JPH11509633A - 生化学的センサー装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 共通フロー流中の多数電気化学的センサーの劣化は、そのそれぞれの基質との相互作用の結果、酸化剤を生産し得るオキシドレダクターゼをその関連酵素として有するどのセンサーも、そのようなオキシドレダクターゼ酵素を持っていない他の酵素センサーの下流に配置することによって避けられる。

Description

【発明の詳細な説明】 生化学的センサー装置および方法本発明の背景 Ｕｐｄｉｋｅ ａｎｄ Ｈｉｃｋｓ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），Ｖｏｌ ．２１４（１９７１）９８６のパイオニア的業績以来、ある酵素を測定装置にま たはそのまわりに固定し、バイオセンサーを創製することに多大の努力が払われ ている。これらのいわゆるバイオセンサーは分析化学、環境化学、臨床化学およ び医療の現場の分野で広い応用がある。バイオセンサー中の酵素の主な機能は、 高い程度の特異性をもって、その濃度または存在を測定しようとする物質の化学 的に選択的なセンサーをもって容易に検出し得る種への変換を触媒することであ る。 そのような応用の一例は、尿素をアンモニアへ特異的に加水分解するウレアー ゼと、アンモニウムイオンに選択的に応答するイオン選択的電極またはセンサー の組合せである。そのようなセンサーはイオノフォアノナクチンを含んでいる膜 を有するであろう。アンモニウム選択的センサーは、この酵素の不存在下では、 尿素を検出もしくは測定できないであろう。 他の広く使用されるバイオセンサーは生理的流体中のグルコースの直接測定を 提供する。もっとも普通のグルコースバイオセンサーは、グルコースの過酸化水 素への酸化を触媒するグルコースオキシダーゼに依存する。代わって過酸化水素 の濃度は電流測定電気化学的セルを使用して測定される。セル中を流れる電流は 、ここに参照 として取入れる米国特許４，７５９，８２８に記載されているように、グルコー ス濃度に直線的に関係する。 センサー設計、製作および使用に関連した多数の論文が技術および特許文献に 見ることができるが、今日実用的バイオセンサーは非常に少数した存在しないと いうことが広く認められている。技術的なチャレンジは多数ある。注目すべきチ ャレンジはバイオセンサーに使用される酵素の生物学的活性のレベルを維持し、 多数回使用に使用できるようにすることである。 酵素活性の高いレベルを達成しそして維持する一つのアプローチは、測定直前 または測定時、関心するサンプルを酵素の溶液／調製物と混合することを含む。 このアプローチは安定な活性な固定化酵素を創製する複雑性からは免れるが、酵 素含有溶液を絶えず添加するための手段を提供する問題を含んでいる。これはそ のような分析に使用する装置の複雑性を増し、そして測定センサーにまたはその まわりの安定な活性固定化酵素の理想に比較して、著しく多い酵素を消費する。 活性酵素の固定化を達成する技術は技術文献に出ている。酵素は普通測定セン サーへまたはその直近へ吸着されるかまたは共有結合され、あるいはサンプルと 測定装置の間に配置される膜中に組入れられる。酵素反応の生成物が選択的セン サー表面（電位差測定装置の場合イオノファア層）と相互作用するか、もしくは 作業電極（電流測定装置の場合）へ膜を通って拡散することが許容される条件が 確立される。不幸にも、そのようなアプローチに基づく多数のバイオセンサーは しばしば失望的性能を示す。典型的な問題は膜のゆるやかな水和、またはサンプ ルもしくは較正液中の成分（重金属、バ クテリア、タンパク破壊酵素であるプロテアーゼ）による酵素の分解を含む。 臨床応用においては、膜系酵素システムが好ましい。何故ならばサンプルがバ イオセンサーに使用した酵素を妨害し得る多数の未知の成分を含み得るし、含む からである。膜マトリックス、テスト物質、酵素が必要とする助因子および試薬 、および反応副生物に対し多孔質であるように選択される。理想的には膜構造は 酵素フレンドリーな環境を提供しつつ、酵素に有害な物質に対する障壁として作 用することである。 バイオセンサーを使用する市販のシステムは比較的複雑である。進歩したシス テム設計は、酵素活性を維持しそして装置を較正するため、較正液または試薬の シリーズがバイオセンサーの上を逐次的に通過することを可能にする。良好な分 析性能は使用したプロトコールもしくは流体シーケンスの厳格な維持によっての み得られる。このことはコンピューター制御システムの必要性を物語る。 前記した努力にもかかわらず、酵素系センサーは永久に持たないことは明らか である。酵素は試薬全体のコストの有意義な部分を占めるので、その使用し得る 寿命を最大化することが望ましい。一回使用センサーは最も特定化した用途を除 いて典型的にコスト禁止的である。さらに一回使用装置は、定義通り、機能度を 検証し次にサンプルをテストするために使用するため認証された流体と較正する ことができない。 センサーの多数回使用は、以前のサンプル成分および反応副生物の除去のため のプロトコールが有効である限り、コスト有効的である。商業的製造者によって 採用されている一方法は、フラッシュお よび／または較正流体の比較的大容積をセンサーを通って次々に流すことである 。有効であるためには、センサーの回復および／または較正は、試験が進行中で あろうとなかろうと、センサーの全寿命期間を通じて必要である。立ち会いなし 使用の合理的期間の間、これはシステムが流体試薬の比較的大容積を収容しなけ ればならないことになる。このことは研究所使用に設計された分析機については 小さな問題でしかないが、この問題はポータブルもしくは手持ち分析機について はもっと急務である。 センサー寿命を延ばす代わりのかなり有効な方法は、作業のスケールを小さく するかもしくはサンプルの前希釈によってサンプルの容積を減らすことである。 どの場合においても目的は、与えられた酵素量あたりセンサーが処理しなければ ならない基質の量を制限し、そして副生物の全体量を減らすことである。希釈あ りまたはなしでサンプルサイズの制限はセンサー寿命を増す傾向にあり、そして 流体の節約が得られる。しかしながらフラッシュまたは較正の程度を減らす試み は不変的により短いセンサー寿命へ導く。 少数の製造者は多数の検体を感知することができる多数バイオ分析システムに 基づいたシステムの提供する。ここでもセンサー寿命問題はセンサーの実用的利 用を制限しているように見える。注目される例外はｉ−ＳＴＡＴ（Ｐｒｉｎｃｅ ｔｏｎ，ＮＪ）であり、該業者は一回使用多検体使い捨て装置の採用によりセン サー寿命問題を解決している。彼等のシステムの一つが米国特許５，０６３，０ ８１に記載されている。 血液ガス、電解質および代謝物をテストする他の多数回使用分析機が米国特許 ４，４５２，６８２に記載されている。この特許は、 グルコースセンサーが尿素セイサーの上流に位置する逐次システムを記載する。 このシステムはセンサーの寿命を増強するため何もしていない。これらの先行技 術逐次流システムは、他の代謝物の少なくとも一部、すなわちバイオセンサーの 上流に過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）を発生するグルコースセンサーを一般に配置する。 このことは記載したこれら下流センサーの寿命を短くする傾向にある。 ＮＯＶＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）は多検体センサー を販売し、そして実用的使用寿命を確実にするためフラッシュ流体の比較的大容 積に依存する。後者の製造者によって上市されている分析機は、電解質センサー 、例えばナトリウム、カリウムおよび塩化物を通り、そして次にクレアチニン、 グルコースおよび尿素のためのバイオセンサーを通ってサンプルおよび較正液を シーケンスで流すための流れチャンネルを使用する。本発明の概要 先行技術多検体バイオセンサーの欠点の多くは、本発明の方法および装置によ って減らされる。本発明は、フラッシュ液の大量の要求を減らすと同時に、直列 に接続されたそのようなセンサーの使用寿命を増強する方法を提供する。本発明 は、液体サンプルの少なくとも２種の成分を感知するためのバイオ分析測定装置 であり、この装置は各自関連する酵素と、そして第１および第２のセンサー装置 の上へ液体を逐次誘導する流れチャンネルを備えた第１および第２のセンサー装 置を有するハウジングを備え、前記第１のセンサー装置は、そのそれぞれの基質 との相互作用の結果、少なくともいくらかは前記流れチャンネル中へ放出され得 る酸化剤を生産することができるオキシドレダクターゼ酵素を使用し、前記第１ のセンサー装 置は前記第２のセンサー装置の下流に配置され、前記ハウジングは各センサー装 置へ接続された測定手段を持っている。 本発明の一具体例においては、前記オキシドレダクターゼは、基質に作用する 時過酸化水素を生産するオキシダーゼ酵素である。このオキシダーゼ酵素は、グ ルコースオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ウ リカーゼ、アルコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ラクトース オキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ、グルタメートオキシダーゼ、Ｌ−アミ ノ酸オキシダーゼ、およびＤ−アミノ酸オキシダーゼを含む群から選択される。 本発明はまた、各自関連する酵素を有する生化学的センサーを有する第１およ び第２のセンサー装置を使用する、液体サンプルの少なくとも２種の成分を感知 する方法であって、前記第１のセンサー酵素は、そのそれぞれの基質との相互作 用の結果、酸化剤を生産することができるオキシドレダクターゼであり、該方法 は前記液体サンプルを第１の流れ方向に前記第１および第２のセンサー装置の各 自へ通過させるステップ、前記第１のセンサー装置を前記第２のセンサー装置の 下流へ配置するステップ、および前記センサーの各自において電子活性を測定す るステップよりなる。 本発明の方法および装置の使用は、多数検体のための複数のバイオセンサーの 使用をそのような使用に通常伴うバイオセンサー寿命の減少なしに許容する。 本発明の実施は、オキシドレダクターゼのその基質との作用の生成物として発 生した酸化剤、通常過酸化水素が下流の感受性のそしてデリケートな酵素を破壊 することを防止する。先行技術には認め られなかった本発明の重要な学習は、センサー内でオキシドレダクターゼに基い て発生した顕微鏡的な量の過酸化水素が下流に位置する酵素を徐々に分解するの に十分であるということである。この分野の技術的リーダー達はこの問題の根源 を認識せず、そして多数の商業的分析機において尿素電極より上流にグルコース を配置していた。彼等は問題の根源を認識せず、濃度が低すぎると考えた。図面の簡単な説明 本発明は、本出願の一部をなす添付図面をあわせて以下の詳細な説明から一層 完全に理解されるであろう。 図１は、流れチャンネル中に直列に配置された少なくとも二つのバイオセンサ ーを有する生化学的センサーの部分断面図である。 図２は、グルコースおよび尿素センサーを含んでいる生化学的センサー中の尿 素センサーの応答であり、ここでは先行技術におけるように尿素センサーの上流 にグルコース電極が配置されている。 図３は、グルコースおよび尿素センサーを含んでいる生化学的センサー中の尿 素センサーの応答であり、ここでは本発明に従って尿素センサーの下流にグルコ ース電極が配置されている。好ましい具体例の詳細な説明 本発明方法は、各自関連する酵素を有するバイオセンサーを使用するいくつか の異なる検体を感知するために使用することができる。この方法は、バイオセン サーの寿命の著しい損失なしに、そして大容積のフラッシュ流体を使用する必要 性なしに、多数検体のセンシングを許容する。請求の範囲中の術語の定義 「生化学的センサー装置」とは、もとの物質がほかの方法では検 出されない、分析しようとする物質から検出可能な種を発生する生化学的反応を 使用する任意の分析測定システムを意味する。限定ではないその例は、酵素と標 識抗体−抗原接合体の反応を含む。 「センサー装置」とは、化学種の濃度変化に応答して直接もしくは間接に電気 信号を提供するように誘発できる任意のトランスジューサーを意味する。その例 は、電位差測定、電流測定または他の電気化学的方法、吸光度および螢光、バイ オルミネッセンス、熱的変化、表面音響波および表面プラスモン共鳴を含む。 「バイオ分析測定装置」または「バイオセンサー」とは、基質を測定可能な種 へ変換することができる酵素と関連させた任意のセンサーを意味する。酵素は溶 液中に、またはセンサーの活性部分と接触して膜もしくはゲル層へ吸着もしくは 共有結合もしくは接近にもしくは保持して提供されることができる。 「流れチャンネル」とは、層流によるか、または表面の攻撃的フラッシングを 促進する態様すなわち乱流もしくは壁ジェット効果を実現するように仕組まれよ うと、センサー装置の活性測定表面を横切ってサンプル、フラッシュもしくは較 正流体の流れを指向させる任意の手段を意味する。 「オキシドレダクターゼ」とは、作用条件に応じて基質を可逆的にもしくは不 可逆的に還元もしくは酸化することができる酵素の一般的クラスの任意の酵素を 意味する。 「基質」は生化学的意味、すなわち酵素反応の出発物質の意味で使用される。 例はグルコースオキシダーゼに対してグルコース、リパーゼに対して脂質、アル コールオキシダーゼに対してアルコールである。 「オキシダーゼ酵素」は生化学的意味を持って使用される。一般に酵素のこの 一般的クラスはそれらのそれぞれの基質に対する作用の間過酸化水素を与える。 「電流測定的測定」とは、印加した電位を維持するのに必要な電流が測定され 、そして一般にイルコビッチ式により検体濃度へ直線的に関連している。 本発明は、第１バイオセンサーがグルコースの測定のために設計され、そして 第２のセンサーが尿素の測定のために設計されている典型的な適用について記載 されるであろう。グルコースバイオセンサーは、それぞれの基質との相互作用の 結果過酸化水素を生産する酵素の使用に依存する任意の入手し得るバイオセンサ ーでよい。そのような使用に適当な一つのそのようなセンサーはＮｏｖａ Ｂｉ ｏｍｅｄｉｃａｌへ発行された米国特許No.４，７５９，８２８に記載されてお り、参照としてここに取り入れる。前に記載したように、グルコースバイオセン サーは、典型的には酸化剤として任意の下流電気化学的センサーの作動に通常有 害に影響する過酸化水素発生を結果する。 本発明において使用する第２のセンサーは、米国特許No.５，０６３，０８１ または４，４５２，６８２に記載されているような尿素バイオセンサーである。 本発明方法によれば、各自関連する酵素を持っている二つのバイオセンサーを 横切って液体サンプルが逐次的に引かれる。分析下の液体サンプルは尿素センサ ーの酵素電極を通って最初に流される。そのようなセンサーは有害な過酸化水素 を発生しない。液体サンプルは次にグルコースのための第２のセンサーを通って 流される。 尿素を含んでいる液体サンプルが尿素電気化学的センサーへ入る時、液体の一 部分はその尿素選択膜４６（図１）と接触しそしてその中へ拡散する。膜中のポ ア内に固定化された酵素と接触する時、尿素は次式によりアンモニウムイオンと 二酸化炭素とに加水分解される。 サンプルのｐＨにおいて、アンモニウムはアンモニウムイオンへ変換される。 尿素（アンモニウム）測定センサーはアンモニウムイオンに応答する。この測 定は次にもとのサンプル中に存在する尿素の濃度に関連づけられる。 グルコース含有液体サンプルが下流グルコースセンサーへ入る時、液体の一部 分はそのグルコース選択性膜と接触しその中へ拡散する。膜のポア内に固定され た酵素および流体からの酵素と接触する時、グルコースは次式によりグルコン酸 と過酸化水素へ酸化される。 過酸化水素はグルコース選択膜中にそしてそれから拡散する。グルコース（過酸 化水素）センサーへ拡散する過酸化水素は以下の式に従って還元される。 他の過酸化水素は流れチャンネル中へ拡散するよう見え、そこで 流体順列に応じて、それは下流へ引かれ、過酸化水素に対して破壊的に感受性の どんな酵素からも遠去けられる。生化学的センサー装置 上の方法を実施するために使用でき、そして本発明に従って構成された装置は 図１に最良に見られ、そして入口２０および出口２０を有する流れチャンネル１ ８を収容するハウジング１０を含んでいる。液体は流れチャンネル１８を通って 引かれる。ぜん動ポンプ又は他の適当なポンピング装置が出口２２へ接続される 。二つのバイオセンサー、すなわち尿素測定センサー１４およびグルコース測定 センサー１６は、前に述べた特許の教えを使用するような、他の点では慣用の態 様でハウジング内に設置される。本発明によれば、グルコース測定センサー１６ は尿素測定センサー１４の下流の流れチャンネル内に配置される。尿素測定セン サー１４は、流れデフレクター５２を使用して流れチャンネル１８の流れをチャ ンバー４８を通って誘導するシールガスケット５４を用いて構成された通り抜け チャンバー１８をカバーする尿素選択性膜４６を含んでいる。流れチャンネル１ ８を通る液体流は、各測定の前後に測定チャンバー４８の適切な混合および洗い 出しを確実にするように流れデフレクター５２によって片寄せられる。それぞれ の電極６６が電位差測定タイプでよい適当な測定タイプへ接続される。 同様な態様で、記載したように尿素測定センサー１４から下流に配置されたグ ルコース測定センサーは、流れデフレクター６２を使用して流れチャンネル１８ がチャンバー５８を通り抜けることを許容するためのシールガスケット６４を使 用して構成された通り抜けチャンバー５８をカバーするグルコース選択性膜５６ を有し、測定 電極６８が適当な測定装置（図示せず）へ接続される。流れチャンネル１８を通 る液流は、各測定の前後に測定チャンバー５８の適切な混合および洗い出しを確 実にするため流れデフレクター６２によって片寄せられる。それぞれの電極６８ は電流測定タイプでよい適当な測定装置へ接続される。 本発明は、そのそれぞれの基質との相互作用の結果、その少なくともいくらか は流れチャンネル中へ放出され得る酸化剤を生産するこができるオキシドレダク ターゼを使用するグルコースセンサーのためのバイオセンサー位置を独特に選択 する。このバイオセンサーをこのように他のセンサーの下流に配置することによ り、他のセンサーの劣化は、オキシドレダクターゼを使用するセンサーの下流に ある他のセンサーほど速く発生しない。これは種々の実験によって証明されてい る。 実施例１尿素センサーに関して上流に配置したグルコースセンサーについての結果 記載した設計の流れチャンネルが、電解質（ＩＭＴ）流れセルと並列にＤｕＰ ｏｎｔ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ＡＲ臨床化学分析機上に組み立てられた。このシ ステムは、前に記載した流れセルを通って、サンプルカップから臨床サンプル、 すなわち血清、血漿または希釈した尿か、またはプラスチックボトルから較正標 準液を逐次的に引くことに依存する。マイクロプロセッサーが、流れチャンネル 中へ適切な液体および／または短い空気セグメント（混合を制限するため）を引 くためのぜん動ポンプおよび流体セレクターアームの作用を制御するために使用 された。ポンプは、センサーとの接触を 確実にするため流れチャンネル中の較正液またはサンプル液のセグメントをスト ップするようにプログラムされた。酵素が生成物の定常濃度を発生するのに十分 な時間の後、アンモニウムイオン（尿素センサー）または過酸化水素（グルコー ス）の濃度が測定された。反応生成物および過剰のサンプルはポンプによって流 れチャンネルから逐次引かれた。較正液も同様に処理された。事前の実験を基に して、システムが待機モードにある時、センサーと接触にある液体を更新し、そ してポンプチューブを運動させるように少容積の液体を動かすためポンプを短時 間運転することが必要なことがわかった。 １９日までの毎日、この分析機は既知濃度の尿素およびグルコースのシリーズ をテストするために使用された。既知の値に対するこれらテスト結果の平均値の プロット化は、尿素およびグルコース選択性膜の酵素の有用寿命の測定を提供し た。図２は、グルコースセンサーアセンブリの下流に配置した時の、尿素センサ ーアセンブリからの結果を指示する。 実施例２グルコースセンサーに関して上流に配置した尿素センサーについての結果 二つのセンサーアセンブリを逆順序に配置した、すなわちグルコースセンサー を尿素センサーから下流に配置したことを除いて、上に記載した実験をくり返し た。 再び１７日までの期間の毎日、分析機は既知濃度の尿素およびグルコースの溶 液のシリーズをテストするために使用された。既知の値に対するこれらテスト結 果の平均値のプロット化は、尿素および グリコース選択性膜の酵素の有用寿命の測定を提供した。図３は、グルコースセ ンサーアセンブリの上流に配置したときの尿素センサーアセンブリからの結果を 指示する。 これらの結果から、尿素センサーをオキシドレダクターゼを使用するセンサー の下流に配置した時、尿素センサーは応答に著しい減少を経験することが明らか である。逆にした時、応答の損失は観察できなかった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．液体サンプルの少なくとも二成分を感知するためバイオ分析測定装置であっ て、 各自関連する酵素を有する生化学的センサーを含む第１および第２のセンサ ー装置と、そして前記第１および第２のセンサー装置の上に逐次第１の流れ方向 に液体を指向する流れチャンネルを有するハウジングを備え、 前記第１のセンサー装置はそのそれぞれの基質との相互作用の結果、少なく とも一部が前記流れチャンネル中へ放出され得る酸化剤を生成することができる オキシドレダクターゼ酵素を使用し、 前記第１のセンサー装置は前記第２のセンサー装置の下流に配置されており 、 前記ハウジングは各センサー装置へ接続された測定手段を有している ことを特徴とする前記測定装置。 ２．前記オキシダーゼ酵素はオキシダーゼ酵素である請求項１の測定装置。 ３．前記オキシドレダクターゼは、グルコースオキシダーゼ、キサンチンオキシ ダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ウリカーゼ、アルコールオキシダーゼ、コレ ステロールオキシダーゼ、ラクトースオキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ、 グルタメートオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、およびＤ−アミノ酸オ キシダーゼよりなる群から選ばれる請求項２の測定装置。 ４．前記酸化剤は過酸化水素である請求項１の測定装置。 ５．各自関連する酵素を有する生化学的センサーを有する第１および第２のセン サー装置であって、前記第１のセンサー酵素はそのそれぞれの基質との相互作用 の結果、酸化剤を生成することができるオキシドレダクターゼであるセンサー装 置を使用して液体サンプル中の少なくとも二成分を感知する方法であって、 前記液体サンプルを第１の流れ方向において前記第１および第２のセンサー 装置の各自へ通過させるステップ、 前記第１のセンサー装置を前記第２のセンサー装置の下流に配置するステッ プ、 前記酵素センサーの各自において電子活性を測定するステップ を含むことを特徴とする前記方法。 ６．前記オキシドレダクターゼ酵素はオキシダーゼ酵素である請求項５の方法。 ７．前記オキシダーゼ酵素は、グルコースオキシダーゼ、キサンチンオキシダー ゼ、サルコキシオキシダーゼ、ウリカーゼ、アルコールオキシダーゼ、コレステ ロールオキシダーゼ、ラクトースオキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ、グル タメートオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、およびＤ−アミノ酸オキシ ダーゼよりなる群から選ばれる請求項５の方法。 ８．オキシダーゼ酵素はグルコースオキシダーゼである請求項７の方法。 ９．酸化剤は過酸化水素である請求項５の方法。