인화되고 최적화될 수 있다. 의료 제공자의 치료 결정의 정확도를 높일 수 있는 기능적 시험관내 데이터가 생성될 수 있다.
결장직장암
결장직장암(CRC) 세포는 불균질성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Roerink et al., (Nature, published online https://doi.org/ 10.1038/s41586-018-0024-3 (2018))). 동일한 종양의 밀접하게 관련된 세포들 사이에 약물에 대한 반응의 유의미한 차이가 관찰되었다. 췌장 세포에 대한 이전과 동일한 논의가 여기에도 적용된다.
본 발명에 의해, 환자의 결장직장암(CRC) 세포를 이들 세포의 성장 및 증대를 지속시키는 조건 하에 배양하는 것이 가능하다. 후속적으로, 세포는 암 환자를 위한 효율적인 약물 치료를 선택하기 위해 상이한 약물 치료에 노출된다. 따라서, 본 발명은 상이한 미세환경에서 CRC 조직의 성장 및 약물 테스트를 가능하게 하는 정밀 의학 플랫폼을 제공하고 따라서 단일 종양 내부의 다수의 클론의 특이성을 포착한다.
본 발명에 따르면, 결장직장암(CRC) 세포는 추가 생물활성 리간드로서 적어도 하나의 RGD 부착 모티프 및 임의로 라미닌, 바람직하게는 라미닌-111 또는 라미닌-511 및 특히 바람직하게는 천연 마우스 라미닌-111 또는 재조합 인간 라미닌-511을 포함하는 완전 한정된 연질 또는 중간정도(50-2,000 Pa 강성) 하이드로겔 매트릭스 및 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함하는 배양 배지의 조합을 사용하여 잘 배양되고 테스트될 수 있는 것으로 나타날 수 있다.
따라서, 이 실시양태에 따르면, 본 발명은
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 임의로 라미닌, 바람직하게는 라미닌-111 또는 라미닌-511 및 특히 바람직하게는 천연 마우스 라미닌-111 또는 재조합 인간 라미닌-511을 포함하는 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 존재 하에 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 적어도 1종의 가교결합제 및 상기 결장직장암 세포를, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 가교결합시킴으로써 제조되고 50 내지 2,000 Pa 범위의 강성을 갖는 이산 용적을 갖는 완전 한정된 하이드로겔 매트릭스 어레이를 포함하는 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 제공하는 단계;
b) 상기 결장직장암 세포를 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지의 존재 하에 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장하도록 하는 단계;
c) 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 1종 이상의 약물을 첨가하는 단계
를 포함하고, 적어도 하나의 상기 가교결합제 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 PEG 하이드로겔 전구체 분자는 PEG-VS(말단 비닐설폰 모이어티를 갖는 폴리에틸렌 글리콜), 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS, 및/또는 PEG-Acr(말단 아크릴레이트 모이어티를 갖는 폴리에틸렌 글리콜), 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-Acr이다.
보다 바람직하게는, 상기 완전 한정된 자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS와 PEG-Acr, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-Acr의 50:50 혼합물을 가교결합제로서 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드와 가교결합시켜 제조되고, 여기서 상기 가교결합제는 RGD 모티프를 포함할 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS를 가교결합제로서 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드와 가교결합시켜 제조되고, 여기서 상기 가교결합제는 RGD 모티프를 포함할 수 있다.
임의적 생물활성 리간드로서, RGD 부착 모티프를 포함하는 생물활성 모티프를 포함하는 리간드가 사용될 수 있다. 적합한 RGD 모티프의 예는 RGD, RGDS, RGDSP, RGDSPG, RGDSPK, RGDTP, RGDSPASSKP, PHSRNSGSGSGSGSGRGDSPG, 또는 사이클로(RGDfC)와 같은 모든 사이클릭 RGD 모티프이지만, 하이드로겔 및 세포 배양 분야에 공지되어 있고 성공적으로 사용된 임의의 RGD 서열이 주로 사용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 임의적 생물활성 리간드는 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 특히 마우스 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형, 예컨대 재조합 인간 라미닌-511 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군에서 선택된다. 적합한 재조합 라미닌 이소형의 예는 라미닌-111, 라미닌-211, 라미닌-332, 라미닌-411, 라미닌-511 또는 라미닌-521이다.
바람직하게는, 상기 배양 배지는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제의 존재를 특징으로 한다. 바람직한 실시양태에 따르면, 문헌[Vlachogiannis et al., Science 359, 920 - 926 (2018)](예를 들어, 보충 자료, p. 5, Human PDO culture media 참고)에 설명된 배양 배지가 사용될 수 있다. 대안적으로, 상업적으로 이용가능한 배양 배지 Intesticult®가 사용될 수 있다. B27 첨가제, N2 첨가제, BSA, L-글루타민, 페니실린-스트렙토마이신, EGF, 노긴, R-스폰딘 1, 가스트린, FGF-10, FGF-염기성, Wnt-3A, 프로스타글란딘 E 2, Y-27632, 니코틴아미드, A83-01, SB202190 및 임의로 HGF가 보충된 Advanced DMEM/F12를 포함하는 문헌[Vlachogiannis et al.]에 설명된 배양 배지가 특히 바람직하다.
특히 바람직하게는, 상기 결장직장암 세포는 인간의 생검 또는 조직 절편 또는 인간 유래 이종이식편(PDX) 조직으로부터 갓 단리되거나 동결된 세포로부터의 것이다.
상기 방법을 사용하여, 상기 결장직장암 세포를 생체내에서 관찰된 약물 결과를 재현하는 조건 하에 선택된 배지에서 성장시키고 증대시키고 후속적으로 테스트할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에 따르면, 세포외 매트릭스 조건은 Matrigel®과 같은 천연 유래 매트릭스의 사용이 완전히 회피될 수 있도록 선택된다.
이 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 결정직장암 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해 50 내지 2,000 Pa 범위의 강성을 갖는 완전 한정된 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS, 및/또는 PEG-Acr, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-Acr,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로, 라미닌, 바람직하게는 라미닌-111 또는 라미닌-511 및 특히 바람직하게는 천연 마우스 라미닌-111 또는 재조합 인간 라미닌-511을 포함하는 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 적어도 하나의 상기 가교결합제 및/또는 상기 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하는 구성요소;
b) 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지
를 포함하는 키트에 관한 것이다.
이 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 결정직장암 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해 50 내지 2,000 Pa 범위의 강성을 갖는 완전 한정된 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS, 및/또는 PEG-Acr, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-Acr,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로, 라미닌, 바람직하게는 라미닌-111 또는 라미닌-511 및 특히 바람직하게는 천연 마우스 라미닌-111 또는 재조합 인간 라미닌-511을 포함하는 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 적어도 하나의 상기 가교결합제 및/또는 상기 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하는 구성요소;
b) 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지;
c) 임의로, 동일한 세포외 매트릭스 조건을 사용하여 생성된 세포 저장소/바이오뱅크로부터의 세포
를 포함하는 키트에 관한 것이다.
이 실시양태의 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건은 또한 암 환자를 위한 요법의 효율성을 테스트하기 위한 방법으로서,
a) 암 환자의 생검 또는 조직 절편로부터 갓 단리되거나 동결된 결장직장암 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 세포로부터 오가노이드를 확립하고 증대시키고, 1종 이상의 약물을 상기 기재된 방법에 의해 상기 오가노이드에 적용하는 단계;
c) 단계 b)에서 적용된 1종 이상의 약물의 활성을 단계 b)에서 적용된 상기 약물 중 하나로 상기 환자를 치료한 결과와 비교하는 단계;
d) 및/또는 환자 오가노이드에서의 약물 활성 결과 및 질환의 해당 유전적 및 표현형 데이터를 제공하여 의사가 환자를 치료하는 방식에 대한 결정을 내리는 것을 지원하는 단계
를 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
단계 b)에서 오가노이드를 확립하기 위한 결장직장암 세포의 단리 전용의 환자 생검 또는 절편은 표준 진단 절차 동안 수집되고 후속적으로 b) 단계가 수행될 위치로 이송될 수 있다.
이 방법의 단계 b)는 상기 설명한 바와 같이, 즉 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 임의로 라미닌, 바람직하게는 라미닌-111 또는 라미닌-511 및 특히 바람직하게는 천연 마우스 라미닌-111 또는 재조합 인간 라미닌-511을 포함하는 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 존재 하에 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 적어도 1종의 가교결합제 및 상기 결장직장암 세포를, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 가교결합시킴으로써 제조되고 50 내지 2,000 Pa 범위의 강성을 갖는 이산 용적을 갖는 완전 한정된 하이드로겔 매트릭스 어레이를 포함하는 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 제공하고;
상기 결장직장암 세포를 바람직하게는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지의 존재 하에 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장하도록 하고;
상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 1종 이상의 약물을 첨가함으로써
수행되고, 여기서 적어도 하나의 상기 가교결합제 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함한다.
상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 첨가된 1종 이상의 약물은 환자의 항암 표준 관리(SoC) 치료에 사용되는 약물(들)을 포함한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 생검 또는 절편은 참조 기준선을 확립하기 위한 조직학적 분석 및/또는 체학 테스트(예를 들어, NGS)를 위해 추가로 가공처리될 수 있다. 이러한 추가 분석의 결과는 또한 상기 생체외 및 생체내 테스트를 비교하고/하거나 상관시키는 데 사용될 수 있다.
이 방법에 기반하여, 적용된 항암 표준 관리(SoC) 치료가 적합한지 또는 상기 설명한 바와 같이 생체외에서 테스트된 상이한 약물 치료 레짐이 더 유망할 수 있는지 여부를 신뢰성 있게 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해, 암 치료는 개인화되고 최적화될 수 있다. 의료 제공자의 치료 결정의 정확도를 높일 수 있는 기능적 시험관내 데이터가 생성될 수 있다.
유방암
상이한 배양 조건을 필요로 하는 별개의 유방암 아형이 있다. 췌장 세포에 대한 이전과 동일한 논의가 여기에도 적용된다.
본 발명에 의해, 유방암 세포, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만 삼중 음성(TNBC) 또는 HER2+ 수용체 상태 유방암 세포를 이들 세포의 성장 및 증대를 지속시키는 조건 하에 배양하는 것이 가능하다. 후속적으로, 세포는 암 환자를 위한 효율적인 약물 치료를 선택하기 위해 상이한 약물 치료에 노출된다. 따라서, 본 발명은 상이한 미세환경에서 유방암 조직의 성장 및 약물 테스트를 가능하게 하는 정밀 의학 플랫폼을 제공하고 따라서 단일 종양 내부의 다수의 클론의 특이성을 포착한다.
본 발명에 따르면, 유방암 세포는 바람직하게는 저산소(낮은 산소 5% O2) 조건 하에, 바람직하게는 완전 한정된 효소-분해가능한 하이드로겔 매트릭스 및 바람직하게는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는 배양 배지를 사용하여 잘 배양되고 테스트될 수 있는 것으로 나타날 수 있다. 일부 아형(특히 TNBC 아형)의 경우, 추가 생물활성 리간드로서 적어도 하나의 RGD 부착 모티프 및 임의로 라미닌, 바람직하게는 라미닌-111 및 특히 바람직하게는 천연 마우스 라미닌-111이 바람직하였다.
따라서, 이 실시양태에 따르면, 본 발명은 유방암 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하는 방법으로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 존재 하에 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 적어도 1종의 가교결합제 및 상기 유방암 세포를, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 가교결합시킴으로써 제조된 이산 용적을 갖는 완전 한정된, 바람직하게는 효소-분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 포함하는 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 제공하는 단계;
b) 상기 유방암 세포를 바람직하게는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지의 존재 하에 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장하도록 하는 단계;
c) 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 1종 이상의 약물을 첨가하는 단계
를 포함하고, 가교결합제 중 적어도 1종은 바람직하게는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 하이드로겔 매트릭스 어레이는 50-2,000 Pa 범위의 연질 또는 중간 강성을 갖는다.
바람직하게는, 상기 PEG 하이드로겔 전구체 분자는 PEG-VS(말단 비닐설폰 모이어티를 갖는 폴리에틸렌 글리콜), 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS, 및/또는 PEG-Acr(말단 아크릴레이트 모이어티를 갖는 폴리에틸렌 글리콜), 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-Acr이다.
보다 바람직하게는, 상기 완전 한정된 하이드로겔 매트릭스 어레이는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS, 또는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS와 PEG-Acr, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-Acr의 50:50 혼합물을 가교결합제로서 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드와 가교결합시킴으로써 제조되며, 여기서 상기 가교결합제는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함할 수 있다.
임의적 생물활성 리간드로서, RGD 부착 모티프를 포함하는 생물활성 모티프를 포함하는 리간드가 사용될 수 있다. 적합한 RGD 모티프의 예는 RGD, RGDS, RGDSP, RGDSPG, RGDSPK, RGDTP, RGDSPASSKP, PHSRNSGSGSGSGSGRGDSPG, 또는 사이클로(RGDfC)와 같은 모든 사이클릭 RGD 모티프이지만, 하이드로겔 및 세포 배양 분야에 공지되어 있고 성공적으로 사용된 임의의 RGD 서열이 주로 사용될 수 있다.
임의적 생물활성 리간드로서, 생물활성 모티프를 포함하는 리간드가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 임의적 생물활성 리간드는 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 특히 마우스 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군에서 선택된다. 적합한 재조합 라미닌 이소형의 예는 라미닌-111, 라미닌-211, 라미닌-332, 라미닌-411, 라미닌-511 또는 라미닌-521이다.
임의적 생물활성 리간드로서, 히알루론산 및 히알루로난과 같은 글리코사미노글리칸을 포함하는 리간드가 사용될 수 있다. 히알루론산의 예는 히알루론산 50k, 히알루론산 1000k, 히알루로네이트 티올 50k 또는 히알루로네이트 티올 1000k이다.
바람직한 실시양태에 따르면, 문헌[Sachs et al. (Cell 172 2018, 1-14 (예를 들어, 보충 자료, p. 5, Human PDO culture media 참고)]에 설명된 배양 배지가 사용될 수 있다. 대안적으로, 상업적으로 이용가능한 배양 배지 IntesticultTM, MammocultTM, WIT-PTM, MEBMTM 또는 StemProTM hESC SFM이 사용될 수 있다. R-스폰딘 1 조정 배지 또는 R-스폰딘 3, 뉴레굴린 1, FGF 7, FGF 10, EGF, 노긴, A83-01, Y-27632, SB202190, B27 보충제, N-아세틸시스테인, 니코틴아미드, 글루타맥스 100x, Hepes, 페니실린/스트렙토마이신, 프리모신 및 Advanced DMEM/F12를 포함하는 문헌[Sachs et al.]에 설명된 배양 배지가 특히 바람직하다. IMDM + FBS(혈청) 또는 문헌[Liu et al. (Sci Rep 2019, (9):622)] 또는 문헌[Lancaster et al. (Nat Biotechnol 2017 35(7): 659-666)]에 기재된 것들과 같은 기타 배지가 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에 따르면, 저산소(낮은 산소 5% O2) 조건이 바람직하다.
특히 바람직하게는, 상기 유방암 세포는 인간의 생검 또는 조직 절편 또는 환자 유래 이종이식편(PDX) 조직으로부터 갓 단리되거나 동결된 세포로부터의 것이다.
상기 방법을 사용하여, 상기 유방암 세포를 생체내에서 관찰된 약물 결과를 재현하는 조건 하에 선택된 배지에서 성장시키고 증대시키고 후속적으로 테스트할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에 따르면, 세포외 매트릭스 조건은 Matrigel®과 같은 천연 유래 매트릭스의 사용이 완전히 회피될 수 있도록 선택된다. 이 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 유방암 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해 완전 한정된, 바람직하게는 효소-분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS, 및/또는 PEG-Acr, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-Acr,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 적어도 하나의 상기 가교결합제는 바람직하게는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함하는 구성요소;
b) 바람직하게는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지
를 포함하는 키트에 관한 것이다.
이 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 유방암에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해 완전 한정된, 바람직하게는 효소-분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS, 및/또는 PEG-Acr, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-Acr,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 적어도 하나의 상기 가교결합제는 바람직하게는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함하는 구성요소;
b) 바람직하게는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지;
c) 임의로, 동일한 세포외 매트릭스 조건을 사용하여 생성된 세포 저장소/바이오뱅크로부터의 세포
를 포함하는 키트에 관한 것이다.
이 실시양태의 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건은 또한 암 환자를 위한 요법의 효율성을 테스트하는 방법으로서,
a) 암 환자의 생검 또는 조직 절편로부터 갓 단리되거나 동결된 유방암 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 세포로부터 오가노이드를 확립하고 증대시키고, 1종 이상의 약물을 상기 기재된 방법에 의해 상기 오가노이드에 적용하는 단계;
c) 단계 b)에서 적용된 1종 이상의 약물의 활성을 단계 b)에서 적용된 상기 약물 중 하나로 상기 환자를 치료한 결과와 비교하는 단계;
d) 및/또는 환자 오가노이드에서의 약물 활성 결과 및 질환의 해당 유전적 및 표현형 데이터를 제공하여 의사가 환자를 치료하는 방식에 대한 결정을 내리는 것을 지원하는 단계
를 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
단계 b)에서 오가노이드를 확립하기 위한 유방암 세포의 단리 전용의 환자 생검 또는 절편은 표준 진단 절차 동안 수집되고 후속적으로 b) 단계가 수행될 위치로 이송될 수 있다.
이 방법의 단계 b)는 상기 설명한 바와 같이, 즉 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 존재 하에 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 적어도 1종의 가교결합제 및 상기 유방암 세포를, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 가교결합시킴으로써 제조된 이산 용적을 갖는 완전 한정된, 바람직하게는 효소-분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이를 포함하는 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 제공하고;
상기 유방암 세포를 바람직하게는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는 하나 이상의 상이한 배양 배지의 존재 하에 상기 하이드로겔 매트릭스의 이산 용적에서 성장하도록 하고;
상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 1종 이상의 약물을 첨가함으로써
수행되고, 여기서 적어도 하나의 상기 가교결합제는 바람직하게는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함한다.
상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 첨가된 1종 이상의 약물은 환자의 항암 표준 관리(SoC) 치료에 사용되는 약물(들)을 포함한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 생검 또는 절편은 참조 기준선을 확립하기 위한 조직학적 분석 및/또는 체학 테스트(예를 들어, NGS)를 위해 추가로 가공처리될 수 있다. 이러한 추가 분석의 결과는 또한 상기 생체외 및 생체내 테스트를 비교하고/하거나 상관시키는 데 사용될 수 있다.
이 방법에 기반하여, 적용된 항암 표준 관리(SoC) 치료가 적합한지 또는 상기 설명한 바와 같이 생체외에서 테스트된 상이한 약물 치료 레짐이 더 유망할 수 있는지 여부를 신뢰성 있게 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해, 암 치료는 개인화되고 최적화될 수 있다. 의료 제공자의 치료 결정의 정확도를 높일 수 있는 기능적 시험관내 데이터가 생성될 수 있다.
전립선암
이 실시양태는 정상 세포(예를 들어, 야생형 건강한 세포, 간질 세포)에 비해 암 세포의 선택된 성장의 문제와 관련하여 본 발명에 의해 제공되는 이점을 보여준다.
일부 장기의 경우, 종양 오가노이드를 형성하는 환자 유래 암 세포는 이의 건강한(야생형) 대응물 또는 관련 간질 세포보다 생체외에서 더 느리게 성장하는 경향이 있고/있거나 Matrigel® 또는 동등한 매트릭스에 기반하는 현재 사용되는 생체외 조건은 하나의 조직 유형의 성장을 다른 조직 유형과 대비하여 선택하고 선호할 수 없다.
따라서, 특정 조치를 취하지 않는 한, 정상 세포는 암 오가노이드 배양물을 과성장시키는 경향이 있다. 일부 경우에 배지 조성의 변형이 이러한 문제를 해결할 수 있다는 사실에도 불구하고, 예를 들어, 전립선암의 경우에 암 세포 대비 정상 세포(건강한 세포)의 과성장은 여전히 문제로 남아 있다. 이것은 예를 들어 어떤 약물 또는 약물 조합이 특정 환자를 치료하는 데 효과적일 수 있는가를 결정하기 위한 생리학적 전임상 모델로서 환자 유래 암 세포의 생체외 성장의 확립을 손상시킨다.
정상 세포의 과성장은 특히 전립선암 오가노이드의 경우에 관찰되었다(Drost et al., Development (2017) 144, 968-975). 예를 들어, 현재 10가지 미만의 전립선암 세포주가 존재하고(반면에 결장암의 경우에 50가지가 넘는 세포주가 존재한다), 이들 중 어느 것도 정확한 암 질환(ATCC 및 ECACC 세포 은행)을 적절하게 반영하지 않는다. 따라서, 정상 세포의 성장을 방해하면서, 예를 들어 전립선암 오가노이드를 성장시키는 능력은 더 많은 생리학적 전임상 모델을 사용하여 신약 개발에 상당히 영향을 미칠 수 있고 개인화 의학 적용을 위해 환자-특이적 세포를 사용할 수 있도록 할 것이다.
문헌[Drost et al., Development (2017) 144, 968-975 (pages 971-972 "Personalized cancer therapy" 참조)]은 (i) 암 세포와 (ii) 정상 세포(야생형) 사이의 선택이 (ii)와 대비하여 (i)의 생체외 순수 세포 집단을 성장시키기 위해 어떻게 수행되는지를 간략하게 설명하고 있다. 간단히 말하면, 가능한 경우에, 이것은 세포 배양 배지에서 화학물질/성장 인자를 첨가하거나 생략함으로써 달성된다. 그러나, 전립선암의 경우에, 이것은 예를 들어 야생형 대응물과 대조적으로 성공적인 배양을 소정 화학물질과 독립적으로 만드는 소정 유전자 돌연변이를 보유하는 소정 결장암의 경우만큼 쉽지 않다. 문헌[Drost et al., Nature protocols, Vol.11 no.2 (2016) 347 (pages 347-348 "Limitation of the method" 참조)]에 설명된 바와 같이, 이들의 배양 프로토콜은 원발성 전립선암으로부터 유래된 오가노이드를 성장시키기에 충분히 우수하지 않았으며, 그 이유는 생체외 종양 세포가 정상 세포보다 선택적인 이점이 없다는 사실 때문일 가능성이 크다. 결과적으로, 각각의 암 샘플 조직 내에 정상적으로 존재하는 정상 전립선 세포는 종양 세포를 과성장시키는 것으로 보인다(문헌[Karthaus et al., Cell 159, 163-175, September 25, 2014, 171페이지의 마지막 "논의(Discussion)" 패러그래프)을 또한 참조). 또한, 뼈 및 연조직에서 전립선 전이로부터의 샘플 생검에서도 유사한 문제가 관찰되었으며(Gao et al., Cell 159, 176-187, September 25, 2014, 177-178페이지의 "결과" 참조), 여기서 정상 숙주 조직 세포(예를 들어, 간질 및/또는 상피 세포)는 암세포를 추월하였다.
덜 흔하게 보고된 정상 세포 과성장의 다른 예는 유방암 및 폐암 생체외 배양을 포함한다. 100가지 초과의 원발성 및 전이성 유방암 오가노이드의 확립을 입증하는 문헌[Sachs et al. (Cell 172 2018, 1-14]에 의해 공개된 연구에는, 오가노이드의 병리는 정상으로 분류되는 반면 원래 조직 병리는 종양으로 분류된 몇 건의 사례가 있다(Sachs et al., Cell 172 2018, 1-14, Table S3). 이것은 또한 예를 들어 p53 내의 돌연변이를 보유하는 환자로부터 유래된 폐암 오가노이드에서 관찰될 수 있으며, 여기서 암성 세포와 대비하여 정상 세포는 세포 배양 배지에 화학물질을 첨가하여 선택될 수 있다(Sachs et al., The EMBO Journal e 100300|2019). 그러나, p53 돌연변이가 없다면, 정상 세포 과성장을 방지할 방법이 없다.
본 발명의 이 실시양태에 따르면, 전립선암 세포의 성장을 촉진하는 동시에 이의 정상 대응물의 확립을 방해하는 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건이 식별되었다. 이것은 그렇지 않으면 정상 대응물에 의해 과성장될 수 있는 암 세포를 신뢰성 있게 평가할 수 있는 스크리닝 방법의 확립을 가능하게 한다.
구체적으로, 정상 전립선 세포는 RGD 부착 모티프를 함유하는 겔 제형 중에서만 성장하며, 중간정도 또는 경질 겔에 비해 연질 겔에서 성장이 더 우수한 것으로 밝혀졌다. 한편, 환자 또는 환자 유래 이종이식편(PDX) 종양으로부터 단리된 전립선암 세포는 RGD 모티프가 존재하거나 존재하지 않는 겔에서 유사한 성장을 보이는 것으로 밝혀졌다. 환자 유래 이종이식편(PDX) 종양으로부터 단리된 일부 전립선암 세포는 RGD가 없는 겔(연질 또는 중간 강성)에서 훨씬 더 잘 성장한다.
따라서, 이 실시양태에 따르면, 본 발명은 정상 대응물 또는 관련 간질 세포보다 생체외에서 더 느리게 성장하는 암 세포, 바람직하게는 전립선암 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하는 방법으로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 존재 하에 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 적어도 1종의 가교결합제 및 상기 암 세포를, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 가교결합시킴으로써 제조된 이산 용적을 갖는 완전 한정된 하이드로겔 매트릭스 어레이를 포함하는 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 제공하는 단계;
b) 상기 암 세포를 하나 이상의 상이한 배양 배지의 존재 하에 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장하도록 하는 단계;
c) 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 1종 이상의 약물을 첨가하는 단계
를 포함하고, 상기 가교결합제 및 상기 임의적 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 PEG 하이드로겔 전구체 분자는 PEG-VS(말단 비닐설폰 모이어티를 갖는 폴리에틸렌 글리콜), 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS, 및/또는 PEG-Acr(말단 아크릴레이트 모이어티를 갖는 폴리에틸렌 글리콜), 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-Acr이다.
보다 바람직하게는, 상기 완전 한정된 하이드로겔 매트릭스 어레이는 PEG-Acr, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-Acr, 또는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS와 PEG-Acr, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-Acr의 50:50 혼합물을 가교결합제로서 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드와 가교결합시킴으로써 제조된다.
바람직하게는, 상기 하이드로겔 매트릭스 어레이는 50-2,000 Pa 범위의 연질 또는 중간정도 강성을 갖는다.
다른 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 완전 한정된 비-자가분해가능한 하이드로겔 매트릭스 어레이는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS를 가교결합제로서 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드와 가교결합시킴으로써 제조된다.
임의적 생물활성 리간드로서, 생물활성 모티프를 포함하는 리간드가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 임의적 생물활성 리간드는 테나신 C 및 글리피칸, 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 특히 마우스 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군에서 선택된다. 적합한 재조합 라미닌 이소형의 예는 라미닌-111, 라미닌-211, 라미닌-332, 라미닌-411, 라미닌-511 또는 라미닌-521이다.
바람직하게는, 배양 배지는 전립선암 세포를 성장시키도록 사전 선택되었다. 상업적으로 이용가능한 배양 배지, 예를 들어 론자(Lonza)(참고번호 CC-3166)로부터의 MammocultTM, WIT-PTM, StemProTM hESC SFM, PrEGMTM BulletKitTM, 및 NutriStem® hPSC XF가 사용될 수 있을 뿐만 아니라, WO 2015/173425 A1 또는 문헌[Drost et al. (Nature Protocol 11, 347-358, January 2016)] 또는 문헌[Beshiri et al. (Clinical Cancer Research 24, 4332-4345), May 2018)] 또는 문헌[Puca et al. (Nature Communications 9:2404, 1-10, June 2018)] 또는 문헌[Ince et al. (Cancer Cell 12, 160-170, August 2007)]에 설명된 바와 같은 배지가 암 세포의 성장에 적합하다. WO 2015/173425 A1에 설명된 배양 배지는 암 세포의 성장에 유리한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 글루타민, BSA, 트랜스페린, 노긴, FGF(2 또는 염기성), FGF 10, EGF, R-스폰딘 조정 배지 또는 재조합, 페니실린/스트렙토마이신, 글루타티온, 니코틴아미드, DHT, 프로스타글란딘 E2, A83-01, Y-27632, N-아세틸시스테인, SB202190 및 Hepes를 포함하는 배양 배지가 특히 바람직하다.
특히 바람직하게는, 상기 암세포는 인간의 생검 또는 조직 절편 또는 환자 유래 이종이식편(PDX) 조직으로부터 갓 단리되거나 동결된 세포로부터의 것이다.
상기 방법을 사용하여, 상기 암세포를 정상 대응물 또는 관련 간질 세포에 의해 과성장되지 않으면서 생체내에서 관찰된 약물 결과를 재현하는 조건 하에 선택된 배지에서 성장시키고 후속적으로 테스트할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에 따르면, 세포외 매트릭스 조건은 Matrigel®과 같은 천연 유래 매트릭스의 사용이 완전히 회피될 수 있도록 선택된다.
이 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 정상 대응물 또는 관련 간질 세포보다 생체외에서 더 느리게 성장하는 암 세포, 바람직하게는 전립선암 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해 완전 한정된 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS, 및/또는 PEG-Acr, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-Acr,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 상기 가교결합제 및 상기 임의적 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는 구성요소;
b) 하나 이상의 상이한 배양 배지
를 포함하는 키트에 관한 것이다.
이 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 정상 대응물 또는 관련 간질 세포보다 생체외에서 더 느리게 성장하는 암 세포, 바람직하게는 전립선암 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 부품 키트로서,
a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해 완전 한정된 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서, 상기 구성요소는
- 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자, 바람직하게는 PEG-VS, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-VS, 및/또는 PEG-Acr, 특히 바람직하게는 4-암 또는 8-암 PEG-Acr,
- 적어도 1종의 가교결합제, 바람직하게는 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 포함하는 펩티드,
- 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
를 포함하고, 상기 가교결합제 및 상기 임의적 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는 구성요소;
b) 하나 이상의 상이한 배양 배지;
c) 임의로, 동일한 세포외 매트릭스 조건을 사용하여 생성된 세포 저장소/바이오뱅크로부터의 세포
를 포함하는 키트에 관한 것이다.
이 실시양태의 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건은 또한 암 환자를 위한 요법의 효율성을 테스트하기 위한 방법으로서,
a) 암 환자의 생검 또는 조직 절편로부터 갓 단리되거나 동결된 암 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 세포로부터 오가노이드를 확립하고 증대시키고, 1종 이상의 약물을 상기 기재된 방법에 의해 상기 오가노이드에 적용하는 단계;
c) 단계 b)에서 적용된 1종 이상의 약물의 활성을 단계 b)에서 적용된 상기 약물 중 하나로 상기 환자를 치료한 결과와 비교하는 단계;
d) 및/또는 환자 오가노이드에서의 약물 활성 결과 및 질환의 해당 유전적 및 표현형 데이터를 제공하여 의사가 환자를 치료하는 방식에 대한 결정을 내리는 것을 지원하는 단계
를 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
단계 b)에서 오가노이드를 확립하기 위한 전립선암 세포의 단리 전용의 환자 생검 또는 절편은 표준 수술 또는 진단 절차 동안 수집되고 후속적으로 b) 단계가 수행될 위치로 이송될 수 있다.
이 방법의 단계 b)는 상기 설명한 바와 같이, 즉 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 존재 하에 하나 이상의 상이한 PEG 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 적어도 1종의 가교결합제 및 상기 암 세포를, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적 내로 가교결합시킴으로써 제조된 이산 용적을 갖는 완전 한정된 하이드로겔 매트릭스 어레이를 포함하는 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건을 제공하고;
상기 암 세포를 하나 이상의 상이한 배양 배지의 존재 하에 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장하도록 하고;
상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 1종 이상의 약물을 첨가함으로써;
수행되고, 여기서 상기 가교결합제 및 상기 임의적 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는다.
상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에서 성장한 세포에 첨가된 1종 이상의 약물은 환자의 항암 표준 관리(SoC) 치료에 사용되는 약물(들)을 포함한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 생검 또는 절편은 참조 기준선을 확립하기 위한 조직학적 분석 및/또는 체학 테스트(예를 들어, NGS)를 위해 추가로 가공처리될 수 있다. 이러한 추가 분석의 결과는 또한 상기 생체외 및 생체내 테스트를 비교하고/하거나 상관시키는 데 사용될 수 있다.
이 방법에 기반하여, 적용된 항암 표준 관리(SoC) 치료가 적합한지 또는 상기 설명한 바와 같이 생체외에서 테스트된 상이한 약물 치료 레짐이 더 유망할 수 있는지 여부를 신뢰성 있게 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해, 암 치료는 개인화되고 최적화될 수 있다. 의료 제공자의 치료 결정의 정확도를 높일 수 있는 기능적 시험관내 데이터가 생성될 수 있다.
동적 오가노이드 성장 이미지 분석 방법
오가노이드 성장의 상이한 매개변수(예를 들어, 성장률, 오가노이드 수, 오가노이드 크기)를 정확하고 쉽게 정량화할 필요가 있다. 기존의 2D 세포 배양의 경우, 오가노이드 성장의 정량화는 배양 웰에서 대사산물의 양을 측정하는 형광, 비색 또는 발광 방법(예를 들어, 알마르 블루(Alamar Blue), MTT, Cell Titer Glow 3D)을 사용하여 간접적으로 달성될 수 있다. 이러한 모든 간접 분석은 이들이 세포에 치명적이지 않은 경우에도, 오가노이드의 적합성에 영향을 미치고 성장한 오가노이드를 추가 사용할 가능성(예를 들어, 약물 테스트, 재생 의학을 위한)을 완전히 방지할 수 있다.
따라서, 비침습적(및 무-표지) 방법을 광학현미경으로서 사용하여 오가노이드 성장을 정량화하는 것은 장기간 배양에서 및/또는 오가노이드가 가능한 한 "고유의(native)" 및 "손대지 않은(untouched)" 상태로 유지되어야할 필요가 있는 경우(예를 들어 재생 의학, 바이오뱅킹을 위해)에 선호되는 대안이다. 3D 오가노이드 배양의 고처리량 이미지화의 정량화의 필요성은 2D 방법의 개조(Carpenter et al., Genome Biology 2006, 7:R100) 또는 신속하고 재현 가능하고 편향 없는 방식으로 오가노이드를 계수하고 측정할 수 있게 하는 새로운 자동화 검출 및 이미지 분할 알고리즘의 개발로 이어졌다. 이러한 방법들은, 면역형광 염색 또는 형광 전이유전자(transgene) 발현을 필요로 하기 때문에 "손대지 않은" 및 "무-라벨" 환자 유래 세포 또는 재이식 프로토콜의 사용과는 호환되지 않는 형광 마커를 사용하여 보다 쉽고 보다 정확하게 수행된다(Robinson et al., PLoSONE 10(12): e0143798. doi:10.1371/journal.pone.01437982015, Boutin et al., Nature scientific reports (2018)8:11135, DOI:10.1038/s41598-018-29169-0 2018).
최근에, 문헌[Borten et al., Nature scientific reports (2018) 8:5319, DOI:10.1038/s41598-017-18815-8 2018]에서는, 3D 명시야 이미지로부터 오가노이드를 구체적으로 분석하여 3D에서 성장한 살아있는 고유한 오가노이드로부터 많은 매개변수를 검출, 분할(즉, 디지털 이미지를 픽셀의 특정 세트로 분할) 및 정량화하기 위한 OrganoSeg라 불리는 Matlab(매스웍스(Mathworks)사로부터) 기반 알고리즘이 개발되었다(Borten 2018). 이 오픈-소스 소프트웨어는 주어진 시점에서 검출된 특징의 크기, 구형도 및 모양을 기반으로 오가노이드의 식별 및 다중매개변수 형태학적 분류를 가능하게 한다.
그러나, 정확하고 강력함에도 불구하고, 이 도구는 시간 차원을 고려하는 것이 가능하지 않으며 오가노이드 성장의 동역학을 적절하게 평가하기 위해 상이한 시점에서 다수의 분석을 필요로 하고 이에 따라 결과적으로 컴파일 작업(compilation work)을 필요로 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 새로운 분석 방법이 제공된다. MATLAB 코드에 기반하여, 상이한 시점에서 획득된 명시야 이미지를 정렬하고 강도에 기반하여 오가노이드를 자동으로 식별 및 분할할 수 있는 새로운 방법이 개발되었다. 이 프로그램은 OrganoSeg와 동일한 방법을 사용하여 명시야 이미지로부터 개체를 분할한다. 주요 차이점은 이러한 분할된 개체를 사용하는 데 있다: OrganoSeg는 크기 및 형태특징을 사용하여 주어진 개별 시점에서 상이한 유형의 오가노이드를 분류하지만, 이 새로운 프로그램은 하나의 단일 분석으로 오가노이드 성장을 동적 추적조사하고 이에 따라 OFE/AIF 및 약물 반응을 계산할 수 있게 한다. 따라서, 프로그램은 오가노이드 성장에 관해 다음의 동적 정보를 제공한다:
ㆍ 오가노이드 형성 효율(OFE) 및,
ㆍ 면적 증가 계수(Area Increse Factor: AIF).
본 발명의 방법을 사용하여, 획득된 각각의 웰에 대한 정렬된 시간-경과 비디오(time-lapse video) 및 단일 렌더링된(rendered) 이미지에서 배양 기간에 따른 오가노이드의 전체 성장을 나타내는 "시간 예측(Time Projections)"을 생성하는 것도 가능하다. 이러한 시간 예측은 프레젠테이션 및 출판에 쉽게 포함된다.
단일 세포 또는 세포의 작은 클러스터가 3D 세포외 매트릭스에 캡슐화될 때, 이들 세포의 서브세트만이 성장하고 오가노이드를 생성할 수 있다; 이것이 배양물의 "오가노이드 형성 효율"(OFE)로서 설계된 것이다. 본 발명의 방법을 사용하면, 0일차에 캡슐화된 세포의 수가 정량화된다. 또한, 이 방법은 사용자가 오가노이드로 간주하는 것의 크기의 임계값을 정의할 수 있게 한다. 그 다음, 이것은 분석에서 임의의 특정 시점에 대한 OFE를 제공한다.
OFE는 오가노이드에서 발달할 수 있는 원래 배양물 중의 세포(예를 들어, 줄기 세포)의 백분율을 나타내지만, 본 발명의 방법을 사용하면, 전체 오가노이드 배양물의 성장률도 시간-경과의 분할 후 시간에 따른 면적의 증가를 계산함으로써 정량화된다. 이것이 "면적 증가 계수"(AIF)이며, 0일차에 단일 세포가 점유하는 총 면적 대 주어진 날짜에 오가노이드가 점유하는 총 면적의 비에 상응한다. 본 발명의 방법은 AIF를 계산하기 위해 첫날 및 마지막 날의 선택을 가능하게 한다.
OFE 점수와 AIF 점수를 합하면 주어진 세포외 매트릭스 조건의 적합성 및 성능에 대한 유용한 정보가 제공된다.
본 발명에 따른 이러한 반자동화 이미지 분석 방법은 고처리량 설정에서 오가노이드 성장의 시간적 조사 및 분석을 가능하게 한다. 이것은 마커 및/또는 유해한 분석의 필요 없이 임의의 오가노이드 배양에 대한 세포외 매트릭스 조건의 적합성 및 성능을 반영하는 편향되지 않고 재현가능한 점수화 제공한다. 이것은 또한 환자 유래 오가노이드 약물 테스트 결과의 반자동 정량화(예를 들어, IC50 값 결정)를 가능하게 한다.
실시예 1: 폐암 세포의 테스트
실시예 1a: c-Met 수용체를 과발현하는 폐암 세포
환자로부터, c-Met 수용체를 과발현하는 폐암 세포를 PDX 세포로부터 수득하였다. 리간드 결합을 통한 활성화 시, c-Met 수용체는 세포 내에서 자가인산화하고 여러 신호전달 캐스케이드를 활성화한다.
비소세포 폐암(NSCLC) 모델 LXFA-1647의 환자 유래 이종이식편(PDX) 세포를 c-Met에 대해 표적화된 약물(c-Met 억제제: PF-04217903, Selleck Chemicals)로 처리하는 것은 자가인산화를 억제하고 생체내 종양 성장 퇴행을 유도한다.
비-자가분해가능한 하이드로겔을 제조하기 위한 하이드로겔 전구체 분자로서 PEG를 사용하였다. 가교결합제로서, 특히 RGD 부착 모티프의 존재 또는 부재와 관련하여 및 MMP 분해 서열의 존재 또는 부재와 관련하여 아미노산 서열이 다양한, 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 함유하는 펩티드를 사용하였다. 일부 하이드로겔에 대해 이루어진 추가 변형은 RGD 부착 모티프를 포함하는 생물활성 리간드 또는/및 천연 라미닌, 재조합 라미닌 이소형 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군에서 선택된 리간드의 부착이었다. 적합한 재조합 라미닌 이소형의 예는 라미닌-111, 라미닌-211, 라미닌-332, 라미닌-411, 라미닌-511 또는 라미닌-521이다. 상기 사전 선택된 특징들이 다양한 하이드로겔의 어레이는 상기 설명한 방법에 의해 확립하였다.
하이드로겔의 기계적 특성도 다양하였다(연질(50-1,000 Pa), 중간정도(1,000-2,000 Pa) 또는 경질(2,000-3,000 Pa) 겔).
비교를 위해, 미한정된 천연 유래 매트릭스 Matrigel®에서도 테스트를 수행하였다.
배양 배지는 상기 설명한 c-Met 억제제 PF-04217903(Selleck Chemicals), 즉 c-met을 표적화하고 이의 자가인산화를 억제하는 약물, 또는 이러한 암 유형의 표준 관리(SoC) 치료에 사용되는 약물(도세탁셀)을 포함하도록 사전 선택하였다. 각각의 약물을 1 내지 8일의 배양(세포 캡슐화 후 1일 내지 8일차) 후에 배양 배지에 첨가하였다. 약물 반응을 약물 첨가 후 5일 내지 10일 후에 측정하였다. 바람직한 배양 배지로서, FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제의 존재를 특징으로 하는 배지를 사전 선택하였다. 본 실시예에 따라, 문헌[Sachs et al. (The EMBO Journal e 100300|2019)]으로부터 개조된 배양 배지를 사용하였다. 바람직한 배양 배지는 글루타민, 노긴, EGF, 섬유아세포 성장 인자 7 및 10[FGF7 및 FGF10], HGF, R-스폰딘-조정 배지, 프리모신, 페니실린/스트렙토마이신, N-아세틸-L-시스테인, 니코틴아미드, A83-01, SB202190(p38-억제제), Y-27632(rock 억제제), B27 보충제 및 HEPES가 보충된 AdDMEM/F12 배지를 포함하였다. . 표적 발현(c-Met 및 포스포 c-Met)은 상응하는 성장 조건에서 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다.
결과는 도 1a, 1b 및 1c에 도시되어 있다.
이들 사전 선택된 조건을 사용하여, 생체내에서 관찰된 약물 결과(즉, c-Met 억제제 PF-04217903(Selleck Chemicals)의 활성)를 재현하는 생체외 성장(생체외 배양, 세포외 매트릭스) 조건을 식별하였다. 이러한 세포외 매트릭스 조건은 "반응자 조건"으로 간주하였다.
본 실시예에서, 가장 바람직한 반응자 조건은 각각의 PEG 하이드로겔 전구체 분자 및 가교결합제로서 (가교결합제 내에 또는 하이드로겔에 부착된) 임의의 RGD 모티프가 없는 2개의 시스테인 모이어티를 함유하는 펩티드로부터 제조된 비-자가분해가능한 하이드로겔을 사용하는 것이었다. 상기 하이드로겔은 50-1,000 Pa(실시예 1a), 보다 더욱 바람직하게는 250-500 Pa 범위의 연질 강성을 갖는다.
동일한 분석에서, 약물 내성을 초래하는 다른 조건이 식별되었다. 약물 내성은 미세환경, 즉 세포외 매트릭스 또는 가용성 인자에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 특히, RGD 모티프를 포함하는 1mM의 생물활성 리간드가 하이드로겔에 부착되면, 종양 세포는 상기 설명한 c-Met 억제제 PF-04217903(Selleck Chemi-cals)에 내성이 되는 것으로 나타날 수 있다. 이러한 조건은 "비반응자 조건"으로 간주하였다(실시예 1b).
마지막으로, 동일한 분석에서, 매트릭스로서 Matrigel®의 사용도 종양 세포가 상기 설명한 c-Met 억제제 PF-04217903(Selleck Chemicals)에 반응하지 않은 "비반응자 조건"(비교 실시예 1)을 제공한 것으로 나타날 수 있다.
도 1b에는, 실시예 1a의 조건 하에 도세탁셀로의 표준 관리(SoC) 처리의 효과뿐만 아니라 c-met-억제제 PF-04217903(Selleck Chemicals)로의 처리의 효과가 도시되어 있다. 두 약물 모두 명백히 효과적이었다.
이에 반해, 도 1c에는, 비교 실시예 1(Matrigel®)의 조건 하에 도세탁셀로의 표준 관리(SoC) 처리의 효과만이 관찰될 수 있는 것으로 도시되어 있다. c-met-억제제 PF-04217903(Selleck Chemicals)로의 처리의 효과는 관찰되지 않았다. 이에 따라, 도 1a 내지 1c)는 조사된 세포에 미치는 c-met-억제제의 효과를 본 발명의 사전 선택 조건 하에서만 볼 수 있음을 도시한다. 통상적인 조건(즉, Matrigel®을 사용) 하에 작업할 때, c-met 억제제를 이용한 가능한 처리는 인식되지 않았을 것이다.
실시예 1b: EGFR 수용체를 과발현하는 폐암 세포
EGFR 수용체를 과발현하는 폐암 세포로 실시예 1a를 반복하였다. 이들 세포는 PDX 세포로부터 수득하였다.
실시예 1a의 "반응자 조건"을 사용 시(즉, (가교결합제 내 또는 하이드로겔에 부착된) 임의의 RGD 모티프가 없음), 실시예 1b에서 예상한 바와 같이 실시예 1b에서 테스트된 세포에서 c-met 수용체의 자가인산화의 결여로 인해c-met 억제제로의 처리의 효과는 관찰될 수 없었다(도 1d 참조). 한편, 이러한 조건 하에서는 EGFR 수용체뿐만 아니라 이의 인산화된 형태가 과발현되었고(도 1d), EGFR 수용체에 작용하는 약물(에를로티닙(Erlotinib) 및 세툭시맙(Cetuximab))뿐만 아니라 파클리탁셀(Paclitaxel)로의 SoC 처리는 명백한 효과(Matrigel®을 사용하는 비교 실시예 1의 조건과 유사(데이터는 제시되지 않음))를 보여주었다(도 1e).
실시예 2: 췌장암 세포의 테스트
환자로부터의 췌장관 선암종(PDAC) 암 세포를 먼저 PDX 모델로서 마우스에서 증대시켰다. PDX 유래 세포를 다양한 세포외 매트릭스 조건에서 성장시켰다.
췌장관 선암종(PDAC) 암 모델 PAXF736의 환자 유래 이종이식편(PDX) 세포를 EGFR을 표적화하는 약물(EGFR 억제제: 세툭시맙)로 처리하는 것은 생체내 종양 성장을 감소시킨다.
비-자가분해가능한 하이드로겔을 제조하기 위한 하이드로겔 전구체 분자로서 PEG를 사용하였다. 가교결합제로서, 특히 RGD 부착 모티프의 존재 또는 부재와 관련하여 및 MMP 분해 서열의 존재 또는 부재와 관련하여 아미노산 서열이 다양한, 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 함유하는 펩티드를 사용하였다. 일부 하이드로겔에 대해 이루어진 추가 변형은 RGD 또는 사이클릭 RGD 부착 모티프를 포함하는 생물활성 리간드 또는 대안적으로 DGEA 모티프를 포함하는 생물활성 리간드의 부착이었다. 상기 사전 선택된 특징들이 다양한 하이드로겔의 어레이는 상기 설명한 방법에 의해 확립하였다.
하이드로겔의 기계적 특성도 다양하였다(경질(2,000-3,000 Pa), 중간정도(1,000-2,000 Pa) 또는 연질(50-1,000 Pa) 겔).
각종 상이한 공지된, 통상적으로 사용되는 및/또는 상업적으로 이용가능한 배양 배지를 사용하였다.
도 2a 및 도 2b에는, RGD 모티프가 없는 가교결합 모이어티 및 RGD 부착 모티프를 포함하는 생물활성 리간드를 갖는 연질 비-자가분해가능한 PEG 하이드로겔(실시예 2a)뿐만 아니라 RGD 모티프를 갖는 가교결합 모이어티 및 DGEA 부착 모티프를 포함하는 생물활성 리간드를 갖는 연질 비-자가분해가능한 PEG 하이드로겔(실시예 2b)에 대한 결과가 도시되어 있다. 비교를 위해, 미한정된 천연 유래 매트릭스 Matrigel®(비교 실시예 2)에서도 테스트를 수행하였다.
도 2a로부터, 테스트된 모든 하이드로겔이 췌장관 선암종(PDAC) 암 모델 PAXF736의 환자 유래 이종이식편(PDX) 세포의 유사한 성장을 유도하였음을 알 수 있다.
도 2b로부터, 실시예 2a에 따른 하이드로겔은 Matrigel®(비교 실시예 2)과 유사한 약물 민감성(세툭시맙에 대한)을 보였음을 알 수 있다. 한편, 실시예 2b에 따른 하이드로겔은 훨씬 더 높은 약물 민감성을 보였다.
도 2c에서, RGD 모티프의 존재 하에 및 MMP-민감성 모티프의 존재(실시예 2c 및 2e) 또는 부재(실시예 2d 및 2f) 하에 연질 겔(50-1,000 Pa, 실시예 2c 및 2d) 또는 중간정도 겔(1,000-2,000 Pa, 실시예 2e 및 2f)을 사용할 때, PDAC 세포의 매우 우수한 성장이 달성될 수 있었으며 이는 Matrigel®에서의 PDAC 세포의 성장(비교 실시예 2)과 유사하였다.
배양 배지에서 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제의 존재는 세포 성장에 중요한 것으로 밝혀졌다. 또한, 하이드로겔 매트릭스는 적어도 하나의 RGD 모티프를 포함해야하는 것으로 밝혀졌다.
본 실시예는 본 발명에 따른 사전 선택의 이점을 보여준다. Matrigel®을 사용하여 통상적인 세포외 매트릭스 조건(비교 실시예 2)에서 작업할 때, 테스트된 세포에 미치는 EGFR 억제제의 효과가 관찰되지 않았다. 따라서, 이 암 유형의 가능한 효과적인 치료법은 식별되지 않았을 것이다.
실시예 2a와 실시예 2b의 비교는 본 발명에 따른 사전 선택의 또 다른 이점을 보여준다. 주로 특정 세포 유형에 적합한 상이한 사전 선택 조건(여기서는 RGD 모티브의 존재)을 사용함으로써, 테스트된 세포의 가능한 내성을 식별할 수 있다. 실시예 2a에서, EGFR 억제제 세툭시맙에 대해 관찰된 약물 민감성은 실시예 2b와 비교하여 훨씬 더 낮았는데, 이는 EGFR 억제제 단독으로의 이 특정 암 세포 유형의 처리가 충분하지 않을 수 있음을 나타낸다.
실시예 3: 섬유아세포와 공동배양된 췌장암 세포의 테스트
추가 실험에서, 상이한 비의 암 관련 섬유아세포(환자로부터 단리되고 2D 배양에서 사전 증대됨)와 PDAC 세포(Matrigel®에서 사전PDO로부터)의 공동배양을 다양한 세포외 매트릭스 조건에서 조사하였다. 공동배양물 중의 섬유아세포는 특정 마커(CD90)를 사용하여 식별하였다.
도 3에는, RGD 모티프와 효소적으로(MMP) 분해가능한 모이어티 둘 다를 포함하는 하이드로겔(실시예 3a), RGD 모티프만을 포함하고 효소적으로 분해가능한 모이어티를 포함하지 않는 하이드로겔(실시예 3b), RGD 모티프를 포함하지 않고 효소적으로 분해가능한 모이어티만을 포함하는 하이드로겔(실시예 3c) 및 RGD 모티프를 포함하지 않고 효소적으로 분해가능한 모이어티를 포함하지 않는 하이드로겔(실시예 3d)에서 33% PDAC 세포와 67% 섬유아세포를 공동배양한 결과가 도시되어 있다. 비교를 위해, 통상적인 미한정된 천연 유래 매트릭스 Matrigel®(비교 실시예 3)을 사용한 결과를 도시한다.
실시예 3a, 즉 RGD 모티프와 효소적으로 분해가능한 모이어티 둘 다를 포함하는 바람직하게는 연질 PEG 하이드로겔에서 최상의 공동-배양 결과가 수득되었음을 알 수 있다.
본 실시예는 섬유아세포와 같은 다른 세포의 동시 성장이 허용되어야 하는지 여부에 따라 조건을 사전 선택할 수 있음을 보여준다.
실시예 4: 결장직장암 세포의 테스트
Matrigel®에서 사전 확립된 환자로부터의 결장직장암(CRC) 세포를 다양한 세포외 매트릭스 조건에서 성장시켰다.
비-자가분해가능한 PEG 하이드로겔 또는 대안적으로 비-자가분해가능한 PEG 하이드로겔과 자가분해가능한 PEG 하이드로겔의 50:50 혼합물을 제공하기 위한 하이드로겔 전구체 분자로서 PEG를 사용하였다. 가교결합제로서, 특히 RGD 부착 모티프의 존재 또는 부재와 관련하여 및 MMP 분해 서열의 존재 또는 부재와 관련하여 아미노산 서열이 다양한, 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 함유하는 펩티드를 사용하였다. 일부 하이드로겔에 대해 이루어진 추가 변형은 RGD 부착 모티프를 포함하는 생물활성 리간드, 또는 대안적으로 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형, 예컨대 재조합 인간 라미닌-511 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군에서 선택된 리간드의 부착이었다. 적합한 재조합 라미닌 이소형의 예는 라미닌-111, 라미닌-211, 라미닌-332, 라미닌-411, 라미닌-511 또는 라미닌-521이다. 상기 사전 선택된 특징들이 다양한 하이드로겔의 어레이는 상기 설명한 방법에 의해 확립하였다.
하이드로겔의 기계적 특성도 다양하였다(경질(2,000-3,000 Pa), 중간정도(1,000-2,000 Pa) 또는 연질(50-1,000 Pa) 겔).
각종 상이한 공지된, 통상적으로 사용되는 및/또는 상업적으로 이용가능한 배양 배지를 사용하였다.
결과는 도 4에 도시되어 있다. 도 4는 0일 및 11일 동안 성장한 인간 결장암 오가노이드의 명시야 이미지를 제공한다.
실시예 4a 내지 4c에서, 비-자가분해가능한 및 비-효소 분해가능한 하이드로겔을 사용하였다. 실시예 4b에서 가교결합 모이어티는 RGD 모티프를 포함하였고, 실시예 4a 및 4c에서 RGD 모티프를 포함하는 생물활성 리간드는 매달린(dangling) 방식으로 부착되었다. 실시예 4b에서, 라미닌-111인 생물활성 리간드는 매달린 방식으로 부착되었다. 실시예 4a 및 4b에 따른 하이드로겔은 연질(500 Pa 미만)인 반면, 실시예 4c에 따른 하이드로겔은 중간정도(1,000 Pa 초과)였다. 실시예 4d에서, 자가분해가능하지만 비-효소 분해가능하고 400 내지 600 Pa 범위의 초기 강성을 갖는 하이드로겔을 사용하였다. 상기 하이드로겔은 RGD 모티프를 포함한 가교결합 모이어티 및 생물활성 리간드로서 라미닌-111을 가졌다. 비교를 위해, 미한정된 천연 유래 매트릭스 Matrigel®(비교 실시예 4)에서도 테스트를 수행하였다.
실시예 4a 내지 4d에 따른 하이드로겔에서 표준 Matrigel®과 유사하지만 한정된 조건(Matrigel®과 달리)에서 세포 성장이 수득된 것으로 나타났다.
한편, 실시예 4e에서는 비-자가분해가능하지만 효소적으로 분해가능하고 게다가 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는 하이드로겔을 사용하였다. 이러한 조건 하에, 테스트된 CRC 세포는 성장하지 않았다.
실시예 4f에서는, 초기 강성이 약 400-600 Pa이고 RGD 모티프(가교결합제에 혼입됨) 및 생물활성제로서 재조합 인간 라미닌-511을 갖는 자가분해가능한 하이드로겔을 사용하였다. 테스트된 CRC 세포의 매우 우수한 성장이 관찰되었다.
배양 배지 중의 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제의 존재가 세포 성장에 유리한 것으로 밝혀졌다. 또한, 하이드로겔 매트릭스는 적어도 하나의 RGD 모티프 및 임의로 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형, 예컨대 재조합 인간 라미닌-511 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 생물활성 리간드를 포함해야 하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 5: 유방암 세포의 테스트
별개의 암 아형(3중 음성(TNBC) 또는 HER2+ 수용체 상태)을 갖는 환자로부터 유래된 유방암 세포를 먼저 PDX 모델로서 마우스에서 증대시켰다. 그 다음, PDX 유래 세포를 다양한 세포외 매트릭스 조건에서 성장시켰다.
비-자가분해가능한 하이드로겔을 제공하기 위한 하이드로겔 전구체 분자로서 PEG를 사용하였다. 가교결합제로서, 특히 RGD 부착 모티프의 존재 또는 부재 및 MMP-민감성 모티프의 존재 또는 부재와 관련하여 아미노산 서열이 다양한, 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 함유하는 펩티드를 사용하였다.
일부 하이드로겔에 대해 이루어진 추가 변형은 RGD 부착 모티프를 포함하는 생물활성 리간드 또는/및 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군에서 선택된 리간드의 부착이었다. 적합한 재조합 라미닌 이소형의 예는 라미닌-111, 라미닌-211, 라미닌-332, 라미닌-411, 라미닌-511 또는 라미닌-521이다. 상기 사전 선택된 특징들이 다양한 하이드로겔의 어레이는 상기 설명한 방법에 의해 확립하였다.
하이드로겔의 기계적 특성도 다양하였다(경질(2,000-3,000 Pa), 중간정도(1,000-2,000 Pa) 또는 연질(50-1,000 Pa) 겔).
각종 상이한 공지된, 통상적으로 사용되는 및/또는 상업적으로 이용가능한 배양 배지를 사용하였다.
테스트는 저산소(낮은 산소 5% O2) 또는 정상산소(18% O2) 조건 하에 수행하였다.
배양 배지 중의 FBS(혈청) 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제의 존재는 세포 성장에 유리한 것으로 밝혀졌다. 또한, 하이드로겔 매트릭스는 바람직하게는 효소적으로 분해가능해야하는 것으로 밝혀졌다.
도 5에는, 상이한 유방암 세포 유형의 성장 결과가 도시되어 있다. HER2+ 또는 삼중 음성 유방암(TNBC) 환자 4명의 인간 원발성 또는 전이성(Mets) 유방암 세포(환자 유래 이종이식편 모델로부터)의 명시야 이미지가 재생된다(4x 대물렌즈 배율).
하단 줄에서, 동일한 시간 후에 실시예 5a에 따른 하이드로겔(생물활성 리간드로서 RGD 모티프 및 라미닌-111을 포함하는 비-자가분해가능한, 효소적으로 분해가능한 연질(<500 Pa) PEG 하이드로겔)이 TNBC 폐 전이성 세포 및 TNBC 원발성 세포에 대해 상단 줄의 비교 실시예 5(Matrigel®)와 유사한 성장 조건을 제공하였음을 알 수 있다.
실시예 5b에 따른 하이드로겔(RGD 모티프를 포함하지만 라미닌 생물활성 리간드는 포함하지 않는 비-자가분해가능한, 효소적으로 분해가능한 연질(<500 Pa) PEG 하이드로겔)은 TNBC 뇌 전이성 세포에 대해 비교 실시예 5(Matrigel®)와 유사한 성장 조건을 제공하였다.
실시예 5c에 따른 하이드로겔(RGD 모티프를 포함하지 않고 라미닌 생물활성 리간드를 포함하지 않는 비-자가분해가능한, 효소적으로 분해가능한 배지(>1,000 Pa) PEG 하이드로겔)은 HER2+ 피부 전이성 세포에 대해 비교 실시예 5(Matrigel®)와 유사한 성장 조건을 제공하였다.
일반적으로, TNBC 아형은 성장시키는 것이 더욱 어려웠다. 저산소 조건은 정상산소 조건보다 유방암 오가노이드 성장을 개선하였다. 또한, 사전 선택된 세포외 매트릭스 조건 하에 성장한 HER2+ 및 TNBC 세포의 형태특징은 Matrigel®에서 확립된 이전에 공개된 유방암 오가노이드의 것과 일치하였다(Sachs et al., 2018, Cell 172, 1-14).
실시예 6: 전립선암 세포의 테스트
상업적으로 이용가능한 건강한 1차 전립선 세포뿐만 아니라 PDX 세포로부터의 전립선암 세포를 다양한 상이한 세포외 매트릭스 조건 내에서 캡슐화하였다.
비-자가분해가능한 하이드로겔을 제공하기 위한 하이드로겔 전구체 분자로서 PEG를 사용하였다. 가교결합제로서, 특히 RGD 부착 모티프의 존재 또는 부재 및 MMP-민감성 모티프의 존재 또는 부재와 관련하여 아미노산 서열이 다양한, 적어도 2개, 바람직하게는 2개의 시스테인 모이어티를 함유하는 펩티드를 사용하였다.
일부 하이드로겔에 대해 이루어진 추가 변형은 RGD 부착 모티프를 포함하는 생물활성 리간드 및/또는 천연 라미닌, 예를 들어 라미닌-111, 재조합 라미닌 이소형 및 이들의 생체기능성 단편으로 이루어진 군에서 선택된 리간드의 부착이었다. 적합한 재조합 라미닌 이소형의 예는 라미닌-111, 라미닌-211, 라미닌-332, 라미닌-411, 라미닌-511 또는 라미닌-521이다. 상기 사전 선택된 특징들이 다양한 하이드로겔의 어레이는 상기 설명한 방법에 의해 확립하였다.
하이드로겔의 기계적 특성도 다양하였다(경질(2,000-3,000 Pa), 중간정도(1,000-2,000 Pa) 또는 연질(50-1,000 Pa) 겔).
각종 상이한 공지된, 통상적으로 사용되는 및/또는 상업적으로 이용가능한 배양 배지를 사용하였다. 바람직하게는, 상기 배양 배지는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제의 존재를 특징으로 한다. 바람직한 실시양태에 따르면, 문헌[Drost et al. (Nature Protocol 11, 347-358, January 2016)] 또는 문헌[Beshiri et al. (Clinical Cancer Research 24, 4332-4345), May 2018)]으로부터 개조된 배양 배지를 사용할 수 있다. 바람직한 배양 배지는 글루타민, BSA, 트랜스퍼린, 노긴, 섬유아세포 성장 인자 2 또는 염기성, 및 FGF 10[FGF2 또는 FGF-염기성 및 FGF10], EGF, R-스폰딘-조정 배지, 페니실린/스트렙토마이신, 글루타티온, 임의로 N-아세틸-L-시스테인, 니코틴아미드, DHT(디하이드로테스토스테론), 인슐린, 프로스타글란딘 E2, A83-01, SB202190(p38-억제제), Y-27632(rock 억제제) 및 HEPES가 보충된 AdDMEM/F12 배지를 포함한다.
결과는 도 6a 및 6b에 도시되어 있다. 실시예 6a 및 6b의 하이드로겔은 효소적으로 분해가능한 연질 하이드로겔이었다. 실시예 6a는 RGD 모티프를 포함하지 않는 하이드로겔이다. 실시예 6b는 RGD 모티프를 포함하는 하이드로겔이다.
정상(건강한) 세포는 생물활성 펩티드 RGD를 함유하는 세포외 매트릭스에서만 성장하고 있는 것으로 밝혀졌다(도 6a, 실시예 6b). 또한, 건강한 세포의 성장은 RGD를 갖는 연질 겔과 비교하여 RGD를 함유하는 중간정도 겔에서 덜 현저하였다. 한편, 실시예 6a(RGD 없음)와 실시예 6b(RGD 있음) 둘 다에서 전립선암 세포가 성장하였다(도 6b).
이와 대조적으로, 천연 유래 매트릭스 Matrigel®을 사용한 비교 실시예에서는 어느 배양 배지에서도 건강한 전립선 세포와 전립선암 세포의 성장 분화가 달성되지 않았다(도 6a 및 6b).

Claims (20)

  1. 임의로 간질 세포 또는 면역 세포와 같은 다른 세포와 조합된 하나의 조직 유형을 이용하여 수행되는 방법으로서,
    a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스(extracellular matrix) 조건을 생성하기 위해, 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 존재 하에, 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자의 상이한 조합, 임의로 적어도 1종의 가교결합제 및 테스트될 조직 유형의 세포를, 기판 상으로 또는 기판, 바람직하게는 다중웰 플레이트의 이산 용적(discrete volume) 내로 가교결합시켜, 이산 용적을 갖는 완전 한정된 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제공하는 단계;
    b) 상기 세포를 하나 이상의 상이한 배양 배지의 존재 하에 상기 하이드로겔 매트릭스 어레이의 상기 이산 용적에서 성장하고 증대되도록 하는 단계;
    c) 상기 하이드로겔 매트릭스 어레이의 상기 이산 용적에서 성장한 세포를 이용하여 작업을 수행하는 단계
    를 포함하고, 하이드로겔 특징의 특정 조합이 테스트될 상기 하나의 조직 유형에 대해 사전 선택된 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔 전구체 분자 또는 상기 하이드로겔 특징 중 적어도 하나 및 상기 배양 배지의 사전 선택은, 무작위 세포외 매트릭스 조건을 사용하는 방법으로부터 적합한 세포외 매트릭스 조건을 선택하는 것에 기초하여 이루어지는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조직 유형은 암 세포 및 정상/건강한 세포로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간의 생검 또는 조직 절편 또는 환자 유래 이종이식편(PDX) 조직으로부터 갓 단리되거나 동결된 세포가 사용되는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 1종 이상의 약물이 상기 하이드로겔 매트릭스의 상기 이산 용적에 첨가되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 유형은 c-Met를 과발현하는 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포이고, 하이드로겔 매트릭스가 비-자가분해가능한 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되고, 가교결합제 및 상기 임의적 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 배양 배지는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 유형은 췌장관 선암종(PDAC) 세포이고, 하이드로겔 매트릭스는 50 내지 3,000 Pa, 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 및 가장 바람직하게는 50 내지 1,000 Pa 범위의 강성을 갖는 비-자가분해가능한 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되고, 가교결합제 중 적어도 1종 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 배양 배지는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 유형은 결장직장암(CRC) 세포이고, 하이드로겔 매트릭스는 적어도 50 내지 2,000 Pa 범위의 초기 강성을 갖는 PEG 하이드로겔이고, 임의로 라미닌, 바람직하게는 라미닌-111 또는 라미닌-511 및 특히 바람직하게는 천연 마우스 라미닌-111 또는 재조합 인간 라미닌-511을 포함하는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 추가로 포함하는 것으로 사전 선택되고, 가교결합제 중 적어도 1종 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 배양 배지는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 유형은 유방암 세포이고, 하이드로겔 매트릭스는 바람직하게는 효소-분해가능한 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되고, 가교결합제 중 적어도 1종은 바람직하게는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함하며, 상기 하이드로겔은 임의로 라미닌, 바람직하게는 라미닌-111 및 특히 바람직하게는 천연 마우스 라미닌-111을 포함하는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 배양 배지는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 유형은 정상 대응물보다 생체외에서 더 느리게 성장하는 암 세포, 바람직하게는 전립선암 세포이고, 하이드로겔 매트릭스는 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 범위의 강성을 갖는 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되고, 상기 가교결합제 및 상기 임의적 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는 방법.
  15. 하나 이상의 조직 유형에서의 작업 또는 하나 이상의 조직 유형을 이용한 작업을 수행하기 위한 부품 키트(kit of parts)로서,
    a) 생물학적, 생물물리학적 및/또는 생화학적 특성이 서로 상이한 완전 한정된 3차원 세포외 매트릭스 조건을 생성하기 위해, 완전 한정된 하이드로겔 매트릭스 어레이를 제조하기 위한 구성요소로서,
    상기 구성요소는
    - 하나 이상의 상이한 하이드로겔 전구체 분자,
    - 임의로 적어도 1종의 가교결합제,
    - 임의로 하나 이상의 생물학적 활성 분자
    를 포함하는 구성 요소,
    b) 하나 이상의 상이한 배양 배지
    를 포함하고, 하이드로겔 특징의 특정 조합이 테스트될 조직 유형에 대해 사전 선택된 키트.
  16. 제15항에 있어서, c-Met를 과발현하는 폐암 세포, 바람직하게는 비소세포 폐암 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 것이며, 하이드로겔 매트릭스는 비-자가분해가능한 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되고, 가교결합제 및 상기 임의적 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않고, 바람직하게는 상기 배양 배지는 FBS(혈청) 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는 키트.
  17. 제15항에 있어서, 췌장관 선암종(PDAC) 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 것이며, 하이드로겔 매트릭스는 50 내지 3,000 Pa, 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 및 가장 바람직하게는 50 내지 1,000 Pa 범위의 강성을 갖는 비-자가분해가능한 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되고, 가교결합제 중 적어도 1종 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하고, 바람직하게는 상기 배양 배지가 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함하는 키트.
  18. 제15항에 있어서, 결장직장암(CRC) 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 것이며, 하이드로겔 매트릭스는 적어도 50 내지 2,000 Pa 범위의 초기 강성을 갖는 PEG 하이드로겔이고, 임의로 라미닌, 바람직하게는 라미닌-111 또는 라미닌-511 및 특히 바람직하게는 천연 마우스 라미닌-111 또는 재조합 인간 라미닌-511을 포함하는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 추가로 포함하는 것으로 사전 선택되고, 가교결합제 중 적어도 1종 및/또는 상기 임의적 생물활성제는 RGD 모티프를 포함하고, 바람직하게는 상기 배양 배지는 R-스폰딘 및 Wnt 3a와 같은 Wnt 효능제를 포함하는 키트.
  19. 제15항에 있어서, 유방암 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 것이며, 하이드로겔 매트릭스는 바람직하게는 효소-분해가능한 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되고, 가교결합제 중 적어도 1종은 바람직하게는 효소적으로 분해가능한 모티프, 바람직하게는 MMP-민감성 모티프를 포함하며, 상기 하이드로겔은 임의로 라미닌, 바람직하게는 라미닌-111 및 특히 바람직하게는 천연 마우스 라미닌-111을 포함하는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 추가로 포함하고, 바람직하게는 상기 배양 배지는 FBS(혈청), 또는 R-스폰딘과 같은 Wnt 효능제를 포함하는 키트.
  20. 제15항에 있어서, 정상 대응물보다 생체외에서 더 느리게 성장하는 암 세포, 바람직하게는 전립선암 세포에 미치는 약물의 영향을 테스트하기 위한 것이며, 하이드로겔 매트릭스는 바람직하게는 50 내지 2,000 Pa 범위의 강성을 갖는 PEG 하이드로겔인 것으로 사전 선택되고, 상기 가교결합제 및 상기 임의적 생물활성제는 임의의 RGD 모티프를 포함하지 않는 키트.
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