CN100535651C - 一种生物传感器酶功能敏感膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的酶功能敏感膜的制备方法及其在电化学生物传感器中的应用。采用剥离再组装的方法将亚甲基蓝插入到二氧化锰层间，将亚甲基蓝插层二氧化锰材料的乙醇分散液滴涂于固体电极表面，待其自然干燥后再将生物相容性聚合物和生物活性物质的均匀混合液滴涂于固体电极表面，待干燥后浸入高分子成膜物质溶液中，取出后在冰箱中挥发掉溶剂，即可在固体电极表面得到一层含亚甲基蓝插层二氧化锰的复合酶功能膜。本发明提供的酶功能敏感膜用于电化学生物传感器，对传感器的检测电位、抗干扰能力、稳定性等性能都有明显的改善。
Description
技术领域：
本发明属于电化学生物传感器及其制备技术领域，特别是涉及一种含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的电化学生物传感器酶功能敏感膜及其制备方法。
背景技术：
电化学生物传感器是迅速发展中的前沿分析技术，其以结构灵巧、成本较低和灵敏、快速的原位分析监测为特色而广泛应用于化学、物理、医疗、材料、环保、食品和工业过程自动控制等领域。
用酶的天然电子传递体——氧来沟通酶与电极之间的电子通道，直接检测酶反应底物的减少或产物的生成的传感器，称为第一代电化学生物传感器。这类传感器已有产品面市，但它有许多缺点：如电极对溶液中氧含量、氧的扩散速度及浓度梯度等依赖性较大，因此检测易受环境中氧分压波动的影响；电极响应时间较长且难以进行活体分析；此外该传感器的灵敏度也不太高。由于直接测定氧含量存在上述弊端，于是人们又选择了直接测定反应产物H2O2的含量，但是在金属或碳电极上H2O2直接氧化的电极电位均较高，一般在+0.6～+0.8V(vs.Ag/AgCl)。在这样高的电极电位下，共存于被测样品中的其他电化学活性物质(如抗坏血酸、尿酸、乙酰氨基酚等)也能够同时被氧化，从而产生干扰电流。
为了克服第一代电化学生物传感器的局限性，电子媒介体被用来替代氧作为电子受体，起到在酶与电极之间进行电子传输的作用。这种采用电子媒介体代替氧的传感器称为第二代电化学生物传感器。电子媒介体的引入大大降低了反应电位，从而提高了生物传感器的灵敏度和抗干扰能力。常用的电子媒介体有二茂铁及其衍生物、四硫富瓦烯及各种有电化学行为的染料等。电子媒介体大多是加在被测溶液中，但这种方法媒介体消耗量大，测定过程也极不方便，因此人们采用多种方法把媒介体固定在电极上。但是，大多数媒介体易溶于水，在反应过程中容易从电极上泄漏出来。层状无机化合物层间离子具有可交换性，可被用作电子媒介体的固定化。
在文献(1)Fresenius J Anal Chem，1998，361：115中，Yang Feng等人成功地把甲苯胺蓝插入到α-磷酸锆中，并以此为电子媒介体制备了辣根过氧化酶生物传感器。用这种方法固定化的甲苯胺蓝在电极表面实现了可逆的氧化还原反应，循环伏安和计时安培实验证明甲苯胺蓝在层间具有良好的稳定性并有效实现了辣根过氧化酶和电极之间的电子转移。制得的电化学生物传感器对过氧化氢的最低检测限为3.0×10-7M。但该传感器的检测电位为-0.25V vs.SCE(相当于-0.23V vs.Ag/AgCl)，而一般认为电化学生物传感器的检测电位在-0.1～0V vs.Ag/AgCl时干扰最小；此外该传感器的稳定性只能保持两周左右，而且没有进行抗干扰实验。
在文献(2)Anal Chim Acta，2004，523：89中，Angèlica M.Lazarin等人把亚甲基蓝插入到磷酸钡层间，然后把这种插层化合物加入到碳糊电极中，并以此电极研究还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶(NADH)的电化学氧化反应。该电极对NADH的响应电位只有-0.08V(vs.SCE)，对NADH的最低检测限为3.9×10-6M，但这种材料没有应用于生物传感器的制作。
发明内容：
本发明采用层状二氧化锰剥离再组装的方法制备亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料，并将其引入到电化学生物传感器敏感膜中，提供一种含亚甲基蓝插层二氧化锰材料的生物传感器酶功能敏感膜及其制备方法。
亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料修饰的电极对底物的检测电位接近0V vs.Ag/AgCl，可以有效降低溶液中电化学活性物质的干扰(一般认为电化学生物传感器的检测电位在-0.1～0V vs.Ag/AgCl时干扰最小)；亚甲基蓝位于二氧化锰层间并得到有效固定，避免了测试过程中电子媒介体的流失；二氧化锰具有良好导电性，有利于测试过程中电子传递，可以提高电化学生物传感器信号响应的灵敏度；二氧化锰比表面积大且表面带负电荷，可与带正电荷的阳离子型生物相容性聚合物通过静电作用结合，而阳离子型生物相容性聚合物中的大量氢键可以进一步稳定酶的活性构象，给酶提供生物相容性良好的微环境，从而提高酶存活的长期性及酶功能膜的稳定性。因此本发明提供的含亚甲基蓝插层二氧化锰材料的酶功能敏感膜可提高电化学生物传感器的综合性能。
本发明提供的含有亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的生物传感器复合酶功能敏感膜是由亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料、生物活性物质、阳离子型生物相容性聚合物和高分子成膜物质组成。该复合膜各成分的含量分别是：亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料为0.002～0.2mg/cm2，生物活性物质为0.1～5.0mg/cm2，阳离子型生物相容性聚合物为0.05～2.0mg/cm2，其余为高分子成膜物质。
所述的亚甲基蓝插层二氧化锰具有超分子插层结构(见图1)，层间距为1.4nm；所述生物活性物质为葡萄糖氧化酶、辣根过氧化酶、酪氨酸酶、细胞色素C中的一种；所述阳离子型生物相容性聚合物是阳离子纤维素和阳离子瓜尔胶中的一种；所述高分子成膜物质为聚乙烯醇缩丁醛(PVB)、全氟磺酸聚合物(Nafion)、壳聚糖(Chitosan)中的一种。
本发明含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的复合酶功能敏感膜的制备方法是：
A采用剥离再组装的方法制备亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料
A-1.按OH-与Mn2+摩尔比为3∶1～4∶1，H2O2与Mn2+摩尔比为6∶1～8∶1，将含有0.6～0.8mol/L NaOH和1.0～1.5mol/L H2O2的混合溶液快速加入到0.3～0.4mol/L的Mn(NO3)2溶液中，剧烈搅拌反应20～30分钟，过滤，将滤饼转移至聚四氟乙烯容器中，按OH-与MnO2摩尔比为2∶1～4∶1且装满度≤80％，加入浓度为2～3mol/L的NaOH溶液，搅拌成糊状，将聚四氟乙烯容器密封于水热釜中，在150～160℃水热处理15～20小时，将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗滤饼至滤液pH值为8～9，将滤饼在70～80℃空气气氛中干燥6～9小时，得到层状二氧化锰；
A-2.按照H+与层状二氧化锰摩尔比为10∶1～15∶1，将上述层状二氧化锰固体粉末加入浓度为1.0～1.5mol/L的HNO3溶液中，室温搅拌反应3～5天，其间每隔24小时更换一次新的1.0～1.5mol/L HNO3溶液，将混合液抽滤，用去离子水洗涤至滤液pH值为6～7，将滤饼在70～80℃空气气氛中干燥6～9小时，得到氢交换的二氧化锰；
A-3.按四甲基氢氧化铵与二氧化锰摩尔比为2∶1～4∶1，将上述氢交换的二氧化锰加入到质量分数为1.5％～2.0％的四甲基氢氧化铵水溶液中，室温下搅拌反应7～10天，将混合液在10000～12000转/分钟的转速下离心5～10分钟，上层溶胶为剥层二氧化锰溶胶，调整浓度范围在0.1～2.0mg/mL；
A-4.按亚甲基蓝与剥层二氧化锰的摩尔比为1∶5～1∶15，将2.0～10.0mg/mL的亚甲基蓝溶液与上述剥层二氧化锰溶胶混合，30～70℃搅拌反应18～30小时，过滤，分别用去离子水和丙酮洗涤沉淀至滤液无色，然后在40～80℃空气气氛中干燥9～15小时，得到亚甲基蓝插层二氧化锰。
B.含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的复合酶功能敏感膜的制备
B-1.将亚甲基蓝插层二氧化锰材料配成0.1～1.0mg/mL的乙醇分散液，按0.5～2.0μL/mm2的用量将该溶液滴涂在洁净的固体电极表面，在室温下干燥10～20小时；
B-2.将质量分数为0.2％～2.0％的阳离子型生物相容性聚合物的水溶液与浓度为1～100mg/mL的生物活性物质的二次蒸馏水溶液按体积比为1∶1～4∶1的比例混合均匀，按0.5～2.0μL/mm2的用量将混合液滴涂在上述亚甲基蓝插层二氧化锰修饰的电极表面，在2～8℃冷冻干燥10～30小时，干燥后将电极浸入到质量分数为0.5～5.0％的高分子成膜物质的溶液中保持1～20分钟，用二次蒸馏水洗掉固定不牢固的酶，在2～8℃冰箱中放置10～30小时使溶剂全部挥发，即在电极表面形成一层含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子材料的复合酶功能敏感膜。
所述生物活性物质为葡萄糖氧化酶、辣根过氧化酶、酪氨酸酶、细胞色素C中的一种；所述阳离子型生物相容性聚合物是阳离子纤维素和阳离子瓜尔胶中的一种；所述高分子成膜物质为聚乙烯醇缩丁醛(PVB)、全氟磺酸聚合物(Nafion)、壳聚糖(Chitosan)中的一种。
上述的高分子成膜物质溶液中，聚乙烯醇缩丁醛、全氟磺酸聚合物的溶剂为无水乙醇，壳聚糖的溶剂为含质量分数为0.5～2％的醋酸二次蒸馏水溶液；固体电极为玻碳电极、铂盘电极和金盘电极中的一种。
本发明的效果可以从利用本发明提供的酶膜制做的电化学生物传感器看出。采用上述方法在玻碳电极上制备含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的辣根过氧化物酶膜并以其作为工作电极，以Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt电极作为对电极组成辣根过氧化酶电化学生物传感器。将该传感器的三电极体系置于pH值为5.5～8.0的磷酸盐缓冲溶液中，采用CHI660B电化学工作站对含亚甲基蓝插层二氧化锰材料的复合酶功能敏感膜修饰电极进行电化学表征，结果表明该传感器可以实现辣根过氧化物酶对过氧化氢的良好的催化作用(如图2所示)。采用i-t法在0V(vs.Ag/AgCl)测试其抗干扰能力，由图3可以看出在0.4mM的过氧化氢底液中加入0.4mM的葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、醋酸和0.1mM的抗坏血酸均未对电极产生干扰。该电极的稳定性保持在2个月以上。
采用不同材料固定辣根过氧化酶制备的敏感膜的检测电位、对抗坏血酸的抗干扰能力及稳定性等主要性能对照见下表：
表1.不同材料制备的酶敏感膜所得生物传感器的性能比较
| 酶膜 | 检测电位 | 抗干扰能力 | 稳定性 |
| 文献1 | -0.25V(vs.SCE)-0.23V(vs.Ag/AgCl) | 未进行抗干扰实验 | 2周 |
| 实施例1 | 0V(vs.Ag/AgCl) | 葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、醋酸抗坏血酸均无干扰 | 2个月 |
| 实施例2 | 0V(vs.Ag/AgCl) | 蔗糖、柠檬酸、醋酸抗坏血酸均无干扰 | 2个月 |
本发明提供的含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的酶功能敏感膜应用于电化学生物传感器的优点是：
(1)将电子媒介体亚甲基蓝固定于二氧化锰层间，可以避免测试过程中电子媒介体的流失，减少了电子媒介体的用量并且简化了操作步骤；
(2)亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料修饰的电极对底物的检测电位接近0V vs.Ag/AgCl，可以有效降低溶液中电化学活性物质的干扰(一般认为电化学生物传感器的检测电位在-0.1～0V vs.Ag/AgCl时干扰最小)；
(3)二氧化锰表面带较多负电荷，可与较多带正电荷的阳离子型生物相容性聚合物通过静电作用结合，而阳离子型生物相容性聚合物中的大量氢键可以进一步稳定酶的活性构象，给酶提供生物相容性良好的微环境，从而提高酶存活的长期性及酶功能膜的稳定性。
附图说明
图1.亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构示意图
a.二氧化锰层板
b.亚甲基蓝
图2.辣根过氧化酶电极对过氧化氢的催化图
横坐标-电压E(单位：V，参比电极为Ag/AgCl)
纵坐标-响应电流i(单位：μA)
a.空白底液的循环伏安图
b.底液中加入6mM过氧化氢后的循环伏安图
图3.辣根过氧化酶电极的干扰测定曲线
横坐标-时间t(单位：秒)
纵坐标-响应电流i(单位：μA)
图4.层状二氧化锰及亚甲基蓝插层二氧化锰的XRD图谱
横坐标-角度2θ(单位：度)
纵坐标-衍射强度I(单位：a.u.(绝对单位))
a.氢型二氧化锰的XRD谱图
b.剥层二氧化锰灰浆的XRD谱图
c.亚甲基蓝插层二氧化锰的XRD谱图
具体实施方式
实施例1
A采用剥离再组装的方法制备亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料
A-1.将200mL含有0.8mol/L NaOH和1.2mol/L H2O2的混合溶液快速加到100mL含有0.3mol/L Mn(NO3)2的溶液中，剧烈搅拌反应20分钟，过滤，将滤饼转移至聚四氟乙烯容器中，加入50mL浓度为2.5mol/L的NaOH溶液，搅拌成糊状，将聚四氟乙烯容器密封于水热釜中，在150℃水热处理16小时，将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗滤饼至滤液pH值为8，将滤饼在70℃空气气氛中干燥7小时，得到层状二氧化锰；
A-2.将2.8g上述层状二氧化锰固体粉末加入到260mL浓度为1.2mol/L的HNO3溶液中，室温搅拌反应3天，其间每隔24小时更换一次新的1.2mol/L HNO3溶液。将混合液抽滤，用去离子水洗涤至滤液pH值为6，将滤饼在70℃空气气氛中干燥8小时，得到氢交换的二氧化锰；
A-3.量取15mL质量分数为25％的四甲基氢氧化铵，溶解于200mL去离子水中，称取1.0g氢交换二氧化锰分散在上述四甲基氢氧化铵水溶液中，室温下搅拌反应8天，将混合液在10000转/分钟的转速下离心8分钟，上层溶胶为剥层二氧化锰溶胶，调整浓度范围在1.8mg/mL；
A-4.称取0.2g亚甲基蓝溶于50mL去离子水中，另取200mL上述剥层二氧化锰溶胶，将两种溶液混和，40℃搅拌反应24小时，过滤，依次用去离子水和丙酮洗涤沉淀至滤液无色，然后在50℃空气中干燥12小时，得到亚甲基蓝插层二氧化锰。
B制备含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的辣根过氧化酶敏感膜
B-1.称取1mg亚甲基蓝插层二氧化锰超声分散在2mL无水乙醇液中，将10μL该溶液滴涂在洁净的玻碳电极表面(Φ＝3mm)，在室温下干燥15小时；
B-2.称取10mg阳离子纤维素溶于1mL二次蒸馏水中，取50μL上述溶液与浓度为10mg/mL活性为300U/mg的辣根过氧化酶10μL混合，得到混合均匀的混合液。分散好的8μL混合液滴加在B-1修饰好的玻碳电极表面。在4℃冰箱中干燥15小时。干燥后将电极浸入到质量分数为1％的聚乙烯醇缩丁醛乙醇溶液中保持10分钟。取出用二次蒸馏水洗掉固定不牢固的酶，4℃冰箱中放置15小时使溶剂全部挥发，在玻碳电极表面形成一层含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子材料的复合酶功能敏感膜，其中亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的含量是0.071mg/cm2，生物活性物质为0.19mg/cm2，阳离子型生物相容性聚合物为0.94mg/cm2，其余为高分子成膜物质。然后将修饰好的电极干态保存在4℃冰箱中备用。
以修饰玻碳电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，实验温度为25±1℃，测试体系为0.1M，pH＝7.0的磷酸缓冲溶液，用i-t法在0V(vs.Ag/AgCl)检测电极对底物H2O2的响应，该生物传感器的响应时间小于30秒，线性范围为2.0×10-6-5.9×10-4M过氧化氢(线性相关系数0.99943)，灵敏度为6.05mAM-1m-2。根据信噪比大于3的原则，测得酶电极的最低检测限为2.3μM过氧化氢；在含有0.4mMH2O2的底液中加入0.4mM的葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、醋酸和0.1mM的抗坏血酸均未对电极产生干扰；电极稳定性保持2个月以上。
实施例2
A采用剥离再组装的方法制备亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料
A-1.将200mL含有0.6mol/L NaOH和1.5mol/L H2O2的混合溶液快速加到100mL含有0.4mol/L Mn(NO3)2的溶液中，剧烈搅拌反应30分钟，过滤，将滤饼转移至聚四氟乙烯容器中，加入50mL浓度为2mol/L的NaOH溶液，搅拌成糊状，将聚四氟乙烯容器密封于水热釜中，在160℃水热处理18小时，将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗滤饼至滤液pH值为9，将滤饼在80℃空气气氛中干燥9小时，得到层状二氧化锰；
A-2.将2.5g上述层状二氧化锰固体粉末加入到300mL浓度为1.5mol/L的HNO3溶液中，室温搅拌反应3天，其间每隔24小时更换一次新的1.5mol/L HNO3溶液。将混合液抽滤，用去离子水洗涤至滤液pH值为7，将滤饼在80℃空气气氛中干燥9小时，得到氢交换的二氧化锰；
A-3.量取16mL质量分数为25％的四甲基氢氧化铵，溶解于200mL去离子水中，称取1.2g氢交换二氧化锰分散在上述四甲基氢氧化铵水溶液中，室温下搅拌反应9天，将混合液在12000转/分钟的转速下离心7分钟，上层溶胶为剥层二氧化锰溶胶，调整浓度范围在0.8mg/mL；
A-4.称取0.3g MB溶于50mL去离子水中，另取200mL上述剥层二氧化锰溶胶，将两种溶液混和，50℃搅拌反应20小时，过滤，分别用去离子水和丙酮洗涤沉淀至滤液无色，然后在70℃空气中干燥8小时，得到亚甲基蓝插层二氧化锰。
B制备含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的葡萄糖氧化酶敏感膜
B-1.称取1mg亚甲基蓝插层二氧化锰材料超声分散在4mL无水乙醇液中，将17μL该溶液滴涂在洁净的铂盘电极表面(Φ＝5mm)，在室温下干燥18小时；
B-2.称取15mg阳离子纤维素溶于1mL二次蒸馏水中，取50μL上述溶液与浓度为100mg/mL活性为47.2U/mg的葡萄糖氧化酶10μL混合，得到混合均匀的混合液。分散好的15μL混合液滴加在B-1修饰好的铂盘电极表面。在7℃冰箱中干燥25小时。干燥后将电极浸入到质量分数为0.5％全氟磺酸聚合物无水乙醇溶液中保持2分钟。取出用二次蒸馏水洗掉固定不牢固的酶，7℃冰箱中放置10小时使溶剂全部挥发，在铂盘电极表面形成一层含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子材料的复合酶功能敏感膜，其中亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的含量是0.022mg/cm2，生物活性物质为1.27mg/cm2，阳离子型生物相容性聚合物为0.96mg/cm2，其余为高分子成膜物质。然后将修饰好的电极干态保存在7℃冰箱中备用。
以修饰铂盘电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，实验温度为25±1℃，测试体系为0.1M，pH＝7.5的磷酸缓冲溶液，用i-t法在0V(vs.Ag/AgCl)检测电极对底物β-D葡萄糖的响应，该生物传感器的响应时间小于15秒，线性范围为2.0×10-6～1.9×10-2M葡萄糖(线性相关系数0.9993)，灵敏度为3.0mAM-1cm-2。根据信噪比大于3的原则，测得酶电极的最低检测限为1.0μM葡萄糖，稳定性保持2个月以上；在含有2mMβ-D葡萄糖的底液中加入0.4mM的蔗糖、柠檬酸、醋酸和0.1mM的抗坏血酸均未对电极产生干扰；电极稳定性保持2个月以上。
实施例3
A采用剥离再组装的方法制备亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料
A-1.将200mL含有0.8mol/L NaOH和1.5mol/L H2O2的混合溶液快速加到100mL含有0.5mol/L Mn(NO3)2的溶液中，剧烈搅拌反应25分钟，过滤，将滤饼转移至聚四氟乙烯容器中，加入50mL浓度为2.3mol/L的NaOH溶液，搅拌成糊状，将聚四氟乙烯容器密封于水热釜中，在160℃水热处理15小时，将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗滤饼至滤液pH值为8.5，将滤饼在75℃空气气氛中干燥9小时，得到层状二氧化锰；
A-2.将2.0g上述层状二氧化锰固体粉末加入到260mL浓度为1.0mol/L的HNO3溶液中，室温搅拌反应5天，其间每隔24小时更换一次新的1.0mol/L HNO3溶液。将混合液抽滤，用去离子水洗涤至滤液pH值为6.5，将滤饼在75℃空气气氛中干燥6小时，得到氢交换的二氧化锰；
A-3.量取20mL质量分数为25％的四甲基氢氧化铵，溶解于200mL去离子水中，称取2.0g氢交换二氧化锰分散在上述四甲基氢氧化铵水溶液中，室温下搅拌反应10天，将混合液在11000转/分钟的转速下离心7分钟，上层溶胶为剥层二氧化锰溶胶，调整浓度范围在1.3mg/mL；
A-4.称取0.4g MB溶于50mL去离子水中，另取200mL上述剥层二氧化锰溶胶，将两种溶液混和，60℃搅拌反应20小时，过滤，分别用去离子水和丙酮洗涤沉淀至滤液无色，然后在70℃空气中干燥10小时，得到亚甲基蓝插层二氧化锰。
B制备含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的细胞色素C敏感膜
B-1.称取1mg亚甲基蓝插层二氧化锰材料超声分散在5mL无水乙醇液中，将10μL该溶液滴涂在洁净的金盘电极表面(Φ＝3mm)，在室温下干燥20小时；
B-2.称取6mg阳离子瓜尔胶溶于1mL二次蒸馏水中，取30μL上述溶液与浓度为8mg/mL的细胞色素C 20μL混合，得到混合均匀的混合液。分散好的10μL混合液滴加在B-1修饰好的金盘电极表面。在3℃冰箱中干燥15小时。干燥后将电极浸入到质量分数为1％的聚乙烯醇缩丁醛乙醇溶液中保持10分钟。取出用二次蒸馏水洗掉固定不牢固的酶，3℃冰箱中放置30小时使溶剂全部挥发，在金盘电极表面形成一层含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子材料的复合酶功能敏感膜，其中亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的含量是0.028mg/cm2，生物活性物质为0.45mg/cm2，阳离子型生物相容性聚合物为0.51mg/cm2，其余为高分子成膜物质。然后将修饰好的电极干态保存在3℃冰箱中备用。
以修饰金盘电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，实验温度为25±1℃，测试体系为0.1M，pH＝6.5的磷酸缓冲溶液，用i-t法在0V(vs.Ag/AgCl)检测电极对底物H2O2的响应，该生物传感器的响应时间小于10秒；在含有0.4mM H2O2的底液中加入0.4mM的葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、醋酸和0.1mM的抗坏血酸均未对电极产生干扰；电极稳定性保持2个月以上。
实施例4
A采用剥离再组装的方法制备亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料
A-1.将200mL含有0.6mol/L NaOH和1.2mol/L H2O2的混合溶液快速加到100mL含有0.5mol/L Mn(NO3)2的溶液中，剧烈搅拌反应25分钟，过滤，将滤饼转移至聚四氟乙烯容器中，加入50mL浓度为2.5mol/L的NaOH溶液，搅拌成糊状，将聚四氟乙烯容器密封于水热釜中，在150℃水热处理16小时，将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗滤饼至滤液pH值为8.5，将滤饼在75℃空气气氛中干燥8小时，得到层状二氧化锰；
A-2.将2.5g上述层状二氧化锰固体粉末加入到300mL浓度为1.4mol/L的HNO3溶液中，室温搅拌反应4天，其间每隔24小时更换一次新的1.4mol/L HNO3溶液。将混合液抽滤，用去离子水洗涤至滤液pH值为6.5，将滤饼在75℃空气气氛中干燥8小时，得到氢交换的二氧化锰；
A-3.量取16mL质量分数为25％的四甲基氢氧化铵，溶解于200mL去离子水中，称取1.2g氢交换二氧化锰分散在上述四甲基氢氧化铵水溶液中，室温下搅拌反应8天，将混合液在11000转/分钟的转速下离心8分钟，上层溶胶为剥层二氧化锰溶胶，调整浓度范围在1.0mg/mL；
A-4.称取0.3g MB溶于50mL去离子水中，另取200mL上述剥层二氧化锰溶胶，将两种溶液混和，60℃搅拌反应25小时，过滤，分别用去离子水和丙酮洗涤沉淀至滤液无色，然后在60℃空气中干燥10小时，得到亚甲基蓝插层二氧化锰。
B制备含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的葡萄糖氧化酶敏感膜
B-1.称取1mg亚甲基蓝插层二氧化锰材料超声分散在3mL无水乙醇液中，将12μL该溶液滴涂在洁净的玻碳电极表面(Φ＝5mm)，在室温下干燥15小时；
B-2.称取20mg阳离子纤维素溶于1mL二次蒸馏水中，取50μL上述溶液与浓度为80mg/mL活性为4200U/mg的酪氨酸酶溶液10μL混合，得到混合均匀的混合液。分散好的15μL混合液滴加在B-1修饰好的玻碳电极表面。在4℃冰箱中干燥25小时。干燥后将电极浸入到质量分数为2％的壳聚糖醋酸溶液中7分钟。取出用二次蒸馏水洗掉固定不牢固的酶，4℃冰箱中放置10小时使溶剂全部挥发，在玻碳电极表面形成一层含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子材料的复合酶功能敏感膜，其中亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的含量是0.047mg/cm2，其中生物活性物质含量是1.02mg/cm2，阳离子型生物相容性聚合物为1.27μg/cm2，其余为高分子成膜物质。然后将修饰好的电极干态保存在4℃冰箱中备用。
以修饰玻碳电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，实验温度为25±1℃，测试体系为0.1M，pH＝7.0的磷酸缓冲溶液，用i-t法在0V(vs.Ag/AgCl)检测电极对底物儿茶酚的响应，该生物传感器的响应时间小于10秒，根据信噪比大于3的原则，测得酶电极最低检测限为1.5μM儿茶酚；线性范围为0.0015～1.5mM(线性相关系数为0.999)，灵敏度为3.5mAM-1cm-2；在含有0.4mM儿茶酚的底液中加入0.4mM的蔗糖、柠檬酸、醋酸和0.1mM的抗坏血酸均未对电极产生干扰；电极稳定性保持2个月以上。
Claims (6)
1.一种生物传感器酶功能敏感膜，是由亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料、生物活性物质、阳离子型生物相容性聚合物和高分子成膜物质组成的复合膜，该复合膜各成分的含量分别是：亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料为0.022～0.2mg/cm2，生物活性物质为0.1～1.27mg/cm2，阳离子型生物相容性聚合物为0.51～2.0mg/cm2，其余为高分子成膜物质。
2.根据权利要求1所述的生物传感器酶功能敏感膜，其特征是：所述的亚甲基蓝插层二氧化锰具有超分子插层结构，其层间距为1.4nm；所述的生物活性物质为葡萄糖氧化酶、辣根过氧化酶、酪氨酸酶、细胞色素C中的一种；所述阳离子型生物相容性聚合物是阳离子纤维素和阳离子瓜尔胶中的一种；所述高分子成膜物质为聚乙烯醇缩丁醛、全氟磺酸聚合物、壳聚糖中的一种。
3.一种制备如权利要求1所述的生物传感器酶功能敏感膜的方法，具体制备步骤如下：
A采用剥离再组装的方法制备亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料
A-1.按OH-与Mn2+摩尔比为3∶1～4∶1，H2O2与Mn2+摩尔比为6∶1～8∶1，将含有0.6～0.8mol/L NaOH和1.0～1.5mol/L H2O2的混合溶液快速加入到0.3～0.4mol/L的Mn(NO3)2溶液中，剧烈搅拌反应20～30分钟，过滤，将滤饼转移至聚四氟乙烯容器中；按OH-与MnO2摩尔比为2∶1～4∶1且装满度≤80％，加入浓度为2～3mol/L的NaOH溶液，搅拌成糊状，将聚四氟乙烯容器密封于水热釜中，在150～160℃水热处理15～20小时，将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗滤饼至滤液pH值为8～9，将滤饼在70～80℃空气气氛中干燥6～9小时，得到层状二氧化锰；
A-2.按照H+与层状二氧化锰摩尔比为10∶1～15∶1，将上述层状二氧化锰固体粉末加入浓度为1.0～1.5mol/L的HNO3溶液中，室温搅拌反应3～5天，其间每隔24小时更换一次新的1.0～1.5mol/L HNO3溶液，之后将混合液抽滤，用去离子水洗涤至滤液pH值为6～7，将滤饼在70～80℃空气气氛中干燥6～9小时，得到氢交换的二氧化锰；
A-3.按四甲基氢氧化铵与二氧化锰摩尔比为2∶1～4∶1，将上述氢交换的二氧化锰加入到质量分数为1.5％～2.0％的四甲基氢氧化铵水溶液中，室温下搅拌反应7～10天，将混合液在10000～12000转/分钟的转速下离心5～10分钟，上层溶胶为剥层二氧化锰溶胶，调整浓度范围在0.1～2.0mg/mL；
A-4.按亚甲基蓝与剥层二氧化锰的摩尔比为1∶5～1∶15，将2.0～10.0mg/mL的亚甲基蓝溶液与上述剥层二氧化锰溶胶混合，30～70℃搅拌反应18～30小时，过滤，分别用去离子水和丙酮洗涤沉淀至滤液无色，然后在40～80℃空气气氛中干燥9～15小时，得到亚甲基蓝插层二氧化锰；
B.含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子结构材料的复合酶功能敏感膜的制备
B-1.将亚甲基蓝插层二氧化锰材料配成0.1～1.0mg/mL的乙醇分散液，按0.5～2.0μL/mm2的用量将该溶液滴涂在洁净的固体电极表面，在室温下干燥10～20小时；
B-2.将质量分数为0.2％～2.0％的阳离子型生物相容性聚合物的水溶液与浓度为1～100mg/mL的生物活性物质的二次蒸馏水溶液按体积比为1∶1～4∶1的比例混合均匀，按0.5～2.0μL/mm2的用量将混合液滴涂在上述亚甲基蓝插层二氧化锰修饰的电极表面，在2～8℃冷冻干燥10～30小时，干燥后将电极浸入到质量分数为0.5～5.0％的高分子成膜物质的溶液中保持1～20分钟，用二次蒸馏水洗掉固定不牢固的酶，在2～8℃冰箱中放置10～30小时使溶剂全部挥发，即在电极表面形成一层含亚甲基蓝插层二氧化锰超分子材料的复合酶功能敏感膜。
4.根据权利要求3所述的制备生物传感器酶功能敏感膜的方法，其特征是步骤B所述生物活性物质为葡萄糖氧化酶、辣根过氧化酶、酪氨酸酶、细胞色素C中的一种；阳离子型生物相容性聚合物是阳离子纤维素和阳离子瓜尔胶中的一种；高分子成膜物质为聚乙烯醇缩丁醛、全氟磺酸聚合物、壳聚糖中的一种。
5.根据权利要求3所述的制备生物传感器酶功能敏感膜的方法，其特征是步骤B所述的高分子成膜物质溶液中，聚乙烯醇缩丁醛、全氟磺酸聚合物的溶剂为无水乙醇，壳聚糖的溶剂为含质量分数为0.5～2％的醋酸二次蒸馏水溶液。
6.根据权利要求3所述的制备生物传感器酶功能敏感膜的方法，其特征是步骤B所述的固体电极为玻碳电极、铂盘电极和金盘电极中的一种。
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