JPS63105678A

JPS63105678A - 固定化菌体の製法

Info

Publication number: JPS63105678A
Application number: JP25275886A
Authority: JP
Inventors: Yukiyoshi Ito; 伊藤　幸良; Katsuhiko Nishida; 勝彦西田
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1986-10-23
Filing date: 1986-10-23
Publication date: 1988-05-10
Anticipated expiration: 2009-05-02
Also published as: JPH0632622B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は固定化菌体の製法に関する。該固定化菌体は酵
素反応により種々の物質、例えば、アミノ酸を製造する
のに有用である。

従来の技術酵素をグルタルアルデヒドや高分子物質で固定化するこ
と及び補酵素をヘキサメチレンジアミンで固定化するこ
とは知られている〔子細一部純；固定化酵素、＠講談社
（１９７５）　〕。酵素又は微生物菌体をカラギーナン
で固定した後、グルタルアルデヒドとへキサメチレンジ
アミンで処理することは知られている〔福井、子細、鈴
木編；酵素工学、東京化学同人（１９８１）　）。

発明が解決しようとする問題点長期間繰り返して使用できる固定化菌体の開発が求めら
れている。

問題点を解決するための手段本発明方法によると、菌体をジアミンとジアルデヒドと
で処理した後、該処理物を高分子物質で固定化すること
により、長期間繰り返し使用に耐える固定化菌体を得る
ことができる。

本発明に用いられるジアミンとしては、アミノ基を二個
有する分子量２００以下の化合物、例えば、エチレンジ
アミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミ
ン、ペンタメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン
、トリエチレンテトラミン、１．７−ジアミノへブタン
、１．８−ジアミノオクタン、１．１０−ジアミノデカ
ン等があげられる。

ジアルデヒドとしては、炭素数１０以下の脂肪族又は芳
香族アルデヒド、例えばグリオキサール、マロンアルデ
ヒド、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒド、アジ
ピンアルデヒド、ピメリンアルデヒド、スペリンアルデ
ヒド、アジピンアルデヒド、セバシンアルデヒド、マレ
インアルデヒド、フマルアルデヒド、フタルアルデヒド
、イソフタルアルデヒド、テレフタルアルデヒド等があ
げられる。

高分子物質としては、ポリビニルアルコールケル、ポリ
アクリルアミドゲル、カラギーナン、アルギン酸ナトリ
ウム等があげられる。

本発明に用いられる菌体としては、細菌、放線菌、糸状
菌、酵母、カビ、藻類等の菌体があげられる。本発明方
法は特に、菌体からの酵素漏出が著しいものに有効であ
る。具体的にはザルモネラ属、シトロバクタ−属等に属
する微生物の菌体があげられる。該微生物の代表例とし
ては、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１９５Ｂ５　
及ヒシトロバククー・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃ
ｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉ）八ＴＣＣ６７５０があげられ
る。

本発明において、微生物菌体をジアミンとジアルデヒド
とで処理するには、微生物の培養液にジアミンとジアル
デヒドを添加するか、培養液から微生物菌体を分離した
後、該菌体をジアミンとジアルデヒドとを含む溶液に懸
濁してもよい。使用するジアミンとジアルデヒドとの重
量は共に微生物菌体の乾燥重量の１／１００〜５倍、好
ましくは１／１（）〜１ノ２倍の範囲である。微生物菌
体を処理する液中のジアミン及びジアルデヒドの濃度は
共に０．１〜５％、好ましくは１〜３％の範囲である。

処理は温度１〜４０℃、好ましくは４〜２５℃、０．５
〜３時間、好ましくは１〜２時間、ｐＨ５〜８、好まし
くは６〜７で行う。

上記の如くして、菌体処理物を得る。

前記菌体処理物を高分子物質で固定化する場合には、例
えば、次の様に行う。

ポリビニルアルコールを用いる場合には、菌体処理物を
ポリビニルアルコール水溶液に加え混合した後、凍結し
、融解する。

ポリアクリルアミドゲルを用いる場合には、アクリルア
ミドと架橋剤（例えばＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリル
アミド）を溶解した緩衝液に菌体処理物を懸濁させ、重
合促進剤（例えば、β−ジメチルアミノプロピオニトリ
ル）及び重合開始剤（例えば、過硫酸カリウム）を加え
て重合する。

カラギーナン及びアルギン酸ナトリウムを用いる場合に
は、菌体処理物をカラギーナン又はアルギン酸ナトリウ
ム水溶液に加え混合した後、該混合液を塩化カリウム（
アルギン酸ナトリウトの場合は塩化カルシウム）水溶液
に滴下する。

反応液から固定化菌体を分離する方法としては、遠心分
離方法、濾過方法等がある。

以下実施例を示す。

実施例１グルコース５％、コーンスチーｊ　ＩＪ　カー　２％、
硫酸アンモニウム１％、リン酸−カリウム０．０５％、
リン酸二カリウム０．０５％及び硫酸マグネシウム・７
水和物０．０２５％からなる培地（ｐＨ？　）にサルモ
ネラ・チフィムリウム＾ＴＣＣ１９５８５を培養して得
られた湿菌体５０ｇ（乾燥重量１２ｇ＞をアジピンアル
デヒド２％及びトリエチレンテトラミン２％を含む０．
２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）　１５０ｍｆ！に懸濁し、
４℃で３時間放置した。ついで、該懸濁液から菌体を遠
心分離した後、該菌体を生理食塩水１５０ｎ＋ｊ！で２
回洗浄した。該洗浄した菌体をゴー七ノールＮＨ−２６
［ポリビニルアルコール、日本合成工業■製〕の２０％
水溶液５０ｇと混合し、−２０℃で１８時間放置した後
、解凍して３〜４ｍｍ角に細断して固定化菌体を得た。

該固定化菌体をフェニルピルビン酸０．２Ｍ、アスパラ
ギン酸ナトリウム０．２４　Ｍ及びリン酸ピリドキサー
ル０．０１ｍＭからなる基質液（１）Ｈ７）１００ｍ！
に懸濁させ、３５℃で２４時間反応させフェニルアラニ
ン２．９ｇを得た。反応後、固定化菌体を金網により回
収し、回収した固定化菌体を新しい基質液に懸濁させて
２回目の反応を行った。このようにして繰り返し反応を
行ったところ、反応１５５回目おけるフェニルアラニン
の生成量は２．３ｇであった。

一方、対照１として、前記操作と同様に培養したサルモ
ネラ・チフィムリウムＡＴＣＣ１９５８５の菌体をアジ
ピンアルデヒド及びトリエチレンテトラミンで前処理す
ることなく、ゴーセノールＮ１−１−２６で固定化して
、該固定化菌体をフェニルアラニンの生成反応に用いる
以外は前記と同様な操作により、フェニルアラニンを１
１）だ。その結果として、反応１回目及び１５回目にお
けるフェニルアラニンの生成量はそれぞれ２．９　ｇ及
び０．　］　ｇであった。

対照２として、前記操作と同様に培養したザルモネラ・
チフィムリウムへＴＣＣ１９５８５の菌体をゴーセノー
ルＮＨ−２６の２０％水溶液５０ｇと混合し、−２０℃
で１８時間放置した後、解凍して３〜４＋＋ｕｎ角に細
断した固定化菌体を得た。該固定化菌体をヘキサメチレ
ンジアミン２％及びグルタルアルデヒド２％を含む０．
２　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐ＋＋　７　）３００ｍｌに
懸濁させ、４℃で３時間放置した。

固定化菌体を回収し、回収した固定化菌体を生理食塩水
３００ｍ１で２回洗浄した。洗浄した固定化菌体をフェ
ニルアラニンの生成反応に用い、前記と同様な操作によ
りフェニルアラニンを得た。

その結果として、１回目及び１５回目におけるフェニル
アラニンの生成量はそれぞれ２．９ｇ及び１．７ｇであ
った。

実施例２及び３実施例１において、第１表に示すジアミン及びジアルデ
ヒドを用いる以外は実施例１と同様にして第１表に示す
結果を得た。

第　　　　１　　　　表実施例４シトロバククー・フロインディＡＴＣＣ６７５０を実施
例１と同組成の培地に培養して得られた湿菌体５０ｇ（
乾燥重量１２ｇ）を２％へキサメチレンジアミン水溶液
（塩酸でｐＨ７に調整したもの）１５０ｍｌに懸濁し、
２５℃で攪拌しながら、２５％グルクルアルデヒド水溶
液１２ｍβを１５分間で滴下した。滴下中、液のｐＨは
５％アンモニア水で６〜７に維持した。さらに、３０分
間攪拌を続けた後、懸濁液から菌体を遠心分離し、該菌
体を生理食塩水２００ｍ１で２回洗浄した。該洗浄した
菌体をソアギーナＭＶ−１０ｒ［カラギーナン。

三菱アセテート■製〕の３％水溶液５０ｇに懸濁させ、
該懸濁液を５％塩化カリウム水溶液に滴下して、約５ｍ
ｍ径の球状固定化菌体を得た。該固定化菌体をフェニル
ピルビン酸す−トリウム０．２Ｍ。

フマル酸ニアンモニウム０．３Ｍ、　リン酸ピリドキサ
ール０．０１ｍＭ、亜硫酸すトリウム・７水和物０．０
５％及び塩化マグネシウム０．００５％からなる基質液
（ｐＨ７）　５０　＋ｎｊ！に懸濁させ、３０℃で２４
時間反応させフェニルアラニン１．５ｇを得た。

反応後、固定化菌体を金網により回収し、回収した固定
化菌体を新しい基質液に懸濁させて２回目の反応を行っ
た。この様にして繰り返し反応を行ったところ、反応６
０回目におけるフェニルアラニンの生成量は１．５ｇで
あった。

一方、対照１として、前記操作において、ヘキサメチレ
ンジアミン及びグルタルアルデヒドの代わりにヘキサメ
チレンジアミンを用いる以外は前記と同様にしてフェニ
ルアラニンの生成を行った。

その結果、１回目及び１０回目のフェニルアラニンの生
成量はそれぞれ１．５ｇ及び０．１ｇであった。

対照２として、前記操作において、ヘキサメチレンジア
ミン及びグルクルアルデヒドを用いない以外は前記と同
様にしてフェニルアラニンの生成を行った。その結果、
１回目及び２０回目のフェニルアラニンの生成量はそれ
ぞれ１．５ｇ及び０．２ｇであった。

発明の効果本発明方法により、長期間繰り返し使用できる固定化菌
体を得ることができる。

特許出願人　　（１０２）協和醗酵工業株式会社代表者
　加　藤　幹　夫ｒｅ

Claims

【特許請求の範囲】

菌体をジアミンとジアルデヒドとで処理した後、該処理
物を高分子物質で固定化することを特徴とする固定化菌
体の製法。