JPS5915629B2 - 抗生物質の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗生物質の製造法に関する。

さらに詳しくは、本発明は抗生物質生産能を有する微生
物菌体を生きたまま担体に固定化して得られる固定化微
生物菌体を炭素源、窒素源およびその他の栄養素を含む
栄養培地と接触反応させて抗生物質を反応液中に生成せ
しめ、これを採取することを特徴とする抗生物質の製造
法に関する。

抗生物質の微生物による製造に際しては、従来バッチ式
で発酵生産するのが通常であった。

本発明者らは工業的により有利な抗生物質の製造法につ
いて種々研究を行った結果、微生物菌体を生かしたまま
固定化する優れた方法を見出し、この方法によって作ら
れた固定化微生物菌体と栄養培地とを接触反応させるこ
とによって抗生物質を反復して製造することが可能であ
り、従来の複雑な発酵工程を用いず簡便な方法で抗生物
質を製造することができることを見出し本発明を完成す
るに到った。

以下本発明について詳述する。

本発明によれば、抗生物質生産能を有する微生物菌体を
生きたまま担体に固定化して得られる固定化微生物菌体
を炭素源、窒素源、その他の栄養素を含む栄養培地と接
触反応させれば抗生物質を生成せしめることができる。

本発明に使用する微生物は、固定化した場合にも生きて
おり抗生物質生産能を有するものであれば細菌、カビ、
放線菌、酵母など、いかなる種類の微生物も用いること
ができる。

具体的に好適な例としては実施例にあげたような菌株、
すなわちペニシリウム・クリゾゲナム（Ｐｅｎ ｉｃ
ｉ ｌ ｌ ｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ） Ａ Ｔ
ＣＣ１２６９０、ペニシリウム°ツタツム（ｐｅｎｉ
ｃｉｌｌｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ ）ＡＴＣＣ９４７９、
バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｉｌ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ１０７１６、バチル
ス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）
ＡＴＣＣ１４５９３などがあげられる。

これら微生物の菌学的性質については次の文献に記載が
ある。

ペニシリウム・クリゾゲナム： Ｍａｎｕｎｌ ｏｆｔ
ｈｅ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉａ、 Ｋ、ＢｏＨｏｇｅｒ
＆Ｃ，Ｔｎｏｍ 、 Ｔｈｅ Ｗｉ・Ｉｌｉａｍｓ
ａｎｄＷｉ Ｉｋｉｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ 、 ＵＳ
Ａ、 １９４９、Ｐ、３５９ ペニシリウム・ツタツム 二同上Ｐ、３６７バチルス
・リケニホルミス ： Ｂｅｒｇｅｙ ｓｍａｎｕａｌ
ｏｆ ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ第８版、５３４頁バチルス・ズブチリス
二同上 ５３１頁これら微生物菌体は一般的公知の方法
たとえばペニシリウム属の微生物についてはＡｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ １５，１２８４（１９６７）、
バチルス属の微生物についてはＢｉｏｃｈｉｍｉｃａ
ｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ３３８ 、５８
８（１９７４）に記載の方法により培養されたものを用
いればよい。

培養時間はペニシリウム属に属する微生物の場合は１．
５−３［Ｅｌ、バチルス属に属する微生物の場合は６〜
１５時間が好ましい。

本発明に用いる固定化微生物菌体の調製法は、一般に酵
素や微生物の固定化法として使用される方法なら、どの
ような方法でも可能であるが、とくにポリアクリルアミ
ドゲル法、コラーゲン法、アルギン酸カルシウムゲル法
による包括固定法などが好適である。

ポリアクリルアミドゲル法による微生物菌体の固定化の
一般的方法としては、微生物の懸濁液中、アクリルアミ
ドモノマーとアクリルアミド誘導体の架橋剤などを重合
させ、形成したポリアクリルアミドゲルの微細な格子の
中に微生物菌体を取り込んで固定化する方法があげられ
る。

たとえば菌体をアクリルアミドモノマーおよび架橋剤と
ともにリン酸緩衝液に懸濁させ重合反応促進剤および重
合開始剤を加えて重合反応を行わせると、菌体を含むポ
リアクリルアミドゲルが得られる。

また使用する菌体濃度は２０〜５００！７１５；ｌ （
ｗｅ ｔ ）７ｍｌが好適である。

架橋剤としてはＮ、マーメチレンビスアクリルアミド（
以ＦＢＩＳという）のほか、Ｎ、Ｎ’−プロピレンビス
アクリルアミド、ジアクリルアミドジメチェルエーテル
、■、２−ジアクリルアミドエチレングリコール、Ｎ、
Ｎ’−ジアリル濃石酸ジアミド、エチレン炭素ビスアク
リルアミド、ヘキサ−１，３，５−トリアクリル−５−
１リアジンなどが用いられる。

反応液中の架橋剤を含むモノマー濃度は、たとえばアク
リルアミドの場合、１０％（Ｗ／Ｖ）以下で、低いほど
よいが、実際上は４〜８％が好適である。

モノマー中の架橋剤濃度は５〜３０係（Ｗ／Ｗ）で使用
可能であるが、１０〜２５％（Ｗ／Ｗ）の範囲が好適で
ある。

次に抗生物質生産に及ぼすアクリルアミドモノマー濃度
および架橋剤（とくにＢＩＳ）濃度の影響を実験例によ
って示す。

実験例 １ ペニシリウム・クリゾゲナムＡＴＣＣ１２６９０をラク
トース３９７ｄｌ、グリコースＩＦＩ／ｄｉ、 コー
ンスチーブリ力−５９７ｄｌからなる培地（ｐＨ６，０
）で２５℃、６０時間振蓋培養する。

培養液を遠心分離し、菌糸を得る。

この菌糸２９（湿重量）を２ 、４ 、６．８，１０゜
１２％（Ｗ／Ｖ）のアクリルアミドモノマー〔各各Ｎ
、 Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（Ｂ Ｉ Ｓ
）７．５％（Ｗ／Ｗ）を含む〕を含んだ１００ｍＭリン
酸緩衝液（ＰＨ７，０） １７．５ｍｌに懸濁さそ、５
％（Ｗ／Ｖ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ′、Ｎ′−テトラメチルエチ
レンジアミン（ＴＥＭＥＤ）溶液０．３ ｍｌおよび５
係（Ｗ／Ｖ）過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）溶液１．０
ｍｌを加え（反応液全量２０ｍ１）、水冷下（約４℃）
で２０分間重合反応を行う。

かくしてペニシリウム・クリゾゲナムの菌糸を含むポリ
アクリルアミドゲルが得られる。

このゲル全量を約４關角に切断して洗浄後、５００７７
２１溶坂ロフラスコに入れ、これにグリコース２００ｍ
９、硫安４０〜およびフェニル酢酸２〜を含んだ０．１
Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０） ２０ｍｌを加え
る。

これを２５℃で５時間振蓋（１２０ｒｐｍ）する。

この場合反応液中に生成するペニシリンＧの力価を第１
図に示す。

アクリルアミドモノマーが２％ではゲル形成が起らない
ため実施不能である。

この結果からアクリルアミドモノマー濃度４〜８％が好
適であることがわかる。

実験例 ２ 実験例１において、アクリルアミドモノマー濃度を５
％ （Ｗ／ Ｖ ）とし、ＢＩＳ濃度を変化させる以外
は実験例１て同様に行った。

その結果生成するペニシリンＧの力価を第２図に示す。

この結果からＢＩＳ濃度は１０〜２５係（Ｗ／Ｖ）が適
していることがわかる。

ポリアクリルアミドゲルを製造する際にはＮ。

Ｎ 、 Ｎ’ 、 Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミ
ン（ＴＥＭＥＤ）、β−ジメチルアミンプロピオニトリ
ル（ＤＭＡＰＮ）などの重合反応促進剤および過硫酸ア
ンモニウム（ＡＰＳ）、ペルオクソ硫酸カリウム（Ｋ２
Ｓ２ ｏｓ）、リボフラビンなどの重合開始剤を使用
する。

重合反応促進剤の濃度としては０．０１〜０，２％（Ｗ
／Ｖ）、重合開始剤の濃度としては０．０２〜０．４％
（Ｗ／Ｖ ）が好適である。

重合反応温度は好ましくは４−１０℃で行なわれる。

重合反応時間は普通３０分以内である。かくして得られ
る菌体を含むポリアクリルアミドゲルをホモゲナイズす
るか細断（１〜１０關角：し、水洗後、炭素源、窒素源
およびその他の栄養素を含む栄養培地に入れ、振盪撹拌
を行うと反応液中に抗生物質が生成するのでこれを採取
する。

またホモゲナイズあるいは細断し、水洗したポリアクリ
ルアミドゲルをカラムに充填し、これに適当な方法で酸
素を供給しつつ栄養培地を適格することによっても抗生
物質を生成させることができる。

栄養培地は、抗生物質生産に用いられる発酵培地ならば
いずれも用いることができる。

ポリアクリルアミドゲルの量は、反応液を振盪撹拌でき
る範囲、ゲル中の菌体に酸素が充分に供給できる範囲で
あればよい。

振盪撹拌は実用的には、例えば１２０〜１５０ｒｐｍで
、３〜２４時間行うとよい。

反応液からの抗生物質の採取は反応液からゲルを瀘取し
た涙液について一般の発酵法で用いられている抗生物質
を単離、精製する方法が適用できる。

コラーゲン膜法による微生物菌体の固定化は例えば微生
物菌体をコラーゲンフィブリル懸濁液と混合し、テフロ
ン板上で１昼夜風乾後、この菌体コラーゲン膜を細断す
るかせずして室温でグルタルアルデヒドを含んだリン酸
緩衝液に浸漬（タンニング処理）することによって行う
ことができる。

コラーゲンフィブリル液は濃度０．１〜２係（Ｗ／Ｖ）
のものを用いる。

微生物菌体はコラーゲンフィブリル液に対し１〜２０％
（Ｗ／Ｖ）がよい。

グルタルアルデヒドの濃度は０．１〜１０％（Ｗ／Ｖ）
がよい。

タンニング処理は１０〜３００秒間行う。

微生物菌体を包括したコラーゲン膜を用いて抗生物質を
生産するには、ポリアクリルアミドゲルを使用する場合
と同様に行う。

アルギン酸カルシウムゲル法による包括固定化としては
、微生物菌体をｏ、 ５−３ ％アルギン酸ソーダ溶液
（アルギン酸ソーダを０．８５％生理食塩水に溶かして
調製する）に懸濁させ、この懸濁液を０．１−５％Ｃａ
Ｃｌ２水溶液に滴下すれば、菌体を含んだ球状のアルギ
ン酸カルシウムゲルが得られる。

微生物菌体を包括したアルギン酸カルシウムゲルを用い
て抗生物質を生産するには、ポリアクリルアミドゲルを
使用する場合における反応液にさらにＣａＣ１１２を０
．０１〜０．５％（Ｗ／Ｖ）加える以外はポリアクリル
アミドゲルを使用する場合と同様に行う。

本発明により得られる微生物菌体を包括したゲルや膜を
保存する場合は、若干の栄養源を含んだ液に浸漬あるい
は湿潤させて冷室（約５℃）に保存するとよい。

本発明の方法で微生物が生きたまま固定化されているこ
とは次の１〜３から明らかである。

（１）固定化微生物の呼吸能を酸素電極を用いて測定し
たところ、固定化微生物は固定化する前の約４割の酸素
消費能を示した。

（２）固定化微生物の呼吸能は呼吸阻害物質の添加によ
り阻害された。

（３）固定化したペニシリウム・クリゾゲナムを用い、
グルコース、硫安、リン酸緩衝液およびフェニル酢酸か
らペニシリンＧを生産する際には空気（酸素）が必要で
あった。

本発明方法によれば、従来は不可能とされていた固定化
微生物による抗生物質の直接生産が可能となった。

つまり、本発明方法によれば、従来法のごとく目的物質
の前駆体を基質として添加することなく、炭素源、窒素
源その他の栄養素を含む一般的栄養培地と接触せしめる
だけで抗生物質を製造することができるので工業的に非
常に有利である。

以下に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明する。

実施例 １ 実験例１において、アクリルアミドモノマーを８００〜
（４％）、ＢＩＳを２００７％とする以外は実験例１と
同様に行った結果、１．６単位／ＩＬｌのペニシリンＧ
が生成した。

このペニシリンＧの力価は通常のバッチ式による培養（
５日間）により製造（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ６４ 、３８０゜１９５６に記載の方法）
したペニシリンＧの平均力価の約４０係であった。

実施例 ２ 実施例１と同様の方法でペニシリンＧの製造を行った反
応液から回収して得られる固定化微生物を用いて実施例
１と同様に反応を繰返してペニシリンＧを生成させた。

この操作を５回行った。５回目のペニシリンＧの生産力
価は１．１単位／ｍｌで最初のペニシリンＧ生産力価の
約７０係であった。

一方固定化していない菌糸を用いて実施例１と同じ反応
を行い、反応液から菌体を回収し、その菌糸を用い同じ
反応を行った。

この反応、回収を５回繰返したとき、５回目のペニシリ
ンＧの生産力価は０．５単位／１１Ｌｌで最初のものの
５係であった。

実施例 ３ 実験例１と同じ方法で培養して得られた菌糸２ｇ（湿重
量）をコラーゲンフィブリル液（ｐＨ４，０）５１１に
懸濁し、テフロン板上に厚さ５ｙｎｍに広げて一夜風乾
すると菌糸・コラーゲン膜が得られた。

これを２ｃｍ角に切断し、０１１％（Ｗ／Ｖグルタルア
ルデヒドを含んだ０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）に１分間浸漬してタンニング処理を行った。

これを洗浄後、５００ｒｆＬｌ容坂ロフラスコに入れ、
これにグルコース２００ ｍｇ、硫安４０即およびフェ
ニル酢酸２〜を含んだ０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０） ２０ｍｌ！を加え、これを２５℃で５時間
振盪（１２０ｒｐｍ）した。

かくして反応液中に０．８単位／ｍｌのペニシリンＧが
生成した。

実施例 ４ バチルス・リケニホルミスＡＴＣＣ１０７１６を可溶性
デンプンＩＪ／ｄｉ１ペプトン１ｆｆ／ｄｌ。

肉エキス０．５ 、！； ／ｄｌからなる培地（ｐＨ７
，２）で３０℃。

１０時間振盪培養した。培養液を遠心分離し菌体を得た
。

この菌体２９を用いアクリルアミドモノマー濃度８係、
ＢＩＳ濃度１０％で行う以外は実験例１と同様に行って
菌体をポリアクリルアミドゲル中に包括固定化した。

このゲルを１０秒間ホモゲナイズし、約２０メツシユ程
度に粒状化した。

これを水洗後、５００ｍ１容坂ロフラスコに入れ、上記
培地と同じ組成の液２０ｍ１を加えて、３０℃で４時間
振盪を行うと、反応液中に１．８単位／１ｒＬｌのバシ
トラシンが生成した。

この反応液からゲルを回収して１日後に上記と同じ反応
を繰返したところ１．６単位／ｒｆＬｌのバシトラシン
が生成した。

一方固定化しない菌体で同様な反応を行ったところ、バ
シトラシンの生成は初回は６．５単位／ｙｎｌｌ、
１日後に繰返したものは０．７単位／ｍｌであった。

実施例 ５ 実施例１においも、ペニシリウム・クリゾゲナムＡＴＣ
Ｃ１２６９０に代えて、ペニシリウム・ツタツムＡＴＣ
Ｃ９４７９を用い、ポリアクリルアミドゲルを約５ｕ角
に切断し、反応時間を７降間にする以外は実施例１と同
様に行った結果、反応液中に１．２単位／１ｒＬｌのペ
ニシリンＧが生成した。

実施例 ６ 実施例４において、バチルス・リケニホルミスＡＴＣＣ
１０７１６に代えてバチルス・ズブチリスＡＴＣＣ１４
５９３を用い、アクリルアミドモノマー濃度を５％、Ｂ
ＩＳ濃度２０係で行う以外は実施例４と同様に菌体をポ
リアクリルアミドゲル中に包括固定化した。

このゲルを約２ｍｍ角に切断し０．８５％生理食塩水で
洗浄後、５００ｍ１容坂ロフラスコに入れ、菌体の培養
培地と同じ組成の液２０ｄを加えて、３０℃で５時間振
盪培養を行うと、反応液中に１，５単位／ｄのバシトラ
シンが生成した。

実施例 ７ 実施例４と同様に培養して得られたバチルス・リケニホ
ルミスＡＴＣＣ１０７１６の菌体２ｆｌを、２チアルギ
ン酸ソーダ溶液２０ＵＩ’（アルギン酸ソーダを０．８
５％生理食塩水に溶かして調製する）に懸濁させた。

この懸濁液を２％Ｃａ Ｃ１２水溶液中に高さ１０Ｃｒ
ｆＬから滴下し、直径約２ｍｍの菌体を含んだ球状のア
ルギン酸カルシウムゲルを調製した。

このようにして得られたゲルを水洗後・５００７７１１
の坂ロフラスコに入れ、可溶性デンプンｌＶｄ１ペプト
ン１ 、！９７ｃｔｉ、肉エキス０．５ Ｅｌ ／ｄｉ
、Ｃａ ｃ１２０、１．９ ／ｄｌの組成分液（ｐＨ７
，２） ２０ｍｌを加えて、３０℃で４時間振盪を行う
と、反応液中に３．１単位／ｍｌのバシトラシンが生成
した。

【図面の簡単な説明】

第１図は反応液中のアクリルアミドモノマー濃度とペニ
シリンＧの力価の関係を示す。 第２図は反応液中のＢＩＳ濃度とペニシリンＧの力価の
関係を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 抗生物質生産能を有する微生物菌体を生きたまま担
   体に固定化して得られる固定化微生物菌体を炭素源、窒
   素源およびその他の栄養素を含む栄養培地と接触反応さ
   せて抗生物質を反応液中に生成せしめ、これを採取する
   ことを特徴とする抗生物質の製造法。 ２、特許請求の範囲１において、該微生物菌体がペニシ
   リウム属またはバチルス属に属する微生物の菌体である
   特許請求の範囲１の方法。 ３ 特許請求の範囲１において、該抗生物質がペニシリ
   ンまたはバシトラシンである特許請求の範囲１の方法。 ４ 特許請求の範囲１において、固定化微生物菌体がポ
   リアクリルアミドゲル法、コラーゲン法またはアルギン
   酸カルシウムゲル法の１つによって得られたものである
   特許請求の範囲１の方法。 ５ 特許請求の範囲４において、ポリアクリルアミドゲ
   ル法を、モノマー濃度１０％（Ｗ／Ｖ）以下、モノマー
   中の架橋剤濃度５〜３０％（Ｗ／Ｖ）で行うことを特徴
   とする特許請求の範囲４の方法。