JPS592694A - 遊離Ｌα−アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、個別に取り出されたα−アミノ酸のＤ対掌体
まｋはラセミ混合物中のＤ対掌体を完全に転化すること
による、Ｌ（ｆ−７ミノ酸の製造法に関する。

発明の背景 α−アミノ酸の利用は、最近かなりの段階まで発展して
きており、特に薬用および食品用の分野においてめざま
しく、特にＬ列のａ　−７ミノ酸の製造は、増々重要に
なってきている。

今までに主に３種のＬ　ａ　−７ミノ酸の製造法が知ら
れている。即ち下記の通りである。

ｔ　天然たん白質の加水分解物を利用する製法で、この
製法の難点は各々のアミノ酸の分離および精製にある。

２、　発酵法による製法で、この製法は１の製法よりは
有利であるが必要とするすべてのα−アミノ酸の製造を
行うことができない点に難点がある。

五　化学谷底による製法で、簡単に多量のａ−アミノ酸
を製造することができるが、この製法の難点は、実質上
う七ミ混合物ができてしまうことである。

経済的観点から将来にわ１こって鍛も有力であるとみら
れる第６の製造法を有利にするには、ラセミ混合物を分
割する一般的方法を開発する必要があり、これが開発で
きるかど５かにかかつている。

この点については、ｃｌ　−７ミノ酸の製造に酵素を利
用する方法が、現在のところ、物理的または化学的分離
を利用する従来法゛よりはるかに有利である。この目的
で現在使用されている酵素には、例えばロイシン・７ミ
ノ・ペプチダーゼ（ＬＡＰ）のようなエキソペプチダー
ゼがあり、これらは、ＤＬα−アミノ酸のアミドから、
Ｌ−鏡像異性体のみを加水分、解する。（１９７２年発
行のＲ，ＫｏｅｌｓｈによるＥｎｚｙｍｏｌｏｇｌａ、
　４２巻、２５７頁参照） ＬＡＰ Ｄ　Ｌ　−Ｒ−ＣＨＯＯＮＨ２＋　Ｉ２０Ｈ２ Ｎ）１２Ｎ）Ｉ２ カルボキシペプチダーゼは、同様な機構で、ある種のア
ミノ酸のＮ−クロロアセチル誘導体の製造に使用されて
きている。（１９５５年発行のＮ、　Ｇｒｕｂｈｏｆｅ
ｒおよびり、　８ｃｈｌｅｉｔｈ　　によるＮａｔｕｒ
ｗｉａａｅｎａｈａｆｔａｎ　　４０巻、５０８頁を参
照）ＤＬ　Ｃｌ０ＨＧｏ−Ｎ−ＯＨ−Ｇｏ２Ｈ１ Ｌ−アラニン＋Ｄ　Ｃｌ０Ｈ２Ｇｏ−Ａｌｔこれら２つ
の笑例におい℃は、Ｄ−異性体が転化しな（・ので、Ｌ
−異性体の収率な、５０％以上にすることができない。

この酵素法についての改良は、酵素作用とラセミ化法の
化学的方法と組合せることにより達成されてきている。

（Ａｃａｄｅｍｉｏ　Ｐｒｅｓｇ　　の１９７６年発行
の、１．（＋ｈｉｂａｔａ、　Ｔ、Ｔｏｓａ、　Ｔ、８
ａｔｏ、　　およびＴ、Ｍｏｒｉによる　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　４４巻、７４６頁
および１９７２年、日本において、５ｏｃｉｅｔｙ　ｏ
ｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
　より発行されたＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｔｅｏｈ
ｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、の３８５負に記載され７Ｃ
１，Ｃｈｉｂａｔａ、　Ｔ、Ｔｏｓａ、　Ｔ。

８ａｔｏ、’Ｔ、ＭｏｒｉおよびＹ、Ｍａｔｕｏによる
第４回国際発酵シンポジウムの議事録参照） 最もよく知られている例は、固定化アミノ７シラーゼ酵
素を利用するもので、ＤＬＲ−アセチル７ミノ酸から、
Ｌ−異性体のみを加水分解するものである。

Ｌ−アミノ酸は、溶媒を濃縮してから結晶化させること
により媒質から分離できる。

残留Ｄ−アセチル’　””　７　ミノ酸は、無水下に無
水酢酸で処理すると、ＤＬ２−メチル５〜オキサゾリン
を生成する。次にこれを加水分解し、ＤＬＮ−７セチル
アミノ酸をつくり、これを、再度、７ミノ７シラーゼで
処理する。連続工程により、ごの製造法ではラセミ混合
物を最終的には完全にＬ−異性体のかたちで回収するこ
とができる。

このような製法によつ工かなりの進歩が達成されたが、
この製造法の難点は、使用される酵素触媒と、触媒を必
要としない化学的方法によるラセミ化段階とが全く異な
る突流条件を必要とするところにある。実際、水溶液中
において行われる酵素による加水分解段階を経、製造さ
れ７ＣＬα−７ミノ酸を分離する１こめの第１濃縮を行
った後、水を完全に除去してから、無水酢酸で置換する
必要があり、無水酢酸は、それぞれのラセミ化工程で化
学量論量的に消費される。

その上、酵累作用工程にもどす際は、媒質中で生成した
酢酸を再蒸発させ、水におきかえる必要がある。この製
法は利点もあるが、技術上も煩雑であり、また経済的見
地からも難点がある。

発明の概要 本発明は、Ｌα−アミノ酸の製造方法に関し、個別で存
在するか、ラセミ混合物中に存在するＤ対掌体を完全に
転化することにより、Ｌα−７ミノ酸を製造するもので
、適確に従来方法による難点を解決することができる。

本発明の製造法は、酵素触媒工程と同一の反応条件（溶
媒。

−２温度９下に実施することのできる、化学的触媒ラセ
ミ化工程を、酵素触媒工程と相互結合的に導入すること
によるものである。

さらに、本発明の製造法においては、それが一つの目的
でもあるが、試薬かラセミ化工程で消費されない点で注
目できる。また単一の溶媒を使用することにより、非常
に単純でしかも経済的な連続製造法とすることができる
。

本発明の製造法では、’　”−７ミノ酸エステルのＤ一
対掌体な、一般式 ％式％（） （式中、Ａｒは、芳香族環であり、環内に窒素のような
ヘテロ原子を含有していてもよく、Ｂは、塩基性基であ
る。） で示される芳香族アルデヒドの１種以上からなる化学触
媒の存在下にラセミ化させることにより、上記エステル
のＤおよびＬの２種の異性体の動的平衡にある混合物を
製造し、Ｌ型状態にあるエステルを、対応する立体安定
性のＬσ−アミノ酸を製造するために、酵素により加水
分解し、次いで遊離Ｌ（１−アミノ酸を回収するもので
あり、上記の化学的ラセミ化工程乙酵素作用による力υ
水分解工程の両方を同一反応条件下に行うことを特徴と
している。

本発明についてのその他の特徴および利点は、下記の詳
細な説明によってさらに詳しく説明する。

まず第一に、本発明者等は、α−アミノ酸のいくつかの
誘導体、そして特にその光学活性エステル類（Ｄ−配置
またはＬ−配置のエステル）は、これらを、ある種のカ
ルボニル化合物またはこれらの混合物の存在下に置くと
、ラセミ化することを発見した。上記ラセミ化は、種々
のタイプの溶媒の存在下、例えはアルコール、特に、メ
タノール、エタノール、グロパノールおよびイソグロパ
ノールのような低級脂肪族フルコール、ホルムアミド、
ジメチルホルムアミド、水またはこれらの混合物の存在
下に起る。

また効峯的なラセミ化は特に水中下でしかも酵素がその
最大触媒活性を示す生理学上の温度および一状態下にお
いて達成される。

特に下記の温度および明条件が生理学上好ましい状態で
ある。即ち、０〜５０℃、さらに好ましくは２０〜４０
℃であり、５〜１ｏｆ）Ｐ）（、さらに好ましくは６〜
９の−である。

本発明の製造法を実施する際のう七ミ化触媒として使用
できるフルグヒドは、一般式、＼　　　　　（“） （式中、Ａｒは、芳香族環であり、窒素のようなヘテロ
原子を含有するものであってもよく、Ｂは、塩基性基で
ある。ノ で示される。

本発明の範鴫で使用することのできる芳香族アルデヒド
は、詳しくは一般式 （式中、Ａｒは、５〜７員の芳香族環であり、また窒素
のような１個のへテロ原子を含むものでもよく、Ｂは、
第３級アミン、または、−ｓｏ２−、−ｏｐｏ、　　、
−０ＰＯ，Ｈ−および−ｓｏ、−のような酸性基のイオ
ン化から生じた陰イオンのような塩基性基であり、ｍお
よびｎは０〜５の整数である。） で示される。

本発明の製造法を実施する際に最も有用なアルデヒドは
、水溶性アルデヒドであり、特に一般式（１）および（
Ｉｌ）で示されるアルデヒドであり、例えば、ピリジン
２−アルデヒドおよびピリジン４−アルデヒドのよ５な
Ａｒ部分が、−ＯＨ。

−８ｏ、Ｈのような親水性基またはＣ１〜５　の低級フ
ルキル基およびＣ１〜５　の低級ヒドロキシフルキル基
のような他の基によって官能化されているものである。

さらに詳しくは、本発明は、ラセミ化触媒として、下記
の一般式で示されるアルデヒドを使用する製造法に関す
る。

（式中、Ｂは、第３級アミンまたは、−ｓｏ２−　。

−０ＰＯ，＝、−０ＰＯ，Ｈ−および−５ｏｉのよ５な
酸性基のイオン化から導ひかれた陰イオンのような塩基
性基である。） ラセミ化触媒として利用するのに好ましい、一般式ψη
で示されるアルデヒドの具体例としては、ピリドキサル
ー５′−ホス７エー）　（Ｐｙｒｉｄｏｘａ　１−５’
　−Ｐｈｏｇｐｈａｔｓ　）および５’−５−カルボキ
シメチルーチオピリドキサルを挙げることができる。溶
液中にお（・てこれら２つのアルデヒドは各々下記の陰
イオンにイオン化される。

一般式（ホ）で示されるアルデヒド中、ピリドキサルー
５′−ホスフェート（’Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ　−５’−
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　）のように（・くつかの化合物は
公知であるが、ｓ’−ｓ−カルボキシメチルチオピリド
キサルのようにい（っかの化合物は新規である。これら
新規化合物は、下記の５／−カルボキシメチルチオピリ
ドキサルの製造法の例に示すような工程と同様な製造法
によっつ（ることかできる。製造法を、下記の反応図式
により説明する。

５Ｃ 〔ピリドキサルの構造類似体の合成〕 塩酸塩（ｈｙａｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）　（ａ）のかた
ちのビタミンＢ６（ピリドキシン）の５ｇを２５０　Ｗ
Ｉ／のアセトン中に懸濁させた。ガス状塩化水素をこの
混合物中に生成物が完全に溶解するまで導入する。こノ
溶液を、栓をしたエルシンマイヤーフラスコ中で室温で
１時間放置してから、エチルエーテルを３容量を添加す
る。環状ケクール（ｂ）が、その塩酸塩のかたちで直ち
に沈澱するが、結晶化させるために一夜５℃で放置して
お（。

化合物（ｂ）を濾過により分離し、エーテルで洗浄して
から、４０℃の真空下で、１Ｍが一定となるまで乾燥さ
せる。収率は９５％である。

１．９の化合物（ｂ）を、１５Ｉ／の５ｏａｒ２中に溶
解してから、室温で１時間放置する。

溶媒を蒸発させた後、錠剤のかたちのソーダの存在下に
真空に保つと、塩素化誘導体（０）が、白色粉末のかた
ちで回収される。

この操作の収率は、実質上定量的であった。

塩素化誘導体（Ｃ）は、異なる求核物質と反応すること
ができるので、各種合成に際して利用す−ることのでき
る出発物質となり得る。検討された求核物質中で最も活
性の高いものがメルカプタンであることが判明した。こ
の反応図式は２種の合成例を説明するものである。

（５／−８−カルボキシメチルチオピリドキサル（幻の
製造〕 塩酸塩のかたちの化合物（０）の１０−３モルを、５　
ｍｌのメタノール中に溶解し、この溶液に、２×１０　
モルのチオグリコール酸を添加する。

さらにソーダ中のＮメタノール４　ｒｎｌを添加する。

最初の数分間にＮｈｏｌが沈澱しはじめるか、さらにこ
の反応を、５０℃で３時間保って続行させる。Ｍａｉｌ
　　をＦ’遇により除去してから、Ｐ液を減圧下Ｋ１１
ｌ縮した後、５１／（７’）、ａＨ３ｏＨ：Ｈａｒ（３
６％）＝８：２の混合物に溶解する。この溶液を５０℃
で３時間放置する。）ｌｈｃｌ　を濾過により凧去して
から、ｒ液を、減圧下に乾燥するまで蒸発させる。生成
物（６）は、エチルエーテルを添加することによりその
塩酸塩のかたちで結晶化する。収率は７６％である。

化合物（ｅｌを水中に溶解し又、１０　　Ｍの濃度にし
てから、？−ダを使用して、ｐＨ７に調整する。ＭｎＯ
２の添加後（化合物（ｅ）の１１に付き５Ｉに相当する
量）、この懸濁液を室温で４〜５時間にわたって、激し
く攪拌し続ける。ＭｎＯ２は遠心分離により除去され、
生成物（幻は、水を蒸発させると単離できるか、水溶液
のままで使用してもよい。

チオグリコール酸の代りにメルカプトエタノールを使用
して、同じ合成法により、化合物（ｇ）までの合成を行
うこともできるか、この化合物は、ラセミ化の際の触媒
活性があまり強くないことが判った。

このように発明者等はこれら芳香族アルデヒド、そして
特に一般式（ホ）で示されるビリドキサルの構造類似体
は、均一相であっても、または反応媒質中に不溶性の担
体上に固定した不均一相であり又も、ラセミ化触媒とし
て完全に満足すべき状態で使用することができることを
発見した。この種の固定は、陰イオン交換樹脂とのイオ
ン結合によるとか６．または適当な官能化後に製造され
た共有結合によるとかの従来公知の方法のいずれによっ
ても行うことができる。

本発明の追加の％徴としては、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）
または（ＩＩＩで示される芳香族化合物の１種または２
種以上からなるラセミ化触媒は、出発物質であるＤ（１
−７ミノ酸エステルについての化学量論量の４倍以下、
より好ましくは、化学量論量の１倍以下の割合で、反応
媒質中に導入することがある。

さらに詳しくは、すでに限定した反応条件下（例えば、
水溶液中で、ｐｌ−１７〜８の状態下）で、０．１モル
／４３の濃度のピリドキナル５Ｉ−ホスフ１子トの存在
下に、２０℃で、エステル濃度とピリドキナル５′−ホ
スフエ−１（Ｐｙ　ｒｉｄ　ｏｘ　ａ　１−５’−Ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ　）の濃度とが実質的に等しくなるよ５
にして、ＤまたはＬα−アミノ酸メチルエステルなラセ
ミ化すると、２〜１０分の％反応時間でラセミ化する。

このタイプのラセミ化は、詳しくはアラニン、アルギニ
ン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グ
ルタミン、ロイシン、リシン、β−フェニルアラニン、
セリン、チロシン、トリプトファン、シスチンおよびメ
チオニンのメチルエステルにおいて達成された。

第１段階の化学的触媒う七ミ化に供することのできるエ
ステルは、主としてアルキルエステルであり、チオエス
テルのように活性化されたフルキルエステルであっても
よく、使用されるα−７ミノ酸は、Ｄ一対掌体のかたち
のものでも、ラセミ混合物のかたちのものでもよい。こ
れらは、遊離塩基のかたち、または塩として使用しても
よい。

さらに、ラセミ化率は、使用するエステルの化学的性質
による・ものであることも判った。例えば、メチルエス
テルから、エチルエステルおよびイソプロピルエステル
へと進むＫつれ、ラセミ化率は低下する。

また、本発−明者等は、ラセミ化率は、アルデヒドの濃
度の関数（ｒｕｎａｔｉｏｎ）　が高くなると上ること
も発見した。アルデヒドの濃度が、ａ−アミノ酸のエス
テルの濃度より明らかに低くなると、ラセミ化率は低下
１°るか、それでも、ｄ−アミノ酸エステルは丁べてラ
セミ化する。このことは、ａ−アミノ酸エステルのラセ
ミ化工程において、アルデヒドが触媒能を有することを
示し又いる。

さらに、遊離α−７ミノ酸は、ａ−アミノ酸のエステル
とは異なり、同一の反応条件下においてアルデヒドを存
在させてもラセミ化しないことも注目すべき点である。

このことは、後述するように、本発明の製造法において
非常に重要である。

最後に、例えば、Ｍｇ、　Ｏａ、　Ｂｕ、　Ｚｎ、　Ｃ
ｄ、　Ｈｇ。

Ｓｎ、　Ｐｂ、　Ｍｎ、　Ｆｅ、　Ｃｏ、　Ｎｉ、　Ｇ
ｕおよびＡ／のような金属から導ひかれるような、金属
陽イオンが、反応媒質中に存在しないように注意する必
要があり、これらが存在すると、遊離ａ−７ミノ酸を、
ラセミ化することも、脱アミノ化することもできなくな
ってしまう。

上記したような種々の観察に基づき、本発明者等は、下
記の機構による化学的触媒ラセミ化について説明するが
、この説明は本発明に伺も制限を与えるものでな（・こ
とは明白である。

Ｌ　　　　　　　　　Ｌシッフ塩基 観察される中間体は、カルバニオンへのバスであり、こ
れは二重に好ましい。即ち、−力ではエステルのカルボ
ニル基とイミン基との共役により、他力では、非対称の
炭素（不整炭素）の陽子を不安定化する、塩基性基（Ｂ
）の分子間補助によってである。

さらに、この塩基性基の重要性は、下記に示す化合物（
ｆ）および化合物（ｇ）の触媒能との明白な差異を観察
することによって明らかになる。

（ｆ）　　　　　　　　　　（ｇ） 事実、−〇〇〇−基を０Ｈ２０Ｈ基で置換すれは、塩基
性かかなり低下するので、触媒として見た場合、化合物
（ｇ）は、化合物（ｆ′）と比較してかなり活性が低く
なる。即ち、これは、う七ミ化現象において、２官能性
触媒が有用であることを明白に示している。

上記の一般式を持つアルデヒドは、アルデヒド基と塩基
性基とが連合している二官能性触媒と考えられ、アルデ
ヒド基は、アミノ酸エステルのシッフ塩基になり、塩基
性基は、カルバニオン、ラセミ化中間体の生成にかかわ
っている。

しかし、分子間機構において最大の効力を示す塩基性触
媒も、また分子間機構中に認められる。

事実、本発明者等は、アミノ酸エステルのラセミ化を、
単一の芳香族アルデヒド（例えば、塩基性１乞含まない
ビリドキサルの類似体）の存在下に行う場合、その反応
媒質中に、カルボキシレートアニオン（酢酸ナトリウム
、または酢酸トリフルキル７ンモニウム）のような塩基
性基を存在させると、実質上ラセミ化率が上ることを観
察した。上記う七ミ化の際も、反応温度および一条件は
一定に保って行う。

最後に、遊離α−アミノ酸の場合、エステル基がないの
で、非対称炭素Ｃ不整炭素）Ｋ結合している陽子の転移
（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）が生じない。

上記の図式によるように、ａ−７ミノ酸エステルの一部
は、エステルと触媒の濃度比によって這−よ・、る一定
の割合でシップ塩基のかたちにとどまる。

経済的見地から、適当なラセミ化率（シッフ塩基のかた
ちにされたエステルの濃度か高くなるにつれ加速される
。ンを達成でき、しかも酵素加水分解にかけることがで
きるために必要とされる、平衡状態にある遊離エステル
のかなり高い濃度を確保することができるように考慮し
て、触媒とエステルの比尊を決定する。

以上、ラセミ化工程について観察し、説明してきたが、
本発明におけるα−アミノ酸エステルは、特定の酵素用
の基質と考えてもよいことは注目すべき点である。

さらに、ラセミ化作用かなされる条件は、酵素作用に一
般的に必要とされる条件と完全に一致し又いる。

事実、’　”−７ミノ酸の特定カルボキシル銹導体は、
そのエステルをも含めて、酵素・触媒により加水分解す
ることにより、遊離ａ−アミノ酸を製造することができ
ることも公知である。これら酵素のりちσ八・くつかは
、高いキラリティー　（ｏｈｉｒａｌｉｔｙ）を持って
おり、混在するＤ対掌体を変化させずに、Ｌ異性体のみ
を加水分解する。

本発昨者等は、このような酵素触媒でも、これを上記し
たよ５ンよラセミ化触媒と組合せて、α−アミノ酸のエ
ステルに使用すると、Ｄ配置、Ｌ配装置およびこれら２
種の対掌体のあらゆる比率の混合物のいずれの場合にお
いてもＬｓの遊Ｍ１ａ　−７ミノ酸のみを製造すること
かでき、しかも出発物質のα−アミノ酸エステルに対し
て高収率で製造することを発見した。

本発明の製造にお（・て高収率が得られるのは、酵素反
応の基質は、ラセミ化平衡にあるが、不可逆反応により
生成した反応生成物は、同一条件下に安定であり、どん
どん蓄積されてゆくためである。

本発明の製造法の一般的反応原理は下記のよ５に単純化
することができる。

配置転換を説明するこの一般図式において、第１段階は
、Ｄ、Ｌまたは、ＤＬα−アミノ酸のエステル化であり
、このためにはすでに公知の種々の試薬が使用でき、例
えは、酸触媒と混合されたアルコール、硫酸メチル、亜
硫酸メチルのようなものが使用される。

エステルからは、すでに示された２種の触媒が使用され
る。即ち酵素用の基質として製造されたラセミ触媒と酵
素触媒とが、均一系中で互いに作用する。本発明の操作
は、最も単純に実施することができるが、少々の難点も
あり、そのうちの最大の難点か、遊離”　−７ミノ酸の
分離と、触媒の回収を行う必要がある点である。

さらに、ラセミ化触媒と、酵素の特定官能基との間に起
る化学反応が、触媒の活性を低下させる可能性があり、
また酵素の触媒活性を変質させてしまう可能性がある。

このため、この２種の触媒は反応媒質中に固足すること
により、これらを分離したｌｓにして使用するのが好ま
しい。例えば触媒を反応媒質中に不溶性である担体上に
担持させるとかの方法をとる。

２種の触媒を担持している不治性担体は、２つの別々の
反応器に充填するための物質として使用することができ
、この２つの反応器を、液状媒質の循環システムによっ
て連結してお（。

さらに単純化されたシステムは、２種の触媒を担粕して
いる不溶性担体を、単−反応器中で反応媒質と混合する
ことによって行ってもよい。

２種の触媒に連続性を与えた反応器のモデルとしては、
循環反応器中に、２種の固定化触媒を交互につみ上げた
層の集まりからなるものを挙げることができる。

酵素は、この発明の技術分野における公知方法のいずれ
かによって固定化することができる。

そして、アルデヒドからなるラセミ化触媒についても同
様に公知方法で固定化することができる。

本発明を実施するに際して、アルデヒドからなるラセミ
化触媒は、ジメチルアミノエーテル５ｅｐｈａｄｅｘ■
のような陰イオン交換樹脂、ジメチルアミノエチルセル
ロース、または第４級アンモニウムをかかえたポリスチ
レンマトリックスを持つ樹脂を担体として使用した。例
えば、ビリドキサルホスフエート（Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ
　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、上記したまうな一範囲内で
、このような樹脂上に、完全なイオン状態で付着してい
る。

本発明の製造法において使用される酵素は、単一相中に
あるか、または、反応媒質中に不溶性である担体、例え
ばポリアクリル系マトリックスまたはポリ糖類マトリッ
クスに付着している。

これらの反応における、不溶性担体および固定化法につ
いては、実施物中で詳細に述べるが本発明は、これらに
より何ら制限を受けるものではない。

本発明の製造法において、最も一般的に使用することの
できる酵素は、トリプシン、ａ−キモトリプシン、パパ
イン、キモパパインおよびロイシン７ミノベプチダーゼ
のような加水分解酵素である。ここに挙げられたものだ
けに限られず広範囲の加水分解酵素が使用できる。酵素
の選択は、製造しようとしているａ−アミノ酸につ（・
ての、各々の特異性により決定する。

本発明の製造法は基本的には、Ｌα−７ミノ酸の製造を
目的としているが、さらに、不活性または活性のα−ア
ミノ酸から、α−炭素によって担持さに丈陽子を、重水
または三重水中で処理することにより、ジュラオリラム
またはトリチウムによって置換させたものを製造しても
よい。

下記の実施例によって、本発明の製造法をさらに詳細に
説明するが、これら＊飾物は本発明を伺ら制限しようと
するものではない。

これらの実施例は、均一相におけるラセミ化に関する。

これらの実施例においては、塩酸塩のかたちのＬまたは
Ｄα−アミノ酸エステルの、　　１０”モル水溶液を、
これにソーダを添加することによりｐＨ７に調整してお
き、これにα−アミノ酸エステルのモル濃度より低いか
同一のモル濃度の、ピリドキサルー５／−ホスフェ−）
　（Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ−５’　−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
）　（ＰＪ（７）の水溶液を同容量添加する。温度を、
適当な温度、例えは２０℃で一定に保った。

溶液の旋光力を、マイクロ旋光計で、５４６止　で連続
的に追跡した。この溶液の旋光力が０になった時（温度
、およびエステル：ピリドキサルの濃度比により変化す
る％反応時間へ反応媒質を、薄層クロマトグラフィーに
より分析し、エステル基が化学的に加水分解されたかど
うか調べるために出発時溶液と比較する。

種々のａ−７ミノ酸についての結果を、下記の表１に示
す。

実施例１１ 本実施例は、不均一相およびラセミ混合物の酵素溶液中
におけるラセミ化に関する。

本実施例では、ピリドキサルー５／−ホスフェート（Ｐ
ｙｒｉｄｏｘａｌ　−５’−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の０
．５１０−２モル水中溶液をつくり、−を７に調整する
こと〜により、母液をつ（つた。

この溶液の５０マイクロリツトルを、５ｔｎｌの酢酸塩
緩衝液（ｐ）１５．４）中に希釈し、光学濃度を４００
　ｎｍ　で測定した。次に３ｇのジエチル７ミノエチル
セルロース樹脂を、２０１／の母液に添加し、懸濁液を
、攪拌下にｐＨ７に保った。

５分後、この懸濁液をうつしかえ、５０マイクロリツト
ルの上澄み液を取り、上記の条件下に４００　ｎｍ　で
旋光分析にかけた。光学濃度が０になると、ピリドキサ
ルー５１−ホスフェートは、担体上に完全に固定された
ことになる。

このようにして得られた溶液に、Ｄチロシン−ソチルエ
ステルを添加し、鍛終ａ度が１０−２モルとなるように
した。この懸濁液を、２０℃の一定温度に保って攪拌し
続けた。

次に３種のサンプルを、一定時間経過するごとに取り出
した。

第１サンプルは、自動分析により分析したところ、媒体
中には遊離ａ−アミノ酸の濃跡か認められないことを示
した。

第２サンプルは、適当に希釈してから、分光光度計で分
析し、上澄み液中に存在する唯一の発色団である遊離チ
ロシンメチルエステルの濃度を決定するため、分光光度
計（λｍａｘ、２．７４ｎｍ　　）で分析した。（損失
部分は、触媒に付着したままである。） 第３サンプルは、対応エステルからＬｆｆ−７ミノ酸を
分離することのできるキモトリプシンによる加水分解を
行った。

得られた結果について、下記の表２に示す。

表　　　２ 実施例１２ 温度を４０℃で行う以外は実施例１１と同じ実験手順で
行ったところ、下記の表３のような結果が得られた。

表　　６ 実施例１６ 本実施例は、５’−８−カルボキシメチルチオピリドキ
サルを使用し、ラセミ混合物溶液を均一相でラセミ化す
る場合に関する。

１０　　Ｍの５／−８−カルボキシメチルチオピリドキ
サル水溶液の５　ｍｅをｐＨ７に調整してから、５Ｘ−
１０ＭのＤ−フェニルアラニンメチルエステル水溶液を
ｓ　ｍｅ％ｐ）（７で添加する。混合物を２０℃の温度
下に攪拌し続ける。

一定時間経過後（表４をか照）、反応混合物の１１／を
、５％のＮａＨＣＯ，水溶液の１ｒｎ／で希釈し、水で
飽和された酢酸エチルの２＃Ｉ／を使用して抽出する。

この処理によって、水相に残留しているラセミ化触媒を
きれいに分離することができ、有機相中には、ａ−アミ
ノ酸エステルが含有されている。

有機相の留分を蒸発させ、酸による加水分解にかけ、自
動α−アミノ酸分析器中で分析する。

この操作により、抽出により分離されたα−アミノ酸エ
ステルを定量的に決定することができる。

他の留分を蒸発させ、ａ−キモトリプシンで処理する。

放出されたフェニルアラニンを、自動分析器で分析する
。この分析により、混合物中に存在するＬ異性体の留分
を決定することができる。

クロマトグラフィーにかけると、出発酢酸エチル相中に
遊離のフェニルアラニンが存在しないことが判った。

得られた結果は下記の表４に示す。

表　　４ 実施例１４ 実施例１１に記載されている濃度と同一の濃度（２０＃
Ｉ／の０．５１０Ｍ溶液に３ｇのジエチルアミノエチル
セルロース樹脂、即ち０．１ミリ当量）で、実施例１１
および１２に記載されたようにして、ピリドキサル、−
５′−ホスフェート（Ｐｙｒｌｏｘａｌ　−５’　−Ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ）　　を固定化する。

この溶液に、５０．９■のＤトリプトファンメチルエス
テルを、塩酸塩のかたちで添加する。

（０，２ぼり当量）、−を７に調整し、４０℃の温度に
保つ。

２０１１Ｉｇのキモトリプシンをこの溶液に加える。

５０分間反応させた後、担体上に固足されたヒ０リシ゛
・キサルホスフエπトを媒質中がら濾過によって分離す
る。上澄み液を測定したところ、１７ｍ／あった。アリ
コート部分を、まず２つの分析にかけた。

１、　クロマトグラフィーにがけ゛たところ、α−アミ
ノ酸エステルは完全にな（なり、液相中に遊離’　−７
ミノ酸のみが存在することが判った。

２　自動分析器による第２の定量分析では、分離された
上澄み液中に存在する遊離トリプトファンの量が、媒質
中に最終的に導入されたエステルのモル愈の４０％に相
当することを示している。（残りの６０％は、直接担体
上に固定されているか、担体をひたしている液相と同様
に触媒を通じて担体に固定されているものと考えられる
。〕 １７ｒｎｌの水および１６．５ｍｇのＤトリプトファン
メチルエステル（すでに加水分解されたトリプトファン
の量に相当する）、さらに１０ｒｎ９のキモトリプシン
を、ラセミ化触媒を含有する固体相に添加する。

４０℃で、新たに６０分間反応させた後、再び２層に分
離する。遊離酸トリプトファンが確認される。この反応
の転化津： Ｄトリプトファンエステル→遊離り酸は、最終添加で比
較した場合、定量的である。

上澄み液を、凍結乾燥させ、遊離α−アミノ酸を、１％
の酢酸で平衡状態にした５ｅｐｈａｄｅｘ■Ｇ２５上で
ｒ遇することにより精製する。

ａ−７ミノ酸を含有する留分を、再び凍結乾燥し、次に
α−アミノ酸を、メタノール−塩化チオニル法によって
室温でエステル化する。

このようにして得られたエステルを、再びピリドキサル
ホスフエニトを存在させずに、キモトリプシンによる加
水分解する。

エステル全部が、直ちに加水分解され、遊離ａ−アミノ
酸が生成するが、このアミノ酸はすべてＬ型に属するも
のであることを示している。

Ｄα−アミノ酸のエステルについて平行実験を行ったが
、比較条件下に遊離ａ−アミノ酸の生成は認められなか
った。

実施例１５ Ｄチロシンメチルエステルを、実施例１４のＤトリプト
ファンと同様に処理した。

第１段階のＬチロシンの回収率は、４２％であった。

同−触媒下に、Ｌチロシンの第１段階留分をＤチロシン
エステルの同量で置き換えた場合、実施例１４と同一の
操作条件下において、すぐれた転化ヰでＬ−チロシンを
製造することができた。

このａ−アミノ酸の立体列は上記したようにして調整し
た。

実施例１６ 実施例１４におけるのと同一の操作条件下に、Ｄフェニ
ル７ラニンメチルエステルを処理スルことにより第１段
階で、３９％のＬフェニルアラニンを製造する。（逆に
いえは、６１％が担体上に固定されて残留している。） 第２追加は、第３追加と同様に、足蓋的に転化した。従
つく、この系においては連続式で操作することができる
。

本発明は、当然のことながら、上記に示′された特定の
実施例によって制限されるものではない。他力、本発明
の範噂から脱しない限り、様々な変更を加えることがで
きる。特に、ラセミ化Ｋかけるエステルおよびラセミ化
に使用するアルデヒド触媒の選択に関しては、様々な変
更が可能である。本発明の製造法によれは、極めて一般
的な方法により種々のα−アミノ酸のＤ対掌体の配置か
らの精留を行うことができる。

α−アミノ酸の具体例としては、例えば、７ラニン、バ
リン、ロイシン、イソロイシン、β−フェニルアラニン
、セリン、トレオニン、リシン、δ−ヒドロキシリシン
、フルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタ
ミン酸、グルタミン、システィン、シスチン、メチオニ
ン、チロシン、チロキシン、プロリン、ヒドロキシプロ
リン、トリプトファン、およびヒスチジンを挙げること
ができる。

第１頁の続き ■出　願　人　エンステイテユ・ナショナル・ドウ・う
・サンナ・工・ドウ・ う・ラシエルシュ・メディカル フランス国７５０１３パリ・リュ・ ドウ・トルビッツ２１０１番地 ５１８−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＋１）　　（１−アミノ酸エステルのＤ対掌体を、一般
   式 ％式％（ （式中、　Ａｒは、芳香族環であり、ヘテロ原子を含有
   する芳香族環であってもよく、Ｂは、塩基性塞ごある。 ） で示される芳香族アルデヒドの１種以上からなる化学触
   媒の存在下にラセミ化することにより、該エステルのＤ
   型およびＬ型の動的平衝にある混合物を製造し、Ｌ型と
   して存在するエステルを、酵素作用により不可逆的に加
   水分解し、対応する立体安定性ＬＤ　−７ミノ酸を製造
   し、遊離Ｌ（７−７ミノ酸を（ロ）収する製造法であっ
   て、上記化零的ラセミ化工程と酵素作用による加水分解
   工程を、同一の反応条件下に行う、遊離Ｌα−アミノ酸
   の製造法。 （２）　　へテロ原子が窒素である特許請求の範囲第１
   項記載の製造法。 （３）　　芳香族アルデヒドが、一般式（式中、Ａｒは
   、５〜７員の芳香族環であって、ヘテロ原子を含有する
   芳香族環であってもよ（、Ｂは、塩基性基であり、ｍお
   よびｎは、０〜５の整数である。ン で示されるものである特許請求の範囲第１項記載の製造
   法。 （４）　　へテロ原子が、窒素である特許請求の範囲第
   ３項記載の製造法。 （５）Ｂが、第３級アミンまたは酸基のイオン化から導
   ひかれる陰イオンである特許請求の範囲第３項記載の製
   造法。 （６）酸基が、−ｃｏ；　、　−ｏｐｏ；−、−０ＰＯ
   ，Ｈ−、または−ＳＯ；である特許請求の範囲第５項記
   載の製造法。 （７）　　芳香族１ルヒドが、一般式 （式中、Ｂは、塩基性基である。） で示されるものである特許請求の範囲第１項記載の製造
   法。 （８）Ｂが、第５級７ミンま１こは、酸基のイオン化か
   ら導ひかれた陰イオンである特許請求の範囲第７項記載
   の製造法。 （９）酸基が、−ｃｏｉ、、　−ｏｐｏｉ−、−０ＰＯ
   ３Ｈ−、および−ＳＯ，−から選択されｋものである特
   許請求の範囲第８項記載の製造法。 顛　式（Ｉｎで示される芳香族アルデヒドにおいて、塩
   基性基Ｂが、−ｃＨ２−ｏ−ｐｏｉ−基である、特許請
   求の範囲第７項記載の製造法。 Ｉ　式（ホ）で示される芳香族アルデヒドにおいて、塩
   基性基Ｂか、−ｃｕ２−ｓ−ｃＨ２−ｃｏ２−基である
   、特許請求の範囲第７項記載の製造法。 αの　１種以上の芳香族アルデヒドからなる化学的ラセ
   ミ化触媒を、Ｄｄ−アミノ酸エステルについての化学量
   論量の４倍以下の割合で反応媒質中に導入する、特許請
   求の範囲第１項記載の製造法。 ＋１：Ｉ　　上記割合か、１倍以下の化学量論量である
   、特許請求の範囲第１２項記載の製造法。 ａ４　　化学的ラセミ化触媒が反応媒質に不溶性の担体
   上に担持されたものである、特許請求の範囲第１項記載
   の製造法。 ａ９　　化学的ラセミ化工程と、酵素的加水分解工程と
   を、アルコール、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド
   、水およびこれら溶媒の混合物の中から選択された溶媒
   中で行う特許請求の範囲第１項記載の製造法。 翰　化学的ラセミ化工程と、酵素的加水分解工程とを、
   ｐＨ５〜１０に保った反応媒質中で行う、特許請求の範
   囲第１項記載の製造法。 ０？）　　−が、６〜９である、特許請求の範囲第１６
   項記載の製造法。 鱈　化学的ラセミ化工程と、酵素的加水分解工程とを、
   ０〜５０℃の温度の反応媒質中で行う、特許請求の範囲
   第１項記載の製造法。 ａ！Ｊ　　温度が２０〜４０℃である、特許請求の範囲
   第１８項記載の製造法。 （２）　出発物質のａ−７ミノ酸エステルを、ラセミ混
   合物のかたちで反応媒質中に導入する、特許請求の範囲
   第１項記載の製造法。 シυ　使用される出発物質のａ−アミノ酸エステル力、
   メチルエステル、エチルエステル、フロビルエステルお
   よびイソプロピルエステルの中から選択されたものであ
   り、遊離塩基または塩のかたちにあるものである、特許
   請求の範囲第１項記載の製造法。 ＠　酵素的加水分解を、エステラーゼを使用して行う、
   特許請求の範囲第１項記載の製造法。 （ハ）エステラーゼが、トリプシン、キモトリプシン、
   ハハイン、キモパパインおよびロイシンアミノペプチタ
   ーゼから選択されたものである特許請求の範囲第２２項
   記載の製造法。 ＠　エステラーゼが、反応媒質中に不溶性の担体上に担
   持されたものである、特許請求の範囲第２２項記載の製
   造法。 ｍ＋　　７ラニン、バリン、ロイ、シン、イソロイシン
   、β−フェニルアラニン、七リン、トレオニン、リシン
   、δ−ヒドロキシリシン、フルギニン、−７スパラギン
   酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、システ
   ィン、シスチン、メチオニン、チロシン、チロキシン、
   プロリン、ヒドロキシプロリン、トリプトファンおよび
   ヒスチジンの中から選択され７Ｃ’−１ミノ酸のＬ対掌
   体な製造することからなる、特許請求の範囲第１項記載
   の製造法。 ｃｌ！θ　化学的ラセミ化触媒が、一般式ＯＲ，ＯＨ で示される。５’−８−カルボキシメチルーチオーピリ
   ドキサルである、特許請求の範囲詔１項記載の、製造法
   。