CN113754686B

CN113754686B - 一种生物素标记苦参碱探针的合成方法

Info

Publication number: CN113754686B
Application number: CN202111188636.XA
Authority: CN
Inventors: 孙娜; 李宏全; 郭冬冬; 凌小雅; 孙盼盼; 孙耀贵; 范阔海; 尹伟
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2021-10-12
Filing date: 2021-10-12
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2041-10-12
Also published as: CN113754686A

Abstract

本发明公开了一种生物素标记苦参碱探针的合成方法，步骤为：将苦参碱与氢氧化钾溶于水中与Boc2O反应得化合物1；将生物素与1‑氨基‑6叔丁氧基氨基己烷溶于DMF中，加入EDCI和DMAP，得化合物2；将化合物2溶于二氯甲烷，冰浴下加入TFA，得化合物3；将化合物1和化合物3溶于DMF，加入EDCI和DMAP，得化合物4；将化合物4溶于二氯甲烷中，加入TFA，得生物素标记苦参碱探针。本发明探针合成过程中，本发明通过HPLC反相制备柱纯化分离提纯，提高了中间产物纯度；由于终产物极性较大，常规手段难易纯化，本发明通过使用HPLC反相柱分离纯化，提高了终产物的纯度。

Description

一种生物素标记苦参碱探针的合成方法

技术领域

本发明涉及化学合成技术领域，具体的说涉及一种生物素标记苦参碱探针的合成方法。

背景技术

小分子药物直接作用靶点的发现及鉴定是目前亟待解决的一个关键问题。寻找小分子药物作用靶点最常用的方法是化学蛋白组学技术，它是以生物素标记的小分子药物探针为工具和手段对其作用靶点蛋白进行标记，利用生物素和亲和素之间的高亲和力进行靶蛋白的分离纯化，并通过质谱技术进行靶蛋白的鉴定。

因此，提供一种合成的苦参碱生物素标记探针，为其后续苦参碱作用靶点的发现提供技术支撑是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种生物素标记苦参碱探针的合成方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种生物素标记苦参碱探针的合成方法，包括以下步骤：

(1)将苦参碱与氢氧化钾溶于水中，105℃加热回流10～12h，自然冷却至室温，加入Boc₂O，搅拌12h；旋蒸浓缩去除水得到固体，用甲醇和二氯甲烷清洗所得固体，将清洗液浓缩得到油状粗产品；用反相柱纯化得到化合物1；合成路线为：

(2)将生物素与1-氨基-6叔丁氧基氨基己烷溶于DMF中，加入EDCI和DMAP，室温搅拌10～12h，加入乙酸乙酯后，分别用饱和食盐水和稀盐酸清洗，然后无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸浓缩得到化合物2；

合成路线为：

(3)将化合物2溶于二氯甲烷，冰浴下加入TFA，室温搅拌1h，浓缩得到化合物3；

合成路线为：

(4)将化合物1和化合物3溶于DMF，冰浴下加入EDCI和DMAP，室温搅拌反应10-12h，将反应液倒入甲基叔丁基醚中析出白色固体，过滤得到化合物4；

合成路线为：

(5)将化合物4溶于二氯甲烷中，冰浴下加入TFA，室温搅拌10-12h，旋蒸浓缩得到粗产品，用反相柱纯化粗产品(以乙腈、水、TFA混合液作为溶剂，乙腈体积分数为5-30％，TFA体积分数为0.1％，流速为20mL/min)得到白色固体，即为生物素标记苦参碱探针。

合成路线为：

进一步，步骤(1)中所述苦参碱与氢氧化钾的摩尔比为1:2；

所述苦参碱与Boc₂O的摩尔比为1:1.125；

所述甲醇和二氯甲烷的体积比为1:10；

所述苦参碱的摩尔质量与水的体积比为1:5(mmol：mL)。

更进一步，步骤(1)中所述加热回流温度为105℃，加热回流时间为10-12h；

所述反相柱纯化条件为以乙腈、水、甲酸混合液作为溶剂，乙腈体积分数为5-60％，甲酸体积分数为0.1％，流速为60ml/min。

采用上述进一步方案的有益效果在于：在碱性条件下，苦参碱的酰胺键水解开环，Boc(叔丁氧羰基)保护氨基，其游离的羧基通过链接子己二胺进行生物素标记构建探针。

进一步，步骤(2)中所述生物素与1-氨基-6叔丁氧基氨基己烷的摩尔比为1:1；

所述生物素与EDCI的摩尔比为1:1；

所述生物素与DMAP的摩尔比为1:0.1；

所述生物素的摩尔质量与DMF的体积比为1:5(mmol：mL)；

所述DMF与乙酸乙酯的体积比为1:10；

更进一步，步骤(2)中所述加入乙酸乙酯后用饱和食盐水和稀盐酸清洗3次；

所述稀盐酸的浓度为0.5mol/L。

采用上述进一步方案的有益效果在于：生物素通过与一端氨基Boc保护的己二胺酰胺化反应连接后，避免了乙二胺与生物素反应时两端氨基都连接生物素。

进一步，步骤(3)中所述化合物2的摩尔质量与TFA的体积的比为2:3(mmol：mL)；

所述化合物2的摩尔质量与l二氯甲烷的体积的比1:10(mmol：mL)；

进一步，步骤(4)中所述化合物1与化合物3的摩尔比为0.68:1；

所述化合物3与EDCI的摩尔比为1:1；

所述化合物3与DMAP的摩尔比为1:0.1；

所述化合物3的摩尔质量与DMF的体积比为1:5(mmol：mL)；

所述DMF与甲基叔丁基醚的体积比为1:10；

采用上述进一步方案的有益效果在于：一端氨基Boc保护的己二胺与生物素连接后，再脱Boc，与Boc保护氨基的开环苦参碱形成酰胺。

进一步，步骤(5)中所述化合物4的质量与TFA的体积的比为275:1(mg：mL)；

所述化合物4的质量与l二氯甲烷的体积的比275:10(mg：mL)；

更进一步，步骤(5)中以乙腈、水、TFA混合液作为溶剂，乙腈体积分数为5-30％，TFA体积分数为0.1％，流速为20mL/min。

采用上述进一步方案的有益效果在于：通过在TFA条件下，脱去氨基保护基，同时TFA与探针成盐，增加探针稳定性，提高了产物纯度；由于终产物极性较大，常规手段难易纯化，本发明通过使用反相柱制备分离，提高了产物的纯度。

本发明的有益效果在于：本通过通过将苦参碱水解开环，其游离的羧基通过链接子己二胺进行生物素标记构建探针。在此过程中，苦参碱开环后氨基需要Boc(叔丁氧羰)保护，最后通过己二胺将开环苦参碱与生物素通过酰胺化反应连接后，氨基再脱保护。在己二胺通过酰胺化反应与生物素进行连接时，采用一端氨基Boc保护的己二胺，避免了乙二胺与生物素反应时两端氨基都连接生物素。一端氨基Boc保护的己二胺与生物素连接后，再脱Boc，与开环苦参碱反应。在本发明探针合成过程中，尽管中间体与产物纯化较为困难，但本发明通过反相柱子纯化分离提纯，提高了中间产物纯度；由于终产物极性较大，常规手段难易纯化，本发明通过反相柱分离，提高了终产物的纯度。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的探针的¹HNMR图；

图2为本发明实施例1制备的探针的¹³CNMR

图3为本发明实施例1制备的探针的红外光谱

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明实施例中：

苦参碱(批号：110805-200508)购自中国食品药品检定研究所，纯度为99％。

生物素(Biotin)、1-氨基-6叔丁氧基氨基己烷、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和对二甲氨基吡啶(DMAP)购买于上海毕得医药科技有限公司。

氢氧化钾、Boc2O酸酐、三氟乙酸(TFA)和N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)购买于上海泰坦科技有限公司。

实施例1

(1)将苦参碱(1g，4mmol)与氢氧化钾(0.45g，8mmol)溶于10mL水中，105℃加热回流12h，冷却至室温，加入Boc2O(0.98g，4.5mmol)，搅拌12h；旋蒸浓缩去除水得到固体，用甲醇和二氯甲烷(1:10)清洗固体，旋蒸浓缩得到油状粗产品；用反相柱子纯化(以乙腈、水、甲酸混合液作为溶剂，乙腈体积分数为5-60％，甲酸体积分数为0.1％，流速为60ml/min)得到化合物1，500mg纯产物，产率：34％。

IR(KBr)ν:3436,2936,1677,1591,1400,1366,1252,618cm-1；MS(EI)m/z:368.3。

(2)将生物素(488mg，2mmol)与1-氨基-6叔丁氧基氨基己烷(432mg，2mmol)溶于10mLDMF，加入EDCI(384mg，2mmol)和DMAP(23mg，0.2mmol)，室温搅拌12h，加入100mL乙酸乙酯，用饱和食盐水和稀盐酸(0.5M)洗三遍，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸浓缩得到化合物2，880mg。产率：99％。

IR(KBr)ν:3389,3269,2934,1694,1520,1482,1250,1178cm-1；MS(EI)m/z:443.3。

(3)将化合物2(880mg，2mmol)溶于20mL二氯甲烷，冰浴下加入3mLTFA，室温搅拌1h，旋蒸浓缩得到化合物3，680mg。

IR(KBr)ν:3377,2940,1682,1178,780,723cm-1；MS(EI)m/z:343.2。

(4)将化合物1(500mg，1.36mmol)，化合物3(680mg，2mmol)溶于10mL DMF，冰浴下加入EDCI(384mg，2mmol)和DMAP(23mg，0.2mmol)，室温搅拌12h。将反应液倒入100mL甲基叔丁基醚中析出白色固体，过滤得到化合物4，550mg。

IR(KBr)ν:3291,2939,1702,1640,1538,1464,1385,1264,1162,693cm-1；MS(EI)m/z:346.3。

(5)将化合物4(550mg)溶于20mL二氯甲烷中，冰浴下加入TFA(2mL)，室温搅拌12h，旋蒸浓缩得到粗产品，经反相柱纯化(以乙腈、水、TFA混合液作为溶剂，乙腈体积分数为5-30％，TFA体积分数为0.1％，流速为20mL/min)得到白色固体探针1，160mg，为生物素标记苦参碱探针。

¹HNMR(400MHz,MeOD)δ4.50(dd,J＝7.7,4.8Hz,1H),4.31(dd,J＝7.8,4.4Hz,1H),3.73–3.61(m,1H),3.50(t,J＝13.3Hz,1H),3.30–3.10(m,8H),3.06(s,1H),2.93(dd,J＝12.8,4.9Hz,1H),2.74–2.54(m,3H),2.28(t,J＝6.6Hz,3H),2.20(t,J＝7.3Hz,2H),2.12–1.96(m,2H),1.91–1.58(m,14H),1.54–1.40(m,6H),1.33(t,J＝14.8Hz,5H)；

¹³CNMR(100MHz,MeOD)δ175.96,175.03,63.41,62.94,61.62,57.19,57.16,57.04,53.42,44.15,41.08,40.31,40.15,38.58,36.83,35.79,33.61,30.72,30.29,29.77,29.55,27.56,27.52,27.00,26.45,25.46,21.08,20.48,20.26；

IR(KBr)ν:3431,2937,1682,1465,1203,1134,722cm-1；MS(EI)m/z:296.2。

对终产物结构进行红外光谱、¹HNMR、¹³CNMR和LCMS表征。从红外光谱图中可以看出3430.12cm^-1为探针1氨基的吸收峰、1682.13cm^-1为探针1酰胺C＝O的吸收峰。从¹HNMR中可看到己二胺(例如1.73ppm处烷基链亚甲基氢质子峰)、开环苦参碱(例如1.73ppm处烷基链亚甲基氢质子峰)及生物素(例如4.31ppm与4.50ppm处对应生物素杂环上两个CH的质子峰)的特征信号峰，HNMR中49个氢质子也与产物C₃₁H₅₄N₆O₃S分子式吻合(5个氨基活泼氢未检出)。在CNMR中低场区化学位移165ppm的1个碳原子对应生物素的羰基碳，173-175ppm的2个碳原子则分别归属于目标化合物中己二胺与生物素和开环苦参碱连接的酰胺碳，高场区对应结构中其它化学位置的烷基碳。LCMS测试显示，214nm波长处检出样品含量为96.89％，质谱出峰296.2与591.4分别对应[M/2+H]和[M+H]，为目标化合物的成功合成提供了直接证据。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。