JPS62130696A - 固定化菌体によるコンドロイチン硫酸分解物の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、固定化菌体を使用してコンドロイチン硫酸を
酵素的に分解し、その分解生成物を製造する方法に関す
る。

〔従来の技術〕

コンドロイチン硫酸は硫酸化ムコ多糖の一種で、Ｄ−グ
ルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンとの縮合体で
ある三糖を繰返し単位とするポリマーである。その性状
の差により、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫
酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ等に分類されている。コン
ドロイチン硫酸は、通常、動物の生体内で生合成され、
タンパク質と共有結合を形成し、軟骨Ｍｉ織のばか血管
壁や股などの結合組織に含まれ、重要な機能をもってい
る。

コンドロイチン硫酸は分子内に多量の硫酸残基をもって
いるので、界面活性作用を示す。この性質を利用して、
コンドロイチン硫酸の中途分解生成物が注射剤や点眼剤
等に広く使用されている。

従来、コンドロイチン硫酸中途分解生成物を調製する場
合には、各種細菌の菌体や培養液から精製したコンドロ
イチン硫酸や、コラ丸抽出液から精製したヒアルロニダ
ーゼ等のコンドロイチン硫酸分解酵素精製物が使用され
ていた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、従来の製法においては、菌体や培養液ま
たは抽出液等からの酵素精製が煩雑で、費用がかかるこ
と、精製酵素は一般に不安定で取扱いが不便なこと、更
には、精製酵素によるコンドロイチン硫酸の分解反応を
回分法で実施するので酵素の再使用ができず不経済であ
ること等の欠点があった。

本発明の目的は、前記の欠点を解消した、コンドロイチ
ン硫酸分解生成物の新規な製法を提供することにある。

ｃ問題点を解決するだめの手段〕 前記の目的は、コンドロイチン硫酸分解酵素含有微生物
の固定化菌体とコンドロイチン硫酸とを接触させ、生成
するコンドロイチン硫酸分解物を分離することからなる
方法によって達成することができる。

本明細書において「コンドロイチン硫酸」とは、グルク
ロン酸とＮ−アセチルガラクトサミン４または６硫酸と
がβ−１，３結合したものを構成単位とするポリマーで
あり、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ（
デルマタン硫酸）、コンドロイチン硫酸Ｃ１更にはコン
ドロイチンポリ硫酸すなわちコンドロイチン硫＃Ｄ、Ｅ
およびＫが含まれる。

本発明において、コンドロイチン硫酸分解酵素含有微生
物は公知のものを使用する。その微生物としては、例え
ば、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の細菌例えばプロ
テウス・ブルガリス（Ｐ、　ｖｕｌｇａｒｉｓ）または
プロテウス・ミラビリス（Ｐ、ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ）、
フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）の細菌例えばフラボバクテリウム・ヘパリヌム（Ｆ、
ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃＯｕｓ）の細菌例えばスタフィロコッカ
ス・オーレウス（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ）、バクテロイデ
ス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の細菌例えばバクテロ
イデス・セタイオタオニクロン（Ｂ、　ｔｈｅｔａｉ。

ｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄ
ｍｏｎａｓ）の細菌例えばシュードモナス・フルオレセ
ンス（Ｐ、ｆｌｕ−ｏｒｅｓｃｅｎｓ）　、エアロモナ
ス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）の細菌が含まれる。好まし
い細菌はプロテウス・ブルガリスまたはフラボバクテリ
ウｌトヘパリヌムであり、特にはプロテウス・ブルガリ
スが好ましい。

固定化する前に前記微生物を増殖させる場合には、栄養
培地を使用する。プロテウス・ブルガリスの場合には、
例えば、グリコース０．１〜１％好ましくは０．２〜０
．５％、酵母エキス０．１〜４％好ましくは１〜２％、
ペプトン０．５〜４％好ましくは１〜２％および食塩０
．２〜１％好ましくは０．５〜１％を含有する培養液を
使用する。前記の栄養培地の組成は、使用する微生物の
種類に応して変化させることができる。前記の栄養培地
のｐＨを６〜８好ましくは６．５〜７．５に調製し、微
生物を接種して、２０〜４０℃好ましくは約３０℃で１
０〜２４時間特には１２〜１６時間振盪培養し、得られ
る培養液を遠心分離して菌体を集める。

こうして得られる菌体を、後述する方法で固定化して本
発明方法における酵素反応に直接使用することもできる
が、栄養培地で生育させただけの菌体がもつコンドロイ
チン硫酸分解活性は一般に低いので、前記の菌体をコン
ドロイチン硫酸の存在Ｆで更に培養して、前記の酵素活
性を高めることが好ましい。この目的のために使用する
培地を、以下「誘導培地」と称する。誘導培地は、基本
的にはコンドロイチン硫酸および適当な窒素源等を含ん
でいる。誘導培地の組成としては、例えば、第一リン酸
カリウム０．１〜２％好ましくは約０．７％、第ニリン
酸カリウム０．１〜１％好ましくは約０．３％、硫酸ア
ンモニウム０．０５〜１％好ましくは約０．　］％、硫
酸マグネシウム０．００５〜０．５％好ましくは約０．
０１％、ペプトン０．０１〜１．０％好ましくは約０．
　］％、ニコチン酸０．００１〜１％好ましくは約０．
００１％およびコンドロイチン硫酸０，０５〜２％好ま
しくは約０．３％からなり、ｐ　Ｈ約７．０〜８．０に
調整したものが好適である。前記の栄養培地で生育させ
て収集した菌体１〜２０ｇ特には５〜ｌｏｇ（湿重量）
を前記の誘導培地１００ｍｆｆ中に懸濁させる。この菌
体懸濁液を２０〜３７℃特には約３０℃で１〜２４時間
特には約１２時間振盪処理し、遠心分離によって目的の
菌体を得る。

栄養培地で生育させた菌体、または更に誘導培地で処理
した菌体を、適当な緩衝液例えば１〜リス塩酸緩衝液に
懸濁させ、適当な物理化学的処理例えば音波処理または
ｌ・ルエン処理によって菌体を破壊し、この物理化学的
処理菌体をコンドロイチン硫酸と接触させても、コンド
ロイチン硫酸分解生成物を得ることができる。この方法
は、従来の精製酵素を使用する方法よりは煩雑でなく、
目的とする分解生成物の収量も高いが、回分法でしか利
用できず、前記処理菌体の回収再使用も実質的に不可能
である。

本発明では、前記の菌体を固定化する。

本発明においては、固定化用の担体として、ポリアクリ
ルアミドゲル、光硬化樹脂、アルギン酸カルシウム、カ
ラギーナンまたは寒天を使用する。

好ましい担体はカラギーナンである。

本発明においては、前記の担体を使用し、それ自体公知
の方法で菌体を固定化する。例えばカラギーナンを担体
として使用する場合には以下の方法で固定化する。栄養
培地で生育させた菌体、または好ましくは誘導培地で処
理した菌体を、１〜１．２ｇ／ｍＡ　　（湿重量）の濃
度で０．８〜０．９％生理食塩水に懸濁し、４０〜５０
℃に加温する。一方、０．８〜０．９％生理食塩水にカ
ラギーナンを溶かして０．８〜０，９％溶液を調整し、
４０〜５０℃に加温してから前記の菌体懸濁液中に約１
＝１の容量比で手早く加えて均一な懸濁液とする。この
混合懸濁液を前記の温度に維持しながら注射器で吸い取
り、２０〜２５℃の２％ＭＣｌ１０．３５Ｍ　ＫＰＲ（
ｐｌ＋７．０）溶液中に滴下すると、直径２〜３１嘗の
ビーズ形ゲル状固定化菌体を得ることができる。あるい
は、前記の混合懸濁液を適当な容器に入れ、氷水浴で冷
却して、２％ＭＣｌ１０．３５Ｍ　ＫＰＢ　（ｐＨ７，
０）溶液中でゲル化させることにより、例えば１辺１〜
２鶴の立方体形のゲル状固定化菌体を得ることができる
。

次にゲル格子からコンドロイチン硫酸分解酵素が漏出す
るのを防止するために、前記のゲル状固定化菌体を硬化
処理する。８ｍＭへギサメチレンジアミンおよび２％Ｍ
ＣＩを含むリン酸塩緩衝液（ｐＨ約７）に、前記のゲル
状固定化菌体を０．１〜０．５ｇ　／　ｍ　ｎの濃度で
懸濁し、静かに攪拌しなから０〜３０℃で５〜２０分間
処理する。続いて、アルデヒド化合物例えばシアルｒｔ
トスクーチおよび２５〜３０％グルタルアルデヒド水溶
液を少量（前記懸濁液に対して１／２５〜１／３０容）
加えて更に０．５〜２時間攪拌を続ける。こうして硬化
固定化菌体を得ることができる。

前記の硬化固定化菌体の格子内に包括されている菌体は
破壊されていないので、コンドロイチン硫酸との接触が
必ずしも充分ではない。そこで格子内の菌体を物理化学
的手段で破壊し、固定化菌体の分解活性を高めることが
好ましい。菌体の破壊は、例えば、トルエン１〜２０容
量％好ましくは８〜１０容量％とコンドロイチン硫酸０
．１〜１％好ましくは約０．５％とを含有するリン酸塩
緩衝液に、前記の固定化菌体を０．１〜０．５　ｇ　／
、ｍ　７！の濃度で懸濁し、約Ｏ℃において０．５〜３
時間好ましくは３０分間激しく攪拌することによって実
施する。あるいは、トルエン処理を行うことな（、自己
溶菌を利用して温和に溶菌させる方法もある。

こうして得られた固定化菌体は、コンドロイチン硫酸０
．３〜０．５％を含むトリス塩酸緩衝液で充分に洗浄し
てから、再び同じ緩衝液に浸漬し、約４℃で保存する。

こうして、コンドロイチン硫酸分解活性の非常に高い固
定化菌体が得られる。

本発明方法において、前記の固定化菌体と接触させるコ
ンドロイチン硫酸は、精製されたものである必要はなく
、部分精製物でもよい。

本発明による固定化菌体とコンドロイチン硫酸との接触
は、回分法または連続法のいずれでも行うことができる
。回分法においては、例えば、リン酸塩緩衝液（ｐＨ６
〜９、好ましくは約８）中に、固定化菌体５ｇ（固定化
処理前の湿菌体換算）に対して０．１〜３％コンドロイ
チン硫酸１０．１ＭＫＰＢ５ｒｒ＋Ｉｌの割合で両者を
懸濁させ、２０〜４０℃好ましくは３０〜３５℃で浸盪
する。その際、マグネシウムイオン存在下で両者を接触
させると酵素活性が向上し、一般には例えば塩化マグネ
シウム５０ｍＭを存在させることが好ましい。あるいは
、固定化菌体をカラムに充填し、コンドロイチン硫酸０
６１〜３％好ましくは０．５〜１％を含むリン酸塩緩衝
液（ｐ　Ｈ６〜９、好ましくは約８）を２０〜４０℃好
ましくは約３５℃で、空間速度（Ｓ、Ｖ、）　０．１〜
２　（時間）−１好ましくは空間速度約０．５（時間）
′で連続的に導通流下させることにより、コンドロイチ
ン硫酸分解生成物を得ることができる。

本発明方法によって得られるコンドロイチン硫酸分解生
成物は、各種の硫酸化オリゴ糖、硫酸化三糖、およびそ
れらの混合物である。

コンドロイチン硫酸分解生成物は、反応終了液またはカ
ラム流出液を分子ふるい例えばセファデックスＧ−５０
に導通ずることによって未反応のコンドロイチン硫酸等
と容易に分離することができる。回分法で使用した固定
化菌体は分離後再回収して再使用することができる。

〔実施例〕

以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれらの実施例によって限定されるものではな
い。

例　　１ プロテウス・ブルガリスＮＣＴＣ４６３６を栄養培地（
グルコース０．１％、食塩０．５％、酵母エキス０．５
％およびペプトン１％含有：　ｐ　Ｈ７，２）　１００
１００Ｏ中で３０℃において２０時間振盪培養した。

菌体を遠心分離によって集め、０．８５％冷生理食塩水
で洗浄し、得られた湿菌体５ｇを誘導培地（第ニリン酸
カリウム０．７％、第一リン酸カリウム０．３％、硫酸
アンモニウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０１％、
ペプトン０．１％、ニコチン酸０．１％およびコンドロ
イチン硫酸０．３％含有）　ｌ０００ｍ＃中に移し、３
０℃で１２時間振盪培養した。遠心分離によって集めた
湿菌体の一部分（１ｇ）を１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，０）２ｍ７！中に懸濁し、９０ＫＨ２で０℃で
５分間音波処理して菌体破砕物を得た。また、前記の誘
導処理後の湿菌体の他の一部分（０，５ｇ）を１０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）０．５ｍ＃に懸濁し、
これにトルエンＱ、１ｍｊ２を加え、３０℃で１０分間
激しく攪拌してトルエン処理菌体を得た。前記の音（Ｉ
３） 液処理菌体、トルエン処理菌体および無処理のプロテウ
ス・ブルガリスＮＣＴＣ４６３６生菌体（対照用）を、
各々、コンドロイチン硫酸３％含有の０．１　Ｍリン酸
カルシウム緩衝液１ｍｐ中で３７℃において１時間反応
させた。得られた三糖の量を以下の表１に示す。

例２ プロテウス・ブルガリスＮＣＴＣ４６３６を例１と同じ
栄養培地で例１と同じ条件下で生育させ、得られた菌体
５ｇを更に例１と同じ誘導培地に移し、３０℃で１２時
間振盪した。遠心分離して集めた湿菌体５ｇを０．８５
％生理食塩水１０ｍ４に懸濁し、４０℃に加温した。一
方、０．８５％生理食塩水中のに一カラギーナン３．１
％溶液１０ｍｌ１を調製して４０゛Ｃに加温してから前
記の菌体懸濁液中に手早く加えて均一な懸濁液とした。

この混合懸濁液を４０℃に維持したまま注射器で吸い取
り、２２℃の２％塩化カリウム水溶液中に滴下し、直径
２〜３ｍｍのビーズ形ゲル状固定化菌体を得た。

次に、塩化カリウム２％およびヘキサメチレンジアミン
８０ｍＭを含む０．３５Ｍリン酸カルシウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）６００ｍＩｌに、前記のゲル状固定化菌体２
０ｇを懸濁し、静かに攪拌しながら２５℃で１０分間処
理した。続いて２５％グルクルアルデヒド水溶液２５ｍ
６を加えて更に１時間攪拌を続けて硬化させた。トルエ
ン９容量％とコンドロイチン０．５％とを含有する０、
３５Ｍリン酸カルシウム緩衝液６００ｍｊ！に前記の硬
化固定化菌体２０ｇを懸濁し、０℃で２０分間激しく攪
拌した。

こうして得られた固定化菌体０．５　ｇを、コンドロイ
チン硫酸３％含有の０．１　Ｍリン酸カリウム緩衝液２
．５ｒｒ＋７７に懸濁し、３７°Ｃで反応させた。結果
を以下の表２に示す。

表２ 前記例２で得た固定化菌体０．５ｇを、コンドロイチン
硫酸５％と種々の濃度の塩化マグネシウムとを含む０．
１　Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０＞２．５ｍ７
！中に懸濁し、３７℃で１０分間反応させたところ、以
下の表３に示すとおりの結果が得られた。

ば下余日 表３ 例４ プロテウス・ブルガリスＮＣＴＣ４６３６の代わりに以
下の表４に記載の細菌を使用すること以外は、前記例２
に記載の方法によって固定化菌体を調製し、その固定化
菌体を例２と同じ条件でコンドロイチン硫酸と１時間反
応させた。結果を以下の表４に°　　示す。

以下余白 表４ 例５ 前記例２で得た固定化菌体］Ｏｍβをカラムに充填し、
コンドロイチン硫酸１％と塩化マグネシウム５０ｍＭと
を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）を
３５℃で種々の空間速度で連続的に導通した。結果を以
下の表５に示す。

表５ 〔発明の効果〕 本発明による固定化菌体は、前記のとおり、高いコンド
ロイチン硫酸分解酵素活性を示す。これは、基質である
コンドロイチン硫酸が分子量の大きな高分子物質である
にもかかわらず、本発明の固定化菌体の格子を通過する
ことによるものであり、予想外のことである。

本発明によれば、煩雑な酵素精製工程が不要となり、固
定化菌体は安定で取扱い」二便利であり、回収して再使
用が可能であり、更に、連続法に使用できる等の利点を
もつ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、コンドロイチン硫酸分解酵素含有微生物の固定化菌
   体とコンドロイチン硫酸とを接触させ、生成するコンド
   ロイチン硫酸分解物を分離することを特徴とする、コン
   ドロイチン硫酸分解物の製法。 ２、前記のコンドロイチン硫酸分解物が、各種オリゴ糖
   の混合物であるかまたは二糖である特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ３、前記のコンドロイチン硫酸分解酵素含有微生物が、
   プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、フラボバクテリウム
   属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スタフィロコッ
   カス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、バクテロイ
   デス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、シュードモナス属
   （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、またはエアロモナス属（
   Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）の細菌である特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ４、前記の固定化菌体の固定化用担体が、ポリアクリル
   アミドゲル、光硬化樹脂、アルギン酸カルシウム、カラ
   ギーナンまたは寒天である特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ５、前記のコンドロイチン硫酸分解酵素含有微生物が、
   栄養培地で生育した菌体であるか、または栄養培地で生
   育した菌体をコンドロイチン硫酸存在下で再培養した菌
   体である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、前記の固定化菌体とコンドロイチン硫酸とをマグネ
   シウムイオン存在下で接触させる特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ７、前記の固定化菌体をカラムに充填し、コンドロイチ
   ン硫酸と連続的に接触させる特許請求の範囲第１項記載
   の方法。