CN115216468A - 一种可塑型酶@金属有机框架凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种可塑型酶@金属有机框架凝胶及其制备方法与应用。在该凝胶的制备流程中，首先将酶原位封装于多孔金属有机框架内，然后通过Ca2+离子与海藻酸钠‑聚丙烯酸的双重交联聚合制备出形貌可控的复合凝胶。金属有机框架外骨架紧密束缚酶的构象，可以显著提高酶的稳定性；同时，高度亲水的水凝胶微环境可富集酶促反应产物，表现出更高的催化“信号”。此外，该复合凝胶可以有效解决酶@金属有机框架微晶材料加工性能差、可塑性差等技术瓶颈，进一步设计成便携式的原位传感器。

Description

一种可塑型酶@金属有机框架凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域。更具体地，涉及一种可塑型酶@金属有机框架凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
酶作为一种天然的生物催化剂，具有高催化活性、高选择性的特点，但是它同时还存在对环境变化敏感的缺点，如高温、强酸性或碱性等条件下容易酶变、失活。为了解决酶的稳定性问题，现有技术常用金属有机框架(MOF)作为酶结构固定化的理想载体，得到的酶@MOF复合材料能够有效提高酶对温度、pH、溶剂等的耐受能力。如中国专利申请提供了一种耐酸改性有机金属框架固定化酶的方法，该方法以柠檬酸或柠檬酸钠修饰2-甲基咪唑，再向其中掺杂纳米二氧化硅、锌离子水溶液和蛋白酶，离心，所得沉淀即为固定化酶；采用水相溶液混合法制备耐酸改性有机金属框架，以掺杂纳米二氧化硅作为载体，共同使得固定化脂肪酶的催化活性、pH耐受性、重复利用率显著提升，但是该方法得到的酶@MOF材料是微晶态的，难以对其进行加工和塑型，极大地限制了酶@MOFs材料在大规模工业化中的应用，并且稳定性也仍有待提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有酶@MOF复合材料为微晶态难以加工塑性，稳定性有待提高的缺陷和不足，提供一种稳定性好的可塑型酶@金属有机框架凝胶。
本发明的目的是提供所述可塑型酶@金属有机框架凝胶的制备方法。
本发明另一目的是提供所述可塑型酶@金属有机框架凝胶的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种可塑型酶@金属有机框架凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、将酶加入2-甲基咪唑溶液中，再加入锌盐溶液，混合均匀，静置，取沉淀，后处理，得酶@金属有机框架；
S2、取步骤S1所得酶@金属有机框架置于2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)溶液中分散均匀，边搅拌边加入海藻酸钠，混合均匀，得混合液；
S3、将步骤S2所得混合液塑性成不同的形状，浸没于钙盐和聚丙烯酸的混合溶液中，聚合完全，即得。
本发明中，先将酶封装于由锌离子与2-甲基咪唑配位组装的金属有机框架(ZIF-8)上，再采用简单的混合法将获得的酶@金属有机框架微晶材料与海藻酸钠溶液混合均匀，并将该混合液注入含Ca2+离子的聚丙烯酸交联剂溶液中，快速聚合塑型得到可塑型酶@金属有机框架凝胶。金属有机框架外骨架紧密束缚酶的构象，可以显著提高酶的稳定性；同时，高度亲水的水凝胶微环境可富集酶促反应产物，表现出更高的催化“信号”。此外，该复合水凝胶可以有效解决酶@金属有机框架微晶材料的加工性能差、可塑性差等技术瓶颈，可进一步设计成便携式的原位传感器。
进一步地，步骤S1中，所述酶选自葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、胆固醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、尿激酶、漆酶、脂肪酶、乙醇脱氢酶、乙酰胆碱酯酶、过氧化氢酶、乳酸氧化酶、β-葡萄糖醛苷酸酶、细胞色素C、尿酸酶、超氧化物歧化酶中的一种或多种。
优选地，步骤S1中，所述酶为葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶、胆固醇氧化酶-辣根过氧化物酶、肌氨酸氧化物酶-辣根过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶-辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶中的一种。
更优选地，步骤S1中，所述酶为两种酶的组合时，两种酶的质量比为1:1，两者之间存在级联反应。例如，选择葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶制备可塑型酶@金属有机框架凝胶，当葡萄糖存在的时候，会触发酶级联反应，并产生的可视化的颜色信号；结合可通过RGB模式识别颜色的智能手机APP对该颜色信号进行快速识别及数据处理，可实现葡萄糖的原位监测；进一步结合对照，可以测定葡萄糖的含量大小，并且不会受到其他杂质的影响，专一性强。
更进一步地，步骤S1中，所述锌盐为乙酸锌或硝酸锌。
进一步地，步骤S1中，所述酶的添加量为0.1～2mg/mL。
更进一步地，步骤S1中，所述2-甲基咪唑与乙酸锌的摩尔比为4:1～12:1。
进一步地，步骤S1中，所述静置的时间为30min～12h。
更进一步地，步骤S1中，所述后处理为依次用水洗沉淀2～4次，乙醇洗涤1～2次，干燥。
进一步地，步骤S2中，所述ABTS溶液的浓度为1～20mM。
更进一步地，步骤S2中，所述酶@金属有机框架的添加量为0.5～100mg/mL。
进一步地，步骤S2中，所述海藻酸钠的添加量为5～80mg/mL。
更进一步地，步骤S3中，所述钙盐为氯化钙、硝酸钙、氯酸钙、高氯酸钙、碳酸氢钙或磷酸二氢钙。
进一步地，步骤S3中，所述钙盐和聚丙烯酸的混合溶液中，所述钙盐的浓度为20～120mol/L，聚丙烯酸的浓度为0.01～2mol/L。
另外的，本发明还提供了一种可塑型酶@金属有机框架凝胶，所述可塑型酶@金属有机框架凝胶由所述制备方法制备得到。
另外的，本发明还要求保护所述可塑型酶@金属有机框架凝胶在传感、生物催化、药物合成、食物加工、含酶洗涤剂、生物燃料中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明制备了一种可塑型酶@金属有机框架凝胶。在该凝胶的制备流程中，首先将酶原位封装于多孔金属有机框架内，然后通过Ca2+离子与海藻酸钠-聚丙烯酸的双重交联聚合制备出形貌可控的复合凝胶。金属有机框架外骨架紧密束缚酶的构象，可以显著提高酶的稳定性；同时，高度亲水的水凝胶微环境可富集酶促反应产物，表现出更高的催化“信号”。此外，该复合水凝胶可以有效解决酶@金属有机框架微晶材料的加工性能差、可塑性差等技术瓶颈，可进一步设计成便携式的原位传感器。
附图说明
图1为本发明实施例1、2的流程示意图。
图2为本发明实施例1所得GH@ZIF-8和GH@ZIF-8-ACP材料以及海藻酸钙凝胶(ACP)的扫描电镜图，其中，图2(a)为GH@ZIF-8，图2(b)为海藻酸钙凝胶，图2(c)为GH@ZIF-8-ACP。
图3为本发明实施例1所得GH@ZIF-8和GH@ZIF-8-ACP的X射线衍射图，其中，图3(a)为GH@ZIF-8-ACP、GH@ZIF-8、ZIF-8的对比，图3(b)为GH@ZIF-8-ACP和ACP的对比。
图4为本发明实验例1中游离酶(GOx：HRP＝1:1，enzyme)、ZIF-8、GH@ZIF-8、GH@ZIF-8-ACP与ACP的傅里叶变换红外光谱图。
图5为本发明实验例1中ZIF-8、GH@ZIF-8、ACP、GH@ZIF-8-ACP的热重分析图。
图6为本发明实验例1中ZIF-8、GH@ZIF-8、ACP、GH@ZIF-8-ACP的N2吸附-解吸等温线，其中，图6(a)为ZIF-8、图6(b)为GH@ZIF-8、图6(c)为ACP、图6(d)为GH@ZIF-8-ACP。
图7为本发明实验例2中球状(a-1)、线状(b-1)、片状(c-1)的GH@ZIF-8-ACP的颜色R值随时间的变化曲线图与球状(a-2)、线状(b-2)、片状(c-2)的GH@ZIF-8-ACP随时间的显色情况。
图8为本发明实验例2中球状、线状与片状GH@ZIF-8-ACP，在保证相同含酶量的前提下，不同时间下显色效果图。
图9为本发明实验例3中片状GH@ZIF-8-ACP在不同葡萄糖浓度下显色15分钟后，R值变化的标准曲线图。
图10为本发明实验例4中GH@ZIF-8-ACP显色的抗干扰实验的对比图。
图11为本发明实验例5中GH@ZIF-8-ACP显色的交叉反应实验的对比图。
图12为本发明实验例6中GH@ZIF-8-ACP的储藏稳定性探究结果统计图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1一种可塑型酶@金属有机框架凝胶
所述可塑型酶@金属有机框架凝胶的制备方法包括以下步骤：
S1、分别配制40mM的乙酸锌溶液和160mM的2-甲基咪唑溶液，称取20mg葡萄糖氧化酶(GOx)与20mg辣根过氧化物酶(HPR)，一起溶于20mL 160mM的2-甲基咪唑溶液中，再加入20mL 40mM的乙酸锌溶液，静置4小时；离心，舍去上清液，水洗3次，乙醇洗涤1次，真空干燥，研磨，得GH@ZIF-8；
S2、称取40mg步骤S1所得GH@ZIF-8，加入1mL 5mM ABTS溶液，将GH@ZIF-8在ABTS溶液中超声分散均匀；分散后，将悬浊液进行磁力搅拌，在搅拌的过程中加入20mg海藻酸钠，保证混合均匀后，获得混合液；
S3、将步骤S2所得混合液装入注射器，小心滴入或直接注入到包含60mol/LCaCl2和0.05mol/L的聚丙烯酸溶液中，聚合10min形成球状或线状复合凝胶GH@ZIF-8-ACP。
实施例2一种可塑型酶@金属有机框架凝胶
所述可塑型酶@金属有机框架凝胶的制备方法包括以下步骤：
S1、分别配制40mM的乙酸锌溶液和160mM的2-甲基咪唑溶液，称取20mg葡萄糖氧化酶(GOx)与20mg辣根过氧化物酶(HPR)，一起溶于20mL 160mM的2-甲基咪唑溶液中，再加入20mL 40mM的乙酸锌溶液，静置4小时；离心，舍去上清液，水洗3次，乙醇洗涤1次，真空干燥，研磨，得GH@ZIF-8；
S2、称取40mg步骤S1所得GH@ZIF-8，加入1mL 5mM ABTS溶液，将GH@ZIF-8在ABTS溶液中超声分散均匀；分散后，将悬浊液进行磁力搅拌，在搅拌的过程中加入20mg海藻酸钠，保证混合均匀后，获得混合液；
S3、以玻璃板为衬底，在涂膜机上将步骤S2所得混合液在玻璃板上涂布均匀，厚度设置为40μm，将上述涂覆混合液的玻璃板浸没在包含60mol/L CaCl2和0.05mol/L的聚丙烯酸溶液中，聚合10min形成片状的复合凝胶GH@ZIF-8-ACP。
实施例1、实施例2的流程示意图参见图1。
实施例3一种可塑型酶@金属有机框架凝胶
与实施例1不同之处在于，实施例3将酶替换为胆固醇氧化酶和辣根过氧化物酶，其余参数及操作参考实施例1。
实施例4一种可塑型酶@金属有机框架凝胶
与实施例1不同之处在于，实施例4将酶替换为肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，其余参数及操作参考实施例1。
实施例5一种可塑型酶@金属有机框架凝胶
与实施例1不同之处在于，实施例5将酶替换为黄嘌呤氧化酶和辣根过氧化物酶，其余参数及操作参考实施例1。
实施例6一种可塑型酶@金属有机框架凝胶
与实施例1不同之处在于，实施例6将酶替换为β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶，其中，β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶的质量比为2:1:1其余参数及操作参考实施例1。
以下以实施例1、2所得可塑型酶@金属有机框架凝胶作为示例，测定其结构表征及性能等参数，其余实施例效果类似。
实验例1可塑型酶@金属有机框架凝胶的结构表征
1、对实施例1所得GH@ZIF-8和GH@ZIF-8-ACP材料和海藻酸钙凝胶(ACP)进行电镜扫描，结果参见图2。由图可见，本发明和实施例1制备所得GH@ZIF-8-ACP材料中，GH@ZIF-8均匀地分散在ACP中。
2、对实施例1所得GH@ZIF-8和GH@ZIF-8-ACP材料进行X射线衍射测试，结果参见图3。由图可见，GH@ZIF-8和GH@ZIF-8-ACP均与标准ZIF-8的PXRD图谱一致，证明制备的复合材料具有高度结晶的ZIF-8结构；同时，该结果也证实GH@ZIF-8被包被在ACP中。
3、采用傅里叶变换红外光谱仪对混合的游离酶(GOx：HRP＝1:1，enzyme)、ZIF-8、GH@ZIF-8、GH@ZIF-8-ACP与ACP这5种样品的结构进行表征，测定结果如图4所示。由图可见，ZIF-8在1580cm-1(C＝N)和1350～1500cm-1处(咪唑环的特征峰)具有特征的红外吸收带，而酶(GOx+HRP)则在1400～1500cm-1和1500～1600cm-1处具有特征的吸收带，分别归属于蛋白质骨架的酰胺II和I带的红外特征吸收峰；此外，GH@ZIF-8既出现了酶的红外特征吸收带，也出现了ZIF-8的特征吸收带，说明酶被成功封装到ZIF-8中。
4、采用热重分析对ZIF-8、GH@ZIF-8、ACP、GH@ZIF-8-ACP进行表征，结果如图5所示。由图可见，在220～500℃处，GH@ZIF-8的失重比ZIF-8快，这可以归因于GH@ZIF-8中包被的酶高温被分解；对比GH@ZIF-8与GH@ZIF-8-ACP，可以发现二者失重趋势类似，但GH@ZIF-8-ACP失重要多一些，这与ACP的分解有关；对比ACP与GH@ZIF-8-ACP可以发现，GH@ZIF-8-ACP失重要少一些，这与GH@ZIF-8-ACP中包含了ZIF-8-ACP有关。
5、测定ZIF-8、GH@ZIF-8、ACP、GH@ZIF-8-ACP的N2吸附-解吸等温线，结果如图6所示。由图可见，ZIF-8、GH@ZIF-8、ACP、GH@ZIF-8-ACP的比表面积分别为1289.6725m2/g、4.0912m2/g、1.6866m2/g、16.8725m2/g；其中，相比于ZIF-8，GH@ZIF-8的比表面积大幅度减小，证明ZIF-8的空隙被酶占据，也说明了酶被包埋在材料中。
实验例2 GH@ZIF-8-ACP与GH@ZIF-8的葡萄糖识别能力对比
在保证相同酶含量的前提下，分别对比单纯的GH@ZIF-8与球状、片状的GH@ZIF-8-ACP(注：为了方便性能对比，这里的GH@ZIF-8-ACP均没有预先包封ABTS)对葡萄糖(1mM)的识别能力，方式如下：
分别将一定质量的球状、线状与片状GH@ZIF-8-ACP加入96孔板中，同时以相应质量的GH@ZIF-8作为对照；在各测试组中分别加入5mM ABTS，并加入1mM葡萄糖，每间隔1min用手机摄像头对各测试组进行拍摄，并通过取色器APP的RGB模式对颜色进行识别，绘制颜色R值随时间变化的曲线，结果参见图7和图8。
由图可见，球状、线状和片状的GH@ZIF-8-ACP均比单纯的GH@ZIF-8具有更高的ΔR值；制成凝胶材料的GH@ZIF-8-ACP显色能力相较于游离在溶液中的GH@ZIF-8更强，说明GH@ZIF-8-ACP有助于提高对葡萄糖的识别灵敏度。
实验例3 GH@ZIF-8-ACP对葡萄糖的定量分析
将片状的GH@ZIF-8-ACP裁成规格为0.5cm×0.5cm的方片，取27片，分开放置于玻璃板上，通过手机摄像头摄影，并用取色APP提取颜色RGB数值的R值作为背景数值；在不同GH@ZIF-8-ACP片上分别滴加1μL浓度为0mM、0.05mM、0.1mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM的葡萄糖溶液，每组平行测试3次，15min后摄影并提取颜色R值，绘制葡萄糖浓度对ΔR值的曲线图，结果参见图9。
由图可见，GH@ZIF-8-ACP对葡萄糖具有分段性的线性响应范围，第一段为0～0.25mM，第二段为0.25～4mM，在相应的浓度范围内均具有良好的线性关系；上述测试结果证明了GH@ZIF-8-ACP可以通过与智能手机颜色识别软件联用，实现葡萄糖的准确定量，并且该方法具有简易便携的优点，可应用于葡萄糖的原位监测。
实验例4基于GH@ZIF-8-ACP的葡萄糖检测的抗干扰实验
将片状的GH@ZIF-8-ACP裁成规格为0.5cm×0.5cm的方片，取36片，分开放置于玻璃板上，通过手机摄像头摄影，并用取色APP提取颜色RGB数值的R值作为背景数值；在GH@ZIF-8-ACP片上分别滴加1μL果糖、木糖、鼠李糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、甘氨酸、BSA、尿素、组氨酸、精氨酸、谷氨酸和丙氨酸溶液(上述浓度均为10mM)，另外分别滴加1μL浓度为1mM的葡萄糖溶液以及1μL去离子水作为对比，每组平行测试3次，15min后摄影，并提取颜色R值，结果参见图10。
由图可见，在果糖、木糖、鼠李糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、甘氨酸、BSA和尿素溶液的浓度均10倍高于葡萄糖的情况下，只有滴加了葡萄糖的GH@ZIF-8-ACP片的R值的变化明显，说明本发明制备所得GH@ZIF-8-ACP对葡萄糖具有专一性。
实验例5 GH@ZIF-8-ACP显色的交叉反应实验
将片状的GH@ZIF-8-ACP裁成规格为0.5cm×0.5cm的方片，取36片，分开放置于玻璃板上，通过手机摄像头摄影，并用取色APP提取颜色RGB数值的R值作为背景数值；在GH@ZIF-8-ACP片上滴加1μL含1mM葡萄糖和10mM木糖、鼠李糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、甘氨酸或BSA的混合液(即溶液中葡萄糖浓度为1mM，其他任一干扰物质的浓度为10mM)，每组平行测试3次，15min后摄影，并提取颜色R值，结果参见图11。
由图可见，混合溶液总体上R值变化和单纯葡萄糖溶液相近，说明在高浓度干扰物存在下，GH@ZIF-8-ACP仍对葡萄糖具有准确的识别能力。
实验例6 GH@ZIF-8-ACP的储藏稳定性考察
将片状的GH@ZIF-8-ACP裁成规格为0.5cm×0.5cm的方片，放置于玻璃板上，通过手机摄像头摄影，并用取色APP提取颜色RGB数值的R值作为背景数值；将GH@ZIF-8-ACP方片常温放置，每隔一段时间取出3个方片，在每个方片中心滴加5μL 1mM的葡萄糖，15min后摄影，并提取颜色R值，通过计算放置不同时间后的GH@ZIF-8-ACP方片对葡萄糖识别的颜色R值变化的平均值，评估其储藏稳定性，结果参见图12。
由图可见，本发明制备的GH@ZIF-8-ACP常温储存30天后，ΔR值是原始数据的85.88％±10.30％，说明GH@ZIF-8-ACP具有优异的储存稳定性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可塑型酶@金属有机框架凝胶的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、将酶加入2-甲基咪唑溶液中，再加入锌盐溶液，混合均匀，静置，取沉淀，后处理，得酶@金属有机框架；
S2、取步骤S1所得酶@金属有机框架置于ABTS溶液中分散均匀，边搅拌边加入海藻酸钠，混合均匀，得混合液；
S3、将步骤S2所得混合液塑性成不同的形状，浸没于钙盐和聚丙烯酸的混合溶液中，聚合完全，即得。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述酶选自葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、胆固醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、尿激酶、漆酶、脂肪酶、乙醇脱氢酶、乙酰胆碱酯酶、过氧化氢酶、乳酸氧化酶、β-葡萄糖醛苷酸酶、细胞色素C、尿酸酶、超氧化物歧化酶中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述酶为葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶、胆固醇氧化酶-辣根过氧化物酶、肌氨酸氧化酶-辣根过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶-辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶中的一种。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述锌盐为乙酸锌或硝酸锌。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述酶的添加量为0.1～2mg/mL。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述酶@金属有机框架的添加量为0.5～100mg/mL。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述海藻酸钠的添加量为5～80mg/mL。
8.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述钙盐为氯化钙、溴化钙、硝酸钙、氯酸钙、高氯酸钙、碳酸氢钙或磷酸二氢钙。
9.一种可塑型酶@金属有机框架凝胶，其特征在于，所述可塑型酶@金属有机框架凝胶由权利要求1～8任一所述制备方法制备得到。
10.权利要求9所述可塑型酶@金属有机框架凝胶在传感、生物催化、药物合成、食物加工、含酶洗涤剂、生物燃料中的应用。
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