ITBG20090060A1 - Processo per la deracemizzazione chemo-enzimatica di alfa-ammino acidi alifatici - Google Patents
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Description
Descrizione
Invenzione avente per TITOLO:
"PROCESSO PER LA DERACEMIZ7. AZIONE CULMO-ENZIMATICA DI ALFA-ANIMINO ACIDI ALITATICI”
p
La presente invenzione riguarda la preparazione di N-ROC-L-allà animino acidi alitatici e più precisamente la trasformazione chemo-enzimatica di una miscela racemiea in un unico enantiomero cóme conseguenza di una risoluzione raccmica catalizzata da un enzima idrolitico e di una racemizzazione catalizzata da una base, Animino acidi non naturali vengono preparati per l'interesse nella preparazione di farmaci a base peptidiea resistenti in vivo.
Gli ammino acidi alitatici non naturali di configurazione L hanno la formula generale in tlg.
1 con R = ad una catena lineare o ramificata di un numero variabile di atomi dì C.
Al contrario degli animino acidi naturali che possono essere preparali per fermentazione, quelli non naturali devono essere ottenuti da un precursore sintetico racemo,
Stato dell'arte
Un metodo comune per l'ottenimento di animino acidi rii tipo L è la sintesi di un racemato miscela dei due enuncio meri, la trasformazione in un derivato ad esempio un estere o una ammide, e l'idrolisi selettiva catalizzata da un enzima idrolitico, in questo modi) a partire da una miscela dei due enantiomeri è possibile ottenere l'emuit annero rii configurazione L-come animino acido e l’altro enanciomero come ad esempio estere non reagito, La resa del processo è al massimo de] 50%. I .'altro enantiomero può però essere successivameme racemizzato e sottoposto nuovamente ad una risoluzione cinetica enzimatica. Ir questo modo tu resa del prodotto può superate il 50% ma il sistema ΐ intrinsecamente poco efficiente m quanto opera su step discontinui, comporta numerosi isolamenti, un notevole impiego di impianti e di forzai lavoro e tempi di lavorazione prolungati, lisempi industriali di questo tipo sono l'uso di N-acilasì su N-acil ammiro acidi racemi descritte da i, Kirimura et al, nel brevetto CA798S23 c in A.S, ISommarius et al, Chimia, 2001. 53, 50 59 o di amidusi sulle ominidi di animino acidi sempre racemi qua li ad esempio quelle descritle in ) R. W. Feenstra ei al. ’Tetrahedrom 1990. 46. 1745· 1756. Se la racemizzazione dell'enantiomero indesidcraLo avviene in un unico sistema reattivo ad urta velocità paragli nubi le alla velocità di idrolisi enzimatica, il processo può diventare una risoluzione cinetica dinamica, cioè un processo in cui un racemato è trasformato completamente in un solo cnaritiomero; una dcracemizzuzione. Un esempio industriale di deracetmzz azione di un alfa-ammino acido è costituito dallu trasformazione del l'amm inoacido racemo nell'idantoìna corrispondente seguita da una idrolisi da pane di una idantoinasi e da una carbamoilasi fornendo l'enamiomero D- con una retai quasi quantitativa come descritto ad esempio nel brevetto Li* 04006.ÌR (.Vf Kvriakos et Λ1.1 o nel brevetto U$-iy802K4 (M, Kyitakos et Al. )
Questo sistema che ha l'i neon veniente di dover utilizzare una biomassa e mm enzimi purificati è molto efficiente ed utilizzato, ma solo per la preparazione di amminoacidi di configurazione D.
Un sistema equivalente per la preparazione di amminoacidi di configurazione assoluta L-non c disponibile,
E' tuttavia nota la possibilità di idrolizzare con enzimi Γ .-selettivi derivati di amminoacidi (N-acii derivati u amminoacidi ummidi) e successivamente di racemizzare lisomero non reagito,
Molti metodi industriali si basano sii tecnologie di questo tipo. Questo tipo di metodo richiede un delti di molti passaggi successivi; risoluzione cinetica , separazione, isolamento del non reagito, racemizzazione ·, che devono essere ripetuti più volte per ottenere una conversione ragionevole. I a risoluzione cinetica dinamica prevede invece gli ani reattivi risoluzione cinetica e di racemizzazione nello stesso reattore.
Recentemente è stato descritto (l i. Arosio et al. Adr, Syntk Culai. 2007, 149, 13Ί5- Ι34Κ Ciurmi ι-cn/y ma tic Dynamic kinetic resolulion of amino ucki-thtoes tersi un metodo innovativo di risoluzione cinetica dinamica applicata a 3SI-BOC ammino acidi tio esteri. In questa metodologia un .immino acido racemo viene trasformalo nel derivato N BQC e nel corrispondente tio estere. Il prodotto viene tlisdolfo in un solvente organico immiscibile con acqua e trattato con una base ad et una trialehil ammina . A questa ailuzione si aggiunge una soluzione acquosa contenente l'enzima idrolitico Nel sistema trifasico avviene contemporaneamente l'idiolisi dei tioestere (enantiomero L-) e lu racemi zzazione del non reagito icnani iomefu D->. Alla fine dei processo tutto il racemo viene trasformalo nel corrispondente N-BOC-ammirio acido di configurazione L-, Il metodo c però limitato ad ammino acidi che abbiano il carbonio chirate in posizione alfa ad un anello aromatica In assenza di queste caratteristiche stmmirali si ha solo una risoluzione cinetica e non la rau.-mizzuzione. U derivato della fenii alanina ad esempio non viene racemizzato in queste condizioni. La sedia di basì adatte per la racemizzazione e inoltre limitata in quanto deve lener conto della presenza dell<’>enzima e della possibile racemizzazione anche del produiio di reazione, avendo il prudono la funzionalità acida.
In contrasto con queste considerazione sulla possibilità di aumentare la Ibiza della base, abbiamo scoperto sorprendentemente che operando in solventi organici adatti con bassissima concentra 7 ione di acqua ed in presenza di animine secondarie cicliche, è possibile raoemizzare anche derivati dì animino acidi alitatici con valori più alti di pKa dei protone in posizione alfa rispetto al gruppo tio-estere senza racemizza l'acido che si forma dopo l'idrolisi. In questo modo è possibile effettuare una deracemizzaziune attraverso una risoluzione cinetica dinamica di a minino acidi che non portano sostituemi come il gruppo aromatico, capaci di aumentare l'acidità del proli me in alfa
In particolare è punibile ottenere ammino acidi alifatici mirandi e non naturali di contigui azione L- e di elevato e.e, in rese > 98%.
I>e scrizione dettagliata dell'invenzione
La risoluzione cinedo dinamica dei derivati di ammiri» acidi oggetto di questa invenzione richiede per essere efficace le seguenii condizioni:
I subornili devono essere sotto forma dì estere in modo da poter essere riconosciuti da un enzima idrolitico. Gli enzimi idroliliei riconoscono in generale gli enantiomeri dei derivati di aminino acidi di configurazione L che è quella riunitale. Soprattutto le proteasi batteriche commerciali, ma anche estcrasi c lipasi hanno una preferenza pei l'cnantiomero L. In esperimenti precedenti abbiamo stabilito che non solo gli OMWSÉJÌ ma anche i rio esteri sono substrato di molti enzimi idrolitici,
in generale si può dire che se estere viene idrolizzato in una reazione catalizzala da un enzima, anche il tio-analogo io sarà, spesso con velocità paragonabili.
• Il substrato deve essere racemizzato nelle condizioni dì reazione e con una velocità paragonabile a quella della reazione di idrolisi in modo da rigenerare continuamente la miscela rucemica. Nelle slesse condizioni l'acido che si forma deve essere configurazionalmente stabile.
« La base usata deve essere abbastanza forte da estrarre il protone in posizione alfa al gruppo estera» ma non all'acido risultante dall<'>idrolisi.
<■>L<'>enzima deve essere stabile in presenza della base e dell'eventuale solvente nonché del itolo che si forma nella reazione di idrolisi.
* La presenza del gruppo Lio t indispensabile per consentire la laceniizzazìonc catalizzata dalla buse. Gli altri requisiti strutturali devono essere tuli da non limitare la struttura ddl'animino acido in modo da conservare generalità al metodo.
<■>Se h reazione avviene In un mezzo acquoso, la base può essere usata in quantità catalitica tu quanto può essere rigenerata con l'aggiunta di suda durante In titolazione in un pHstat. In caso di reazione in un mezzo non acquoso, la base viene salificata e deve essere presente in quantità stechiometrica.
<■>Il tioestere substrato deve essere stabile all'idrolisi spontanea nelle condizioni di reazione. La cosa è abbastanza critica in quanto i tioesteri sono di per sé attivati verso le reazioni di idrolisi,
Le condizioni che consentono di realizzare un efficace processo di deracemizzazione di derivati di suiti nino acidi allattici sono le seguenti:
1 substrati sono tioesteri di animino acidi con erilmercaptano, tricloroelilmcrcaptiim, benzilmercaptano. e simili.
I derivati degli amminoacidi sono preferibilmente protetti all'azoto come acetil Por mi 1 o tertbutossicarbonile per conferire maggiore solubilità nei solventi organici ed aumentare la. racemizzabilità.
Fra gli enimi idrolitici le lipasi da Candida antartica, da Pseudomonas. le esternai t> le protessi da Badllus Subiìlis sono adatte e subili nelle condizioni di reazione.
II mezzo di reazione è preferibilmente a basso contenuto di acqua o praticamente anidro, mentre ie basi compatibili otiti il processo sono ammine cicliche e loro N-aldiil derivati come N-alchil-piperidine. N-aichil-murfolrne, N-alchil-pìrrolidine, diazobicidononenc. diazobicicloundecene e simili.
Sulla base delle precedenti considerazioni oggetto del presente brevetto bt
Un processo di risoluzione cinetica dinamica di un composto di formula generale I
In cui
R rappresenta un gruppo alchilico ΓΓΓ,0 lineare, ramificato o cìclico eventualmente sostituito un gruppo arilalchilico eteromi alchilico eventualmente sostituito, R rappresenta un gruppo proiettivo del gruppo amminico quale ad esempio formile, acetile . ieri -bufitossi carbonile, benzilossicarbonile o gruppi analoghi compatibili con le condizioni di reazione e ben itoli «gli esperti della chimica degli aminoacidi quali ad esempio quelli citati in Houben-Weyl “Synthesis of Peplides ami Peptidomimetics" o in Kocienski Pnuectìng Groups ” o in Grccnc- Wuts "Proieeting Group in Organic Synthesis"
R’ rappresenta un gruppo alehtlico C|-C,jlineare, ramificato o ciclico eventualmente sostituito o uri gruppo arilalchico eventualmente sostituito, a dare un composto di formula generale 11
in Cui
R rappresent idrogeno o un gruppo alchilico Ci-C» lineare ramificato o ciclico
P ed R hanno gli stessi significali riportati nella formula 1.
11 processo di risoluzione cinetica dinamica oggetto del presemi: brcvetio viene condotto utilizzando come enzima idrolìtico urta lipasi una estcrasi o una protessi opportunamente selezionala sulla base del tipo di substrato prescelto. L'enzima può essere ulilìz/ato in forma lihera o supportata su matrice inerte. Esempi non limitanti degli enzimi utilizzabili sono lipasi da Candida Antartica, prntcasi di origine batterica esterasi.
T.c basi utilizzate nel processo sono N-alchil-immine cicliche quali ad esempio N -metri -motfolina. N-alchil-pipcridintt, N-alchil-pinolidina. diazabtckloundeccnc diazabiciclonomenec, diisopropiletilammina o altre basi forti organiche,
il solvente di reazione è un alcol secondario o terziario quali ad esempio isopropano (o o tcrt butanolo o un solvente aprotico con contenuto di acqua compreso tra 0 e 60%. Ne! caso vengano utilizzati alcoli secondari anidri come solventi, si ottiene la formazione di esteri ul posto degli acidi prodotti in presenza di quantità almeno stechiometriche di acqua.
Esempi
Esempio I.
Procedura generale
In un reattore termo statato a 40"C sono stati sciolti I g di tirestere in 40 mi di 2-propanolo sono stati poi aggiunti 20mg di nanalene come standard interno e 2eq di base. Si aggiungo poi l'enzima (500 U> in forma solida o immobilizzata. La reazione viene agitata alla stessa temperatura e seguita in HPLC su colonna chinile ,ad esempio Chiracell-OD. A con versione completata viene filitelo l'enzima, il solvente viene evaporato ed il residuo viene ripreso con acqua e portato a pH circa 8.
Si lava la sol acquosa con opportuno solvente , la fase acquosa viene acidificata con HO f> N limi a pH 5 ed estratta con acetato d’etile o con altro solvente adatto, Da questa soluzione il prodotto viene isolato per e vapora/ ione o per precipitazione con un solvente insolubilizzan opportunamente scelto,
L-Norleucine :: (D.LfBOC-Norleucina tioetilestere ( l g . 563 armo 1) in 30 mi di t-butanoio addizionato di 20mg naftaline, DBU (2eq,7,2ónumd, imì> cd I g di suhtilisina cross linkata (attività 2.000 U/g). La reazione è completa in 48 h ( liPLC’> dopo la procedura di lavorazione della miscela sì isolano 765 mg (3.3 mmol) di L-BOC-norLeu-OH resa: 91%·, ce (HPLC) >95%·
’H NMR (400 MHz.CIX-lj): 5 = 0.90 0, J = 6.94 Hz, 3H*. 1 .28-1.41 (m. 4H). 1 .45 (a. OH), 1 ,60-1,93 (m. 2H), 4. 1 1 ft>r s, 0.3H1. 4.30 (br s. 0.7H). 5.01 (hr s, 0.711). 6.0V (br s, U.3H). Esempio 3;
T.-Norvaline: (D.L) HOC Norvalina lioetilestere i l g. 3.K0nimol) in 30 mi di i-butanolo addizionato di 20mg naftalene. DBU( 2eq.7.26mmol.lml)ed I g di subii lisina cross linkata (attività 2.00(1 IJ/g) . La reazione è completa in 48 Li (HPLCÌ dopo la procedura di lavorazione della miscela si isolano 781 mg (3,7 mmol) di L4JOC- norV ai-OH resu: 97%, «Ì (HPI.C| >95%
H N'MR (400 MH/,CDC13⁄4); 8 = 0.95 (L I = 7.37 Hz. 311), 1.35-1.45 (m. 2H), 1.44 <s, 9H).
1.5V 1.89 (m. 2H), 4.15 (br s> 0.3H), 4.30 (br s, 0.7HL 4.99 (br s, 0.7H). 5.95 <hr s, 0.3H), Esempio 4:
L-2-ammino ottanoico : BOC-D.L- Ammino ottano ico benzil estere ( I g , 2 7 mmol) in 30 mi di t-butanolo addizionalo di 20mg naftaleiw. DHL' (2eq, 7.26mmol.lml) ed I g di subti lisina cross linkata (attività 2.000 U/g). La reazione è completa in 90 ti (HTT.C) dopo la procedimi di lavorazione della miscela si isolano 730 mg ( 2.6 mmll dell’acido BOC-L-Ammino ottanoico resa: 90%. ec (HPLC) >95%
3H NMR (400 MHz.CDCL): 8 = 0.90 (1, 1 = 6.94 Hz, 311), 1.44 (m, 9H). 1.20 1.40 fm. 8H1.
1.60-1 .70 (m, I H}. 1 ,83 fbrs. IH), 4.10 (br s, 0.3 H), 54.30 ibi s. 0.7HL 5.00 (hr s. 0.7H), 6.04 ibr s. 0.3H). 9.60 (br s. IH).
Esempio 5;
L-l enilalanìna: BOC-D.L-Pcnilalanitm bctizil estere < 1 g, 2.6 mmot.) in 30 mi di t-butanolo addizionato di 20mg naftalene, DBIJ (leq, 7,26mmol,lml) ed l g di subtilis’ma cross linkata (attività '2.000 U/g) La reazione è completa in 90 h (HPLC) dopi la procedura di lavorazione della miscela si isolano 689 mg ( 2.6 mimi) di UOL'-L-l enilalanina resa: 91%, ee (HP1.Q >959f-MM 265.30 ['382)
Ή NMR (400 MHz-CDCl*}: δ= 1.28 (s, 3H), S 1.42 (s. 6H), 2.91-3,19 (ni. 2H), 4.40 <s, 0.411), 4.62 [s. 0.6HK 84.99 (s, 0.7H). 6.59 ts, 0.3H). 7.19-7.29 (m. 511), 10.6 (br sT IH). Esempio 6:
1.-omo -Fenilalanina ; liOC-DJ- Fenilalanina benzil estere ( 1 E, 25 mmnl) in 313 mi di tbrininolo addizionato di 20mg naftalene. DBU (2eq. 7.26mmol.Iml) ed 1 g di subtilisia cross linkata (attività 2.0110 LVgk
reazione è completa in 90 h iHPLCl dopo la proceduta di lavorazione della miscela si isolano 670 mg (2.4 mmol) di BOC-L-Fenilalanina resa; 80%, ee (HPLC) >95%
Ή NMR (250 MHz. CT>CU): tì = 1.46 (s, 9H), 1 ,94-2.30 (m. 2H), 2.73 (l. J=7.8 Hz. 2H).
4.28-4,43 (m. IH). 5-10 (d. J=7.4 Hz, HI), 7.18-7.32 (tu. 5H). 10.6 (br s. IH).
Esempio 7:
L-omo -Fenilalanina : BOCHL-omo- fenilalanina benzil estere il g, 2.5 mino!) in 30 mi di 2-propanolo addizionato di 20mg naftalene. I3BU <2eq. 7.26mmol ,1ml) ed 1 g di subtilisina cross linkata (attività 2.000 LVgj , La reazione è compieta Ln 90 h (HPLC) dopo la procedura di lavorazioni: della miscela si isolano 567 mg ( 1.8 munii) di BOC-L-omo-Femlalanina -2-propil estere resa: 82% . et < ΗΓΙ .C 1 >95%
'H NMR (400 MHz. CDCL): 5 = 1.263 (t. 6Π), &- 1.46 Is. 9H). 1 .94-2.30 (m. 2H). 2.73 (m, 2HI. 4.3 (brs. 0.511), 5-5, 15 (m. 1,5H), 7-18-7.32 (m. Sili,
Esempio 8;
L-omo-F eninanalina : BOC-D.L-Fenilalanina benzil estere ( I g, 2.5 mmol) in 30 mi dì t butanolo addizionato di 20mg naftalene, N-metil-morfolinaa (leq, 7.26tntnol ) ed 1 g di subtilisina cross iinkata (attivitit 2.UU0 U(gl
La reazione è completa in 90 h (HPLC) dopo la procedura di lavorazione della miscela si isolano 502 nm 11 ,8 rumo]) di BOCL-Feailalanma resa: 85%. ee (HPLC) >95 %
IH NMP <250 ΜΗζ, ΧΛΧλ3): δ= 1.46 (s. 9H), 1 .94 -2.3(1 (m. 211), 2J3 (t, J=7.8 Hz. 2H), 4.28-4,43 <m, IH). 5,10 (d. J=7,4 Hz, UT). 7. lft-7.32 (m, 5Hi. 10.6 (br s. IH».
Claims (1)
- Rivendicazioni 1 Un processo di risoluzione cineica dinamica di un composto di formula generale 1 in cui R rappresenta un gruppo alchilico c1 -c1 lineale, ramificato o ciclico eventualmente sostituito. un gruppo arialchilico o eteroarilachili eventualmente sostituito P rappresenta un gruppo protettivo dell'ammina quale ad esempio formile, acetile, lertbutilossi carbonile, benzilossicarboriile o gruppi analoghi compatibili con le condizioni di reazione R' rappresenta un gruppo alchilic orC(, lineare , ramificato o ciclico eventualmente sostituito o un gruppo ariialehilieo eventualmente sostituito, a dare un composto di formula generale II in cui R" rappresenta idrogeno o un gruppo alhilico CVQ, lineare ramificato o ciclico P cri K hanno gli stessi significati riportati nella formula I, utilizzante un enzima idrolitico stereoselettio in presenza di una base in grado di racemizzare il tioestere non idrolizzato, m opportuno solvente o miscela, di solventi a temperature comprese tra IO e 6U<'>X\ 2. Un processo di risoluzione cinetica secondo la rivendicazione 1 che utilizzi come enzima idrolitico una lipasi una esterasi o una protasi opportunamente selezionata sulla base del tipo di substrato prescelto in cui l'enzima può essere utilizzati) in forma libera o supportata su matrice inerte. i Un processo di risoluzione cinetica secondo la rivendicazione I in cui le basi utilizzale nel processo siano ammine quali ad esempio diazabicicloundecene, diazabiciclonomene , diisopropiletilammina N metil morfolina o altre basi forti organiche. 4. Un processo secondo la rivendicazione 1 in cui il solvente di reazione sia un alcol secondario o terziario, un solvente aprotico miscele tra questi in qualunque rapporto con contenuto di acqua compreso fra 0 c 60%. 5. Un processo secondo la rivendicazione i nel quale il solvente sia un alcol secondino e il prodotto ottenuto sia l'estere corrispondente all<'>alcol secondario utilizzalo, 6. Il processo di cui alla rivendicazione 2 nei quale l'enzima impiegato sia una proteasi da Bacillus Subtilis. libera o legata a LUI supporto inerte. 7. Il processo di cui alla rivendicazione 3 in cui la base utilizzata sia diazabicicloundecene o diazabiciclononene S. Il processo di cui alla rivendicazione 4 in cui il solvente sia un alcol terziario con contenuto ir acqua compreso tra i) e I03⁄4. 9. Il processo dì cui alla rivendicazione I in cui la temperatura di reazione sin compresa tra 20 e 50°C.
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| EP0089886A1 (fr) * | 1982-03-23 | 1983-09-28 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Procédé de préparation d'un alpha-amino-acide libre L |
-
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| EP0089886A1 (fr) * | 1982-03-23 | 1983-09-28 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Procédé de préparation d'un alpha-amino-acide libre L |
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| AROSIO, D. ET AL.: "Chemo-Enzymatic Dynamic Kinetic Resolution of Amino Acid Thioesters", ADVANCED SYNTHESIS & CATALYSIS, vol. 349, no. 8, 4 June 2007 (2007-06-04), pages 1345 - 1348, XP002592179 * |
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