CN100359324C - 含剥层二氧化锰的生物传感器酶功能敏感膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含剥层二氧化锰的电化学生物传感器酶功能敏感膜及其制备方法。该敏感膜是由氧化酶、固定酶的高分子物质及剥层二氧化锰组成。利用剥层二氧化锰比表面积大、表面活性中心多、带有负电荷及具有良好导电性等特性，可以提高生物传感器的灵敏度、稳定性及抗干扰能力，从而提高生物传感器的综合性能指标。该敏感膜的制备方法是：将剥层二氧化锰的溶胶与氧化酶混合均匀，然后滴涂在洁净的玻碳电极表面，在室温下干燥后将其浸入到高分子凝胶中固定，室温下挥发掉溶剂，即在玻碳电极表面形成一层含剥层二氧化锰的酶功能敏感膜。
Description
技术领域：
本发明属于电化学生物传感器及其制备技术领域，特别是涉及一种含剥层二氧化锰的电化学生物传感器酶功能敏感膜及其制备方法。
背景技术：
电化学生物传感器具有性能稳定、选择性高、价格低廉、操作简便、易微型化等特点，已在临床诊断、工业控制、食品检测、药物分析、环境分析、生物芯片和军事领域等诸多方面得到广泛应用。其中利用生物活性物质与电极间的直接电化学行为(即直接电子传递)进行检测的第三代无试剂电化学生物传感器更是备受人们关注，是当前电化学生物传感器研究领域的热点。
但无试剂电化学生物传感器的灵敏度和应用范围尚存在一定的局限性，这主要是因为：(1)缺少简便高效的方法对生物活性物质进行固定；(2)大部分生物活性物质(如酶、细胞等)的活性中心在一定程度上被蛋白质所掩蔽，生物活性中心与电极之间的直接电子传递比较困难。
为了解决上述问题，人们将纳米材料引入电化学生物传感器生物敏感膜体系，利用纳米材料的比表面积大、表面活性中心多、吸附能力强等优异性质，提高生物敏感膜的响应灵敏度、稳定性及抗干扰能力等性能指标。到目前为止，被用于生物敏感膜的纳米材料包括纳米金属颗粒(Au、Ag、Cu等)、纳米金属氧化物颗粒(SiO2、TiO2、MnO2等)及纳米层状材料(蒙脱土、层状双羟基复合金属氧化物等)等。
在文献(1)Analytical Biochemistry，2002，307：110中，Song-Qin Liu等人研究了通过纳米金胶将辣根过氧化酶固定在碳糊电极上的生物电化学传感器，结果表明纳米金使生物活性中心与电极间更易发生电子转移，从而实现了辣根过氧化酶的直接电化学行为，增强了传感器的灵敏度、稳定性和再生性能。该传感器对H2O2的响应范围为0～0.3mmol/L，线性范围为0.48～50μmol/L，当信噪比为3时，检测限为0.21μmol/L。
在文献(2)Electrochimica Acta，2004，49：1981中，Yan Zhang等人研究了将辣根过氧化酶通过纳米TiO2固定在热解石墨电极上的生物传感器，结果表明纳米TiO2固定的辣根过氧化酶在电极上有效地实现了直接电化学行为，增强了传感器的稳定性。该传感器对H2O2的线性响应范围为7.5×10-6～1.23×10-4mol/L，信噪比为3时，检出限为2.5μM。
在文献(3)Electrochemistry Communications，2004，6：1169中，Jing-Juan Xu等人将纳米二氧化锰颗粒引入到壳聚糖修饰的葡萄糖传感器中，研究发现纳米二氧化锰颗粒能够在壳聚糖膜中稳定存在，并且能够消除抗坏血酸对葡萄糖传感器检测的干扰。当抗坏血酸与葡萄糖的浓度比为1∶10时，抗坏血酸的干扰误差小于9％，当抗坏血酸与葡萄糖的浓度比为1∶50时，抗坏血酸的干扰误差小于3％。
发明内容：
本发明的目的在于将一种新型剥层二氧化锰纳米材料引入到生物传感器敏感膜中，提供一种含剥层二氧化锰的生物传感器酶功能敏感膜及其制备方法。利用剥层二氧化锰比表面积大、表面活性中心多、带有负电荷及具有良好导电性等特性，提高生物传感器的灵敏度、稳定性、抗干扰能力等，从而提高生物传感器的综合性能指标。
本发明提供的含剥层二氧化锰的生物传感器酶功能敏感膜，是由氧化酶、固定酶的高分子物质及剥层二氧化锰组成，其中氧化酶的含量是0.42～7.0μg/mm2，剥层二氧化锰的含量0.14～14.2μg/mm2，其余为固定酶的高分子物质。上述氧化酶为辣根过氧化酶、细胞色素C中的任意一种；固定酶的高分子物质为聚乙烯醇缩丁醛、聚乙二醇、壳聚糖中的任意一种；剥层二氧化锰具有二维的片层结构，厚度约为1～4nm，层板带有负电荷。
本发明含剥层二氧化锰的生物传感器酶功能敏感膜的制备方法是：
A剥层二氧化锰溶胶的制备
A-1.按OH-与Mn2+摩尔比为3∶1～4∶1，H2O2与Mn2+摩尔比为6∶1～8∶1，将含有0.6～0.8mol/L NaOH和1.0～1.5mol/L H2O2的混和溶液快速加入到0.3～0.4mol/L Mn(NO3)2的溶液中，剧烈搅拌反应20～30分钟，过滤，将滤饼转移至聚四氟乙烯容器中，按OH-与MnO2摩尔比为2∶1～4∶1且装满度≤80％加入浓度为2～3mol/L的NaOH溶液，搅拌呈糊状，将聚四氟乙烯容器密封于水热釜中，在150～160℃水热处理15～20小时。将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗滤饼至滤液pH值为8～9。将滤饼在70～80℃空气气氛中干燥6～9小时，得到层状二氧化锰。
A-2.按照H+与层状二氧化锰摩尔比为10∶1～15∶1，将上述层状二氧化锰固体粉末加入浓度为1.0～1.5mol/L的HNO3溶液中，室温搅拌反应3天，其间每隔24小时更换一次新的1.0～1.5mol/L HNO3溶液。将混合液抽滤，用去离子水洗涤至滤液pH值为6～7，将滤饼在70～80℃空气气氛中干燥6～9小时，得到氢交换的二氧化锰。
A-3.按四甲基氢氧化铵与二氧化锰摩尔比为2∶1～4∶1，将上述氢交换的二氧化锰加入到质量分数为1.5％～2.0％的四甲基氢氧化铵水溶液中，室温下搅拌反应7～10天，将混合液在10000～12000转数/分钟的转速下离心5～10分钟，上层溶胶即为剥层二氧化锰溶胶，调整浓度在0.1～2.0mg/mL范围备用。
B.含剥层二氧化锰的酶功能敏感膜的制备
将浓度为0.1～2.0mg/mL剥层二氧化锰溶胶与浓度为1～10mg/mL的氧化酶的二次蒸馏水溶液按体积比1∶1～2∶1的比例混合，然后置于25±1℃恒温摇床中，以150～180转数/分钟的速率混合5～10分钟直至混合均匀，将该混合液滴涂在洁净的玻碳电极表面，在室温下干燥后将其浸入到浓度为0.5～5％(m/v)的高分子凝胶中保持2～20分钟，用二次蒸馏水冲洗掉固定不牢固的酶，室温放置10～20小时使溶剂全部挥发，在玻碳电极表面形成一层含剥层二氧化锰的酶功能敏感膜。
上述氧化酶为辣根过氧化酶、细胞色素C中的一种，其中辣根过氧化酶的活性为100～330U/mg；高分子凝胶分别是聚乙烯醇缩丁醛凝胶、聚乙二醇凝胶或壳聚糖凝胶，其中聚乙烯醇缩丁醛凝胶、聚乙二醇凝胶的溶剂为无水乙醇，壳聚糖凝胶的溶剂为含质量分数为1％的醋酸二次蒸馏水溶液。
采用日本日立H-800透射电镜(TEM)对水热反应方法制备的二氧化锰及剥层后的二氧化锰进行表征(如图1所示)。水热反应方法制备的二氧化锰为颗粒状，剥层后的二氧化锰为二维片层状，厚度约为1～4nm。
本发明的效果可以从用本发明含剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜制作的生物传感器电极看出。将含剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜修饰的玻碳电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，组成辣根过氧化酶生物传感器。将辣根过氧化酶生物传感器的三电极体系置于pH值为6～7.5的磷酸盐缓冲，采用CHI660B电化学工作站对含剥层二氧化锰的生物传感器酶功能敏感膜修饰电极进行了电化学循环伏安表征(如图2所示)，结果表明剥层二氧化锰的引入，有效地增强了辣根过氧化酶在电极上的直接电化学行为，为制备无试剂生物传感器奠定了基础。采用i-t法测试电极对H2O2响应电流，由图3可以看出，含剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜对过氧化氢的响应灵敏度较不含有剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜提高2倍以上，响应时间小于5秒，当信噪比为3时，检出限为0.16μmol/L；由图4可以看出，含剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜对H2O2的响应范围较宽，为0～5mmol/L，线性范围为5×10-7～4.3×10-4mol/L。
采用不同纳米材料固定辣根过氧化酶制备的敏感膜的式量电位E0’、检出限及线性范围等主要性能的对照见下表：
表1.不同纳米材料固定辣根过氧化酶制备的敏感膜的性能比较
| 酶膜 | 式量电位E<sup>0</sup>’vs.Ag/AgCl(V) | 检出限(μmol/L) | 线性范围(M) |
| 文献1 | -0.356 | 0.21 | 4.8×10<sup>-7</sup>～5.0×10<sup>-5</sup> |
| 文献2 | -0.365 | 2.5 | 7.5×10<sup>-6</sup>～1.23×10<sup>-4</sup> |
| 实施例1 | -0.32 | 0.16 | 5×10<sup>-7</sup>～4.3×10<sup>-4</sup> |
由表1可以看出，采用本发明方法制备的含剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜得到的辣根过氧化酶的式量电位更接近自由酶的式量电位，这说明剥层二氧化锰给酶提供了更加有利的微环境。在性能上，采用本发明方法制备的含剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜，可以获得和引入纳米金胶所制备的敏感膜相当的性能，但本发明采用的剥层二氧化锰更加廉价，制备工艺简单。另外，剥层二氧化锰层板带有负电荷，与带正电荷的氧化酶之间有较强的静电作用力，可以提高酶功能敏感膜的稳定性，剥层二氧化锰的存在还可以大幅度减小抗坏血酸等底物的干扰，抗干扰性能也明显提高(参见实施例1)。
附图说明：
图1.水热法合成二氧化锰和剥层二氧化锰的透射电镜(TEM)图
图1A-水热法合成的层状二氧化锰的TEM图
图1B-剥层二氧化锰的TEM图
图2.辣根过氧化酶在含剥层二氧化锰的敏感膜修饰的玻碳电极上的直接电化学行为CV图
横坐标-电压E(单位：V，参比电极为Ag/AgCl)
纵坐标-电流i(单位：μA)
图2a-剥层二氧化锰+辣根过氧化酶修饰电极的CV曲线
图2b-辣根过氧化酶修饰电极的CV曲线
图2c-剥层二氧化锰修饰电极的CV曲线
图3.含剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜修饰电极和不含剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜修饰电极的i-t曲线
横坐标-时间t(单位：秒)
纵坐标-响应电流i(单位：μA)
图3a-剥层二氧化锰+辣根过氧化酶修饰电极对10-5mol/L H2O2的i-t响应
图3b-辣根过氧化酶修饰电极对10-5mol/L H2O2的i-t响应
图4.H2O2浓度与含剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜修饰电极响应电流的关系曲线
横坐标-过氧化氢的浓度c(单位：mol/L)
纵坐标-响应电流i(单位：μA)
具体实施方式：
实施例1
A制备剥层二氧化锰溶胶
A-1.将200mL含有0.6mol/L NaOH和1.2mol/L H2O2的混和溶液快速加到100mL含有0.3mol/L Mn(NO3)2的溶液中，剧烈搅拌反应20分钟，过滤，将滤饼转移至聚四氟乙烯杯中，加入30mL浓度为2mol/L的NaOH溶液，搅拌呈浆糊状，将聚四氟乙烯杯密封于水热釜中，在150℃水热处理20小时。将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗滤饼至滤液pH值为8。将滤饼在70℃空气气氛中干燥9小时，得到层状二氧化锰。
A-2.将2.6g上述层状二氧化锰固体粉末加入到300mL浓度为1mol/L的HNO3溶液中，室温搅拌反应3天，其间每隔24小时更换一次新的1mol/L HNO3溶液。将混合液抽滤，用去离子水洗涤至滤液pH值为6，将滤饼在70℃空气气氛中干燥9小时，得到氢交换二氧化锰。
A-3.量取12mL质量分数为25％的四甲基氢氧化铵，溶解于200mL去离子水中，称取1.4g氢交换二氧化锰分散在上述四甲基氢氧化铵水溶液中，室温下搅拌反应7天。将混合液在10000转数/分钟的转速下离心10分钟，上层溶胶即为剥层二氧化锰溶胶，调整浓度在0.15mg/mL备用。
B制备含剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜
将浓度为0.15mg/mL剥层二氧化锰溶胶10μL与浓度为10mg/mL活性为250U/mg的辣根过氧化酶10μL混合，将混合液置于25±1℃恒温摇床中，以180转数/分钟速率分散5分钟，得到混合均匀的混合液。分散好的混合液滴加在表面洁净的玻碳电极表面。待其在室温下自然晾干后，再将电极置于浓度为2％(m/v)的聚乙烯醇缩丁醛无水乙醇溶液中5分钟。取出用二次蒸馏水冲洗掉固定不牢固的酶，室温放置10小时挥发掉溶剂，在玻碳电极表面形成一层含剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜，然后将修饰好的电极保存在4℃下磷酸缓冲液中备用。
以修饰玻碳电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，实验温度为30±1℃，测试体系为pH＝6.5的磷酸缓冲液。用循环伏安法表征，发现剥层二氧化锰有效地提高了辣根过氧化酶在电极上的直接电化学行为(见图2所示)；i-t法检测电极对底物H2O2的响应，该生物传感器的平衡时间在6分钟以内，响应时间小于5秒，响应灵敏度提高2倍以上(如图3所示)，线形范围为5×10-7～4.3×10-4mol/L(如图4所示)，当信噪比为3时，检出限为0.16μmol/L；该电极稳定性保持1个月以上；当过氧化氢与抗坏血酸的浓度比为1∶1时，干扰误差小于9％。
实施例2
A制备剥层二氧化锰溶胶
A-1.将200mL含有0.8mol/L NaOH和1.2mol/L H2O2的混和溶液快速加到100mL含有0.4mol/L Mn(NO3)2的溶液中，剧烈搅拌反应30分钟，过滤，将滤饼转移至聚四氟乙烯杯中，加入50mL浓度为3mol/L的NaOH溶液，搅拌呈浆糊状，将聚四氟乙烯杯密封于水热釜中，在160℃水热处理15小时。将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗滤饼至滤液pH值为9。将滤饼在80℃空气气氛中干燥6小时，得到层状二氧化锰。
A-2.将2.5g上述层状二氧化锰固体粉末加入到280mL浓度为1.5mol/L的HNO3溶液中，室温搅拌反应4天，其间每隔24小时更换一次新的1.5mol/LHNO3溶液。将混合液抽滤，用去离子水洗涤至滤液pH值为7，将滤饼在80℃空气气氛中干燥6小时，得到氢交换二氧化锰。
A-3.量取18mL质量分数为25％的四甲基氢氧化铵，溶解于200mL去离子水中，称取1.1g氢交换二氧化锰分散在上述四甲基氢氧化铵水溶液中，室温下搅拌反应10天。将混合液在12000转数/分钟的转速下离心5分钟，上层溶胶即为剥层二氧化锰溶胶，调整浓度为2.0mg/mL备用。
B制备含剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜
将浓度为2.0mg/mL的剥层二氧化锰溶胶50μL与浓度为5mg/mL活性为330U/mg的辣根过氧化酶40μL混合，将混合液置于25±1℃恒温摇床中，以150转数/分钟速率分散10分钟，得到混合均匀的混合液。分散好的混合液滴加在表面洁净的玻碳电极表面。待其在室温下自然晾干后，再将电极置于浓度为1％(m/v)壳聚糖水溶液中10分钟。取出用二次蒸馏水冲洗掉固定不牢固的酶，室温放置20小时挥发掉溶剂，在玻碳电极表面形成一层含剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜，然后将修饰好的电极保存在4℃下磷酸缓冲液中备用。
以修饰玻碳电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，实验温度为30±1℃，测试体系为pH＝7.5的磷酸缓冲液。用i-t法检测电极对底物H2O2的响应电流，该生物传感器的平衡时间在6分钟以内，响应时间小于5秒，线性范围为6.5×10-6～3.3×10-4mol/L，当信噪比为3时，检出限为0.8μmol/L；稳定性保持2个月以上；当过氧化氢与抗坏血酸的浓度比为10∶1时，干扰误差小于5％。
实施例3
A制备剥层二氧化锰溶胶
A-1.将200mL含有0.6mol/L NaOH和1.5mol/L H2O2的混和溶液快速加到100mL含有0.4mol/L Mn(NO3)2的溶液中，剧烈搅拌反应30分钟，过滤，将滤饼转移至聚四氟乙烯杯中，加入40mL浓度为3mol/L的NaOH溶液，搅拌呈浆糊状，将聚四氟乙烯杯密封于水热釜中，在160℃水热处理18小时。将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗滤饼至滤液pH值为8。将滤饼在80℃空气气氛中干燥8小时，得到层状二氧化锰。
A-2.将2.5g上述层状二氧化锰固体粉末加入到300mL浓度为1.2mol/L的HNO3溶液中，室温搅拌反应4天，其间每隔24小时更换一次新的1.2mol/LHNO3溶液。将混合液抽滤，用去离子水洗涤至滤液pH值为6，将滤饼在70℃空气气氛中干燥7小时，得到氢交换二氧化锰。
A-3.量取16mL质量分数为25％的四甲基氢氧化铵，溶解于200mL去离子水中，称取1.2g氢交换二氧化锰分散在上述四甲基氢氧化铵水溶液中，室温下搅拌反应9天。将混合液在12000转数/分钟的转速下离心6分钟，上层溶胶即为剥层二氧化锰溶胶，调整浓度为0.5mg/mL备用。
B.制备含剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜
将浓度为0.5mg/mL剥层二氧化锰胶100μL与浓度为10mg/mL活性为100U/mg的辣根过氧化酶50μL混合，将混合液置于25±1℃恒温摇床中，以180转数/分钟速率分散10分钟，得到混合均匀的混合液。将分散好的混合液滴加在表面洁净的玻碳电极表面。待其在室温下自然晾干后，再将电极置于浓度为5％(m/v)聚乙二醇无水乙醇溶液中15分钟，用二次蒸馏水冲洗掉固定不牢固的酶，室温放置15小时挥发掉溶剂，在玻碳电极表面形成一层含剥层二氧化锰的辣根过氧化酶敏感膜，然后将修饰好的电极保存在4℃下磷酸缓冲液中备用。
以修饰玻碳电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，实验温度为30±1℃，测试体系为pH＝6.0的磷酸缓冲液。i-t法检测电极对底物H2O2的响应，该生物传感器的平衡时间在6分钟以内，响应时间小于5秒，线性范围为8.5×10-7～4×10-4mol/L；当信噪比为3时，检出限为0.42μmol/L，该电极稳定性保持1个月以上；当过氧化氢与抗坏血酸的浓度比为1∶1时，干扰误差小于9％。
实施例4
A制备剥层二氧化锰溶胶
A-1.将200mL含有0.6mol/L NaOH和1.0mol/L H2O2的混和溶液快速加到100mL含有0.3mol/L Mn(NO3)2的溶液中，剧烈搅拌反应20分钟，过滤，将滤饼转移至聚四氟乙烯杯中，加入40mL浓度为2.5mol/L的NaOH溶液，搅拌呈浆糊状，将聚四氟乙烯杯密封于水热釜中，在150℃水热处理16小时。将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗滤饼至滤液pH值为9。将滤饼在80℃空气气氛中干燥7小时，得到层状二氧化锰。
A-2.将2.5g上述层状二氧化锰固体粉末加入到200mL浓度为1.5mol/L的HNO3溶液中，室温搅拌反应3天，其间每隔24小时更换一次新的1.5mol/LHNO3溶液。将混合液抽滤，用去离子水洗涤至滤液pH值为6，将滤饼在80℃空气气氛中干燥8小时，得到氢交换二氧化锰。
A-3.量取20mL质量分数为25％的四甲基氢氧化铵，溶解于250mL去离子水中，称取2.0g氢交换二氧化锰分散在上述四甲基氢氧化铵水溶液中，室温下搅拌反应8天。将混合液在11000转数/分钟的转速下离心8分钟，上层溶胶即为剥层二氧化锰溶胶，调整浓度为0.8mg/mL备用。
B制备含剥层二氧化锰的细胞色素C敏感膜
将浓度为0.8mg/mL的剥层二氧化锰溶胶60μL与浓度为1mg/mL的细胞色素C40μL混合，将混合液置于25±1℃恒温摇床中，以180转数/分钟分散6分钟，得到混合均匀的混合液。将分散好的混合液滴加在表面洁净的玻碳电极表面。待其在室温下自然晾干后，再将电极置于浓度为1％(m/v)的壳聚糖水溶液中20分钟，用二次蒸馏水冲洗掉固定不牢固的细胞色素C，室温放置15小时挥发掉溶剂，在玻碳电极表面形成一层含剥层二氧化锰的细胞色素C敏感膜，然后将修饰好的电极在4℃下干态保存备用。
以修饰玻碳电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，实验温度为30±1℃，测试体系为pH＝7.0的磷酸缓冲液。用i-t法检测工作电极对底物H2O2的响应电流，该生物传感器的平衡时间在6分钟以内，响应时间小5秒，稳定性保持2个月以上。
Claims (3)
1.含剥层二氧化锰的生物传感器酶功能敏感膜，是由氧化酶、固定酶的高分子物质及剥层二氧化锰组成，其中氧化酶的含量是0.42～7.0μg/mm2，剥层二氧化锰的含量0.14～14.2μg/mm2，其余为固定酶的高分子物质；
所述氧化酶为辣根过氧化酶、细胞色素C中的任意一种；所述固定酶的高分子物质为聚乙烯醇缩丁醛、聚乙二醇、壳聚糖中的任意一种；剥层二氧化锰具有二维的片层结构，厚度为1～4nm，层板带有负电荷。
2.含剥层二氧化锰的生物传感器酶功能敏感膜的制备方法：具体步骤如下：
A剥层二氧化锰溶胶的制备
A-1.按OH-与Mn2+摩尔比为3∶1～4∶1，H2O2与Mn2+摩尔比为6∶1～8∶1，将含有0.6～0.8mol/L NaOH和1.0～1.5mol/L H2O2的混和溶液快速加入到0.3～0.4mol/L Mn(NO3)2的溶液中，剧烈搅拌反应20～30分钟，过滤，将滤饼转移至聚四氟乙烯容器中，按OH-与MnO2摩尔比为2∶1～4∶1且装满度≤80％加入浓度为2～3mol/L的NaOH溶液，搅拌呈糊状，将聚四氟乙烯容器密封于水热釜中，在150～160℃水热处理15～20小时，将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗滤饼至滤液pH值为8～9，将滤饼在70～80℃空气气氛中干燥6～9小时，得到层状二氧化锰；
A-2.按照H+与层状二氧化锰摩尔比为10∶1～15∶1，将上述层状二氧化锰固体粉末加入浓度为1.0～1.5mol/L的HNO3溶液中，室温搅拌反应3天，其间每隔24小时更换一次新的1.0～1.5mol/LHNO3溶液，将混合液抽滤，用去离子水洗涤至滤液pH值为6～7，将滤饼在70～80℃空气气氛中干燥6～9小时，得到氢交换的二氧化锰；
A-3.按四甲基氢氧化铵与二氧化锰摩尔比为2∶1～4∶1，将上述氢交换的二氧化锰加入到质量分数为1.5％～2.0％的四甲基氢氧化铵水溶液中，室温下搅拌反应7～10天，将混合液在10000～12000转数/分钟的转速下离心5～10分钟上层溶胶即为剥层二氧化锰溶胶，调整浓度在0.1～2.0mg/mL范围备用；
B.含剥层二氧化锰的酶功能敏感膜的制备
将浓度为0.1～2.0mg/mL剥层二氧化锰溶胶与浓度为1～10mg/mL的氧化酶的二次蒸馏水溶液按体积比1∶1～2∶1的比例混合，然后置于25±1℃恒温摇床中，以150～180转数/分钟的速率混合5～10分钟直至混合均匀，将该混合液滴涂在洁净的玻碳电极表面，在室温下干燥后将其浸入到浓度为0.5～5％(m/v)的高分子凝胶中保持2～20分钟，用二次蒸馏水冲洗掉固定不牢固的酶，室温放置10～20小时使溶剂全部挥发，在玻碳电极表面形成一层含剥层二氧化锰的酶功能敏感膜；
步骤B所述氧化酶为辣根过氧化酶、细胞色素C中的一种，高分子凝胶分别是聚乙烯醇缩丁醛凝胶、聚乙二醇凝胶或壳聚糖凝胶。
3.根据权利要求2所述的含剥层二氧化锰的生物传感器酶功能敏感膜的制备方法，其特征是辣根过氧化酶的活性为100～330U/mg；聚乙烯醇缩丁醛凝胶、聚乙二醇凝胶的溶剂为无水乙醇，壳聚糖凝胶的溶剂为含质量分数为1％的醋酸二次蒸馏水溶液。
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