CN113943388A - 一种改性聚合物微球、制备方法及其在固定化酶领域中的应用 - Google Patents

一种改性聚合物微球、制备方法及其在固定化酶领域中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种改性聚合物微球、制备方法及其在固定化酶领域中的应用，属于固定化酶制备技术领域，本发明分为以下步骤：第一步，通过自稳定沉淀聚合方法制备带吸电子基团的聚合物微球；第二步，在微球表面修饰有螯合配体基团；第三步，利用吸电子基团螯合过渡金属离子得到可以负载酶的改性微球材料；第四步，在微球材料表面固定化带His标签的蛋白酶。本发明用简单的振荡方法固定化酶，反应条件简单温和，同时实现了纯化和固定化过程。固定化提高了酶的相对活性和稳定性，制备得到的固定化酶结合牢靠，可进行多次酶催化反应。

Description

一种改性聚合物微球、制备方法及其在固定化酶领域中的 应用
技术领域
本发明属于固定化酶的制备技术领域，具体涉及一种改性聚合物微球、制备方法及其在固定化酶领域中的应用。
背景技术
酶是一种重要的生物催化剂，由于其底物选择性高、催化效率高、反应条件温和等优点，在食品工业、生物催化、皮革工业、生物传感器、生物柴油等领域得到了广泛的应用，但是酶制剂存在稳定性差、储存运输条件严苛、不可重复使用等缺点，限制了其在各个领域的广泛应用。酶固定化技术，在保持催化活性的同时，将游离酶固定在载体上，可以显著提高酶的稳定性。此外，固定化酶可以回收利用。因此，酶固定化在过去的几十年中得到了广泛的发展，这对酶在工业过程中应用的可行性产生了重大的经济和科学影响。传统的固定化技术可分为吸附法、包埋法、交联法和共价结合法四大类。
与其他方法相比，共价结合法将活性氨基酸残基共价连接到载体表面，能够提供稳定的固定化。这种方法需要载体上大量的可修饰基团与酶分子发生化学偶联，使得共价结合固定化的酶几乎不泄漏。因此，共价结合法制备的固定化酶具有很强的稳定性。但相关技术中，有在酶表面包覆明胶得到了碳材料固定化酶，通过光固化水凝胶制备固定化酶，通过交联剂对氨基树脂载体进行修饰从而使酶网状交联而固定化，但以上方法由于载体基团对酶活性中心的影响以及酶与载体之间的相互作用，会显著降低固定化酶的催化活性，而且这些方法对酶的种类选择都有局限性。
发明内容
为解决相关技术中出现的问题，本发明提供了一种改性聚合物微球、制备方法以及将其用在选择性固定化酶的方法，通过自稳定沉淀聚合方法一步制备了聚合物微球，改性后通过简单的振荡吸附即可选择性固定化His标签酶，对酶活不产生影响，操作简单，经济环保。本发明的方法对酶的纯度要求不高，可选择的酶的种类范围广，制备得到的固定化酶结合牢靠，可进行多次酶催化反应。
本发明提供的一个技术方案是一种改性聚合物微球的制备方法，包括：
将苯乙烯与表面带有吸电子基团的单体发生自稳定沉淀聚合反应，经过洗涤、离心、干燥得到未改性聚合物微球；
将所述未改性聚合物微球与螯合配体超声分散于超干溶剂中，氮气保护下反应8-12h；
加入过渡金属盐，所述的吸电子基团与过渡金属离子的摩尔比为1∶(0.5～6)，室温下搅拌反应4-6h，透析24-48h后干燥得到改性聚合物微球。
在本发明的可选实施案例中，所述螯合配体与所述表面带有吸电子基团的单体的摩尔比为1∶(1.1～2)，优选1∶(1.2～1.5)。
在本发明的可选实施案例中，所述螯合配体具有以下结构：
Figure BDA0003331647070000021
其中，R1，R2，R3各自独立地为氢原子，羧基，吡啶、-CH2COOH、PO4 3-。
作为一种或多种优选实施方案，所述螯合配体可以是二甲基吡啶胺、亚胺基二乙酸、次胺基三乙酸、乙二胺四乙酸中的至少一种。
在本发明的可选实施案例中，所述过渡金属盐为二水合氯化铜、无水硫酸铜、五水合硫酸铜、三水合硝酸铜、氯化锌、七水合硫酸锌、六水合氯化镍、六水合硫酸镍、六水合氯化钴、七水合硫酸钴。
在本发明的可选实施案例中，所述的吸电子基团包括酸酐、羧酸基、磺酸基、酰氯、酰亚胺、羧酸酯、环氧基团、卤素中的至少一种。
作为本发明的第二个方面，提供一种改性聚合物微球，是所述的改性聚合物微球的制备方法得到。
作为本发明的第三方面，提供一种改性聚合物微球选择性固定化酶的方法，将所述的改性聚合物微球与酶溶液混合后，通过搅拌或者振荡，4-30℃下固定化。
作为一种或多种可选的实施例，所述酶上含有组氨酸残基组成的His标签。
作为一种或多种可选的实施例，所述酶可以是蛋白酶，所述蛋白酶包括单酶或多酶作为一种或多种可选的实施例，所述蛋白酶可以是自身含有His标签的酶，或者自身不含有His标签的酶，所述自身不含His标签的酶需要通过基因重组技术将His标签插入N端或者C端。
本发明的有益效果：
本发明提供的改性聚合物微球通过自稳定沉淀方法一步制备得到，制备方法、后续改性和后处理方法简单，进一步可以用该制备方法得到的改性聚合物微球选择性固定化带His标签的酶，该固定化酶的方法对酶活不产生影响，并且操作简单，经济环保；并且该法对酶的纯度要求不高，可选择的酶的种类范围广；通过该方法制备得到的固定化酶结合牢靠，可进行多次酶催化反应，并且与游离酶相比，相对活性显著提高。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为实施例1制备未改性聚合物微球、改性聚合物微球的红外光谱图；3000cm-1～4000cm-1为N-H拉伸振动，1854cm-1和1780cm-1为C＝O拉伸振动。
图2为粗酶(1)、Co柱纯化酶液(2)、实施例2制备聚合物微球纯化酶液(3)的SDS-PAGE分析(M为蛋白质分子量标准物)，实施例2所得的酶液与粗酶液相比在46.1kD处有清晰条带，证明实施例制备的固定化酶材料可同时对目标酶进行固定和纯化。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，并不用于限制本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中涉及的酶液浓度测定方法：
反应一段时间后，取样1ml，以10000rpm的离心速度，5min离心时间，离心3次，收集所有上清液，测定固定化后的酶浓度。酶的吸附容量(Q，mg·g-1)由以下方程式计算：
Figure BDA0003331647070000031
C0：吸附前酶液浓度(mg/g)
C：吸附后酶液浓度(mg/g)
m：固定化聚合物微球的质量(mg)
V：反应体积(mL)
本发明实施例中涉及的酶活力测定方法：
酶活反应体系由0.5mM MgCl2、15mM果糖-6-磷酸(底物)、20mM磷酸盐溶液(pH7.5)、～0.5μg酶组成。在30℃反应5分钟后，用沸水浴终止反应，离心10min，通过高效液相色谱(HPLC)检测。酶活力的单位(U)定义为单位时间内果糖-6-磷酸转化成甘露糖-6-磷酸的量。计游离酶活性(U/mg)为100％，以此计算固定化酶的相对酶活性。
本发明实施例中，未改性共聚微球采用以下方法制得：在氮气保护的条件下，将单体、交联剂和引发剂加入介质中溶解，并于60～90℃反应2～24h，得到交联苯乙烯-马来酸酐聚合物微球的分散体系，再经离心分离得到交联苯乙烯-马来酸酐聚合物的白色固体，自制不同粒径和形貌的苯乙烯-马来酸酐未改性共聚微球。
实施例1
在绿色荧光蛋白中引入组氨酸标签片段，大肠杆菌异源表达绿色荧光蛋白egfp。以质粒p1300-1灵芝为模板设计引物，上游酶切位点BamHI，下游酶切位点SalI，进行PCR反应，获得的产物进行胶回收。提质粒pet28a，将酶切后的质粒进行胶回收，16℃过夜连接纯化后的片段和载体，连接产物转化至大肠杆菌DE3感受态细胞中，挑取转化子接种后发酵得菌液，Ni柱纯化得到带组氨酸标签的绿色荧光蛋白。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、1.225g马来酸酐、0.026g二乙烯苯、0.05g偶氮二异丁腈(重结晶)、35ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟；通过离心除去上清液，固体产物用乙酸异戊酯洗涤，离心两次，再用石油醚洗涤6次，除去上清液，烘干后得到未改性聚合物微球。
将0.404g通过上述方法所制备的产物、450μl(2.5mmol)二甲基吡啶胺、三乙胺(新蒸馏)溶于超干二甲基甲酰胺中，在氮气保护下，于室温下反应8～12h；再加入0.475gNiCl6·6H2O；将混合物在室温下搅拌5小时，再透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到改性聚合物微球。
将5mg改性聚合物微球分散于10ml纯化荧光蛋白酶溶液中，于4℃孵育组装得到固定化绿色荧光蛋白，所得固定化酶负载量参见表1。
实施例2
过夜培养活化重组菌株GLpmi-QCDC，将1％的接种物接种到含30mg/L卡那霉素的新鲜无菌LB培养基中，OD600达到0.6-0.8时加入IPTG使终浓度为0.5mM，25℃、150r·min-1下培养10h。菌液在12000r·min-1下离心5min，用1×PBS(pH＝7.4)溶液重悬后在冰水混合物中超声破碎，上清液以4℃、12000rpm离心20min得到磷酸甘露糖异构酶粗酶液，Co柱纯化得到纯化磷酸甘露糖异构酶。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、1.225g马来酸酐、0.026g二乙烯苯、0.0253g偶氮二异丁腈(重结晶)、35ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟；通过离心除去上清液，固体产物用乙酸异戊酯洗涤，离心两次，再用石油醚洗涤6次，除去上清液，(烘干后得到未改性聚合物微球。
将0.404g通过上述方法制备的产物、450μl二甲基吡啶胺、三乙胺(新蒸馏)溶于超干二甲基甲酰胺中，反应物在氮气保护下，于室温下培养8～12h；再加入0.475g NiCl6·6H2O。将混合物在室温下搅拌5小时，再透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到改性聚合物微球。
将5mg改性聚合物微球分散于10ml纯化磷酸甘露糖异构酶溶液中，于4℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
实施例3
按照实施例2方法得到纯化磷酸甘露糖异构酶。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、1.225g马来酸酐、0.026g二乙烯苯、0.05g偶氮二异丁腈(重结晶)、35ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟；通过离心除去上清液，固体产物用乙酸异戊酯洗涤，离心两次，再用石油醚洗涤6次，除去上清液，烘干后得到未改性聚合物微球。
将0.404g通过上述方法所制备的产物、450μl二甲基吡啶胺、三乙胺(新蒸馏)溶于超干二甲基甲酰胺中，反应物在氮气保护下，于室温下培养8～12h；再加入0.238g NiCl6·6H2O；将混合物在室温下搅拌5小时，再透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到改性聚合物微球。
将5mg改性聚合物微球分散于10ml纯化磷酸甘露糖异构酶溶液中，于4℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
实施例4
按照实施例2方法得到纯化磷酸甘露糖异构酶。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、1.225g马来酸酐、0.026g二乙烯苯、0.05g偶氮二异丁腈(重结晶)、35ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟；通过离心除去上清液，固体产物用乙酸异戊酯洗涤，离心两次，再用石油醚洗涤6次，除去上清液，烘干后得到未改性聚合物微球。
将0.404g通过上述方法所制备的产物、450μl二甲基吡啶胺、三乙胺(新蒸馏)溶于超干二甲基甲酰胺中。反应物在氮气保护下，于室温下培养8～12h；再加入0.95g NiCl6·6H2O。将混合物在室温下搅拌5小时，透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到改性聚合物微球。
将5mg改性聚合物微球分散于10ml纯化磷酸甘露糖异构酶溶液中，于4℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
实施例5
按照实施例2方法得到纯化磷酸甘露糖异构酶。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、1.225g马来酸酐、0.026g二乙烯苯、0.05g偶氮二异丁腈(重结晶)、35ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟，通过离心除去上清液，固体产物用乙酸异戊酯洗涤，离心两次，再用石油醚洗涤6次，除去上清液，烘干后得到未改性聚合物微球。
将0.404g通过上述方法所制备的产物、450μl二甲基吡啶胺、三乙胺(新蒸馏)溶于超干二甲基甲酰胺中。反应物在氮气保护下，于室温下培养8～12h；再加入1.9g NiCl6·6H2O。将混合物在室温下搅拌5小时，透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到改性聚合物微球。
将5mg改性聚合物微球分散于10ml纯化磷酸甘露糖异构酶溶液中，于4℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
实施例6
按照实施例2方法得到纯化磷酸甘露糖异构酶。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、1.225g马来酸酐、0.026g二乙烯苯、0.05g偶氮二异丁腈(重结晶)、35ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟，通过离心除去上清液，固体产物用乙酸异戊酯洗涤，离心两次，再用石油醚洗涤6次，烘干后得到未改性聚合物微球。
将0.404g通过上述方法所制备的产物、450μl二甲基吡啶胺、三乙胺(新蒸馏)溶于超干二甲基甲酰胺中。反应物在氮气保护下，于室温下培养8～12h；加入2.85g NiCl6·6H2O。将混合物在室温下搅拌5小时，透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到改性聚合物微球。
将5mg改性聚合物微球分散于10ml纯化磷酸甘露糖异构酶溶液中，于4℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
实施例7
按照实施例2方法得到磷酸甘露糖异构酶粗酶(未经Co柱纯化)。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、1.225g马来酸酐、0.026g二乙烯苯、0.05g偶氮二异丁腈(重结晶)、35ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟，通过离心除去上清液，固体产物用乙酸异戊酯洗涤，离心两次，再用石油醚洗涤6次(少干燥步骤)得到未改性聚合物微球。
将0.404g通过上述方法所制备的产物、450μl二甲基吡啶胺、三乙胺(新蒸馏)溶于超干二甲基甲酰胺中。反应物在氮气保护下，于室温下培养8～12h；加入1.9g NiCl6·6H2O。将混合物在室温下搅拌5小时，透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到改性聚合物微球。
将5mg改性聚合物微球分散于10ml磷酸甘露糖异构酶粗酶溶液中，于4℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
实施例8
按照实施例2方法得到纯化磷酸甘露糖异构酶。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、2.45g马来酸酐、0.0375g偶氮二异丁腈(重结晶)、25ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟。加入1.1g二乙烯基苯，0.005g偶氮二异丁腈，12.5ml乙酸异戊酯，75℃水浴反应3小时后，加入30ml丙酮继续反应30分钟，丙酮离心3次除去上清液，(少干燥步骤)得到未改性聚合物微球。
将制备的0.326g上述产物、450μl二甲基吡啶胺、三乙胺(新蒸馏)溶于超干二甲基甲酰胺中。反应物在氮气保护下，于室温下培养8～12h；再加入1.9gNiCl6·6H2O。将混合物在室温下搅拌5小时，透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到改性聚合物微球。
将5mg改性聚合物微球分散于10ml纯化磷酸甘露糖异构酶溶液中，于4℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
实施例9
按照实施例2方法得到纯化磷酸甘露糖异构酶。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、2.45g马来酸酐、0.0375g偶氮二异丁腈(重结晶)、25ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟。加入1.1g二乙烯基苯，0.005g偶氮二异丁腈，12.5ml乙酸异戊酯，75℃水浴反应3小时后，加入30ml丙酮继续反应30分钟，丙酮离心3次除去上清液，烘干后得到未改性聚合物微球。
将制备的0.326g上述产物、450μl二甲基吡啶胺、三乙胺(新蒸馏)溶于超干二甲基甲酰胺中。反应物在氮气保护下，于室温下培养8～12h；再加入0.95g NiCl6·6H2O。将混合物在室温下搅拌5小时，透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到改性聚合物微球。
将5mg改性聚合物微球分散于10ml纯化磷酸甘露糖异构酶溶液中，于4℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
实施例10
按照实施例2方法得到纯化磷酸甘露糖异构酶。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、2.45g马来酸酐、0.0375g偶氮二异丁腈(重结晶)、25ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟。加入1.1g二乙烯基苯，0.005g偶氮二异丁腈，12.5ml乙酸异戊酯，75℃水浴反应3小时后，加入30ml丙酮继续反应30分钟，丙酮离心3次除去上清液，烘干后得到未改性聚合物微球。
将制备的0.326g上述产物、450μl二甲基吡啶胺、三乙胺(新蒸馏)溶于超干二甲基甲酰胺中。反应物在氮气保护下，于室温下培养8～12h；再加入0.475g NiCl6·6H2O。将混合物在室温下搅拌5小时，透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到改性聚合物微球。
将5mg改性聚合物微球分散于10ml纯化磷酸甘露糖异构酶溶液中，于4℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
实施例11
按照实施例2方法得到纯化磷酸甘露糖异构酶。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、1.225g马来酸酐、0.026g二乙烯苯、0.05g偶氮二异丁腈(重结晶)、35ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟。通过离心除去上清液。固体产物用乙酸异戊酯洗涤，离心两次，再用石油醚洗涤6次，烘干后得到未改性聚合物微球。
将制备的0.404g上述产物、450μl二甲基吡啶胺、三乙胺(新蒸馏)溶于超干二甲基甲酰胺中。反应物在氮气保护下，于室温下培养8～12h；再加入1.9gNiCl6·6H2O。将混合物在室温下搅拌5小时，透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到改性聚合物微球。
将5mg改性聚合物微球分散于10ml纯化磷酸甘露糖异构酶溶液中，于20℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
实施例12
按照实施例2方法得到纯化磷酸甘露糖异构酶。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、1.225g马来酸酐、0.026g二乙烯苯、0.05g偶氮二异丁腈(重结晶)、35ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟。通过离心除去上清液。固体产物用乙酸异戊酯洗涤，离心两次，再用石油醚洗涤6次，烘干后得到未改性聚合物微球。
将制备的0.332g上述产物、0.332g亚氨基二乙酸溶于25mL去离子水中，65℃搅拌至溶解，用1M NaOH溶液调节pH～9，继续搅拌6h结束反应，用1M HCl调节pH～7；反应物离心去除上清液后加入1.9g NiCl6·6H2O。将混合物在室温下搅拌5小时，透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到改性聚合物微球。
将5mg改性聚合物微球分散于10ml纯化磷酸甘露糖异构酶溶液中，于4℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
实施例13
按照实施例2方法得到纯化磷酸甘露糖异构酶。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、1.225g马来酸酐、0.026g二乙烯苯、0.05g偶氮二异丁腈(重结晶)、35ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟。通过离心除去上清液。固体产物用乙酸异戊酯洗涤，离心两次，再用石油醚洗涤6次。
将制备的0.404g上述产物、450μl二甲基吡啶胺、三乙胺(新蒸馏)溶于超干二甲基甲酰胺中。反应物在氮气保护下，于室温下培养8～12h；再加入1.9g CoCl2·6H2O。将混合物在室温下搅拌5小时，透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到改性聚合物微球。
将5mg改性聚合物微球分散于10ml纯化磷酸甘露糖异构酶溶液中，于4℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
对比例1
按照实施例2方法得到纯化磷酸甘露糖异构酶。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、1.225g马来酸酐、0.026g二乙烯苯、0.05g偶氮二异丁腈(重结晶)、35ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟。通过离心除去上清液。固体产物用乙酸异戊酯洗涤，离心两次，再用石油醚洗涤6次，烘干后得到产物1。
将制备的0.404g上述产物1、450μl二甲基吡啶胺、三乙胺(新蒸馏)溶于超干二甲基甲酰胺中。反应物在氮气保护下于室温下培养8～12h。透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到产物2。
将5mg上述产物2分散于10ml纯化磷酸甘露糖异构酶溶液中，于4℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
对比例2
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、1.225g马来酸酐、0.026g二乙烯苯、0.05g偶氮二异丁腈(重结晶)、35ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟。通过离心除去上清液。固体产物用乙酸异戊酯洗涤，离心两次，再用石油醚洗涤6次，烘干后得到产物1。
将制备的0.404g上述产物1、450μl二甲基吡啶胺、三乙胺(新蒸馏)溶于超干二甲基甲酰胺中。反应物在氮气保护下于室温下培养8～12h。加入1.9g NiCl6·6H2O。将混合物在室温下搅拌5小时，透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到改性聚合物微球。
将5mg改性聚合物微球分散于10ml不带His标签的绿色荧光蛋白溶液中，于20℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
对比例3
按照实施例2方法得到纯化磷酸甘露糖异构酶。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、1.225g马来酸酐、0.026g二乙烯苯、0.05g偶氮二异丁腈(重结晶)、35ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟。通过离心除去上清液。固体产物用乙酸异戊酯洗涤，离心两次，再用石油醚洗涤6次，烘干后得到未改性聚合物微球。
将5mg未改性聚合物微球分散于10ml纯化磷酸甘露糖异构酶溶液中，于4℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
对比例4
按照实施例2方法得到纯化磷酸甘露糖异构酶。
在100ml圆底烧瓶中加入1.3g苯乙烯(减压蒸馏)、1.225g马来酸酐、0.026g二乙烯苯、0.0253g偶氮二异丁腈(重结晶)、35ml乙酸异戊酯，氮气吹扫30min后，75℃水浴反应90分钟。通过离心除去上清液。固体产物用乙酸异戊酯洗涤，离心两次，再用石油醚洗涤6次，烘干得到产物。
将制备的0.404g上述产物、450μl二甲基吡啶胺、三乙胺(新蒸馏)溶于超干二甲基甲酰胺中。反应物在氮气保护下，于室温下培养8～12h；再加入0.261g CaCl2。将混合物在室温下搅拌5小时，透析48h后，在40℃的真空干燥箱中干燥至恒重，得到产物。
将5mg上述产物分散于10ml纯化磷酸甘露糖异构酶溶液中，于4℃孵育组装得到固定化磷酸甘露糖异构酶，所得固定化酶负载量和酶活性参见表1。
表1.固定化酶负载量及相对酶活力
酶负载量Q(mg/g) 相对酶活力(％)
PMI纯酶 -- 100
实施例1 124 --
实施例2 180 139
实施例3 69 67
实施例4 184 174
实施例5 102 112
实施例6 80 88
实施例7 192 154
实施例8 107 118
实施例9 180 172
实施例10 131 140
实施例11 184 170
实施例12 122 97
实施例13 154 166
对比例1 7 0
对比例2 13 --
对比例3 10 0
对比例4 0 0
本发明制备的固定化酶酶负载量在0-184mg/g之间，相对酶活力最高可达到游离酶的1.74倍，与未改性的微球材料(对比例3)以及表面不含过渡金属(对比例1、对比例4)的微球材料相比，负载量大大提升。由于微球材料与酶通过His标签完成固定化过程，固定化酶的活性最大化保留；而且在协同作用及局部浓度效应作用下，固定化酶的相对活性有所提高。与对比例2相比，证明制备的微球材料对酶的固定化具有选择性，因此可以同时进行固定化和纯化过程。
综上所述，本发明所述固定化酶材料相较于对比例方法在酶负载量及相对活性方面具有明显优势；所制备的螯合金属离子聚合物微球可以负载His标签酶后得到固定化酶，所得固定化酶可以保持良好的酶活性。
以上仅以较佳实施例对本发明的技术方案进行介绍，但是对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，应能在具体实施方式上及应用范围上进行改变，故而，综上所述，本说明书内容不应该理解为本发明的限制，凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。

Claims (10)

1.一种改性聚合物微球的制备方法，其特征在于，包括：
将苯乙烯与表面带有吸电子基团的单体发生自稳定沉淀聚合反应，经过洗涤、离心、干燥得到未改性聚合物微球；
将所述未改性聚合物微球与螯合配体超声分散于超干溶剂中，氮气保护下反应8-12h；
加入过渡金属盐，所述的吸电子基团与过渡金属离子的摩尔比为1∶(0.5～6)，室温下搅拌反应4-6h，透析24-48h后干燥得到改性聚合物微球。
2.根据权利要求1所述的改性聚合物微球的制备方法，其特征在于，所述螯合配体与所述表面带有吸电子基团的单体的摩尔比为1∶(1.1～2)，优选1∶(1.2～1.5)。
3.根据权利要求1所述的改性聚合物微球的制备方法，其特征在于，所述螯合配体具有以下结构：
Figure FDA0003331647060000011
其中，R1，R2，R3各自独立地为氢原子，羧基，吡啶、-CH2COOH、PO4 3-。
4.根据权利要求1所述的改性聚合物微球的制备方法，其特征在于，所述过渡金属盐为二水合氯化铜、无水硫酸铜、五水合硫酸铜、三水合硝酸铜、氯化锌、七水合硫酸锌、六水合氯化镍、六水合硫酸镍、六水合氯化钴或七水合硫酸钴中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的改性聚合物微球的制备方法，其特征在于，所述的吸电子基团包括酸酐、羧酸基、磺酸基、酰氯、酰亚胺、羧酸酯、环氧基团、卤素中的至少一种。
6.一种改性聚合物微球，其特征在于，是由权利要求1～5任意一项所述的改性聚合物微球的制备方法得到。
7.一种改性聚合物微球选择性固定化酶的方法，其特征在于，将权利要求6所述的改性聚合物微球或者通过权利要求1～5任一项所述的制备方法得到的改性聚合物微球，与酶溶液混合后，通过搅拌或者振荡，在4-30℃下固定化。
8.根据权利要求7所述的改性聚合物微球选择性固定化酶的方法，其特征在于所述酶上含有组氨酸残基组成的His标签。
9.根据权利要求7所述的改性聚合物微球选择性固定酶的方法，其特征在于所述酶可以是蛋白酶，所述蛋白酶包括单酶或多酶体系。
10.根据权利要求9所述的改性聚合物微球选择性固定酶的方法，其特征在于所述蛋白酶可以是自身含有His标签的酶，或者自身不含有His标签的酶，所述自身不含His标签的酶需要通过基因重组技术将His标签插入N端或者C端。
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