CN113621588A - 固定半乳糖氧化酶的方法及其产品和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及固定半乳糖氧化酶的方法及其产品和应用，通过将半乳糖氧化酶与二价铜离子、四价锆离子于磷酸盐缓冲液中固定，或是将半乳糖氧化酶与二价铜离子、羟高铁血红素于磷酸盐缓冲液中固定，制备得到金属蛋白框架材料。在催化转化5‑羟甲基糠醛时，上述固定方法提高了半乳糖氧化酶的活性，且可以用于多种醇类和醛类的氧化，具有广泛的应用前景。

Description

固定半乳糖氧化酶的方法及其产品和应用
技术领域
本发明属于生物材料制备领域，具体涉及固定半乳糖氧化酶的方法及其产品和应用，尤其是利用二价铜离子、四价锆离子和二价铜离子、羟高铁血红素固定半乳糖氧化酶的方法，以及由该方法制备得到的双金属蛋白框架材料与应用。
背景技术
半乳糖氧化酶是一种铜依赖性酶，是一种工业相关的氧化酶，该酶能够自然地催化各种醇(糖)的羟基氧化成相应的醛基，同时能够将分子氧还原为过氧化氢。半乳糖氧化酶在催化糖反应中表现出很高的特异性，基于这一特异性，半乳糖氧化酶可应用于各种分析技术，如奶类产品和相关乳制品中的乳糖的测定，或应用于粘液分泌细胞的组织化学检查，还可以用于生物传感器中来测量生物体液中的半乳糖及其相关的衍生物。在化学合成领域，半乳糖氧化酶可以催化部分具有羟基的底物，氧化成具有醛基的产物，而该产物可以作为中间产物发生进一步的催化氧化，从而实现复杂化合物的完整合成流程，因此，提高半乳糖氧化酶的催化转化效率具有重要的意义。
利用铜、锰金属离子固定半乳糖氧化酶比游离半乳糖氧化酶具有更高的催化在转化效率、更好的热稳定性，同时具有更好的重复使用性。但是对于半乳糖氧化酶的催化转化效率的明显提高仍是需要解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供固定半乳糖氧化酶的方法及其产品和应用，通过将半乳糖氧化酶与二价铜离子、四价锆离子于磷酸盐缓冲液中固定，或是将半乳糖氧化酶与二价铜离子、羟高铁血红素于磷酸盐缓冲液中固定，制备得到金属蛋白框架材料。半乳糖氧化酶是一种铜依赖性酶，活性中心的铜为二价时半乳糖氧化酶才具有活性，发挥催化转化作用，因此，能够持续将半乳糖氧化酶活性中心的一价铜氧化为二价铜，是半乳糖氧化酶持续发挥催化转化作用的关键。利用二价铜离子和四价锆离子以及二价铜离子和羟高铁血红素均可以使半乳糖氧化酶持续发挥催化转化作用，进而提高催化转化效率。
更为具体的，本发明采用的技术方案如下：一种固定半乳糖氧化酶的方法，包括以下步骤：
（1）使用大肠杆菌作为表达菌株，将半乳糖氧化酶进行诱导培养，通过镍柱亲和层析法进行纯化，得到半乳糖氧化酶；
（2）将半乳糖氧化酶、二价铜离子和四价锆离子，以及半乳糖氧化酶、二价铜离子和羟高铁血红素分别加入到PBS缓冲液中；
（3）将混合后的溶液混匀，形成固定后的金属蛋白框架材料；
（4）将金属蛋白框架材料与溶液分离。
作为本发明进一步改进的技术方案，步骤（1）中，选用大肠杆菌BL21（DE3）作为表达菌株，pET28（a）为载体，利用IPTG进行诱导表达，通过镍柱进行纯化，使用酶标仪测试半乳糖氧化酶的浓度。
作为本发明进一步改进的技术方案，步骤（2）中，半乳糖氧化酶浓度为0.02-0.5mg/ml，二价铜离子浓度为0.15-10mM，四价锆离子离子浓度为0.05-1.5mM；步骤（2）中，半乳糖氧化酶浓度为0.02-0.5mg/ml，二价铜离子浓度为0.15-10mM，羟高铁血红素浓度为0.0025-1mM；所述的PBS缓冲液的pH为7.0-7.8。
作为本发明进一步改进的技术方案，步骤（3）中，将混合后溶液轻轻上下颠倒数次使之混合均匀，在15℃-30℃条件下静置16h-72h，形成金属蛋白框架颗粒。
作为本发明进一步改进的技术方案，步骤（4）中，采用离心分离，在转速为3000rpm -6000 rpm，温度为4℃-15℃的条件下将固定后金属蛋白框架颗粒与溶液分离。
另一方面，本发明还保护所述的方法制备得到的基于二价铜离子和四价锆离子固定半乳糖氧化酶的金属蛋白框架材料。
另一方面，本发明还保护所述的方法制备得到的基于二价铜离子和羟高铁血红素固定半乳糖氧化酶的金属蛋白框架材料。
本发明还保护上述的金属蛋白框架材料在催化转化5-羟甲基糠醛中的应用。
本发明还保护上述的金属蛋白框架材料用于多种醇类和醛类的氧化。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
一方面，本发明通过将二价铜离子、四价锆离子与半乳糖氧化酶于磷酸盐缓冲液中固定，得到双金属蛋白框架材料，发挥催化转化作用，提高了半乳糖氧化酶的活性，转化率比游离半乳糖氧化酶催化转化5-羟甲基糠的效率提高5-6倍。且具有多底物适用性，具有广泛的应用前景。
另一方面，本发明通过将二价铜离子、羟高铁血红素与半乳糖氧化酶于磷酸盐缓冲液中固定，得到金属蛋白羟高铁血红素框架材料，发挥催化转化作用，将羟基氧化为醛基时，提高了半乳糖氧化酶的活性，转化率比游离半乳糖氧化酶催化转化5-羟甲基糠醛的效率提高5-6倍。且可以用于多种醇类和醛类的氧化，具有广泛的应用前景。
附图说明
以下结合附图对本发明作进一步说明, 附图仅对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围：
图1为本发明的半乳糖氧化酶、二价铜离子和四价锆离子金属蛋白框架材料扫描电镜图；
图2为本发明的半乳糖氧化酶、二价铜离子和羟高铁血红素材料扫描电镜图；
图3为本发明的半乳糖氧化酶、二价铜离子和四价锆离子金属蛋白框架材料面扫描图；
图4为本发明的半乳糖氧化酶、二价铜离子和羟高铁血红素材料面扫描图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进行详细描述，但本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
利用二价铜离子、四价锆离子和二价铜离子、羟高铁血红素固定半乳糖氧化酶的具体方法如下：
（1）使用大肠杆菌BL21（DE3）作为表达菌株，pET28（a）为载体，利用IPTG将半乳糖氧化酶进行诱导表达培养，利用载体上的His标签，通过镍柱亲和层析法纯化，使用酶标仪测试得到一定浓度的半乳糖氧化酶；
（2）将半乳糖氧化酶、二价铜离子离子和四价锆离子加入到pH为7.4的PBS缓冲液中，使半乳糖氧化酶终浓度为0.02-0.5mg/ml，二价铜离子浓度为0.15-10mM，四价锆离子离子终浓度为0.05-1.5mM；
将半乳糖氧化酶、二价铜离子和羟高铁血红素加入到pH为7.4的PBS缓冲液中，使半乳糖氧化酶终浓度为0.02-0.5mg/ml，二价铜离子浓度为0.15-10mM，羟高铁血红素终浓度为0.0025-1mM；
（3）将混合后溶液轻轻上下颠倒数次使之混合均匀，置于25℃恒温箱静置24h，形成半乳糖氧化酶、二价铜离子和四价锆离子金属蛋白框架材料和得到的半乳糖氧化酶、二价铜离子和羟高铁血红素材料；
（4）形成金属蛋白框架材料后，使用离心机，在4800rpm转速，4℃条件下将固定后颗粒与溶液分离，得到半乳糖氧化酶、二价铜离子和四价锆离子金属蛋白框架材料和得到的半乳糖氧化酶、二价铜离子和羟高铁血红素材料的固体颗粒。
待半乳糖氧化酶、二价铜离子和四价锆离子金属蛋白框架材料和得到的半乳糖氧化酶、二价铜离子和羟高铁血红素材料固体颗粒干燥后，得到图1和图2的扫描电镜测试图，和图3和图4的面扫描图。经测试，其转化率均比游离半乳糖氧化酶催化转化5-羟甲基糠醛的效率提高5-6倍。
以上实施例显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，而不是以任何方式限制本发明的范围，在不脱离本发明范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。

Claims (9)

1.一种固定半乳糖氧化酶的方法，其特征在于，通过将半乳糖氧化酶与二价铜离子、四价锆离子于磷酸盐缓冲液中固定，或是将半乳糖氧化酶与二价铜离子、羟高铁血红素于磷酸盐缓冲液中固定，制备得到金属蛋白框架材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）使用大肠杆菌作为表达菌株，将半乳糖氧化酶进行诱导培养，通过镍柱亲和层析法进行纯化，得到半乳糖氧化酶；
（2）将半乳糖氧化酶、二价铜离子和四价锆离子，以及半乳糖氧化酶、二价铜离子和羟高铁血红素分别加入到PBS缓冲液中；
（3）将混合后的溶液混匀，形成固定后的金属蛋白框架材料；
（4）将金属蛋白框架材料与溶液分离。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，选用大肠杆菌BL21（DE3）作为表达菌株，pET28（a）为载体，利用IPTG进行诱导表达，通过镍柱进行纯化，使用酶标仪测试半乳糖氧化酶的浓度。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，半乳糖氧化酶浓度为0.02-0.5mg/ml，二价铜离子浓度为0.15-10mM，四价锆离子离子浓度为0.05-1.5mM；步骤（2）中，半乳糖氧化酶浓度为0.02-0.5mg/ml，二价铜离子浓度为0.15-10mM，羟高铁血红素浓度为0.0025-1mM；所述的PBS缓冲液的pH为7.0-7.8。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，将混合后溶液轻轻上下颠倒数次使之混合均匀，在15℃-30℃条件下静置16h-72h，形成金属蛋白框架颗粒。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，采用离心分离，在转速为3000rpm -6000 rpm，温度为4℃-15℃的条件下将固定后金属蛋白框架颗粒与溶液分离。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法制备得到的金属蛋白框架材料。
8.根据权利要求7所述的金属蛋白框架材料在催化转化5-羟甲基糠醛中的应用。
9.权利要求7所述的金属蛋白框架材料用于多种醇类和醛类的氧化。
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