JPH0262958A - リン酸濃度測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、試料中のリン酸を迅速かつ安価に測定可能な
酵素電極に関するものである。

従来の技術 酵素電極は、その簡便性・迅速性等の優秀な特性を有し
、近年、臨床分析・食品分析・環境分析等の広範な分野
で広く利用されるようになってきている。

従来酵素電極は、主として糖質、脂質、アミノ酸等の有
機化合物を対象とするものを中心に開発されている。

一方、食品・環境試料中等の無機化合物は、人手による
抽出・発色・比色操作等を伴う吸光分析法等を中心とす
る方法で測定されている。

この中で、リン酸は多くの食品試料・生体試料環境試料
等に含まれており、生体における代謝過程で重要な役割
を演じ、また近年は河川・海洋における環境汚染物質の
１つとしてその分析は重要な項目となってきてる。リン
酸、特に、オルトリン酸の分析方法としては、モリブデ
ン酸との反応により、リンモリブデン酸を形成させ、還
元操作を行うことにより生じる青色を吸光光度分析法に
より定量するのが一般的である。この操作はかなりの操
作手順を伴い、また試料中にタンパク質が含まれる場合
は、除タンパク操作を必要とし、煩雑なものである。さ
らにケイ酸による妨害等にも注意を払う必要があった。

このような観点から、簡便性・迅速性に優れた酵素電極
法をリン酸の定量に摘要すべく、アルカリフォスファタ
ーゼによる、グルコース−６−リン酸の加水分解反応に
対して、リン酸が拮抗阻害を示すことを利用した電極が
提案されている（Ｇ。

Ｇ　、　Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ　ａｎｄ　Ｍ　、Ｎａｎｊ
ｏ；Ａｎａｌ、Ｃｈｉ＋＊。

Ａｃｔａ、７８．６９＜１９７５））、Ｌかしこの方法
では５手軽に実行可能な測定系は組めるが、使用するグ
ルコース−６−リン酸が高価で使い捨てにせざるを得な
いという欠点があった。

本発明が解決しようとする課題 本発明は、試料中のリン酸を測定するにあたり、高価な
試薬を使用することなく、分析コストの低減が可能な、
迅速性に優れた酵素電極を提案せんとするものである。

課題を解決するための手段 本発明に係わる酵素電極は、グルコースオキシダーゼ（
ＥＣ：　１．１．３．４）、ムタロターゼ（ＥＣ：５．
１．３．３）、インベルターゼ（ＥＣ：　３．２．１．
２６）およびスクロースフォスフォリラーゼ（ＥＣ：　
２．４．１．７）を固定化した構成を有し、測定時に、
試料溶液にスクロースを共存せしめ測定することを特徴
とするものである。また本発明は、ピラノースオキシダ
ーゼ（ＥＣ：　ｔ、ｔ、３．１０＞、インベルターゼお
よびスクロースフォスフォリラーゼを固定化した酵素電
極を用い、試料溶液にスクロースを共存せしめ測定する
ことを特徴とするリン酸濃度測定方法である。

この電極は比較的耐久性に優れた酵素により構成されて
おり、安定で、かつ使用する試薬も低価格なものである
。

作　　用 スクロースフォスフォリラーゼはシュードモナス（Ｐ　
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属やロイコノストック（Ｌ　
ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　）属等の細菌が生産することが
知られている酵素である。この酵素は下記に示す反応を
触媒する。

スクロース　＋　無機リン酸　＝ α−Ｄ−グルコースー１−リン酸　十　〇−フラクトー
ス　　　・・・（１）この式において、無機リン酸がス
クロースの分解に関与することがわかる。つまり過剰の
スクロースが存在する系にリン酸が添加されると、（１
）式によりスクロースは、Ｄ−フラクトースとα−Ｄ−
グルコースー１−リン酸に分解される。

一方、リン酸がない場合は、スクロースは以下に示す反
応系により加水分解される。

スクロース　＋　水　＝　α−Ｄ−グルコース　＋　Ｄ
−７ラクトース・・・（２）ここで生じたα−Ｄ−グル
コースは、以下の反応により、酸化分解される。

α−Ｄ−グルコース　＝　β−Ｄ−グルコース　　　　
　　　　　　　　・・・く３）β−Ｄ−グルコース　＋
　酸素　＝ グルコノ−δ−ラクトン　十　過酸化水素　　　　　　
　　　・・・（４）ここで、（２）式に関与する酵素は
インベルターゼ、（３）式に関与する酵素はムタロター
ゼ、そして（４）式に関与する酵素がグルコースオキシ
ダーゼである。

最終的に（４）式で示されるグルコースオキシダーゼに
より触媒される反応で消費される酸素を測定するか、生
成される過酸化水素を測定する。

つまりリン酸の有無により、スクロースの分解反応の経
路が変化するわけであり、スクロース存在系における定
常出力は、リン酸の添加により減少する方向になる。

また（３）、（４）式に示される反応を触媒する酵素で
あるムタロターゼとグルコースオキシダーゼのかわりに
、（５）式の反応を触媒するピラノースオキシダーゼを
用いても測定が可能である。

Ｄ−グルコース　士　酸素　−〇−グルコサン　十　過
酸化水素　　・・べ５）スクロースフォスフォリラーゼ
は、その至適ｐＨが６．０から７．０付近であり、共に
用いるグルコースオキシダーゼ、ムタロターゼ、インベ
ルターゼおよびピラノースオキシダーゼも無理なく利用
できるｐＨ範囲にある。

本酵素電極は数種類の酵素が共同して作用するため、そ
の反応速度論的解析の詳細を検討することは容易ではな
い。しかし定性的には以下のように考えられる。ムタロ
ターゼとグルコースオキシダーゼあるいはピラノースオ
キシダーゼの活性がインベルターゼの活性に比べて充分
大きければインベルターゼの触媒作用により生じたグル
コースは速やかに分解され、反応の律速段階はスクロー
スの分解過程（く２）式）にあることになる。

方で、系内にリン酸が加えられるとスクロースはグルコ
ース−１−リン酸とフラクトースに加水分解されるが、
もしスクロースフォスフォリラーゼの活性がインベルタ
ーゼより高ければ、系内にリン酸が加えられた影響が強
く現れる。したが・）てリン酸を高感度で測定するため
には、スクロースフォスフォリラーゼの活性がインベル
ターゼの活性より高くなるように酵素の活性比を調整す
ることが望ましい。

本発明で用いる試薬はスクロースだけであり、極めて安
価に分析が実施できる。

本発明に係わる酵素電極は、その原理かられかるように
、グルコースにも感応する。グルコースが含まれる試料
を測定する場合には、まずスクロースを添加しない時の
出力値を記録しておき、次に添加した場合の出力値との
差から正確なリン酸の定量が可能である。また、試料中
にスクロースが含まれる場合にも、予めブランク値を計
測しておくことにより補正が可能である。

電極の作成方法としては、グルコースオキシダーゼ、ム
タロターゼ、インベルターゼ、およびスクロースフォス
フォリラーゼを適当なＭＷＩ液、たとえばｐＨ７，０の
リン酸ａｍ液に溶解しこれに架橋剤、たとえばグルタル
アルデヒド等の多官能基性アルデヒドを混合し、白金、
カーボン等の電極上、もしくは選択透過膜上に塗布して
乾燥架橋すればよい。この時、架橋膜の強度を上昇させ
るためにアルブミン等の他のタンパク質やポリマーを共
存させることらできる。

このように作成した酵素電極はバッチ系で使用してもよ
いし、フロー型計測装置に組み込んで使用することもで
きる。また酸素の減少量、過酸化水素の増加量のいずれ
をモニターしてもよい。

なお測定時の緩衝液は５リン酸を全く含まない方が感度
的には有利であるが、特に過酸化水素を検出する場合Ｓ
／Ｎ比を向上するためには、リン酸緩衝液の利用が望ま
しく、この場合１ｍＭ〜１０ｍＭ程度のリン酸緩衝液な
らば使うことができる。

実施例 以下に実施例を示し本発明をより具体的に説明するが、
もちろん本発明はこれのみに限定されるものではない、
なお、％は重量％を表す。

実施例１ （１）電極の作成方法 直径２　ｒｎ　ｒｎの白金線の側面を熱収縮テフロンで
被覆し、その線の一端をやすりおよび１５００番のエメ
リー紙で平滑に仕上げる。この平滑に仕上げた白金線上
に酵素を固定化した。グルコースオキシダーゼ〈シグマ
社製、Ｔｙｐｅ■−８）０゜２　ｒｎ　ｇ、インベルタ
ーゼ（シグマ社製、Ｇ　ｒ　ａ　ｄ　ｅ■）１．０ｒｎ
ｇ、ムタロターゼ（シグマ社製）１μｌ、スクロースフ
ォスフォリラーゼ（シグマ社り６．０ｍｇ、および牛血
清アルブミン（シグマ社製、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）７．
０ｍｇを１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，
０）１ｍＺに溶解しその中にグルタルアルデヒドを０．
５％になるように加える。この混合液を手早く先に用意
した白金線の研磨平滑化した端面に３μ！のせ、風乾す
る。その後、１０ｍＭリン酸ナトリウム［１液（ｐＨ６
，５）中に保存する。

（２）測定方法 作成した酵素電極を作用電極、１　ｃ　ｒｎ角の白金板
状電極を対極とし、参照電極として飽和カロメル電極（
以下、ＳＣＥと略す）を用いこれらをポテンシオスタッ
トに接続した０作用電極に対５ＣＥ０．６Ｖの電圧を印
加して測定系を構成した。

測定に用いた＆！衝液は１０ｍＭリン酸ナトリウｌ−Ｍ
衝液（ｐＨ６，５）である。測定温度は３７℃（±０．
２℃）とした、マグネチックスタラーで溶液を撹拌しな
がら、系内にスクロースを１ｍＭ加えた。スクロースの
分解および生成したグルコースの酸化に伴って生じる過
酸化水素の酸化電流が安定化するのを待って、リン酸溶
液を１０ｒｎＭから１．　ＯＯｍ　Ｍとなるように順次
添加し、酸化電流に由来する出力値の減少をレコーダー
に記録した。この記録結果が第１図である。スクロース
を加えるとく図中■の点）速やかに電流が増大し一定値
に落ち着く。そこにリン酸を加えるとく図中■の点）、
電流値が減少することがわかる。そして、溶液内のリン
酸濃度に対して出力減少値をグラフ化したものが第２図
である。リン酸濃度Ｏ〜５０ｍＭに対して良好な直線性
を有する検量線が得られていることがわかる。

発明の効果 本発明により、リン酸の分析を簡便・迅速に実施でき、
かつ分析に要する費用を著しく削減することが可能とな
った。

【図面の簡単な説明】

第１図は測定の実施例であり、横軸は時間、縦軸は出力
電流値を示している。矢印の時点で各々スクロース（■
）とリン酸（■）を加えている。 第２図はリン酸の検を線である。 代理人　　弁理士　画数　圭一部 時間

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）グルコースオキシダーゼ、ムタロターゼ、インベ
   ルターゼおよびスクロースフオスフオリラーゼを固定化
   した酵素電極を用い、試料溶液にスクロースを共存せし
   め測定することを特徴とするリン酸濃度測定方法。
2. （２）ピラノースオキシダーゼ、インベルターゼおよび
   スクロースフオスフオリラーゼを固定化した酵素電極を
   用い、試料溶液にスクロースを共存せしめ測定すること
   を特徴とするリン酸濃度測定方法。