JP4662694B2 - エナンチオマー豊富化したＮ−保護されていないβ−アミノ酸の酵素的製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エナンチオマー豊富化したβ−アミノ酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性β−アミノカルボン酸は、天然物、例えばアルカロイド及び抗生物質中に現れ、かつその単離は、とりわけ、医薬の製造の際の必須の中間生成物としてその増大する重要性のために、ますます関心を獲得している（とりわけ次のもの参照：E. Juaristi, H. Lopez-Ruiz, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 983-1004）。光学活性β−アミノカルボン酸の遊離形並びにその誘導体は、興味深い薬理作用を示し、かつ修飾ペプチドの合成の際にも使用されることができる。
【０００３】
β−アミノカルボン酸の製造方法として、これまで、ジアステレオマー塩による古典的なラセミ化合物の分割（提案された経路：H. Boesch他, Org. Proc. Res. Developm. 2001, 5, 23-27）及び特にリチウム−フェニルエチルアミドのジアステレオ選択的付加(A. F. Abdel-Magid, J. H. Cohen, C. A. Maryanoff, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 955-970)が確立されている。後者の方法は、徹底的に探求されたと見なされており、かつその場合に起こる多数の欠点にもかかわらず、好ましくは使用される。一方では、化学量論的量のキラルな試薬が必要とされ、このことは、接触不斉法と比較して大きな欠点である。そのうえ、高価でかつさらに危険な助剤、例えばｎ−ブチルリチウムを、脱プロトン化による化学量論的な試薬の活性化に必要とされる。十分な立体選択性のためには、さらに約−７０℃の低い温度での反応の実施が重要であり、このことは、反応器材料への高い要求、付加的な費用及び高いエネルギー消費を意味する。
【０００４】
生体触媒的経路での光学活性β−アミノカルボン酸の製造は、確かに現在、副次的な役割のみを果たすに過ぎないが、しかし特に、生体触媒による反応の経済的利点及び生態学的利点に基づき望ましい。化学量論的量のキラルな試薬の使用が考慮されず、かつその代わりに、天然のかつ環境に優しい触媒である僅かな触媒量の酵素が使用される。水性媒体中で効率的に使用されるこれらの生体触媒は、それらの触媒的性質及びそれらの高い有効性に加えて、さらに、多数の合成金属含有触媒とは対照的に、金属含有、特に重金属含有でかつそれゆえ有毒の供給原料の使用が放棄されることができる利点を有する。
【０００５】
技術水準において、例えばβ−アミノカルボン酸のエナンチオ選択的なＮ−アシル化のことが既に何度も報告されている。
【０００６】
例えば、L. T. Kanerva他, Tetrahedron：Asymmetry, 7巻, No.6, 1707-1716頁, 1996に、有機溶剤中での２，２，２−トリフルオロエチルエステルでの多様な脂環式β−アミノカルボン酸のエチルエステルのエナンチオ選択的Ｎ−アシル化及び生体触媒としてのCandida antarcticaからのリパーゼSP 526又はPseudomonas cepaciaからのリパーゼPSが記載されている。
【０００７】
V. M. Sanchez他は、Ｎ−アセチル化β−アミノカルボン酸エステルの製造に関してCandida antarcticaからのリパーゼでの（±）−エチル−３−アミノブチラートの生体触媒によるラセミ化合物の分割(Tetrahedron：Asymmetry, 8巻, No.1, 37-40頁, 1997)を研究している。
【０００８】
EP-A-8 890 649には、アミダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ及びリパーゼの群から選択される加水分解酵素の存在で、カルボン酸エステルでのエナンチオ選択的アシル化及びその後のアミノ酸エステルの未反応鏡像異性体の単離による、ラセミ体アミノ酸エステルからの光学活性アミノ酸エステルの製造方法が開示されている。
【０００９】
WO-A-98/50575は、ラセミ体β−アミノカルボン酸の鏡像異性体を立体選択的にアシル化するための条件下でラセミ体β−アミノカルボン酸、アシルドナー及びペニシリンＧアシラーゼの接触によるキラルなβ−アミノカルボン酸又はその相応するエステルの取得方法に関するものであり、その際、他の鏡像異性体は本質的に反応せず、かつこうしてキラルなβ−アミノカルボン酸が得られる。逆の反応順序も研究されている(V. A. Soloshonok, V. K. Svedas, V. P. Kukhar, A. G. Kirilenko, A. V. Rybakova, V. A. Solodenko, N. A. Fokina, O. V. Kogut, I. Y. Galaev, E. V. Kozlova, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, Synlett 1993, 339-341；V. Soloshonok, A. G. Kirilenko, N. A. Fokina, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, V. P. Kukhar, V. K. Svedas, E. V. Kozlova, Tetrahedron：Asymmetry 1994, 5, 1119-1126；V. Soloshonok, N. A. Fokina, A. V. Rybakova, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, A. E. Sochorinsky, V. P. Kukhar, M. V. Savchenko, V. K. Svedas, Tetrahedron：Asymmetry 1995, 6, 1601-1610；G. Cardillo, A. Tolomelli, C. Tomasini, Eur. J. Org. Chem. 1999, 155-161)。この方法の場合に不利には、エナンチオ選択的な加水分解後の生成物混合物の困難な後処理である。遊離β−アミノカルボン酸の分離後に、困難に分離されうるフェニル酢酸及びＮ−フェニルアセチル−β−アミノカルボン酸からなる混合物が得られる。
【００１０】
エナンチオマー豊富化したカルボン酸の取得のためには、既に長い間、リパーゼとのその反応が公知である。US5518903では、この原理が、しかしながらうまくいったりいかなかったりしながらＮ−保護されたβ−アミノ酸エステルに転用されてきている。ひとえにラセミ体Ｎ−ブトキシカルボニル−β−アミノ酪酸の相応するベンジルエステルがリパーゼを用いて高度にエナンチオ選択的に分割されることができたのに対して、残りの使用されるメチルエステルもしくはｎ−ブチルエステルは単に最大７０％ｅｅの範囲内のｅｅ−値を提供する。その際、どうやらｎ−ブチルエステルへの相応するメチルエステルの移行が、製造された酸のｅｅ−値の悪化と同時に現れるらしいことが確かめられうる。こうして、Ｎ−Ｂｏｃ−β−アミノ酪酸のｎ−ブチルエステルから出発するエステル加水分解は、Asahi社の酵素リパーゼを用いて、８日間後に収率３７％で４５％ｅｅの相応する酸のｅｅ−値をもたらす。AmanoのリパーゼPSを用いて、同じ反応の場合にそれでも７日間かけて４１％の収率で６１％ｅｅに豊富化した化合物が得られる。それと比較して、相応するメチルエステルは７０％ｅｅを提供する。
【００１１】
Faulconbridge他により最近刊行された結果から、ｐＨ ８での芳香族β−アミノ酸エチルエステルのエステル加水分解が、AmanoのリパーゼPSを用いて受け入れられうる収率及び極めて良好な鏡像異性体過剰で行われることが引き出されうる(Tetrahedron Letters 2000, 41, 2679-81)。生成物は、９９％ｅｅまでの鏡像異性体純度で得られるが、しかしながら、専ら水性懸濁液中で実施された合成は、若干の欠点と結びついている。一方では、確かに結晶化がこれらの条件下で選択的であるが、しかしながら、反応自体が、比較例２に明らかに示されているように、８５．１％ｅｅのより低いｅｅ−値をまねくことを示していた。全体として、これは一方では望ましくない鏡像異性体の形成に基づく収率損失を意味し、他方では、ｅｅ−値が工業的規模で僅かなプロセス変動に応じて、変化した結晶化条件に基づき９９％ｅｅ未満もしくはそれどころか９８％ｅｅ未満にも簡単に低下しうるという問題性も引き起こす。＞９８％ｅｅ、特に＞９９％ｅｅのできるだけ高いｅｅ−値は、しかし薬剤学的用途のためには必要条件である。さらにまた、例えば限外濾過による良好な酵素分離を保証することができるために、懸濁液中での実施に加えて純液体媒体中での実施も望ましいだろう。最適には、この工程において同様に高いｅｅ−値が生じるべきであり、このことは、これまでの文献方法では実現されることができない（このために比較例１及び２も参照）。
【００１２】
有機溶剤の使用下での一相の反応媒体の存在での酵素的加水分解は、Nagata他により報告されている(S. Katayama, N. Ae, R. Nagata, Tetrahedron：Asymmetry 1998, 9, 4295-4299)。その際、環式β−アミノ酸エステルが使用された。２０ｈの反応時間での９４％ｅｅのエナンチオ選択性及び５０％の転換率を有する最良の結果は、アセトン（９０％）及び水（１０％）からなる溶剤混合物の使用で達成された。より低い水含分で、より劣悪な結果が達成された。一般的に、難−水混和性溶剤と比較して良−水溶性の溶剤の使用は、優れていることがわかった。こうして、水及び２０％のアセトンで飽和であった有機媒体としてのジイソプロピルエーテルの使用は、単に５８％ｅｅのｅｅ−値をもたらすに過ぎない。これとは異なり、ＴＨＦを有するアセトンに加えて、別の良−水溶性溶剤が適していることが示されている（９５％ｅｅ）が、その際、しかしながらここでは、幾らか完全な転換率を達成するために、長い反応時間が必要とされる（９６ｈ）。
【００１３】
これまで、有機溶剤の存在の特徴を伴いこの成果をあげた合成は、しかしながら環式β−アミノ酸エステルの製造に限定されたままである。文献中で環式β−アミノ酸エステルについて記載された最適な条件下で（上記参照）、開鎖状のペンダントの所望の目的化合物の製造の際に徹底的により低い収率及び受け入れることができない長い反応時間が得られる（比較例１）。
【００１４】
【特許文献１】
EP-A-8 890 649
【特許文献２】
WO-A-98/50575
【特許文献３】
US5518903
【非特許文献１】
E. Juaristi, H. Lopez-Ruiz, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 983-1004
【非特許文献２】
H. Boesch他, Org. Proc. Res. Developm. 2001, 5, 23-27
【非特許文献３】
A. F. Abdel-Magid, J. H. Cohen, C. A. Maryanoff, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 955-970
【非特許文献４】
L. T. Kanerva他, Tetrahedron：Asymmetry, 7巻, No.6, 1707-1716頁, 1996
【非特許文献５】
V. M. Sanchez他, Tetrahedron：Asymmetry, 8巻, No.1, 37-40頁, 1997
【非特許文献６】
V. A. Soloshonok, V. K. Svedas, V. P. Kukhar, A. G. Kirilenko, A. V. Rybakova, V. A. Solodenko, N. A. Fokina, O. V. Kogut, I. Y. Galaev, E. V. Kozlova, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, Synlett 1993, 339-341
【非特許文献７】
V. Soloshonok, A. G. Kirilenko, N. A. Fokina, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, V. P. Kukhar, V. K. Svedas, E. V. Kozlova, Tetrahedron：Asymmetry 1994, 5, 1119-1126
【非特許文献８】
V. Soloshonok, N. A. Fokina, A. V. Rybakova, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, A. E. Sochorinsky, V. P. Kukhar, M. V. Savchenko, V. K. Svedas, Tetrahedron：Asymmetry 1995, 6, 1601-1610
【非特許文献９】
G. Cardillo, A. Tolomelli, C. Tomasini, Eur. J. Org. Chem. 1999, 155-161
【非特許文献１０】
Faulconbridge他, Tetrahedron Letters 2000, 41, 2679-81
【非特許文献１１】
S. Katayama, N. Ae, R. Nagata, Tetrahedron：Asymmetry 1998, 9, 4295-4299
【非特許文献１２】
Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Ed.：K. Drauz, H. Waldmann, VCH, 1995, 165頁
【非特許文献１３】
Sharma B. P.；Bailey L. F.及びMessing R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialien-Techniken und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836-852
【非特許文献１４】
Paradkar, V. M.；Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity ofα-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-5010
【非特許文献１５】
Mori T.；Okahata, Y. (1997), A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971-1974
【非特許文献１６】
Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active form in toluene、Biocatalysis 6, 291-305
【非特許文献１７】
Kamiya, N.；Okazaki, S. -Y.；Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11, 375-378
【非特許文献１８】
E. Katchalski-Katzir, D. M. Kraemer, J. Mol. Catal. B：Enzym. 2000, 10, 157
【非特許文献１９】
Petty, K. J. (1996), Metal-chelate affinity chromatography In：Ausubel, F. M.他 eds. Current Protocols in Molecular Biology, 2巻, New York：John Wiley and Sons
【非特許文献２０】
St. Clair, N.;Wang, Y. -F.；Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380-383
【非特許文献２１】
Bommarius, A. S.；Drauz, K.;Groeger, U.；Wandrey, C.；Membrane Bioreactors for the Production of Enantiomerically Pure α-Amino Acids, in：Chirality in Industry (Hrsg.：Collins, A. N.；Sheldrake, G. N.；Crosby, J.) 1992, John Wiley & Sons, 371-397頁
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、故にβ−アミノ酸を酵素的に製造するための別の方法の記載であった。特に、本方法は、経済的並びに生態学的視点のもとに有利には工業的規模で使用可能であるべきであり、すなわち環境適合性、労災防止及びプロセスの頑丈さ並びに空／時−収量及び選択率に関して特に傑出すべきである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
より詳細に記載されないが、しかしながら技術水準から当然と思われるように従うこれらの及び別の課題は、対象の請求項１の特徴を有する方法により解決される。従属請求項２〜８は、本発明の好ましい実施態様に基づいている。
【００１７】
加水分解酵素でのＮ−保護されていない、特に開鎖状β−アミノ酸エステルの鏡像異性体混合物の酵素的加水分解によるエナンチオマー豊富化したＮ−保護されていない、特に開鎖状β−アミノ酸の製造方法を、水と、与えられた反応条件下に水と二相を形成する有機溶剤とからなる二相系中で実施することにより、極めて意外にも、このためにしかしそれに劣らず有利な方法でなされた課題の解決に成功する。意外なことに、その際、これまで公知の有機−水性系と比較してかなりより高い反応性だけでなく、良好なエナンチオ選択性も達成される。二相系中での反応は、それどころか、生成物が≧９９％ｅｅで生じるように最適化される（例４）。さらに、本発明による例３によるｅｅ−値（８９％ｅｅ）は、純水性系中での試験と比較して明らかにより良好な結果となることは興味深い（比較例２、８１．５％ｅｅ）。有機溶剤のプロセス工学的利点に加えて、それゆえ、本方法は、水性の標準媒体に比較して、さらに生成物中のより高いエナンチオ選択性を発生させる利点を有する。
【００１８】
好ましくは、本対象の方法において一般式（Ｉ）
【００１９】
【化１】
【００２０】
［式中、
Ｒ、Ｒ″は互いに独立して、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）−アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）−アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）−シクロアルキル、（Ｃ６〜Ｃ１８）−アリール、（Ｃ７〜Ｃ１９）−アラルキル、（Ｃ３〜Ｃ１８）−ヘテロアリール、（Ｃ４〜Ｃ１９）−ヘテロアラルキル、（（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル）１ - ３−（Ｃ３〜Ｃ８）−シクロアルキル、（（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル）１ - ３−（Ｃ６〜Ｃ１８）−アリール、（（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル）１ - ３−（Ｃ３〜Ｃ１８）−ヘテロアリールを表し、
Ｒ′はＨ、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）−アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）−アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）−シクロアルキル、（Ｃ６〜Ｃ１８）−アリール、（Ｃ７〜Ｃ１９）−アラルキル、（Ｃ３〜Ｃ１８）−ヘテロアリール、（Ｃ４〜Ｃ１９）−ヘテロアラルキル、（（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル）１ - ３−（Ｃ３〜Ｃ８）−シクロアルキル、（（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル）１ - ３−（Ｃ６〜Ｃ１８）−アリール、（（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル）１ - ３−（Ｃ３〜Ｃ１８）−ヘテロアリールを表す］で示される化合物が使用される。
【００２１】
原則的には、当業者は相応するエステル基の選択において自由である。その選択の際に経済的かつ反応工学的視点に沿う。エステルの形成のために好都合なアルコールは、特に場合により蒸留により反応混合物から簡単に除去されることができるようなものである。極めて特に好ましくは、本発明による方法におけるβ−アミノ酸アルキル−又はβ−アミノ酸アリールエステルの使用である。極めて好ましくは、相応するｎ−プロピルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｓ−ブチルエステル、イソブチルエステル又はｔ−ブチルエステルの使用である。
【００２２】
反応パラメーターの選択は、当業者に同様に自由に任される。これは、個々の場合についてルーチン実験に基づいて別個に算出される。いずれにせよ、本対象の酵素的方法には、４〜１０、好ましくは６〜９及びより好ましくは７〜８．５のｐＨ値範囲が適している。ｐＨ ８周辺で、Amano社のリパーゼPSが特に適していることがわかった。
【００２３】
温度に関して、原則としてｐＨ値についてと同じ必要条件が存在する。ここでも、どの酵素がどの温度で最も最適に操作されるかに応じて、できるだけ最適な温度が個々の場合について算出されうる。好熱生物からの酵素については、１００℃までの高い温度が可能である。他方で他のものは、＜０℃〜−１５℃ではじめて最適に、場合によりアイスマトリックス中で操作する。好ましくは、反応の間に調節された温度は、１５〜４０℃及びより好ましくは２０〜３０℃の範囲内であるべきである。
【００２４】
使用すべき酵素の選択は、当業者の務めである。Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Ed.：K. Drauz, H. Waldmann, VCH, 1995, 165頁及びそこで引用された文献から、多くの適している酵素が選択可能である。好ましくは、エステル加水分解にはリパーゼが選ばれ、より好ましくは、Pseudomonas cepaciaからのAmanoのリパーゼPSが使用される。
【００２５】
適用については、考慮されるポリペプチドは、遊離形で、均質に精製された化合物又は組換え型として製造された酵素として使用されてよい。さらに、ポリペプチドは、無傷の寄生生物(Gastorganismus)の成分としても、又は宿主生物(Wirtsorganismus)の溶解されかつ任意に高度に精製された細胞塊と一緒に使用されてよい。
【００２６】
同様に固定化された形での酵素の使用が可能である(Sharma B. P.；Bailey L. F.及びMessing R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialien-Techniken und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836-852)。有利には、凍結乾燥による固定化が行われる(Paradkar, V. M.；Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-5010；Mori T.；Okahata, Y. (1997), A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971-1974；Otamiri, M.；Adlercreutz, P.；Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active form in toluene、Biocatalysis 6, 291-305)。極めて特に好ましくは、表面活性物質、例えばAerosol OT又はポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコール(PEG)又はBrij 52(ジエチレングリコール−モノ−セチルエーテル)の存在での凍結乾燥である(Kamiya, N.；Okazaki, S. -Y.；Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11, 375-378)。
【００２７】
極めて好ましくは、Eupergit（Ｒ）、特にEupergit C（Ｒ）及びEupergit 250L（Ｒ）(Roehm)上での固定化である（概観として、次のもの参照：E. Katchalski-Katzir, D. M. Kraemer, J. Mol. Catal. B：Enzym. 2000, 10, 157）。同様に好ましくは、His−タグ（ヘキサ−ヒスチジン）を付けることにより修飾されたポリペプチドとの組合せでのＮｉ−ＮＴＡ上での固定化である(Petty, K. J. (1996), Metal-chelate affinity chromatography In：Ausubel, F. M.他 eds. Current Protocols in Molecular Biology, 2巻, New York：John Wiley and Sons)。
【００２８】
ＣＬＥＣｓとしての使用は、同様に考えられる(St. Clair, N.;Wang, Y. -F.；Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380-383)。これらの措置により、有機溶剤により不安定になるポリペプチドから、水性溶剤及び有機溶剤の混合物中もしくは完全に有機物(Organik)中で操作されることができるようなものを生じさせることに成功しうる。
【００２９】
本対象の反応は、それぞれ、このために準備された反応容器中で実施されてよい。これらは、詳細には通常のバッチ反応器、ループ反応器、又は酵素−膜−反応器である(Bommarius, A. S.；Drauz, K.;Groeger, U.；Wandrey, C.；Membrane Bioreactors for the Production of Enantiomerically Pure α-Amino Acids, in：Chirality in Industry (Hrsg.：Collins, A. N.；Sheldrake, G. N.；Crosby, J.) 1992, John Wiley & Sons, 371-397頁)。
【００３０】
与えられた反応条件下に水と二相を形成する、それゆえすなわち水不溶性又は水難溶性でありかつ本発明による方法において使用されることができる有機相として、全ての種類の有機の、水不溶性又は水難溶性の溶剤並びにそれからなる混合物が当てはまる。特に、これらは、エーテル、ケトン、エステル、飽和又は不飽和の、線状又は分枝鎖状の炭化水素である。
【００３１】
その際、メチル−ｔ−ブチルエーテル(MTBE)、ジイソプロピルエーテル、酢酸エチルエステル、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン及びトルエン、並びにそれからなる相応する任意の混合物が特に適していることが判明している。
【００３２】
場合により水に不溶性の担持材料もしくは随伴物質又は安定剤上に吸着されて存在する酵素の使用の場合には、不溶性の担体もしくは随伴物質又は安定剤を、反応における酵素の使用前に、酵素及び担体の分離が単純に可能である限り、使用される酵素の不溶性の担持材料でもたらされうる生成物が汚染されないように、分離することが有利であることが判明している。例えば、有利には利用すべきAmano社のリパーゼPSはシリカ担体上に吸着されている。ここでは、故に、反応系からケイ酸を除去するために、反応媒体への反応体の添加前に酵素水溶液のろ過が行われるべきである。酵素の活性又は加工性は、この手順に通例、負の影響を及ぼさない。
【００３３】
“Ｎ−保護されていない”は、本発明の範囲内で、酸のβ−窒素原子が反応条件下に安定なＮ−保護基によりブロックされていないという事実であると理解される。そのようなものとして、特に普通の保護基、例えばＺ−、Ｂｏｃ−、Ｆｍｏｃ−、Ｅｏｃ−、Ｍｏｃ−、アセチル−等が認識されうる。
【００３４】
（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルとみなされうるのは、全ての結合異性体と一緒に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル又はオクチルである。これらは、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ８）−ハロゲンアルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＯ２、ＳＨ、Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルで１回又は複数回置換されていてよい。
【００３５】
（Ｃ２〜Ｃ８）−アルケニルとして、メチルを例外として、少なくとも１つの二重結合を有する前記で表されたような（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−基であると理解すべきである。
【００３６】
（Ｃ２〜Ｃ８）−アルキニルは、メチルを例外として、少なくとも１つの三重結合を有する前記で表されたような（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−基であると理解すべきである。
【００３７】
（Ｃ１〜Ｃ８）−アシルは、−Ｃ＝Ｏ官能基を介して分子に結合した（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−基であると理解される。
【００３８】
（Ｃ３〜Ｃ８）−シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルもしくはシクロヘプチル基等であると理解される。これらは、１つ又はそれ以上のハロゲン及び／又はＮ−、Ｏ−、Ｐ−、Ｓ−原子含有の基で置換されていてよく及び／又は環中にＮ−、Ｏ−、Ｐ−、Ｓ−原子含有の基、例えば１−、２−、３−、４−ピペリジル、１−、２−、３−ピロリジニル、２−、３−テトラヒドロフリル、２−、３−、４−モルホリニルを有していてよい。これは、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ８）−ハロゲンアルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＯ２、ＳＨ、Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、（Ｃ１〜Ｃ８）−アシル、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルで１回又は複数回置換されていてよい。
【００３９】
（Ｃ６〜Ｃ１８）−アリール基は、炭素原子６〜１８個を有する芳香族基であると理解される。特にこれには化合物、例えばフェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、ビフェニル基が含まれる。これは、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ８）−ハロゲンアルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＯ２、ＳＨ、Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、（Ｃ１〜Ｃ８）−アシル、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルで１回又は複数回置換されていてよい。
【００４０】
（Ｃ７〜Ｃ１９）−アラルキル基は、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル基を介して分子に結合した（Ｃ６〜Ｃ１８）−アリール基である。
【００４１】
（Ｃ１〜Ｃ８）−アルコキシは、酸素原子を介して考慮される分子に結合した（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−基である。
【００４２】
（Ｃ１〜Ｃ８）−アルコキシカルボニルは、−ＯＣ（Ｏ）官能基を介して考慮される分子に結合した（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−基である。これは他のオキシカルボニル基と同義にみなされる。
【００４３】
（Ｃ１〜Ｃ８）−ハロゲンアルキルは、１つ又はそれ以上のハロゲン原子で置換された（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−基である。
【００４４】
（Ｃ３〜Ｃ１８）−ヘテロアリール基は、本発明の範囲内で、へテロ原子、例えば窒素、酸素又は硫黄を環中に有し、炭素原子３〜１８個からなる５、６又は７員の芳香族環系を呼ぶ。そのようなヘテロ芳香族化合物とみなされるのは、特に基、例えば１−、２−、３−フリル、例えば１−、２−、３−ピロリル、１−、２−、３−チエニル、２−、３−、４−ピリジル、２−、３−、４−、５−、６−、７−インドリル、３−、４−、５−ピラゾリル、２−、４−、５−イミダゾリル、アクリジニル、キノリニル、フェナントリジニル、２−、４−、５−、６−ピリミジニルである。これは、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ８）−ハロゲンアルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＯ２、ＳＨ、Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、（Ｃ１〜Ｃ８）−アシル、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルで１回又は複数回置換されていてよい。
【００４５】
（Ｃ４〜Ｃ１９）−ヘテロアラルキルは、（Ｃ７〜Ｃ１９）−アラルキル基に相応するヘテロ芳香族系であると理解される。
【００４６】
ハロゲンとして、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素が当てはまる。
【００４７】
用語のエナンチオマー豊富化した、は、本発明の範囲内で、＞５０％かつ＜１００％の範囲内のその光学対掌体との混合物中の鏡像異性体の含分であると理解される。
【００４８】
示された構造は、全ての可能なジアステレオマー及び鏡像異性体及び可能であるその混合物に基づいている。
【００４９】
記載された文献箇所は、本発明の開示に一緒に含まれるものとみなされる。
【００５０】
【実施例】
実験例：
比較例１：
ラセミ化合物rac−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル９．２mmol（１．７９ｇ）を、水２５ｍＬ及び有機溶剤成分としてアセトン２５ｍＬからなる溶剤混合物５０ｍＬ中に取り、かつ自動ｐＨ−スタットを用いて１Ｍカセイソーダ液（Merck社から購入）の添加により溶液をｐＨ ８．２のｐＨ値に調節する。２０℃の反応温度に達した際に、反応を開始するために、AmanoリパーゼPS ２００ｍｇ（Pseudomonas cepacia；Amano Enzymes、Inc.社より購入）を添加する。３、５及び２４時間の反応時間後に、形成された（Ｓ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸の形成された転換速度を測定する。その際、３時間後に１．８％、５時間後に２．０％及び２４時間後に５．５％の転換率が算出される。エナンチオ選択性の値は、反応の不満足な経過に基づき低い転換率を考慮して測定しなかった。転換率測定をＨＰＬＣにより行った。
【００５１】
比較例２：
ラセミ化合物rac−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル９．２mmol（１．７９ｇ）を水５０ｍＬ中に取り、かつ自動ｐＨ−スタットを用いて１Ｍカセイソーダ液（Merck社より購入）の添加により溶液をｐＨ ８．２のｐＨ値に調節する。エステルを完全に溶解させるために、さらにアセトン３ｍＬを溶解させるために添加する。２０℃の反応温度に達した際に、反応を開始するために、Amanoリパーゼ PS ２００ｍｇ（Pseudomonas cepacia；Amano Enzymes、Inc.社より購入）を添加する。３及び６時間の反応時間後に、形成された（Ｓ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸の形成された転換速度並びに６時間後にエナンチオ選択性を測定する。その際、３時間後に１８．５％もしくは６時間後に３７．８％の転換率及び８５．１％ｅｅのエナンチオ選択性（６時間後）が算出される。転換率測定及びエナンチオ選択性測定をＨＰＬＣにより行った。
【００５２】
例３：
ラセミ化合物rac−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル９．２mmol（１．７９ｇ）を水２５ｍＬ及び有機溶剤成分としてメチル−ｔ−ブチルエーテル２５ｍＬ（ＭＴＢＥ）からなる二相の溶剤混合物５０ｍＬ中に取り、かつ自動ｐＨ−スタットを用いて１Ｍカセイソーダ液（Merck社より購入）の添加により二相系をｐＨ ８．２のｐＨ値に調節する。２０℃の反応温度に達した際に、反応を開始するために、AmanoリパーゼPS ２００ｍｇ（Pseudomonas cepacia；Amano Enzymes、Inc.社より購入）を添加する。３、５及び２４時間の反応時間後に、形成された（Ｓ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸の形成された転換速度を測定する。その際、３時間後に２３．５％の転換率もしくは１５時間後に約≧５０％の定量転換率及び８９．０％ｅｅのエナンチオ選択性（１５時間後）が算出される。転換率測定及びエナンチオ選択性測定をＨＰＬＣにより行った。
【００５３】
例４：
水８１ｍＬを装入し、かつこれにAmanoリパーゼPS １．４５ｇ（Pseudomonas cepacia；Amano Enzymes、Inc.社より購入）を添加する。引き続いて溶けない固体を濾別する。ろ液として生じる酵素水溶液を、有機溶剤成分としてメチル−ｔ−ブチルエーテル８１ｍＬ（ＭＴＢＥ）と混合する。生じた二相系を、自動ｐＨ−スタットを用いて１Ｍカセイソーダ液（Merck社より購入）の添加によりｐＨ ８．２に調節する。２０℃の温度に達した際に、次いでラセミ化合物rac−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸−ｎ−プロピルエステル１８８．２mmol（３９．０ｇ）を添加し、かつ反応を開始する。反応時間は１５時間であり、その際、所望の生成物（Ｓ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸からなる白色沈殿物が生じる。１５時間の反応時間後に、アセトン１６０ｍＬを、沈殿を完全にするために添加し、約４５分間後撹拌し、かつ固体を濾別する。固体を、少しのアセトンで複数回洗浄し、かつ引き続いて真空中で乾燥させる。４１．６％の収率に相応した、所望の（Ｓ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸１２．９１ｇが得られる。生成物についてのエナンチオ選択性は、９９．６％ｅｅである。エナンチオ選択性測定をＨＰＬＣにより行った。化学的純度については９８．８％が算出された（滴定により算出）。生成物の構造を、付加的にＮＭＲ分光法により確認した。
【発明の属する技術分野】
本発明は、エナンチオマー豊富化したβ−アミノ酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性β−アミノカルボン酸は、天然物、例えばアルカロイド及び抗生物質中に現れ、かつその単離は、とりわけ、医薬の製造の際の必須の中間生成物としてその増大する重要性のために、ますます関心を獲得している（とりわけ次のもの参照：E. Juaristi, H. Lopez-Ruiz, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 983-1004）。光学活性β−アミノカルボン酸の遊離形並びにその誘導体は、興味深い薬理作用を示し、かつ修飾ペプチドの合成の際にも使用されることができる。
【０００３】
β−アミノカルボン酸の製造方法として、これまで、ジアステレオマー塩による古典的なラセミ化合物の分割（提案された経路：H. Boesch他, Org. Proc. Res. Developm. 2001, 5, 23-27）及び特にリチウム−フェニルエチルアミドのジアステレオ選択的付加(A. F. Abdel-Magid, J. H. Cohen, C. A. Maryanoff, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 955-970)が確立されている。後者の方法は、徹底的に探求されたと見なされており、かつその場合に起こる多数の欠点にもかかわらず、好ましくは使用される。一方では、化学量論的量のキラルな試薬が必要とされ、このことは、接触不斉法と比較して大きな欠点である。そのうえ、高価でかつさらに危険な助剤、例えばｎ−ブチルリチウムを、脱プロトン化による化学量論的な試薬の活性化に必要とされる。十分な立体選択性のためには、さらに約−７０℃の低い温度での反応の実施が重要であり、このことは、反応器材料への高い要求、付加的な費用及び高いエネルギー消費を意味する。
【０００４】
生体触媒的経路での光学活性β−アミノカルボン酸の製造は、確かに現在、副次的な役割のみを果たすに過ぎないが、しかし特に、生体触媒による反応の経済的利点及び生態学的利点に基づき望ましい。化学量論的量のキラルな試薬の使用が考慮されず、かつその代わりに、天然のかつ環境に優しい触媒である僅かな触媒量の酵素が使用される。水性媒体中で効率的に使用されるこれらの生体触媒は、それらの触媒的性質及びそれらの高い有効性に加えて、さらに、多数の合成金属含有触媒とは対照的に、金属含有、特に重金属含有でかつそれゆえ有毒の供給原料の使用が放棄されることができる利点を有する。
【０００５】
技術水準において、例えばβ−アミノカルボン酸のエナンチオ選択的なＮ−アシル化のことが既に何度も報告されている。
【０００６】
例えば、L. T. Kanerva他, Tetrahedron：Asymmetry, 7巻, No.6, 1707-1716頁, 1996に、有機溶剤中での２，２，２−トリフルオロエチルエステルでの多様な脂環式β−アミノカルボン酸のエチルエステルのエナンチオ選択的Ｎ−アシル化及び生体触媒としてのCandida antarcticaからのリパーゼSP 526又はPseudomonas cepaciaからのリパーゼPSが記載されている。
【０００７】
V. M. Sanchez他は、Ｎ−アセチル化β−アミノカルボン酸エステルの製造に関してCandida antarcticaからのリパーゼでの（±）−エチル−３−アミノブチラートの生体触媒によるラセミ化合物の分割(Tetrahedron：Asymmetry, 8巻, No.1, 37-40頁, 1997)を研究している。
【０００８】
EP-A-8 890 649には、アミダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ及びリパーゼの群から選択される加水分解酵素の存在で、カルボン酸エステルでのエナンチオ選択的アシル化及びその後のアミノ酸エステルの未反応鏡像異性体の単離による、ラセミ体アミノ酸エステルからの光学活性アミノ酸エステルの製造方法が開示されている。
【０００９】
WO-A-98/50575は、ラセミ体β−アミノカルボン酸の鏡像異性体を立体選択的にアシル化するための条件下でラセミ体β−アミノカルボン酸、アシルドナー及びペニシリンＧアシラーゼの接触によるキラルなβ−アミノカルボン酸又はその相応するエステルの取得方法に関するものであり、その際、他の鏡像異性体は本質的に反応せず、かつこうしてキラルなβ−アミノカルボン酸が得られる。逆の反応順序も研究されている(V. A. Soloshonok, V. K. Svedas, V. P. Kukhar, A. G. Kirilenko, A. V. Rybakova, V. A. Solodenko, N. A. Fokina, O. V. Kogut, I. Y. Galaev, E. V. Kozlova, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, Synlett 1993, 339-341；V. Soloshonok, A. G. Kirilenko, N. A. Fokina, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, V. P. Kukhar, V. K. Svedas, E. V. Kozlova, Tetrahedron：Asymmetry 1994, 5, 1119-1126；V. Soloshonok, N. A. Fokina, A. V. Rybakova, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, A. E. Sochorinsky, V. P. Kukhar, M. V. Savchenko, V. K. Svedas, Tetrahedron：Asymmetry 1995, 6, 1601-1610；G. Cardillo, A. Tolomelli, C. Tomasini, Eur. J. Org. Chem. 1999, 155-161)。この方法の場合に不利には、エナンチオ選択的な加水分解後の生成物混合物の困難な後処理である。遊離β−アミノカルボン酸の分離後に、困難に分離されうるフェニル酢酸及びＮ−フェニルアセチル−β−アミノカルボン酸からなる混合物が得られる。
【００１０】
エナンチオマー豊富化したカルボン酸の取得のためには、既に長い間、リパーゼとのその反応が公知である。US5518903では、この原理が、しかしながらうまくいったりいかなかったりしながらＮ−保護されたβ−アミノ酸エステルに転用されてきている。ひとえにラセミ体Ｎ−ブトキシカルボニル−β−アミノ酪酸の相応するベンジルエステルがリパーゼを用いて高度にエナンチオ選択的に分割されることができたのに対して、残りの使用されるメチルエステルもしくはｎ−ブチルエステルは単に最大７０％ｅｅの範囲内のｅｅ−値を提供する。その際、どうやらｎ−ブチルエステルへの相応するメチルエステルの移行が、製造された酸のｅｅ−値の悪化と同時に現れるらしいことが確かめられうる。こうして、Ｎ−Ｂｏｃ−β−アミノ酪酸のｎ−ブチルエステルから出発するエステル加水分解は、Asahi社の酵素リパーゼを用いて、８日間後に収率３７％で４５％ｅｅの相応する酸のｅｅ−値をもたらす。AmanoのリパーゼPSを用いて、同じ反応の場合にそれでも７日間かけて４１％の収率で６１％ｅｅに豊富化した化合物が得られる。それと比較して、相応するメチルエステルは７０％ｅｅを提供する。
【００１１】
Faulconbridge他により最近刊行された結果から、ｐＨ ８での芳香族β−アミノ酸エチルエステルのエステル加水分解が、AmanoのリパーゼPSを用いて受け入れられうる収率及び極めて良好な鏡像異性体過剰で行われることが引き出されうる(Tetrahedron Letters 2000, 41, 2679-81)。生成物は、９９％ｅｅまでの鏡像異性体純度で得られるが、しかしながら、専ら水性懸濁液中で実施された合成は、若干の欠点と結びついている。一方では、確かに結晶化がこれらの条件下で選択的であるが、しかしながら、反応自体が、比較例２に明らかに示されているように、８５．１％ｅｅのより低いｅｅ−値をまねくことを示していた。全体として、これは一方では望ましくない鏡像異性体の形成に基づく収率損失を意味し、他方では、ｅｅ−値が工業的規模で僅かなプロセス変動に応じて、変化した結晶化条件に基づき９９％ｅｅ未満もしくはそれどころか９８％ｅｅ未満にも簡単に低下しうるという問題性も引き起こす。＞９８％ｅｅ、特に＞９９％ｅｅのできるだけ高いｅｅ−値は、しかし薬剤学的用途のためには必要条件である。さらにまた、例えば限外濾過による良好な酵素分離を保証することができるために、懸濁液中での実施に加えて純液体媒体中での実施も望ましいだろう。最適には、この工程において同様に高いｅｅ−値が生じるべきであり、このことは、これまでの文献方法では実現されることができない（このために比較例１及び２も参照）。
【００１２】
有機溶剤の使用下での一相の反応媒体の存在での酵素的加水分解は、Nagata他により報告されている(S. Katayama, N. Ae, R. Nagata, Tetrahedron：Asymmetry 1998, 9, 4295-4299)。その際、環式β−アミノ酸エステルが使用された。２０ｈの反応時間での９４％ｅｅのエナンチオ選択性及び５０％の転換率を有する最良の結果は、アセトン（９０％）及び水（１０％）からなる溶剤混合物の使用で達成された。より低い水含分で、より劣悪な結果が達成された。一般的に、難−水混和性溶剤と比較して良−水溶性の溶剤の使用は、優れていることがわかった。こうして、水及び２０％のアセトンで飽和であった有機媒体としてのジイソプロピルエーテルの使用は、単に５８％ｅｅのｅｅ−値をもたらすに過ぎない。これとは異なり、ＴＨＦを有するアセトンに加えて、別の良−水溶性溶剤が適していることが示されている（９５％ｅｅ）が、その際、しかしながらここでは、幾らか完全な転換率を達成するために、長い反応時間が必要とされる（９６ｈ）。
【００１３】
これまで、有機溶剤の存在の特徴を伴いこの成果をあげた合成は、しかしながら環式β−アミノ酸エステルの製造に限定されたままである。文献中で環式β−アミノ酸エステルについて記載された最適な条件下で（上記参照）、開鎖状のペンダントの所望の目的化合物の製造の際に徹底的により低い収率及び受け入れることができない長い反応時間が得られる（比較例１）。
【００１４】
【特許文献１】
EP-A-8 890 649
【特許文献２】
WO-A-98/50575
【特許文献３】
US5518903
【非特許文献１】
E. Juaristi, H. Lopez-Ruiz, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 983-1004
【非特許文献２】
H. Boesch他, Org. Proc. Res. Developm. 2001, 5, 23-27
【非特許文献３】
A. F. Abdel-Magid, J. H. Cohen, C. A. Maryanoff, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 955-970
【非特許文献４】
L. T. Kanerva他, Tetrahedron：Asymmetry, 7巻, No.6, 1707-1716頁, 1996
【非特許文献５】
V. M. Sanchez他, Tetrahedron：Asymmetry, 8巻, No.1, 37-40頁, 1997
【非特許文献６】
V. A. Soloshonok, V. K. Svedas, V. P. Kukhar, A. G. Kirilenko, A. V. Rybakova, V. A. Solodenko, N. A. Fokina, O. V. Kogut, I. Y. Galaev, E. V. Kozlova, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, Synlett 1993, 339-341
【非特許文献７】
V. Soloshonok, A. G. Kirilenko, N. A. Fokina, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, V. P. Kukhar, V. K. Svedas, E. V. Kozlova, Tetrahedron：Asymmetry 1994, 5, 1119-1126
【非特許文献８】
V. Soloshonok, N. A. Fokina, A. V. Rybakova, I. P. Shishkina, S. V. Galushko, A. E. Sochorinsky, V. P. Kukhar, M. V. Savchenko, V. K. Svedas, Tetrahedron：Asymmetry 1995, 6, 1601-1610
【非特許文献９】
G. Cardillo, A. Tolomelli, C. Tomasini, Eur. J. Org. Chem. 1999, 155-161
【非特許文献１０】
Faulconbridge他, Tetrahedron Letters 2000, 41, 2679-81
【非特許文献１１】
S. Katayama, N. Ae, R. Nagata, Tetrahedron：Asymmetry 1998, 9, 4295-4299
【非特許文献１２】
Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Ed.：K. Drauz, H. Waldmann, VCH, 1995, 165頁
【非特許文献１３】
Sharma B. P.；Bailey L. F.及びMessing R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialien-Techniken und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836-852
【非特許文献１４】
Paradkar, V. M.；Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity ofα-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-5010
【非特許文献１５】
Mori T.；Okahata, Y. (1997), A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971-1974
【非特許文献１６】
Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active form in toluene、Biocatalysis 6, 291-305
【非特許文献１７】
Kamiya, N.；Okazaki, S. -Y.；Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11, 375-378
【非特許文献１８】
E. Katchalski-Katzir, D. M. Kraemer, J. Mol. Catal. B：Enzym. 2000, 10, 157
【非特許文献１９】
Petty, K. J. (1996), Metal-chelate affinity chromatography In：Ausubel, F. M.他 eds. Current Protocols in Molecular Biology, 2巻, New York：John Wiley and Sons
【非特許文献２０】
St. Clair, N.;Wang, Y. -F.；Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380-383
【非特許文献２１】
Bommarius, A. S.；Drauz, K.;Groeger, U.；Wandrey, C.；Membrane Bioreactors for the Production of Enantiomerically Pure α-Amino Acids, in：Chirality in Industry (Hrsg.：Collins, A. N.；Sheldrake, G. N.；Crosby, J.) 1992, John Wiley & Sons, 371-397頁
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、故にβ−アミノ酸を酵素的に製造するための別の方法の記載であった。特に、本方法は、経済的並びに生態学的視点のもとに有利には工業的規模で使用可能であるべきであり、すなわち環境適合性、労災防止及びプロセスの頑丈さ並びに空／時−収量及び選択率に関して特に傑出すべきである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
より詳細に記載されないが、しかしながら技術水準から当然と思われるように従うこれらの及び別の課題は、対象の請求項１の特徴を有する方法により解決される。従属請求項２〜８は、本発明の好ましい実施態様に基づいている。
【００１７】
加水分解酵素でのＮ−保護されていない、特に開鎖状β−アミノ酸エステルの鏡像異性体混合物の酵素的加水分解によるエナンチオマー豊富化したＮ−保護されていない、特に開鎖状β−アミノ酸の製造方法を、水と、与えられた反応条件下に水と二相を形成する有機溶剤とからなる二相系中で実施することにより、極めて意外にも、このためにしかしそれに劣らず有利な方法でなされた課題の解決に成功する。意外なことに、その際、これまで公知の有機−水性系と比較してかなりより高い反応性だけでなく、良好なエナンチオ選択性も達成される。二相系中での反応は、それどころか、生成物が≧９９％ｅｅで生じるように最適化される（例４）。さらに、本発明による例３によるｅｅ−値（８９％ｅｅ）は、純水性系中での試験と比較して明らかにより良好な結果となることは興味深い（比較例２、８１．５％ｅｅ）。有機溶剤のプロセス工学的利点に加えて、それゆえ、本方法は、水性の標準媒体に比較して、さらに生成物中のより高いエナンチオ選択性を発生させる利点を有する。
【００１８】
好ましくは、本対象の方法において一般式（Ｉ）
【００１９】
【化１】
［式中、
Ｒ、Ｒ″は互いに独立して、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）−アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）−アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）−シクロアルキル、（Ｃ６〜Ｃ１８）−アリール、（Ｃ７〜Ｃ１９）−アラルキル、（Ｃ３〜Ｃ１８）−ヘテロアリール、（Ｃ４〜Ｃ１９）−ヘテロアラルキル、（（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル）１ - ３−（Ｃ３〜Ｃ８）−シクロアルキル、（（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル）１ - ３−（Ｃ６〜Ｃ１８）−アリール、（（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル）１ - ３−（Ｃ３〜Ｃ１８）−ヘテロアリールを表し、
Ｒ′はＨ、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）−アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）−アルキニル、（Ｃ３〜Ｃ８）−シクロアルキル、（Ｃ６〜Ｃ１８）−アリール、（Ｃ７〜Ｃ１９）−アラルキル、（Ｃ３〜Ｃ１８）−ヘテロアリール、（Ｃ４〜Ｃ１９）−ヘテロアラルキル、（（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル）１ - ３−（Ｃ３〜Ｃ８）−シクロアルキル、（（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル）１ - ３−（Ｃ６〜Ｃ１８）−アリール、（（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル）１ - ３−（Ｃ３〜Ｃ１８）−ヘテロアリールを表す］で示される化合物が使用される。
【００２１】
原則的には、当業者は相応するエステル基の選択において自由である。その選択の際に経済的かつ反応工学的視点に沿う。エステルの形成のために好都合なアルコールは、特に場合により蒸留により反応混合物から簡単に除去されることができるようなものである。極めて特に好ましくは、本発明による方法におけるβ−アミノ酸アルキル−又はβ−アミノ酸アリールエステルの使用である。極めて好ましくは、相応するｎ−プロピルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｓ−ブチルエステル、イソブチルエステル又はｔ−ブチルエステルの使用である。
【００２２】
反応パラメーターの選択は、当業者に同様に自由に任される。これは、個々の場合についてルーチン実験に基づいて別個に算出される。いずれにせよ、本対象の酵素的方法には、４〜１０、好ましくは６〜９及びより好ましくは７〜８．５のｐＨ値範囲が適している。ｐＨ ８周辺で、Amano社のリパーゼPSが特に適していることがわかった。
【００２３】
温度に関して、原則としてｐＨ値についてと同じ必要条件が存在する。ここでも、どの酵素がどの温度で最も最適に操作されるかに応じて、できるだけ最適な温度が個々の場合について算出されうる。好熱生物からの酵素については、１００℃までの高い温度が可能である。他方で他のものは、＜０℃〜−１５℃ではじめて最適に、場合によりアイスマトリックス中で操作する。好ましくは、反応の間に調節された温度は、１５〜４０℃及びより好ましくは２０〜３０℃の範囲内であるべきである。
【００２４】
使用すべき酵素の選択は、当業者の務めである。Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Ed.：K. Drauz, H. Waldmann, VCH, 1995, 165頁及びそこで引用された文献から、多くの適している酵素が選択可能である。好ましくは、エステル加水分解にはリパーゼが選ばれ、より好ましくは、Pseudomonas cepaciaからのAmanoのリパーゼPSが使用される。
【００２５】
適用については、考慮されるポリペプチドは、遊離形で、均質に精製された化合物又は組換え型として製造された酵素として使用されてよい。さらに、ポリペプチドは、無傷の寄生生物(Gastorganismus)の成分としても、又は宿主生物(Wirtsorganismus)の溶解されかつ任意に高度に精製された細胞塊と一緒に使用されてよい。
【００２６】
同様に固定化された形での酵素の使用が可能である(Sharma B. P.；Bailey L. F.及びMessing R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialien-Techniken und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836-852)。有利には、凍結乾燥による固定化が行われる(Paradkar, V. M.；Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-5010；Mori T.；Okahata, Y. (1997), A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971-1974；Otamiri, M.；Adlercreutz, P.；Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active form in toluene、Biocatalysis 6, 291-305)。極めて特に好ましくは、表面活性物質、例えばAerosol OT又はポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコール(PEG)又はBrij 52(ジエチレングリコール−モノ−セチルエーテル)の存在での凍結乾燥である(Kamiya, N.；Okazaki, S. -Y.；Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11, 375-378)。
【００２７】
極めて好ましくは、Eupergit（Ｒ）、特にEupergit C（Ｒ）及びEupergit 250L（Ｒ）(Roehm)上での固定化である（概観として、次のもの参照：E. Katchalski-Katzir, D. M. Kraemer, J. Mol. Catal. B：Enzym. 2000, 10, 157）。同様に好ましくは、His−タグ（ヘキサ−ヒスチジン）を付けることにより修飾されたポリペプチドとの組合せでのＮｉ−ＮＴＡ上での固定化である(Petty, K. J. (1996), Metal-chelate affinity chromatography In：Ausubel, F. M.他 eds. Current Protocols in Molecular Biology, 2巻, New York：John Wiley and Sons)。
【００２８】
ＣＬＥＣｓとしての使用は、同様に考えられる(St. Clair, N.;Wang, Y. -F.；Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380-383)。これらの措置により、有機溶剤により不安定になるポリペプチドから、水性溶剤及び有機溶剤の混合物中もしくは完全に有機物(Organik)中で操作されることができるようなものを生じさせることに成功しうる。
【００２９】
本対象の反応は、それぞれ、このために準備された反応容器中で実施されてよい。これらは、詳細には通常のバッチ反応器、ループ反応器、又は酵素−膜−反応器である(Bommarius, A. S.；Drauz, K.;Groeger, U.；Wandrey, C.；Membrane Bioreactors for the Production of Enantiomerically Pure α-Amino Acids, in：Chirality in Industry (Hrsg.：Collins, A. N.；Sheldrake, G. N.；Crosby, J.) 1992, John Wiley & Sons, 371-397頁)。
【００３０】
与えられた反応条件下に水と二相を形成する、それゆえすなわち水不溶性又は水難溶性でありかつ本発明による方法において使用されることができる有機相として、全ての種類の有機の、水不溶性又は水難溶性の溶剤並びにそれからなる混合物が当てはまる。特に、これらは、エーテル、ケトン、エステル、飽和又は不飽和の、線状又は分枝鎖状の炭化水素である。
【００３１】
その際、メチル−ｔ−ブチルエーテル(MTBE)、ジイソプロピルエーテル、酢酸エチルエステル、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン及びトルエン、並びにそれからなる相応する任意の混合物が特に適していることが判明している。
【００３２】
場合により水に不溶性の担持材料もしくは随伴物質又は安定剤上に吸着されて存在する酵素の使用の場合には、不溶性の担体もしくは随伴物質又は安定剤を、反応における酵素の使用前に、酵素及び担体の分離が単純に可能である限り、使用される酵素の不溶性の担持材料でもたらされうる生成物が汚染されないように、分離することが有利であることが判明している。例えば、有利には利用すべきAmano社のリパーゼPSはシリカ担体上に吸着されている。ここでは、故に、反応系からケイ酸を除去するために、反応媒体への反応体の添加前に酵素水溶液のろ過が行われるべきである。酵素の活性又は加工性は、この手順に通例、負の影響を及ぼさない。
【００３３】
“Ｎ−保護されていない”は、本発明の範囲内で、酸のβ−窒素原子が反応条件下に安定なＮ−保護基によりブロックされていないという事実であると理解される。そのようなものとして、特に普通の保護基、例えばＺ−、Ｂｏｃ−、Ｆｍｏｃ−、Ｅｏｃ−、Ｍｏｃ−、アセチル−等が認識されうる。
【００３４】
（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルとみなされうるのは、全ての結合異性体と一緒に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル又はオクチルである。これらは、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ８）−ハロゲンアルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＯ２、ＳＨ、Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルで１回又は複数回置換されていてよい。
【００３５】
（Ｃ２〜Ｃ８）−アルケニルとして、メチルを例外として、少なくとも１つの二重結合を有する前記で表されたような（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−基であると理解すべきである。
【００３６】
（Ｃ２〜Ｃ８）−アルキニルは、メチルを例外として、少なくとも１つの三重結合を有する前記で表されたような（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−基であると理解すべきである。
【００３７】
（Ｃ１〜Ｃ８）−アシルは、−Ｃ＝Ｏ官能基を介して分子に結合した（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−基であると理解される。
【００３８】
（Ｃ３〜Ｃ８）−シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルもしくはシクロヘプチル基等であると理解される。これらは、１つ又はそれ以上のハロゲン及び／又はＮ−、Ｏ−、Ｐ−、Ｓ−原子含有の基で置換されていてよく及び／又は環中にＮ−、Ｏ−、Ｐ−、Ｓ−原子含有の基、例えば１−、２−、３−、４−ピペリジル、１−、２−、３−ピロリジニル、２−、３−テトラヒドロフリル、２−、３−、４−モルホリニルを有していてよい。これは、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ８）−ハロゲンアルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＯ２、ＳＨ、Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、（Ｃ１〜Ｃ８）−アシル、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルで１回又は複数回置換されていてよい。
【００３９】
（Ｃ６〜Ｃ１８）−アリール基は、炭素原子６〜１８個を有する芳香族基であると理解される。特にこれには化合物、例えばフェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、ビフェニル基が含まれる。これは、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ８）−ハロゲンアルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＯ２、ＳＨ、Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、（Ｃ１〜Ｃ８）−アシル、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルで１回又は複数回置換されていてよい。
【００４０】
（Ｃ７〜Ｃ１９）−アラルキル基は、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル基を介して分子に結合した（Ｃ６〜Ｃ１８）−アリール基である。
【００４１】
（Ｃ１〜Ｃ８）−アルコキシは、酸素原子を介して考慮される分子に結合した（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−基である。
【００４２】
（Ｃ１〜Ｃ８）−アルコキシカルボニルは、−ＯＣ（Ｏ）官能基を介して考慮される分子に結合した（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−基である。これは他のオキシカルボニル基と同義にみなされる。
【００４３】
（Ｃ１〜Ｃ８）−ハロゲンアルキルは、１つ又はそれ以上のハロゲン原子で置換された（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル−基である。
【００４４】
（Ｃ３〜Ｃ１８）−ヘテロアリール基は、本発明の範囲内で、へテロ原子、例えば窒素、酸素又は硫黄を環中に有し、炭素原子３〜１８個からなる５、６又は７員の芳香族環系を呼ぶ。そのようなヘテロ芳香族化合物とみなされるのは、特に基、例えば１−、２−、３−フリル、例えば１−、２−、３−ピロリル、１−、２−、３−チエニル、２−、３−、４−ピリジル、２−、３−、４−、５−、６−、７−インドリル、３−、４−、５−ピラゾリル、２−、４−、５−イミダゾリル、アクリジニル、キノリニル、フェナントリジニル、２−、４−、５−、６−ピリミジニルである。これは、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ８）−ハロゲンアルキル、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＯ２、ＳＨ、Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキル、（Ｃ１〜Ｃ８）−アシル、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルキルで１回又は複数回置換されていてよい。
【００４５】
（Ｃ４〜Ｃ１９）−ヘテロアラルキルは、（Ｃ７〜Ｃ１９）−アラルキル基に相応するヘテロ芳香族系であると理解される。
【００４６】
ハロゲンとして、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素が当てはまる。
【００４７】
用語のエナンチオマー豊富化した、は、本発明の範囲内で、＞５０％かつ＜１００％の範囲内のその光学対掌体との混合物中の鏡像異性体の含分であると理解される。
【００４８】
示された構造は、全ての可能なジアステレオマー及び鏡像異性体及び可能であるその混合物に基づいている。
【００４９】
記載された文献箇所は、本発明の開示に一緒に含まれるものとみなされる。
【００５０】
【実施例】
実験例：
比較例１：
ラセミ化合物rac−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル９．２mmol（１．７９ｇ）を、水２５ｍＬ及び有機溶剤成分としてアセトン２５ｍＬからなる溶剤混合物５０ｍＬ中に取り、かつ自動ｐＨ−スタットを用いて１Ｍカセイソーダ液（Merck社から購入）の添加により溶液をｐＨ ８．２のｐＨ値に調節する。２０℃の反応温度に達した際に、反応を開始するために、AmanoリパーゼPS ２００ｍｇ（Pseudomonas cepacia；Amano Enzymes、Inc.社より購入）を添加する。３、５及び２４時間の反応時間後に、形成された（Ｓ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸の形成された転換速度を測定する。その際、３時間後に１．８％、５時間後に２．０％及び２４時間後に５．５％の転換率が算出される。エナンチオ選択性の値は、反応の不満足な経過に基づき低い転換率を考慮して測定しなかった。転換率測定をＨＰＬＣにより行った。
【００５１】
比較例２：
ラセミ化合物rac−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル９．２mmol（１．７９ｇ）を水５０ｍＬ中に取り、かつ自動ｐＨ−スタットを用いて１Ｍカセイソーダ液（Merck社より購入）の添加により溶液をｐＨ ８．２のｐＨ値に調節する。エステルを完全に溶解させるために、さらにアセトン３ｍＬを溶解させるために添加する。２０℃の反応温度に達した際に、反応を開始するために、Amanoリパーゼ PS ２００ｍｇ（Pseudomonas cepacia；Amano Enzymes、Inc.社より購入）を添加する。３及び６時間の反応時間後に、形成された（Ｓ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸の形成された転換速度並びに６時間後にエナンチオ選択性を測定する。その際、３時間後に１８．５％もしくは６時間後に３７．８％の転換率及び８５．１％ｅｅのエナンチオ選択性（６時間後）が算出される。転換率測定及びエナンチオ選択性測定をＨＰＬＣにより行った。
【００５２】
例３：
ラセミ化合物rac−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル９．２mmol（１．７９ｇ）を水２５ｍＬ及び有機溶剤成分としてメチル−ｔ−ブチルエーテル２５ｍＬ（ＭＴＢＥ）からなる二相の溶剤混合物５０ｍＬ中に取り、かつ自動ｐＨ−スタットを用いて１Ｍカセイソーダ液（Merck社より購入）の添加により二相系をｐＨ ８．２のｐＨ値に調節する。２０℃の反応温度に達した際に、反応を開始するために、AmanoリパーゼPS ２００ｍｇ（Pseudomonas cepacia；Amano Enzymes、Inc.社より購入）を添加する。３、５及び２４時間の反応時間後に、形成された（Ｓ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸の形成された転換速度を測定する。その際、３時間後に２３．５％の転換率もしくは１５時間後に約≧５０％の定量転換率及び８９．０％ｅｅのエナンチオ選択性（１５時間後）が算出される。転換率測定及びエナンチオ選択性測定をＨＰＬＣにより行った。
【００５３】
例４：
水８１ｍＬを装入し、かつこれにAmanoリパーゼPS １．４５ｇ（Pseudomonas cepacia；Amano Enzymes、Inc.社より購入）を添加する。引き続いて溶けない固体を濾別する。ろ液として生じる酵素水溶液を、有機溶剤成分としてメチル−ｔ−ブチルエーテル８１ｍＬ（ＭＴＢＥ）と混合する。生じた二相系を、自動ｐＨ−スタットを用いて１Ｍカセイソーダ液（Merck社より購入）の添加によりｐＨ ８．２に調節する。２０℃の温度に達した際に、次いでラセミ化合物rac−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸−ｎ−プロピルエステル１８８．２mmol（３９．０ｇ）を添加し、かつ反応を開始する。反応時間は１５時間であり、その際、所望の生成物（Ｓ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸からなる白色沈殿物が生じる。１５時間の反応時間後に、アセトン１６０ｍＬを、沈殿を完全にするために添加し、約４５分間後撹拌し、かつ固体を濾別する。固体を、少しのアセトンで複数回洗浄し、かつ引き続いて真空中で乾燥させる。４１．６％の収率に相応した、所望の（Ｓ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸１２．９１ｇが得られる。生成物についてのエナンチオ選択性は、９９．６％ｅｅである。エナンチオ選択性測定をＨＰＬＣにより行った。化学的純度については９８．８％が算出された（滴定により算出）。生成物の構造を、付加的にＮＭＲ分光法により確認した。
Claims (7)
- 加水分解酵素で、Ｎ−保護されていないβ−アミノ酸アルキルエステルの鏡像異性体混合物を酵素的加水分解することによってエナンチオマー豊富化したＮ−保護されていないβ−アミノ酸を製造する方法において、
加水分解を、水と、与えられた反応条件下に水と二相を形成する有機溶剤とからなる二相系中で行うことを特徴とする、エナンチオマー豊富化したＮ−保護されていないβ−アミノ酸の製造方法。 - 相応するｎ−プロピルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｓ−ブチルエステル、イソブチルエステル又はｔ−ブチルエステルを使用する、請求項１記載の方法。
- 反応のｐＨ値が４〜１０である、請求項１又は２記載の方法。
- 反応の際の温度が＋１５〜＋１００℃である、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
- リパーゼを使用する、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
- 反応を酵素−膜−反応器中で実施する、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
- 有機溶剤としてエーテル、ケトン、エステル、飽和又は不飽和の線状又は分枝鎖状の炭化水素を使用する、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
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