CN102173378B - 一种具有生物传感功能的纳米材料及其制备方法 - Google Patents

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本发明公开了一种一步合成的具生物传感功能的纳米材料及其在生物传感方面的应用。该纳米材料是按照包括下述步骤的方法制备得到的：室温下，将酶、辅酶、电子转移介体混合，然后往该混合液中加入稀土离子，得到将各活性组分均整合到一起的纳米颗粒。将该纳米颗粒修饰到玻碳电极表面，用电化学方法测定了其生物传感性能。本发明利用常规的反应物通过一步合成法可制备出均匀的具有生物传感功能的纳米材料，而且制备的纳米材料表现出优异的生物传感性能。

Description

一种具有生物传感功能的纳米材料及其制备方法
技术领域
本发明属于生物传感材料的电化学应用领域，具体涉及一种具有生物传感功能的纳米材料及其制备方法与应用。
背景技术
电化学生物传感器最近几十年来引起广泛的关注。这是因为，与其他传感器相比，电化学生物传感器兼具电化学传感的简单性及生物传感对分子的专一识别性，因此具有选择性好、灵敏度高、简单、便携等突出优点，在公共安全、医疗卫生和环境监测等方面得到了广泛应用。一般而言，生物电化学传感器包括电子转移介体、酶、辅酶(基于脱氢酶体系的生物传感)三个部分。传统的生物电化学传感器的制备过程通常将电子转移介体直接滴涂到导电基底(如玻碳电极)上，然后将酶通过共价或非共价方式固定于其上。如此多步骤的电极制备过程必然会存在复杂、重现性差、费时等缺点，因此无法满足快速、重现性好、精确的现场测定要求。因此，如何将参与生物电催化反应的物质(如酶、辅酶和电子转移介体等)同时固定到电极表面，成为亟待解决的难题。
最近，无限配位聚合物(infinite coordination polymers，ICPs)作为一种新型纳米材料越来越受到人们的广泛关注。它由金属离子或金属离子簇和多齿桥联配体通过自组装而成的具有可控的尺寸和形貌的一类有机无机杂化材料，在传感、催化、光学、气体储存、离子交换、价态互变异构和药物载体等方面显示出巨大的应用前景。此外，ICPs能将不同种类的客体分子独自或混合包裹于其内，从而大大增加了其在光、电、磁方面的独特性能及潜在应用。将有机染料、无机金属纳米粒子、量子点、药物和蛋白包裹于ICPs内而得到多功能纳米材料的研究已有报告。然而，迄今为止，无限配位聚合物在电化学方面的应用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够将酶、辅酶、电子转移介体同时固定，且兼具生物传感功能的纳米材料及其制备方法。
本发明所提供的纳米材料是按照包括下述步骤的方法制备得到的：室温下将酶、与所述酶相匹配的辅酶和电子转移介体溶于水溶液中，得混合溶液；向所述混合溶液中加入含稀土金属离子的水溶液，静置直至沉淀完全，离心，收集沉淀并洗涤，即得到所述具有生物传感功能的纳米材料。
所述酶具体包括下述任意一种酶：葡萄糖氧化酶、次黄嘌呤氧化酶、丙酮酸氧化酶、葡萄糖脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、乙酸脱氢酶、纤维二糖脱氢酶、D-果糖脱氢酶和谷丙转氨酶；
所述辅酶具体为NAD+或NADP+；
所述电子转移介体可选自下述任意一种：亚甲基蓝、亚甲基绿、硫堇、二茂铁类物质(如二茂铁、羧酸二茂铁等)、醌类物质(如苯醌、四氯苯醌等)、聚亚甲基绿和氮杂环染料。
本发明方法的所述混合溶液中，酶的浓度可为200-2000μg/mL，辅酶的浓度可为1-10mM，电子转移介体的可浓度为0.1-1mM；向所述混合液中加入的稀土金属离子与所述辅酶的摩尔比可为(1∶1)-(3∶1)。
上述方法中，溶解酶、辅酶和电子转移介体的水溶液具体可为水、HEPES缓冲液(2-[4-(hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)或Tris-HCl缓冲液。
所用的HEPES缓冲液的浓度可为0.1M，其pH值为6.0-7.4。
本发明的再一个目的是提供一种纳米材料修饰电极以及以该修饰电极为工作电极制备的生物传感器。
本发明所提供纳米材料修饰电极，可按照下述两种方法制备得到：
1、将本发明制备的具有生物传感功能的纳米材料分散于水中，配制成分散液；再将所述分散液滴涂到电极表面，干燥，得到纳米材料修饰电极；
2、将本发明制备的具有生物传感功能的纳米材料掺杂到碳纳米管或石墨烯中，然后将掺杂的碳纳米管或石墨烯修饰到电极表面，干燥，得到纳米材料修饰电极。
其中，将纳米材料掺杂到碳纳米管或石墨烯的方法为常规方法，参见文献(K.Gong，Y.Yan，M.Zhang，L.Su，S.Xiong，L.Mao，Analytical Sciences，2005，21，1383-1393；K.Gong，Y.Dong，S.Xiong，Y.Chen，L.Mao，Biosensors and Bioelectronics，2004，20，254-259；Y.Yan，W.Zheng，M.Zhang，L.Wang，L.Su，L.Mao，Langmuir，2005，21，6560-6566)。
上述1或2中所述电极具体可为玻碳电极。
本发明所提供的电化学生物传感器既可为三电极体系，也可为两电极体系，包括工作电极、对电极、电解液，所述工作电极是本发明所提供的纳米材料修饰电极。
以葡萄糖电化学传感器为例，利用ICPs作为载体将参与葡萄糖电化学催化的活性物质都整合在一起，从而构建一个将各活性组分都整合到一个纳米球内的电化学传感器。具体如下：以辅酶β-nicotinamide adenine dinucleotide(NAD+)为配体的镧系ICPs作为构建单元，在该无限配位聚合物中，NAD+的核酸碱基和磷酸基与镧系金属离子配位，而NAD+的电活性部位并没有受此影响。然后，在合成该无限配位聚合物过程中将电子转移介体亚甲基绿(Methylene Green，MG)和葡萄糖脱氢酶(glucosedehydrogenase，GDH)同时包裹进去，得到具有生物传感功能的纳米材料。以该纳米材料修饰的玻碳电极或与碳纳米管、石墨烯等导电性物质掺杂后纳米材料修饰的玻碳电极为工作电极，构建了一个便捷、有效、环境友好的葡萄糖电化学传感器。用电化学方法测定了其对葡萄糖的响应，证实了该纳米材料对葡萄糖具有快速、灵敏、线性范围宽的响应特征。
本发明提供了一种将电化学生物传感器中的酶、辅酶、电子介体同时固定的一步室温合成法。与传统的方法相比，具有下述突出的优点：首先，大大简化了传感器的制备过程，省去了许多繁琐的程序；其次，该方法是环境友好的，在合成过程中没有使用苛刻的条件及造成材料的浪费；最后，所得无限配位聚合物尺寸处于纳米级别，极大地缩短了各物质之间的距离，加快了酶的电活性中心与电极表面的电子传递，进而有利于传感器的微型化。该方法在整合的电化学传感器和生物燃料电池甚至电化学其他领域都具有重要的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中MG/GDH/Tb-NAD+纳米材料的扫描电子显微镜照片(SEM)。
图2为实施例1中MG/GDH/Tb-NAD+纳米材料的葡萄糖响应曲线(i-t曲线)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的产品和方法作进一步的说明，但这些具体实施例不以任何方式限制本发明的保护范围。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、制备具有生物传感功能的纳米材料(MG/GDH/Tb-NAD+)及电化学传感器
将MG(亚甲基绿)、GDH(葡萄糖脱氢酶)和NAD+同时溶于1mL HEPES缓冲溶液(pH 7.4，浓度0.1M)中，使其各自浓度分别为0.1mM、200μg/mL和10mM。在室温条件下，将1mL Tb(NO3)3·6H2O(10mM)水溶液加入上述溶液，静置若干小时。所得的沉淀用纯水洗涤并离心，弃去上清液。重复上述操作至少三次，最后再用纯水分散。然后对其进行了SEM表征(见图1)，可看出所得材料尺寸为纳米级。
MG/GDH/Tb-NAD+的电化学传感研究：
将5μL MG/GDH/Tb-NAD+水分散液滴涂到裸玻碳电极表面，自然晾干。以该修饰电极为工作电极，以Ag/AgCl(饱和氯化钾)为参比、以铂丝为对电极，以0.1M磷酸缓冲溶液(pH 7.0)为支持电解液，得到葡萄糖电化学传感器。用电化学方法测定了其对葡萄糖的响应。
将电位控制在0.2V，往支持电解液中不断滴加葡萄糖(初始浓度：2M)数微升，从图2可看出，在250μM-8mM范围内，对葡萄糖呈现快速、线性响应。
综上，本发明利用室温一步合成法，得到能够将酶、辅酶、电子转移介体同时固定的纳米颗粒，并通过电化学测试手段证实了该纳米材料对葡萄糖具有快速、灵敏、线性范围宽的响应特点。该方法为酶、辅酶、介体的固定提供了一个行之有效、便捷的方法，在传感器、生物燃料电池甚至电化学其他领域都存在重要的应用价值。

Claims (2)

1.一种制备具有生物传感功能的纳米材料的方法，包括下述步骤：室温下将酶、与所述酶相匹配的辅酶和电子转移介体溶于水溶液中，得混合溶液；向所述混合溶液中加入含稀土金属离子的水溶液，静置直至沉淀完全，离心，收集沉淀并洗涤，即得到所述具有生物传感功能的纳米材料；
所述酶为选自下述任意一种：葡萄糖脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、乙酸脱氢酶、纤维二糖脱氢酶和D-果糖脱氢酶；所述辅酶为NAD+；
所述电子转移介体选自下述任意一种：亚甲基蓝、亚甲基绿、硫堇、二茂铁类物质、醌类物质、聚亚甲基绿和氮杂环染料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述混合溶液中，所述酶的浓度为200-2000μg/mL，所述辅酶的浓度为1-10mM，所述电子转移介体的浓度为0.1-1mM；向所述混合液中加入的所述稀土金属离子与所述辅酶的摩尔比为（1:1）-（3:1）。
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