CN109852603A - 一种含木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花及其制备方法和应用 - Google Patents
一种含木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种含木瓜蛋白酶的铁‑铜复合磁性纳米花及其制备方法和应用，属于酶固定化领域。一种含木瓜蛋白酶的铁‑铜复合磁性纳米花的制备方法，该方法是将氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子溶液与木瓜蛋白酶溶液混合后，再加入铜离子无机盐溶液，得到含木瓜蛋白酶的铁‑铜复合磁性纳米花。本发明合成的木瓜蛋白酶铁‑铜复合磁性纳米花与游离酶相比具有更大的比表面积，进而减少了酶与底物间的传质阻碍，固定化后的木瓜蛋白酶的酶活是游离酶的25倍左右。
Description
技术领域
本发明涉及一种含木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花及其制备方法和应用，属于酶固定化领域。
背景技术
木瓜蛋白酶又称木瓜酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实中，其中未成熟的乳汁中含量最为丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶。同时，木瓜蛋白酶具有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、脂、酰胺等均有较强的水解能力。此外，木瓜蛋白酶在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质。不仅如此，其耐热性也非常好，虽然其最适温度为55-65℃，但是在10-85℃这个温度范围内均有催化活性。在食品行业木瓜蛋白酶主要应用于肉类嫩化，啤酒澄清等领域，而在医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业木瓜蛋白酶也得到了广泛应用。在食品、医药以及轻工业等领域，木瓜蛋白酶作为一种生物催化剂是一种非常有潜力的催化材料。然而，在实际的生产过程中由于生产条件对酶的不利影响，酶的催化活力常常受到限制。研究人员尝试通过固定化的方法解决在实际生产中酶活低，酶稳定性差，不能回收进行重复利用等缺点。但是，发现一种固定过程无毒，能快速与反应液分离的，并且具有很高酶活的固定化方法是非常必要的。
酶与传统的化学催化剂相比具有特异性强、环境友好、绿色安全、经济高效等优点。因此，近年来把酶作为一种催化剂应用于工业生产已经成为行业发展的潮流。但是，在把酶应用于实际生产的过程中还存在很多难题。首先由于酶是一种可溶性蛋白质，在进行工业生产时酶会溶于反应液，反应结束后不能将其分离出来只能对其进行灭活处理，因此会造成产物被污染的现象。其次由于生产环境并不一定是酶的最适生长环境，所以在生产过程中恶劣的环境会刺激酶的生长并降低酶活。随着科学技术的发展，研究人员发现把酶通过某种方式固定化后，可以使其变成不溶的状态并且可以提高其稳定性，这为把酶作为一种催化剂应用于实际工业生产提供了更好的发展前景。
酶的固定方法有很多种，包括吸附法、包埋法、结合法、交联法等等。每种固定化方法都各有其优缺点，怎样使酶在被固定的同时增加其酶活是近年来的研究热点。其中，用纳米花来固定化酶取得了突破性进展，用这种方法固定的酶不仅具有较强的稳定性而且酶活非常高。因为纳米花具有更大的表面积，这在酶与底物接触方面具有相当大的优势。但是纳米花的结构相对脆弱，在分离的过程中不能过于剧烈。因此，寻找一种可以与反应液快速分离的纳米级酶固定化方法是极为重要的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种含木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花的制备方法。本发明合成的带有羧酸基团的四氧化三铁与其他方法合成的四氧化三铁相比更容易合成复合材料。首先将四氧化三铁进行氨基修饰，然后与木瓜蛋白酶通过氢键结合起来，最后与铜离子复合形成具有三维花型结构的纳米级催化材料，此催化材料酶活高且带有磁性易与产物分离。氨基修饰的四氧化三铁先与木瓜蛋白酶通过氢键间的吸附作用结合在一起，然后又与铜离子通过自组装方式二次固定，牢固地结合到纳米花上。同理，木瓜蛋白酶通过这种二次固定的方法也大大提高了其酶活回收率，增加了其催化效率。因此，此种纳米花催化材料不但具有高酶活，而且磁性强烈且稳定，在工业生产中有很大的应用前景。
一种含木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花的制备方法，该方法是将氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子溶液与木瓜蛋白酶溶液混合后，再加入铜离子无机盐溶液，得到含木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花，
所述氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子按下述方法制得：将100～500mg磁性Fe3O4纳米粒子加入100g浓度为400mmol/L的尿素水溶液中超声，然后按照摩尔比为2:10:6:14:1的比例分别加入溴化十六烷基三甲基铵、正丁醇、环己烷、正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌均匀后在40～70℃条件下反应24小时，其中，十六烷基三甲基溴化铵为1.25g；然后，在60～80℃条件下用丙酮回流24小时，收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子。
上述技术方案中，所述铜离子无机盐为氯化铜、硫酸铜、溴化铜中的一种或多种混合。
进一步地，所述铜离子无机盐溶液浓度为120～140mM，优选为120Mm。
上述技术方案中，所述木瓜蛋白酶溶液的浓度为0.1～0.5mg/ml。
上述技术方案中，优选将300mg磁性Fe3O4纳米粒子加入100g浓度为400mmol/L的尿素水溶液中超声。
优选地，所述木瓜蛋白酶溶液按下述方法配置：将木瓜蛋白酶溶于水性溶液中，所述水性溶液为25℃环境下pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液。所述磷酸盐缓冲溶液是把磷酸氢二钠(十二水)3.63g，磷酸二氢钾(二水)0.24g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g溶解后定容至1L得到的溶液。
上述技术方案中，所述氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子溶液的浓度为0.5～5mM。
优选地，所述氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子溶液按下述方法配置：将氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子溶于水性溶液中，所述水性溶液为25℃环境下pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液。所述磷酸盐缓冲溶液是把磷酸氢二钠(十二水)3.63g，磷酸二氢钾(二水)0.24g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g溶解后定容至1L得到的溶液。
进一步地，所述磁性Fe3O4纳米粒子与铜离子无机盐溶液中铜离子的摩尔为1:1～1:5，优选为1:4。
上述技术方案中，所述氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子与木瓜蛋白酶的质量比为1:0.5～1:6。
上述技术方案中，优选所述磁性Fe3O4纳米粒子按下述方法制得：将1～5g柠檬酸钠溶于80mL乙二醇中，加入1～5g铁盐搅拌至溶解，再加入1～10g乙酸钠搅拌30分钟，将上述溶液在200℃条件下保温20小时，反应结束后水洗，醇洗，干燥得黑色磁性Fe3O4纳米粒子，所述铁盐为三氯化铁、硫酸亚铁、氢氧化铁中的一种。
本发明所述含木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花的制备方法一个优选的技术方案为：所述方法包括如下步骤：
(1)将1～5g柠檬酸钠溶于80mL乙二醇中，加入1～5g铁盐搅拌至溶解，再加入1～10g乙酸钠搅拌30分钟，将上述溶液在200℃条件下保温20小时，反应结束后水洗，醇洗，干燥得黑色磁性Fe3O4纳米粒子，所述铁盐为三氯化铁、硫酸亚铁、氢氧化铁中的一种；
(2)将300mg磁性Fe3O4纳米粒子加入100g浓度为400mmol/L的尿素水溶液中超声，然后按照摩尔比为2:10:6:14:1的比例分别加入溴化十六烷基三甲基铵、正丁醇、环己烷、正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌均匀后在40～70℃条件下反应24小时，其中，十六烷基三甲基溴化铵为1.25g；然后，在60～80℃条件下用丙酮回流24小时，收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子；
(3)用水性溶液配制得到浓度为0.1～0.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液；
(4)将步骤(2)中得到的氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子配制成浓度为0.5～5mM的溶液，加入到步骤(3)得到的木瓜蛋白酶溶液中，摇床震荡2小时；然后加入铜离子无机盐溶液，搅拌均匀后在20～30℃静置24～96小时，使混合液通过自组装的方式合成铁-铜复合磁性纳米花，收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到铁-铜复合磁性纳米花。
上述技术方案，步骤(1)中，制备磁性Fe3O4纳米粒子时需要在200℃环境下进行，反应时间为20小时。目的是使游离的磁性Fe3O4纳米粒子在长时间高温的环境下形成带有羧酸基团的磁性Fe3O4纳米粒子。
上述技术方案，步骤(3)中，水性溶液为25℃环境下pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液。所述磷酸盐缓冲溶液是把磷酸氢二钠(十二水)3.63g，磷酸二氢钾(二水)0.24g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g溶解后定容至1L得到的溶液。
上述技术方案，步骤(4)中，氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子与铜离子比例为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5。此处离子的比例为物质的量的比。
上述技术方案，步骤(4)中，静置时氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子的浓度为0.5～5mM，木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花是由金属离子与酶复合形成的，因此金属离子的浓度对木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花的影响是非常显著的。金属离子浓度如果过低会使过多的游离酶不能复合，进而导致大量的酶被损失。同时，如果金属离子过高会导致合成的木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花中酶的负载量降低，此时酶的活性会明显降低。
本发明的另一目的是提供由上述方法制得的含木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花，所述磁性纳米花四氧化三铁磁性粒子与木瓜蛋白酶通过氢键的吸附作用结合在一起，然后在磷酸盐缓冲液中与铜离子通过超分子组装的方式形成具有三维花状结构的含木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花。
本发明的又一目的是提供上述磁性脂肪酶纳米花催化材料在水解牛奶中的蛋白质的应用。
本发明提供的木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花可以水解牛奶中的蛋白质，降低αs1-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的含量，生产适度水解的牛奶，降低牛奶的致敏性。
本发明利用木瓜蛋白酶作为有机组分，氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子与铜离子作为无机组分，通过两种组分之间的氢键间的吸附作用与自组装形成了酶活高易分离的木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花。该纳米花与游离酶相比比表面积较大，进而减少了酶与底物间的传质阻碍，因此固定化后的木瓜蛋白酶较游离酶的酶活有了一定的提高。与游离酶相比其更明显的优势是可以快速地和反应液分离，这为将其应用到实际生产中提供了更多可能性。
本发明的有益效果：本发明合成的木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花与游离酶相比具有更大的比表面积，进而减少了酶与底物间的传质阻碍，固定化后的木瓜蛋白酶的酶活是游离酶的25倍左右。与游离酶相比其更明显的优势是可以快速地和反应液分离，并且具有更好的pH稳定性与温度稳定性，不仅提高了木瓜蛋白酶的重复利用性能，而且二次固定的方法使其具有稳定磁性的用时又具有很高的酶活回收率。本发明合成的木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花中不含任何有毒元素，生物相容性好，从而在食品、医药以及轻工业等领域都将有广泛的应用价值。与传统的固定化方法相比，该催化材料与反应液分离更加容易，在实际的生产过程中会节约很多生产成本，创造更大的经济价值。
附图说明
图1为实施例6所得氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子、磷酸铜、木瓜蛋白酶和实施例6所得木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花的红外图。
图2为实施例6所得氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子、磷酸铜和实施例6所得木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花的X-射线衍射图。
图3为实施例6所得木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花的能谱图。
图4(a)为实施例6所得木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花扫描电镜图；(b)木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花的局部放大图；
图5为实施例6所得木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花水解牛奶中蛋白质的SDS-PAGE电泳图。
图6为实施例6所得木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花的循环利用性图。
具体实施方式
下述实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用的试剂等均可从化学或生物试剂公司购买。
下述实施例采用的材料以及木瓜蛋白酶酶活测定方法：
1、材料
木瓜蛋白酶：购自源叶生物科技有限公司，活性为800u/mg；
二硫苏糖醇(DTT)：购自北京索莱宝科技有限公司；
硫酸亚铁：购自天津市化学试剂三厂；
氯化铜：购自沈阳市试剂一厂；
硫酸铜：购自天津市瑞金特化学品有限公司；
乙酸钠、正硅酸乙酯、正丁醇：购自天津市科密欧化学试剂有限公司；
氢氧化铁、柠檬酸钠、环己烷、十六烷基三甲基溴化铵：购自天津市大茂化学试剂厂；
N-苯甲酰-L-精氨酸乙脂(BAEE)、3-氨丙基三乙氧基硅烷：购自阿拉丁试剂有限公司；
溴化铜、三氯化铁、乙二醇：购自国药集团化学试剂有限公司；
磷酸盐缓冲液(PBS)：0.01M，pH 7.4，所述磷酸盐缓冲溶液是把磷酸氢二钠(十二水)3.63g，磷酸二氢钾(二水)0.24g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g溶解后定容至1L得到的溶液。。
2、木瓜蛋白酶酶活测定方法：采用比色法，以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)为底物，由于木瓜蛋白酶能使BAEE酯键的水解生成N-苯甲酰-L-精氨酸(BA)，在波长253nm下N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)的紫外光吸收远远低于N-苯甲酰-L-精氨酸的紫外光吸收。因此随着酯键的水解，水解产物BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，可以通过吸光度的增加量来反应木瓜蛋白酶催化活力的强弱。具体操作步骤如下：
分别取四支试管，一支作为空白对照，另外三支作为样品(三个平行试验)。首先，称量2.5mg木瓜蛋白酶，使其分散于100mL PBS(0.01mol/L,pH 7.4)中，配置成均匀酶液。分别取2mL于试管中，空白对照中加入2mL不含酶的PBS溶液。然后，加入1mL浓度为30mmol/LDTT溶液，并在摇床上震荡10min。最后，加入2mmol/L BAEE溶液，摇床上反应5min后在253nm下测吸光值。纳米花的酶活测试方法为：取包含0.05mg木瓜蛋白酶的纳米花溶于2mL PBS进行酶活测试，测试方法与游离酶相同。
木瓜蛋白酶活力单位(U)定义为：在上述实验条件下，以2mmol/L BAEE为底物，每分钟使ΔA253增加0.001为一个酶活力单位。
实施例1
(1)将1.2g柠檬酸钠溶于80mL乙二醇中,加入2.6g三氯化铁搅拌至溶解，再加入3.2g乙酸钠搅拌30分钟，将上述溶液在200℃条件下保温20小时。反应结束后用水洗3遍，乙醇洗5遍后自然干燥,得到的黑色粉末即为四氧化三铁磁性粒子。
(2)取步骤(1)所得四氧化三铁磁性粒子300mg加入到100g 400mmol/L尿素水溶液中超声1小时，然后加入1.25g十六烷基三甲基溴化铵，1.25g正丁醇和5g环己烷，搅拌均匀后加入0.875g正硅酸四乙酯和0.375g 3-氨丙基三乙氧基硅烷。将混合液在70℃反应24小时，反应结束后取沉淀用在80℃丙酮回流24小时。最后收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子。
(3)取17.4mg步骤(2)中制备得到的氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶于5mL PBS中，超声30分钟使其分散均匀。再取9mg木瓜蛋白酶溶于83mL PBS，溶解后加入到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶液中。然后将溶液放到摇床上震荡2小时，使酶与氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子充分接触。
(4)2小时后加入1.9mL氯化铜溶液(120mmol/L)，混匀后静置3天。3天后，磁性分离溶液得到沉淀，用去离子水洗5次，最后冷冻干燥得到的粉末即为木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花。
上述制备得到的木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花的性能检测结果：
图1为四氧化三铁磁性粒子、磷酸铜、木瓜蛋白酶和木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花的红外图。在波数1042cm-1(非对称伸缩振动)、988cm-1(伸缩振动)、623cm-1(弯曲振动)处的吸收峰来自于P-O键的振动，对照木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花(c)与磷酸铜(d)可知纳米花中存在磷酸集团。图中木瓜蛋白酶(b)在1655cm-1、1538cm-1处均有特征吸收峰，此处为-CONH(酰胺键)的伸缩振动，在木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花(c)中也能找到该吸收峰。另外，在1464cm-1处的吸收峰来自Fe-O键，在2800-3000cm-1的峰为-CH2和-CH3的伸缩振动，在3300cm-1为-OH的伸缩振动。通过对木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花(c)、磷酸铜(d)、木瓜蛋白酶(b)和四氧化三铁磁性粒子(a)的红外谱图可以看出木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花是由上述几种物质构成的。
图2为四氧化三铁磁性粒子(a)、磷酸铜(b)和木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花(c)的X-射线衍射图。由图可知磷酸铜(b)与木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花(c)的衍射峰极其相似，同时木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花(c)的所有衍射峰均能从磷酸铜(b)中找到。由此证实纳米花是以磷酸铜结晶体作为主要载体，并且磷酸铜与游离木瓜蛋白酶结合具有很高的结晶度，说明二者组装结构较为稳定。此外，对比木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花(c)与四氧化三铁磁性粒子(a)的衍射峰，发现四氧化三铁磁性粒子(a)中的衍射峰均能从木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花(c)中找到，但是可能是由于含量较少的原因大部分衍射峰被覆盖并且强度较弱。
图3为木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花的能谱图。由图可知，纳米花中的Cu和P信号非常强烈。由此，进一步证明，木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花的无机成分主要为磷酸铜晶体。
图4为由木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花的扫描电镜图。其中，从图a中我们可以看出铁、铜离子与木瓜蛋白酶形成了完整的三维花型结构，且其颗粒较小花瓣繁多具有丰富的比表面积。图b为木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花的局部放大图，可以看到氨基修饰的四氧化三铁、铜离子与木瓜蛋白酶自组装成均匀且致密的花瓣结构，氨基修饰的四氧化三铁紧密地结合到纳米花中，赋予了纳米花磁性。
实施例2
(1)将1.2g柠檬酸钠溶于80mL乙二醇中,加入2.6g三氯化铁搅拌至溶解，再加入3.2g乙酸钠搅拌30分钟，将上述溶液在200℃条件下保温20小时。反应结束后用水洗3遍，乙醇洗5遍后自然干燥,得到的黑色粉末即为四氧化三铁磁性粒子。
(2)取步骤(1)所得四氧化三铁磁性粒子300mg加入到100g 400mmol/L尿素水溶液中超声1小时，然后加入1.25g十六烷基三甲基溴化铵，1.25g正丁醇和5g环己烷，搅拌均匀后加入0.875g正硅酸四乙酯和0.375g 3-氨丙基三乙氧基硅烷。将混合液在70℃反应24小时，反应结束后取沉淀用在80℃丙酮回流24小时。最后收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子。
(3)取34.7mg步骤(2)中制备得到的氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶于5mL PBS中，超声30分钟使其分散均匀。再取9mg木瓜蛋白酶溶于83mL PBS，溶解后加入到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶液中。然后溶液在摇床上震荡2小时，使酶与氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子充分接触。
(4)2小时后加入3.8mL氯化铜溶液(120mmol/L),混匀后静置3天。3天后，磁性分离溶液得到沉淀，用去离子水洗5次，最后冷冻干燥得到的粉末即为木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花。
实施例3
(1)将1.2g柠檬酸钠溶于80mL乙二醇中,加入2.6g三氯化铁搅拌至溶解，再加入3.2g乙酸钠搅拌30分钟，将上述溶液在200℃条件下保温20小时。反应结束后用水洗3遍，乙醇洗5遍后自然干燥,得到的黑色粉末即为四氧化三铁磁性粒子。
(2)取步骤(1)所得四氧化三铁磁性粒子300mg加入到100g 400mmol/L尿素水溶液中超声1小时，然后加入1.25g十六烷基三甲基溴化铵，1.25g正丁醇和5g环己烷，搅拌均匀后加入0.875g正硅酸四乙酯和0.375g 3-氨丙基三乙氧基硅烷。将混合液在70℃反应24小时，反应结束后取沉淀用在80℃丙酮回流24小时。最后收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子。
(3)取52.1mg步骤(2)中制备得到的氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶于5mL PBS中，超声30分钟使其分散均匀。再取9mg木瓜蛋白酶溶于83mL PBS，溶解后加入到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶液中。然后将溶液放到摇床上震荡2小时，使酶与氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子充分接触。
(4)2小时后加入5.6mL氯化铜溶液(120mmol/L),混匀后静置3天。3天后，磁性分离溶液得到沉淀，用去离子水洗5次，最后冷冻干燥得到的粉末即为木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花。
实施例4
(1)将1.2g柠檬酸钠溶于80mL乙二醇中,加入2.6g三氯化铁搅拌至溶解，再加入3.2g乙酸钠搅拌30分钟，将上述溶液在200℃条件下保温20小时。反应结束后用水洗3遍，乙醇洗5遍后自然干燥,得到的黑色粉末即为四氧化三铁磁性粒子。
(2)取步骤(1)所得四氧化三铁磁性粒子300mg加入到100g 400mmol/L尿素水溶液中超声1小时，然后加入1.25g十六烷基三甲基溴化铵，1.25g正丁醇和5g环己烷，搅拌均匀后加入0.875g正硅酸四乙酯和0.375g 3-氨丙基三乙氧基硅烷。将混合液在70℃反应24小时，反应结束后取沉淀用在80℃丙酮回流24小时。最后收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子。
(3)取17.4mg步骤(2)中制备得到的氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶于5mL PBS中，超声30分钟使其分散均匀。再取18mg木瓜蛋白酶溶于83mL PBS，溶解后加入到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶液中。然后将溶液放到摇床上震荡2小时，使酶与氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子充分接触。
(4)2小时后加入1.9mL氯化铜溶液(120mmol/L),混匀后静置3天。3天后，磁性分离溶液得到沉淀，用去离子水洗5次，最后冷冻干燥得到的粉末即为木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花。
实施例5
(1)将1.2g柠檬酸钠溶于80mL乙二醇中,加入2.6g三氯化铁搅拌至溶解，再加入3.2g乙酸钠搅拌30分钟，将上述溶液在200℃条件下保温20小时。反应结束后用水洗3遍，乙醇洗5遍后自然干燥,得到的黑色粉末即为四氧化三铁磁性粒子。
(2)取步骤(1)所得四氧化三铁磁性粒子300mg加入到100g 400mmol/L尿素水溶液中超声1小时，然后加入1.25g十六烷基三甲基溴化铵，1.25g正丁醇和5g环己烷，搅拌均匀后加入0.875g正硅酸四乙酯和0.375g 3-氨丙基三乙氧基硅烷。将混合液在70℃反应24小时，反应结束后取沉淀用在80℃丙酮回流24小时。最后收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子。
(3)取34.7mg步骤(2)中制备得到的氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶于5mL PBS中，超声30分钟使其分散均匀。再取18mg木瓜蛋白酶溶于83mL PBS，溶解后加入到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶液中。然后将溶液放到摇床上震荡2小时，使酶与氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子充分接触。
(4)2小时后加入3.8mL氯化铜溶液(120mmol/L),混匀后静置3天。3天后，磁性分离溶液得到沉淀，用去离子水洗5次，最后冷冻干燥得到的粉末即为木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花。
实施例6
(1)将1.2g柠檬酸钠溶于80mL乙二醇中,加入2.6g三氯化铁搅拌至溶解，再加入3.2g乙酸钠搅拌30分钟，将上述溶液在200℃条件下保温20小时。反应结束后用水洗3遍，乙醇洗5遍后自然干燥,得到的黑色粉末即为四氧化三铁磁性粒子。
(2)取步骤(1)所得四氧化三铁磁性粒子300mg加入到100g 400mmol/L尿素水溶液中超声1小时，然后加入1.25g十六烷基三甲基溴化铵，1.25g正丁醇和5g环己烷，搅拌均匀后加入0.875g正硅酸四乙酯和0.375g 3-氨丙基三乙氧基硅烷。将混合液在70℃反应24小时，反应结束后取沉淀用在80℃丙酮回流24小时。最后收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子。
(3)取52.1mg步骤(2)中制备得到的氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶于5mL PBS中，超声30分钟使其分散均匀。再取18mg木瓜蛋白酶溶于83mL PBS，溶解后加入到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶液中。然后将溶液放到摇床上震荡2小时，使酶与氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子充分接触。
(4)2小时后加入5.6mL氯化铜溶液(120mmol/L),混匀后静置3天。3天后，磁性分离溶液得到沉淀，用去离子水洗5次，最后冷冻干燥得到的粉末即为木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花。
实施例7
(1)将1.2g柠檬酸钠溶于80mL乙二醇中,加入2.6g三氯化铁搅拌至溶解，再加入3.2g乙酸钠搅拌30分钟，将上述溶液在200℃条件下保温20小时。反应结束后用水洗3遍，乙醇洗5遍后自然干燥,得到的黑色粉末即为四氧化三铁磁性粒子。
(2)取步骤(1)所得四氧化三铁磁性粒子300mg加入到100g 400mmol/L尿素水溶液中超声1小时，然后加入1.25g十六烷基三甲基溴化铵，1.25g正丁醇和5g环己烷，搅拌均匀后加入0.875g正硅酸四乙酯和0.375g 3-氨丙基三乙氧基硅烷。将混合液在70℃反应24小时，反应结束后取沉淀用在80℃丙酮回流24小时。最后收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子。
(3)取17.4mg步骤(2)中制备得到的氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶于5mL PBS中，超声30分钟使其分散均匀。再取27mg木瓜蛋白酶溶于83mL PBS，溶解后加入到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶液中。然后将溶液放到摇床上震荡2小时，使酶与氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子充分接触。
(4)2小时后加入1.9mL氯化铜溶液(120mmol/L),混匀后静置3天。3天后，磁性分离溶液得到沉淀，用去离子水洗5次，最后冷冻干燥得到的粉末即为木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花。
实施例8
(1)将1.2g柠檬酸钠溶于80mL乙二醇中,加入2.6g三氯化铁搅拌至溶解，再加入3.2g乙酸钠搅拌30分钟，将上述溶液在200℃条件下保温20小时。反应结束后用水洗3遍，乙醇洗5遍后自然干燥,得到的黑色粉末即为四氧化三铁磁性粒子。
(2)取步骤(1)所得四氧化三铁磁性粒子300mg加入到100g 400mmol/L尿素水溶液中超声1小时，然后加入1.25g十六烷基三甲基溴化铵，1.25g正丁醇和5g环己烷，搅拌均匀后加入0.875g正硅酸四乙酯和0.375g 3-氨丙基三乙氧基硅烷。将混合液在70℃反应24小时，反应结束后取沉淀用在80℃丙酮回流24小时。最后收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子。
(3)取34.7mg步骤(2)中制备得到的氨基修饰四氧化三铁磁性粒子溶于5mL PBS中，超声30分钟使其分散均匀。再取27mg木瓜蛋白酶溶于83mL PBS，溶解后加入到氨基修饰四氧化三铁磁性粒子溶液中。然后将溶液放到摇床上震荡2小时，使酶与氨基修饰四氧化三铁磁性粒子充分接触。
(4)2小时后加入3.8mL氯化铜溶液(120mmol/L),混匀后静置3天。3天后，磁性分离溶液得到沉淀，用去离子水洗5次，最后冷冻干燥得到的粉末即为木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花。
实施例9
(1)将1.2g柠檬酸钠溶于80mL乙二醇中,加入2.6g三氯化铁搅拌至溶解，再加入3.2g乙酸钠搅拌30分钟，将上述溶液在200℃条件下保温20小时。反应结束后用水洗3遍，乙醇洗5遍后自然干燥,得到的黑色粉末即为四氧化三铁磁性粒子。
(2)取步骤(1)所得四氧化三铁磁性粒子300mg加入到100g 400mmol/L尿素水溶液中超声1小时，然后加入1.25g十六烷基三甲基溴化铵，1.25g正丁醇和5g环己烷，搅拌均匀后加入0.875g正硅酸四乙酯和0.375g 3-氨丙基三乙氧基硅烷。将混合液在70℃反应24小时，反应结束后取沉淀用在80℃丙酮回流24小时。最后收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子。
(3)取52.1mg步骤(2)中制备得到的氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶于5mL PBS中，超声30分钟使其分散均匀。再取27mg木瓜蛋白酶溶于83mL PBS，溶解后加入到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶液中。然后将溶液放到摇床上震荡2小时，使酶与氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子充分接触。
(4)2小时后加入5.6mL氯化铜溶液(120mmol/L),混匀后静置3天。3天后，磁性分离溶液得到沉淀，用去离子水洗5次，最后冷冻干燥得到的粉末即为木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花。
实施例10
按照所述的酶活检测方法，检测上述实施例1～9的方法制备得到的木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花的催化活性，结果如表1。由表1可知，通过改变木瓜蛋白酶的浓度(0.1～0.3mg/mL)以及反应液中氨基修饰的四氧化三铁与铜的含量，所制备的木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花催化活性为1832～3868U/mg，与游离酶(148±4U/mg)相比提高了12～26倍。
表1.木瓜蛋白酶复合纳米材料的催化活性
实施例11
通过煅烧的方法，检测上述实施例1～9的方法制备得到的木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花的含酶量，然后计算其包埋率与酶活回收率。具体公式如下(游离木瓜蛋白酶酶活为198±56U/mg)：
表2.木瓜蛋白酶复合磁性纳米花的包埋率与酶活回收率
实施例12
将实施例6所得到的木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花用来水解牛奶中蛋白质，具体为：将40mg木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花加入到2.5mL 50％牛奶溶液中，在25℃下对牛奶溶液进行酶催化反应，水浴振荡酶解6h,并且每1h收集反应液。对反应液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测牛奶溶液中剩余的蛋白质含量，从而评价其酶解的程度。通过实验确定最适反应时间为5h，磁性分离从酶解产物中分离木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花，再加入50％牛奶溶液，在上述条件下进行酶解，实现木瓜蛋白酶的循环利用。
木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花经过15次循环利用，牛奶中的蛋白质仍能很好的被其水解。同时对每次循环后的木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花进行酶活测试，发现15次循环利用后的其酶活仍为最初的78％左右，具有良好的循环利用性能。图5为木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花的循环利用性图。由图可知，木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花在水解牛奶中蛋白质的循环利用中始终保持较高酶活，剩余的催化活性还能保持最初的78％左右。
实施例13
将实施例6所得到的木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花放入含水的烧杯中浸泡48h后，烧杯中并没有物质析出。正如图4所呈现的一样，木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花中四氧化三铁磁性粒子、铜离子与木瓜蛋白酶有序且牢固的结合在一起。此外，这种酶催化材料被进行循环利用15次后仍保持了较高的催化活性。综上所述，表明这种固定化酶的方法展现出较好的结构稳定性与操作稳定性。
实施例14
(1)将1.2g柠檬酸钠溶于80mL乙二醇中,加入2.6g三氯化铁搅拌至溶解，再加入3.2g乙酸钠搅拌30分钟，将上述溶液在200℃条件下保温20小时。反应结束后用水洗3遍，乙醇洗5遍后自然干燥,得到的黑色粉末即为四氧化三铁磁性粒子。
(2)取步骤(1)所得四氧化三铁磁性粒子300mg加入到100g 400mmol/L尿素水溶液中超声1小时，然后加入1.25g十六烷基三甲基溴化铵，1.25g正丁醇和5g环己烷，搅拌均匀后加入0.875g正硅酸四乙酯和0.375g 3-氨丙基三乙氧基硅烷。将混合液在70℃反应24小时，反应结束后取沉淀用在80℃丙酮回流24小时。最后收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子。
(3)取17.4mg步骤(2)中制备得到的氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶于5mL PBS中，超声30分钟使其分散均匀。再取9mg木瓜蛋白酶溶于83mL PBS，溶解后加入到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶液中。然后将溶液放到摇床上震荡2小时，使酶与氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子充分接触。
(4)2小时后加入1.9mL氯化铜溶液(120mmol/L)与1.9mL硫酸铜铜溶液(120mmol/L)，混匀后静置3天。3天后，磁性分离溶液得到沉淀，用去离子水洗5次，最后冷冻干燥得到的粉末即为木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花。
实施例15
(1)将1.2g柠檬酸钠溶于80mL乙二醇中,加入2.6g三氯化铁搅拌至溶解，再加入3.2g乙酸钠搅拌30分钟，将上述溶液在200℃条件下保温20小时。反应结束后用水洗3遍，乙醇洗5遍后自然干燥,得到的黑色粉末即为四氧化三铁磁性粒子。
(2)取步骤(1)所得四氧化三铁磁性粒子300mg加入到100g 400mmol/L尿素水溶液中超声1小时，然后加入1.25g十六烷基三甲基溴化铵，1.25g正丁醇和5g环己烷，搅拌均匀后加入0.875g正硅酸四乙酯和0.375g 3-氨丙基三乙氧基硅烷。将混合液在70℃反应24小时，反应结束后取沉淀用在80℃丙酮回流24小时。最后收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子。
(3)取34.7mg步骤(2)中制备得到的氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶于5mL PBS中，超声30分钟使其分散均匀。再取9mg木瓜蛋白酶溶于83mL PBS，溶解后加入到氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子溶液中。然后将溶液放到摇床上震荡2小时，使酶与氨基修饰的四氧化三铁磁性粒子充分接触。
(4)2小时后加入3.8mL氯化铜溶液(120mmol/L)与3.8mL硫酸铜溶液(120mmol/L),混匀后静置3天。3天后，磁性分离溶液得到沉淀，用去离子水洗5次，最后冷冻干燥得到的粉末即为木瓜蛋白酶铁-铜复合磁性纳米花。
Claims (9)
1.一种含木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花的制备方法，其特征在于：该方法是将氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子溶液与木瓜蛋白酶溶液混合后，再加入铜离子无机盐溶液，得到含木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花，
所述氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子按下述方法制得：将100～500mg磁性Fe3O4纳米粒子加入100g浓度为400mmol/L的尿素水溶液中超声，然后按照摩尔比为2:10:6:14:1的比例分别加入溴化十六烷基三甲基铵、正丁醇、环己烷、正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌均匀后在40～70℃条件下反应24小时，其中，十六烷基三甲基溴化铵为1.25g；然后，在60～80℃条件下用丙酮回流24小时，收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述磁性Fe3O4纳米粒子按下述方法制得：将1～5g柠檬酸钠溶于80mL乙二醇中，加入1～5g铁盐搅拌至溶解，再加入1～10g乙酸钠搅拌30分钟，将上述溶液在200℃条件下保温20小时，反应结束后水洗，醇洗，干燥得黑色磁性Fe3O4纳米粒子，所述铁盐为三氯化铁、硫酸亚铁、氢氧化铁中的一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述铜离子无机盐为氯化铜、硫酸铜、溴化铜中的一种或多种混合。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子与木瓜蛋白酶的质量比为1:0.5～1:6。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述木瓜蛋白酶溶液的浓度为0.1～0.5mg/ml；所述氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子溶液的浓度为0.5～5mM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述铜离子无机盐溶液浓度为120～140mM；所述磁性Fe3O4纳米粒子与铜离子无机盐溶液中铜离子的摩尔比为1:1～1:5，优选为1:4。
7.权利要求1～6的任一项所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)将1～5g柠檬酸钠溶于80mL乙二醇中，加入1～5g铁盐搅拌至溶解，再加入1～10g乙酸钠搅拌30分钟，将上述溶液在200℃条件下保温20小时，反应结束后水洗，醇洗，干燥得黑色磁性Fe3O4纳米粒子，所述铁盐为三氯化铁、硫酸亚铁、氢氧化铁中的一种；
(2)将300mg磁性Fe3O4纳米粒子加入100g浓度为400mmol/L的尿素水溶液中超声，然后按照摩尔比为2:10:6:14:1的比例分别加入溴化十六烷基三甲基铵、正丁醇、环己烷、正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌均匀后在40～70℃条件下反应24小时，其中，十六烷基三甲基溴化铵为1.25g；然后，在60～80℃条件下用丙酮回流24小时，收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子；
(3)用水性溶液配制得到浓度为0.1～0.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液；
(4)将步骤(2)中得到的氨基修饰的磁性Fe3O4纳米粒子配制成浓度为0.5～5mM的溶液，加入到步骤(3)得到的木瓜蛋白酶溶液中，摇床震荡2小时；然后加入铜离子无机盐溶液，搅拌均匀后在20～30℃静置24～96小时，使混合液通过自组装的方式合成铁-铜复合磁性纳米花，收集沉淀，经过洗涤、磁性分离、冷冻干燥得到铁-铜复合磁性纳米花。
8.权利要求1～7任一项所述方法制得的含木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花，其特征在于：所述磁性纳米花磁性Fe3O4纳米粒子与木瓜蛋白酶通过氢键的吸附作用结合在一起，然后在磷酸盐缓冲液中与铜离子通过超分子组装的方式形成具有三维花状结构的含木瓜蛋白酶的铁-铜复合磁性纳米花。
9.权利要求8所述磁性脂肪酶纳米花催化材料在水解牛奶中的蛋白质的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN110129290A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-08-16 | 江苏大学 | 金属有机框架材料固定化漆酶及其制备方法和应用 |
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104437280A (zh) * | 2014-11-03 | 2015-03-25 | 西北工业大学 | 一种有机/无机杂化磁性纳米花的制备方法 |
| US20170336398A1 (en) * | 2016-04-26 | 2017-11-23 | Washington State University | Compositions and methods for antigen detection incorporating inorganic nanostructures to amplify detection signals |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104437280A (zh) * | 2014-11-03 | 2015-03-25 | 西北工业大学 | 一种有机/无机杂化磁性纳米花的制备方法 |
| US20170336398A1 (en) * | 2016-04-26 | 2017-11-23 | Washington State University | Compositions and methods for antigen detection incorporating inorganic nanostructures to amplify detection signals |
| CN108130321A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-06-08 | 大连工业大学 | 一种含蛋白酶-无机杂化纳米花的水凝胶及其制备方法和应用 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110129290A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-08-16 | 江苏大学 | 金属有机框架材料固定化漆酶及其制备方法和应用 |
| CN110129290B (zh) * | 2019-04-03 | 2022-10-28 | 江苏大学 | 金属有机框架材料固定化漆酶及其制备方法和应用 |
| CN111849959A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-10-30 | 威海百合功能食品技术研究院有限公司 | 一种利用共固定双酶催化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法 |
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