CN113105430B - 含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物和其盐类化合物、其制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物，如式(I)或式(II)所示；其中，R1～R9各自独立地选自H或C1～C5的烷基；X1与X2各自独立地选自C1～C5的亚烷基或二价杂原子。与现有技术相比，本发明提供的含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物可用作氨基酸基元，融合到多肽及蛋白质中，与含有1,2,4‑三氮嗪互补基团的探针进行快速生物连接和标记，并且该非天然氨基酸化合物不仅脂溶性高、生物相容性好，同时还含有亚胺砜环庚炔杂环性能稳定，不易与生物体内的水分子、氨基和巯基类分子进行亲核副反应，从而有利于生物正交反应，便于生物活体监测。

Description

含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物和其盐类化合 物、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于化学生物学非天然手性氨基酸技术领域，尤其涉及含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物和其盐类化合物、其制备方法及用途。
背景技术
天然手性氨基酸是构建多肽和蛋白质的基本结构单元，但用天然手性氨基酸构建的多肽和蛋白质也存在一些问题，例如容易被体内的蛋白酶降解，不易通过血脑屏障，半衰期短的缺点，另外也存在定点修饰困难的问题。因此可通过在一个生物活性肽链上或蛋白质中引入合适的非天然手性氨基酸以加强其抗降解能力，或者提高其与受体的亲和力及生物利用度，也可以将非天然手性氨基酸引入到多肽或蛋白质中，对其进行定点修饰来研究生物学活性。
但非天然手性氨基酸无法从自然界中获得，必须依赖人工合成。化学生物学家已经发展了两百多种具有不同生理功能的可编码非天然手性氨基酸，其中类似于赖氨酸的非天然手性氨基酸就有二十多种(L.Wang,P.G.Schultz,Angew.Chem.Int.Ed.2005,44,34–66；陈鹏等，Acta Chim.Sin.2012,70,1439–1445；刘涛等，Sci.Sin.Chem.2018,48,1394–1406；沈玥等，Synth.Bio.J.2020,1,103–119)。尽管如此，结合生物多样性，发展新的非天然手性氨基酸仍然具有非常重要的意义。
最近美国J.A.Prescher、英国M.E.Webb、捷克M.Vrabel与本课题组利用1,2,4-三氮嗪与反式-环辛烯或硫代环庚炔类化合物的反电子需求狄尔斯-阿尔德环加成反应(Inverse Electron-Demand Diels-Alder Cycloaddition，IEDDA)，发展新的生物正交连接(J.A.Prescher,et al.,J.Am.Chem.Soc.2015,137,8388-8391&M.E.Webb,et al.,Chem.Eur.J.2015,21,14376–14381&M.Vrabel,et al.,Chem.Sci.2017,8,3593–3598&J.A.Prescher,et al.,Chem.Sci.2019,10,9109–9114&J,-A.Ma et al.,ACS Catal.2019,9,4600–4608)，尤其发现硫代环庚炔类化合物可与1,2,4-三氮嗪快速反应，而不与3,6-二芳基取代的四氮嗪反应。但这些文献里面大多都是将1,2,4-三氮嗪衍生为非天然手性氨基酸，用反式-环辛烯或硫代环庚炔类化合物作为互补基团的探针。反之，以1,2,4-三氮嗪作为互补基团的探针，就迫切需要设计合成新型含有硫代环庚炔的非天然手性氨基酸。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物和其盐类化合物、其制备方法及用途，该含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物可用作氨基酸基元融合到多肽及蛋白质中，与含有1,2,4-三氮嗪互补基团的探针进行快速生物连接和标记。
本发明提供了一种含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物，如式(I)或式(II)所示：
Figure BDA0003018562790000021
其中，R1～R9各自独立地选自H或C1～C5的烷基；
X1与X2各自独立地选自C1～C5的亚烷基或二价杂原子。
优选的，R1～R9各自独立地选自H或C1～C3的烷基；X1与X2各自独立地选自C1～C3的亚烷基、O、S或Se。
优选的，R1～R9均为甲基；X1与X2各自独立地选自亚甲基、O、S或Se。
本发明还提供了一种含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物的制备方法，包括：
将氨基保护的式(III)所示的手性氨基酸与式(IV)所示的N-琥珀酰亚胺基-酰亚胺砜环庚炔进行酯酰胺交换反应，氨基脱保护后，得到式(I)所示的含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物；
或将氨基保护的式(III)所示的手性氨基酸与式(V)所示的N-琥珀酰亚胺基碳酸二酯亚胺砜环庚炔进行酰胺化反应，氨基脱保护后，得到式(II)所示的含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物；
Figure BDA0003018562790000031
其中，R1～R9各自独立地选自H或C1～C5的烷基；R10为氨基保护基团；
X1与X2各自独立地选自C1～C5的亚烷基或二价杂原子。
优选的，所述式(V)所示的N-琥珀酰亚胺基碳酸二酯亚胺砜环庚炔按照以下方法制备：
S1)将式(VI)所示的化合物在催化剂的作用下与羟甲基化试剂反应，得到式(VII)所示的化合物；
S2)将所述式(VII)所示的化合物与N，N'-双琥珀酰亚胺基碳酸酯反应，得到式(V)所示的N-琥珀酰亚胺基碳酸二酯亚胺砜环庚炔；
Figure BDA0003018562790000032
优选的，所述步骤S1)中催化剂选自双(三甲硅基)氨基锂和/双(三甲硅基)氨基钠；羟甲基化试剂选自多聚甲醛和/或环六亚甲基四胺；
所述步骤S2)中反应在缚酸剂存在的条件下进行；所述缚酸剂选自三乙胺、二异丙基乙基胺、三乙烯基二胺、吡啶与4-二甲氨基吡啶中的一种或多种。
优选的，所述酯酰胺交换反应与酰胺化反应各自独立地在乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、1,4-二氧六环、氯仿、二氯甲烷与二氯乙烷中的一种或多种中进行；
所述氨基保护基团选自9-芴甲氧羰基、叔丁氧羰基(Boc)或苄氧羰基。
本发明还提供了上述的非天然手性氨基酸化合物的盐类化合物。
本发明还提供了上述的非天然手性氨基酸化合物的盐类化合物作为生物正交反应的功能基团的应用。
优选的，所述生物正交反应的标记物包含1，2，4-三氮嗪基团。
本发明提供了一种含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物，如式(I)或式(II)所示；其中，R1～R9各自独立地选自H或C1～C5的烷基；X1与X2各自独立地选自C1～C5的亚烷基或二价杂原子。与现有技术相比，本发明提供的含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物可用作氨基酸基元，融合到多肽及蛋白质中，与含有1,2,4-三氮嗪互补基团的探针进行快速生物连接和标记，并且该非天然氨基酸化合物含有亚胺砜环庚炔杂环性能稳定，不易与生物体内的水分子、氨基和巯基类分子进行亲核副反应，从而有利于生物正交反应，便于生物活体监测。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物，如式(I)或式(II)所示：
Figure BDA0003018562790000051
其中，R1～R9各自独立地为H或C1～C5的烷基，优选为H或C1～C3的烷基，更优选为H或C1～C2的烷基，再优选均为甲基。
X1与X2各自独立地为C1～C5的亚烷基或二价杂原子，优选为C1～C3的亚烷基、O、S或Se，更优选为C1～C2的亚烷基、O、S或Se，再优选为亚甲基、O、S或Se。
最优选地，本发明提供的含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物为式(1)～式(8)所示的一种或多种：
Figure BDA0003018562790000052
本发明提供的含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物可用作氨基酸基元，融合到多肽及蛋白质中，与含有1,2,4-三氮嗪互补基团的探针进行快速生物连接和标记，并且该非天然氨基酸化合物不仅脂溶性高、生物相容性好，同时还含有亚胺砜环庚炔杂环性能稳定，不易与生物体内的水分子、氨基和巯基类分子进行亲核副反应，从而有利于生物正交反应，便于生物活体监测。
本发明还提供了一种上述含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物的制备方法，包括：将氨基保护的式(III)所示的手性氨基酸与式(IV)所示的N-琥珀酰亚胺基-酰亚胺砜环庚炔进行酯酰胺交换反应，氨基脱保护后，得到式(I)所示的含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物。
其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。
将氨基保护的式(III)所示的手性氨基酸与式(IV)所述的N-琥珀酰亚胺基-酰亚胺砜环庚炔进行酯酰胺交换反应；所述氨基保护的式(III)所示的手性氨基酸与式(IV)所述的N-琥珀酰亚胺基-酰亚胺砜环庚炔的摩尔比优选为(2～4)：1，更优选为(2.5～3.5)：1，再优选为3：1；所述酯酰胺交换反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂优选为乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、1,4-二氧六环、氯仿、二氯甲烷与二氯乙烷中的一种或多种；反应体系中N-琥珀酰亚胺基-酰亚胺砜环庚炔的浓度优选为0.01～0.1mmol/mL，更优选为0.02～0.07mmol/mL，再优选为0.03～0.05mmol/mL；所述酯酰胺交换反应优选在保护气氛中进行；所述保护气氛为本领域技术人员熟知的保护气氛即可，并无特殊的限制，本发明中优选为氮气；所述酯酰胺交换反应优选在室温下进行；反应的时间优选为2～8h，更优选为4～6h；反应结束后经硅胶柱层析分离后，得到中间体；所述硅胶柱层析所用的流动相优选为乙酸乙酯与甲醇；所述乙酸乙酯与甲醇的体积比优选为1：1。
将所述中间体进行氨基脱保护；所述脱保护的方法根据氨基保护基团的种类进行选择；在本发明中，所述氨基保护基团优选为9-芴甲氧羰基；所述脱保护所选用的环状二级胺选自哌啶、吗啉或哌嗪。
氨基脱保护后，优选过滤，用氯仿甲醇混合溶液洗涤，合并洗液，将洗液脱出溶剂后，溶于水中，用乙酸乙酯洗涤后，将水溶液减压浓缩，冷冻干燥；得到式(I)所示的含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物；所述氯仿甲醇混合溶液中氯仿与甲醇的体积比优选为3：1。
具体地，以R1～R9均为甲基为例，式(I)所示的非天然手性氨基酸化合物的合成反应式如下：
Figure BDA0003018562790000071
或将氨基保护的式(III)所示的手性氨基酸与式(V)所示的N-琥珀酰亚胺基碳酸二酯亚胺砜环庚炔进行酰胺化反应，脱保护后，得到式(II)所示的含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物。
其中，所述式(V)所示的N-琥珀酰亚胺基碳酸二酯亚胺砜环庚炔优选按照以下方法制备：S1)将式(VI)所示的化合物在催化剂的作用下与羟甲基化试剂反应，得到式(VII)所示的化合物；S2)将所述式(VII)所示的化合物与N，N'-双琥珀酰亚胺基碳酸酯反应，得到式(V)所示的N-琥珀酰亚胺基碳酸二酯亚胺砜环庚炔。
将式(VI)所示的化合物在催化剂的作用下与羟甲基化试剂反应；所述催化剂优选为碱性催化剂，更优选为有机胺类催化剂，再优选为双(三甲硅基)氨基锂和/或双(三甲硅基)氨基钠；所述羟甲基化试剂优选为多聚甲醛和/或环六亚甲基四胺；所述式(IV)所示的化合物与催化剂的摩尔比优选为1：(1～1.5)，更优选为1：1.2；所述式(IV)所示的化合物与羟甲基化试剂的摩尔比优选为1：(5～15)，更优选为1：(8～12)，再优选为1：10；所述反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂优选为四氢呋喃；在本发明中，优选先将式(IV)所示的化合物、催化剂与有机溶剂混合搅拌后，再加入羟甲基化试剂进行反应；所述混合搅拌的时间优选为10～30min，更优选为10～20min，再优选为15min；所述反应优选在保护气氛中进行；所述保护气氛优选为氩气；所述反应的时间优选为20～30h，更优选为22～26h，再优选为24h。
反应结束后，优选冷却至0℃下加入水淬灭反应，然后用乙醚萃取，干燥除去溶剂后，硅胶柱层析分离，得到式(VII)所示的化合物；所述层析分离所用的溶剂优选为石油醚与乙酸乙酯；所述石油醚与乙酸乙酯的体积比优选为5:1到1:1。
将所述式(VII)所示的化合物与N，N'-双琥珀酰亚胺基碳酸酯反应；所述式(VII)所示的化合物与N，N'-双琥珀酰亚胺基碳酸酯的摩尔比优选为1：(1～2)，更优选为1：(1.2～1.8)，再优选为1：1.5；该反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂优选为乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、1,4-二氧六环、氯仿、二氯甲烷与二氯乙烷中的一种或多种；该反应优选在缚酸剂存在的条件下进行；所述缚酸剂优选为三乙胺、二异丙基乙基胺、三乙烯基二胺(DABCO)、吡啶与4-二甲氨基吡啶(DMAP)中的一种或多种；所述式(VII)所示的化合物与缚酸剂的摩尔比优选为1：(3～8)，更优选为1：(4～6)；在本发明中，优选先将式(VII)所示的化合物、缚酸剂与有机溶剂混合，冷却至0℃后加入N，N'-双琥珀酰亚胺基碳酸酯，然后在室温下反应；所述反应的时间优选为2～8h，再优选为4～6h。
反应结束后，除去溶剂，经硅胶柱层析分离，得到式(V)所示的N-琥珀酰亚胺基碳酸二酯亚胺砜环庚炔；所述硅胶柱层析分离所用的溶剂优选为石油醚与乙酸乙酯；所述石油醚与乙酸乙酯的体积比优选为10:1到4:1。
具体地，以R1～R9均为甲基为例，所述式(V)所述化合物的合成反应式如下：
Figure BDA0003018562790000081
将氨基保护的式(III)所示的手性氨基酸与式(V)所示的N-琥珀酰亚胺基碳酸二酯亚胺砜环庚炔进行酰胺化反应；所述氨基保护的式(III)所示的手性氨基酸与式(V)所示的N-琥珀酰亚胺基碳酸二酯亚胺砜环庚炔的摩尔比优选为(1～2)：1，更优选为(1.3～1.8)：1，再优选为1.5：1；所述酰胺化反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂优选为乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、1,4-二氧六环、氯仿、二氯甲烷与二氯乙烷中的一种或多种；反应体系中式(V)所示的N-琥珀酰亚胺基碳酸二酯亚胺砜环庚炔的浓度优选为0.01～0.2mmol/mL，更优选为0.01～0.15mmol/mL，再优选为0.05～0.1mmol/mL，最优选为0.07～0.08mmol/mL；所述酰胺化反应优选在室温下反应；所述酰胺化反应的时间优选为20～30h，更优选为22～26h，再优选为24h；酰胺化反应结束后，优选加入乙醚与水，分液后将有机相用饱和食盐水洗涤后，经硅胶柱层析分离，得到中间产物；所述硅胶柱层析分离所用的溶剂优选为甲醇、二氯甲烷与乙酸；所述甲醇、二氯甲烷与乙酸的比例优选为2:10:1到1:5:1。
将所述中间体进行氨基脱保护；所述脱保护的方法根据氨基保护基团的种类进行选择；在本发明中，所述氨基保护基团优选为9-芴甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)或苄氧羰基(Cbz)；所述脱保护所选用的环状二级胺选自哌啶、吗啉或哌嗪。
氨基脱保护后，优选过滤，用氯仿甲醇混合溶液洗涤，合并洗液，将洗液脱出溶剂后，溶于水中，用乙酸乙酯洗涤后，将水溶液减压浓缩，冷冻干燥；得到式(II)所示的含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物；所述氯仿甲醇混合溶液中氯仿与甲醇的体积比优选为3：1。
具体地，以R1～R9均为甲基为例，所述式(II)所示的非天然手性氨基酸化合物的合成反应式如下：
Figure BDA0003018562790000091
Figure BDA0003018562790000101
其中，R1R1～R9各自独立地为H或C1～C5的烷基，优选为H或C1～C3的烷基，更优选为H或C1～C2的烷基，再优选均为甲基。
R10为氨基保护基团，优选为9-芴甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)或苄氧羰基(Cbz)。
X1与X2各自独立地为C1～C5的亚烷基或二价杂原子，优选为C1～C3的亚烷基、O、S或Se，更优选为C1～C2的亚烷基、O、S或Se，再优选为亚甲基、O、S或Se。
本发明还提供了一种上述非天然手性氨基酸化合物的盐类化合物；优选为式(I)或式(II)所示含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物与盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、对甲苯磺酸、酒石酸、顺丁烯二酸与反丁烯二酸中的一种或多种形成的盐酸类化合物。
相对于天然手性氨基酸，本发明制备的含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物具有以下优点：1)脂溶性高，生物相容性好；2)引入的亚胺砜环庚炔杂环相对比较稳定，与生物体内的水分子、氨基和巯基类分子不易进行亲核副反应，从而有利于生物正交反应；3)其中含有的亚胺砜环庚炔杂环与1,2,4-三氮嗪能很好地进行生物正交化学反应，便于生物活体监测。
本发明还提供了一种上述非天然手性氨基酸化合物或非天然手性氨基酸化合物的盐类化合物作为生物正交反应的功能基团的应用。本发明提供的含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物和/或含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物的盐类化合物作为氨基酸基元融合到多肽和/或蛋白质中。
所述生物正交反应的标记物包含1，2，4-三氮嗪基团，即融合到多肽和/或蛋白质中的含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物和/或含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物的盐类化合物可与含有1，2，4-三氮嗪互补基团的探针进行快速生物连接和标记，进而可分析和研究大分子动态生化过程。
在本发明中，具体地，所述包含1，2，4-三氮嗪基团的标记物为：
Figure BDA0003018562790000111
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物和其盐类化合物、其制备方法及用途进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
实施例1：N6-[3’,3’,6’,6’-四甲基-4’,5’-二脱氢-2’,3’,6’,7’-四氢-1′H-1′λ6-硫庚烷-1’-氧代-1’-亚胺甲酰]-l-赖氨酸(化合物1)
Figure BDA0003018562790000112
在氮气氛围下，将N-琥珀酰亚胺基碳酸酯-酰亚胺砜环庚炔(171mg,0.5mmol)和二氯甲烷(15mL)加入50mL反应瓶中。在室温下，向反应瓶中加入Fmoc氨基保护的l-赖氨酸(553mg,1.5mmol)，在此温度搅拌反应4小时。薄层色谱硅胶TLC检测反应完全后，减压脱除溶剂，经快速硅胶柱用乙酸乙酯和甲醇(1:1体积比)层析分离，以85％收率得到218mg中间体。
将此中间体溶解于15mL二氯甲烷中，加入负载哌嗪的聚苯乙烯(1.33g,1.33mmol,200-400mesh,extent of labeling:1.0-2.0mmol/g loading,2％cross-linked withdivinylbenzene)，室温搅拌反应6小时，薄层硅胶色谱(TLC)监测表明含有保护基的中间体完全消失。过滤，用150毫升氯仿/甲醇(3:1体积比)洗涤三次，合并滤液，减压脱除溶剂。所得粗品溶解于100毫升水中，用乙酸乙酯洗涤(3×100mL)，分液所得水溶液减压浓缩后，冷冻干燥，得到白色固体化合物1(150mg,收率95％)。
利用核磁共振对实施例1中得到的化合物1进行分析，得到1H NMR[400MHz,d6-DMSO-D2O(1/1)],δ(ppm):1.24-1.26(m,2H),1.28(s,6H),1.43(s,6H),1.50-1.53(m,2H),1.73-1.76(m,2H),3.07(d,2H),3.15-3.20(m,2H),3.30(d,2H),3.40-3.43(m,1H)；LRMS(ESI+):m/z 372([M+H]+)。
实施例2：O-{[3’,3’,6’,6’-四甲基-4’,5’-二脱氢-2’,3’,6’,7’-四氢-1’H-1′λ6-硫庚烷-1’-氧代-1’-亚胺甲酰胺]乙基}-l-丝氨酸(化合物2)
Figure BDA0003018562790000121
与实施例1类似的方法，采用Fmoc氨基保护的胺乙基l-丝氨酸与N-琥珀酰亚胺基碳酸酯-酰亚胺砜环庚炔，在乙腈溶液中反应，采用哌啶作为有机碱脱除Fmoc保护基，得到化合物2(134mg,总收率72％)。
利用核磁共振对实施例2中得到的化合物2进行分析，得到1HNMR[400MHz,d6-DMSO-D2O(1/1)],δ(ppm):1.28(s,6H),1.43(s,6H),3.09(d,2H),3.16-3.20(m,2H),3.31(d,2H),3.55-3.65(m,5H)；LRMS(ESI+):m/z 374([M+H]+)。
实施例3：S-{[3’,3’,6’,6’-四甲基-4’,5’-二脱氢-2’,3’,6’,7’-四氢-1’H-1′λ6-硫庚烷-1’-氧代-1’-亚胺甲酰胺]乙基}-l-丝氨酸(化合物3)
Figure BDA0003018562790000122
与实施例1类似的方法，采用Fmoc氨基保护的胺乙基l-半胱氨酸与N-琥珀酰亚胺基碳酸酯-酰亚胺砜环庚炔，在DMF溶液中反应，采用吗啉作为有机碱脱除Fmoc保护基，得到化合物3(132mg,总收率68％)。
利用核磁共振对实施例3中得到的化合物3进行分析，得到1HNMR[400MHz,d6-DMSO-D2O(1/1)],δ(ppm):1.28(s,6H),1.43(s,6H),2.78-2.85(m,4H),3.10(d,2H),3.15-3.20(m,2H),3.32(d,2H),3.50-3.56(m,1H)；LRMS(ESI+):m/z 390([M+H]+)。
实施例4：Se-{[3’,3’,6’,6’-四甲基-4’,5’-二脱氢-2’,3’,6’,7’-四氢-1’H-1′λ6-硫庚烷-1’-氧代-1’-亚胺甲酰胺]乙基}-l-丝氨酸(化合物4)
Figure BDA0003018562790000123
与实施例1类似的方法，采用Fmoc氨基保护的胺乙基l-硒代半胱氨酸与N-琥珀酰亚胺基碳酸酯-酰亚胺砜环庚炔，在DMF溶液中反应，采用哌嗪作为有机碱脱除Fmoc保护基，得到化合物4(175mg,总收率80％)。
利用核磁共振对实施例4中得到的化合物4进行分析，得到1HNMR[400MHz,d6-DMSO-D2O(1/1)],δ(ppm):1.28(s,6H),1.43(s,6H),1.72-1.78(m,4H),3.07(d,2H),3.14-3.19(m,2H),3.32(d,2H),3.47-3.51(m,1H)；LRMS(ESI+):m/z 438([M+H]+)。
实施例5：N6-[3’,3’,6’,6’-四甲基-4’,5’-二脱氢-2’,3’,6’,7’-四氢-1’-氧代-1’-甲亚胺-1’H-1′λ6-硫庚烷-2’-甲氧甲酰]-l-赖氨酸(化合物5)
Figure BDA0003018562790000131
在高纯氩气保护下，将3,3,6,6-四甲基-4,5-二脱氢-2,3,6,7-四氢-1’-氧代-1’-甲亚胺基-1H-1λ6-硫庚烷(VI)(213mg,1mmol)溶解于无水四氢呋喃(15mL)，室温下加入双(三甲硅基)氨基锂(LiHMDS)(1M THF,1.2mL,1.2mmol,1.2equiv.)，搅拌15分钟后，加入多聚甲醛(300mg,10mmol,10equiv.)，继续在室温下搅拌24小时，薄层硅胶色谱(TLC)监测原料完全消失。冷却至0℃下加入水(10mL)猝灭反应，将混合物转移至分液漏斗中，并用乙醚萃取(3x15mL)，合并萃取液，饱和食盐水洗涤，干燥，旋蒸脱除溶剂，粗品经快速硅胶柱用石油醚和乙酸乙酯(石油醚与乙酸乙酯的体积比为5:1到1:1)层析分离，以36％收率得到2-羟甲基-3,3,6,6-四甲基-4,5-二脱氢-2,3,6,7-四氢-1’-氧代-1’-甲亚胺基-1H-1λ6-硫庚烷(VII)(87.6mg)。
在高纯氩气保护下，将化合物(VII)(87.6mg,0.36mmol)和三乙胺(201μL,1.44mmol,4equiv.)溶于乙腈(5mL)中，冷却至0℃后加入N,N’-双琥珀酰亚胺碳酸酯(139mg,0.54mmol,1.5equiv.)，然后在室温搅拌反应4小时。旋蒸脱除溶剂，将粗产物经快速硅胶柱用石油醚和乙酸乙酯(体积比为10:1到4:1)层析分离，定量得到N-琥珀酰亚胺基碳酸二酯亚胺砜环庚炔(V)。
将该N-琥珀酰亚胺基碳酸二酯亚胺砜环庚炔(V)溶于DMF(5mL)中，加入Fmoc氨基保护的l-赖氨酸盐酸盐(219mg,0.54mmol,1.5equiv.)和二异丙基乙基胺(125μL,0.72mmol,2equiv.)，室温搅拌反应24小时。向反应混合物中加入40毫升乙醚和10毫升水，转移至分液漏斗中，分液，用饱和食盐水洗涤有机相两次，将粗产物经快速硅胶柱用甲醇/二氯甲烷/乙酸(2:10:1到1:5:1)层析分离，得到Fmoc氨基保护的非天然手性氨基酸186mg，两步收率81％。
将上述所得Fmoc氨基保护的非天然手性氨基酸186mg(0.29mmol)溶解于15mL二氯甲烷中，加入负载哌嗪的聚苯乙烯(1.16g,1.16mmol,200-400mesh,extent of labeling:1.0-2.0mmol/g loading,2％cross-linked with divinylbenzene)，室温搅拌反应5小时，薄层硅胶色谱(TLC)监测表明含有保护基的中间体完全消失。过滤，用150毫升氯仿/甲醇(3:1体积比)洗涤三次，合并滤液，减压脱除溶剂。所得粗品溶解于100毫升水中，用乙酸乙酯洗涤(3×100mL)，分液所得水溶液减压浓缩后，冷冻干燥，得到白色固体化合物5(104mg,收率86％)。
利用核磁共振对实施例5中得到的化合物5进行分析，得到1H NMR[400MHz,d6-DMSO-D2O(1/1)],δ(ppm):1.22-1.25(m,2H),1.27(s,6H),1.41(s,6H),1.49-1.52(m,2H),1.70-1.73(m,2H),2.78-2.81(m,1H),2.84(s,3H),3.16-3.20(m,2H),3.30(d,2H),3.36-3.40(m,1H),3.67-3.71(m,2H)；LRMS(ESI+):m/z416([M+H]+).
实施例6：O-{[3’,3’,6’,6’-四甲基-4’,5’-二脱氢-2’,3’,6’,7’-四氢-1’H-1′λ6-硫庚烷-1’-氧代-1’-甲亚胺-2’-甲氧甲酰胺]乙基}-l-丝氨酸(化合物6)
Figure BDA0003018562790000141
与实施例5类似的方法，采用Fmoc氨基保护的胺乙基l-丝氨酸与N-琥珀酰亚胺基碳酸酯-酰亚胺砜环庚炔，在氯仿溶液中反应，采用吗啉作为有机碱脱除Fmoc保护基，得到化合物6(109mg,收率90％)。
利用核磁共振对实施例6中得到的化合物6进行分析，得到1H NMR[400MHz,d6-DMSO-D2O(1/1)],δ(ppm):1.28(s,6H),1.43(s,6H),2.80-2.85(m,4H),3.18-3.21(m,2H),3.30(d,2H),3.60-3.70(m,7H)；LRMS(ESI+):m/z 418([M+H]+).
实施例7：S-{[3’,3’,6’,6’-四甲基-4’,5’-二脱氢-2’,3’,6’,7’-四氢-1’H-1’λ6-硫庚烷-1’-氧代-1’-甲亚胺-2’-甲氧甲酰胺]乙基}-l-丝氨酸(化合物7)
Figure BDA0003018562790000151
与实施例5类似的方法，采用Fmoc氨基保护的胺乙基l-半胱氨酸与N-琥珀酰亚胺基碳酸酯-酰亚胺砜环庚炔，在DMA溶液中反应，采用哌啶作为有机碱脱除Fmoc保护基，得到化合物7(116mg,总收率92％)。
利用核磁共振对实施例7中得到的化合物7进行分析，得到1H NMR[400MHz,d6-DMSO-D2O(1/1)],δ(ppm):1.28(s,6H),1.43(s,6H),2.70-2.77(m,5H),2.81(s,3H),3.20-3.24(m,2H),3.30(d,2H),3.60-3.65(m,3H)；LRMS(ESI+):m/z 434([M+H]+).
实施例8：Se-{[3’,3’,6’,6’-四甲基-4’,5’-二脱氢-2’,3’,6’,7’-四氢-1’H-1′λ6-硫庚烷-1’-氧代-1’-甲亚胺-2’-甲氧甲酰胺]乙基}-l-丝氨酸(化合物8)
Figure BDA0003018562790000152
与实施例5类似的方法，采用Fmoc氨基保护的胺乙基l-硒代半胱氨酸与N-琥珀酰亚胺基碳酸酯-酰亚胺砜环庚炔，在二氯乙烷溶液中反应，采用哌嗪作为有机碱脱除Fmoc保护基，得到化合物8(117mg,总收率84％)。
利用核磁共振对实施例8中得到的化合物8进行分析，得到1H NMR[400MHz,d6-DMSO-D2O(1/1)],δ(ppm):1.26(s,6H),1.40(s,6H),1.70-1.76(m,4H),2.72-2.76(m,3H),2.83(s,3H),3.30(d,2H),3.60-3.65(m,3H)；LRMS(ESI+):m/z 482([M+H]+).
生物正交连接化学试验
含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸与3-氰基-5-(4’-硝基)苯基-6-乙氧羰基-1,2,4-三氮嗪的加成-氧化反应二级动力学速率常数均用紫外(UV)-停留光谱仪(stopped-flow device)测定。将含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物在乙腈/水(1/1)中配制为四个浓度：0.05mM,0.065mM,0.075mM or 0.1mM，实验中3-氰基-5-(4’-硝基)苯基-6-乙氧羰基-1,2,4-三氮嗪与亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸的摩尔比为20/1，每组实验测定3次取平均值，测定二级动力学速率常数k2(M-1·s-1)表1所示。
表1二级动力学速率常数测定结果
Figure BDA0003018562790000161
以上表中数据说明，含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸与3-氰基-5-(4’-硝基)苯基-6-乙氧羰基-1,2,4-三氮嗪可快速发生反电子需求狄尔斯-阿尔德环加成反应(Inverse Electron-Demand Diels-Alder Cycloaddition，IEDDA)，证明这类化合物可用于生物正交连接化学试验，在化学生物学和生物成像方面有非常大的潜在应用价值。

Claims (10)

1.一种含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物，如式(I)或式(II)所示：
Figure FDA0003458196470000011
其中，R1～R9各自独立地选自H或C1～C5的烷基；
X1与X2各自独立地选自C1～C5的亚烷基或二价杂原子。
2.根据权利要求1所述的非天然手性氨基酸化合物，其特征在于，R1～R9各自独立地选自H或C1～C3的烷基；X1与X2各自独立地选自C1～C3的亚烷基、O、S或Se。
3.根据权利要求1所述的非天然手性氨基酸化合物，其特征在于，R1～R9均为甲基；X1与X2各自独立地选自亚甲基、O、S或Se。
4.一种含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物的制备方法，其特征在于，包括：
将氨基保护的式(III)所示的手性氨基酸与式(IV)所示的N-琥珀酰亚胺基-酰亚胺砜环庚炔进行酯酰胺交换反应，氨基脱保护后，得到式(I)所示的含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物；
或将氨基保护的式(III)所示的手性氨基酸与式(V)所示的N-琥珀酰亚胺基碳酸二酯亚胺砜环庚炔进行酰胺化反应，氨基脱保护后，得到式(II)所示的含有亚胺砜环庚炔的非天然手性氨基酸化合物；
Figure FDA0003458196470000012
Figure FDA0003458196470000021
其中，R1～R9各自独立地选自H或C1～C5的烷基；R10为氨基保护基团；
X、X1与X2各自独立地选自C1～C5的亚烷基或二价杂原子。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述式(V)所示的N-琥珀酰亚胺基碳酸二酯亚胺砜环庚炔按照以下方法制备：
S1)将式(VI)所示的化合物在催化剂的作用下与羟甲基化试剂反应，得到式(VII)所示的化合物；
S2)将所述式(VII)所示的化合物与N，N'-双琥珀酰亚胺基碳酸酯反应，得到式(V)所示的N-琥珀酰亚胺基碳酸二酯亚胺砜环庚炔；
Figure FDA0003458196470000022
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1)中催化剂选自双(三甲硅基)氨基锂和/双(三甲硅基)氨基钠；羟甲基化试剂选自多聚甲醛和/或环六亚甲基四胺；
所述步骤S2)中反应在缚酸剂存在的条件下进行；所述缚酸剂选自三乙胺、二异丙基乙基胺、三乙烯基二胺、吡啶与4-二甲氨基吡啶中的一种或多种。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述酯酰胺交换反应与酰胺化反应各自独立地在乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、1,4-二氧六环、氯仿、二氯甲烷与二氯乙烷中的一种或多种中进行；
所述氨基保护基团选自9-芴甲氧羰基、叔丁氧羰基或苄氧羰基。
8.权利要求1～3任意一项所述的非天然手性氨基酸化合物的盐类化合物。
9.权利要求1～3任意一项所述的非天然手性氨基酸化合物、权利要求4～7任意一项制备方法所制备的非天然手性氨基酸化合物或权利要求8所述的非天然手性氨基酸化合物的盐类化合物在制备生物正交反应的功能基团的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述生物正交反应的标记物包含1，2，4-三氮嗪基团。
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