JPH04158799A - Ｄ―３―ヒドロキシ酪酸またはアセト酢酸の高感度定量法および定量用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ産業上の利用分野〕 本発明は、臨床生化学検査、食品検査等におけるＤ−３
−ヒドロキシ酪酸またはアセト酢酸の酵素サイクリング
反応を用いた新規な高感度定量法および定量用組成物に
関する。

〔従来の技術〕

Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸、アセト酢酸は、臨床検査分野
においてケトン体の各成分として測定され、代謝不全の
指標として重要である。ケトン体には、上記２つの他に
アセトンも含まれるが、アセトンは気化しやすく不安定
であり、又、血中Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸、アセト酢酸
に比し低値であるため、臨床上は、Ｄ−３−ヒドロキシ
醋酸、アセトＦＦ９を測定すれば十分とされている。

従来の測定法としては、例えばアセト酢酸をジアゾニウ
ム塩と化学的に反応させてヒドラヅ化合物またはアブ化
合物として吸光度を測定するジアゾニウム法、およびア
セト酢酸、アセトンを測定するためにアセト酢酸、アセ
トンにニトロプルシフト試薬を化学反応せしめ呈色体と
なすニトロプルジッド法等の化学法、およびケトン体を
アセトンに変換してガスクロマトグラフィーで検出する
ガスクロマトグラフィー法、および酵素法等がある。

ジアゾニウム法は感度が高いが、除蛋白が必要であり、
Ｄ−３−ヒドロキン酪酸を測定するには予めＤ−３−ヒ
ドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼにより、Ｄ−３−ヒドロ
キシ酪酸をアセト酢酸に変換せしめてから求めた値（Ｄ
−３−ヒドロキシ酪酸とアセト酢酸の合計）からアセト
酢酸の値を差し引いて求めることになる。しかしながら
、−Ｃに化学的測定法は特異性が低いので、他の夾雑物
の影響を受けやすく例えばジアゾニウム法においては、
オギザロ酢酸の影響を受は易いものであった（Ｃｌｉｎ
ｉｃａＣｈｉｍｉｃａ　　Ａｃｔａ、１３４．３２７　
３３６（１，９８３））。また、ニトロプルジッド法は
、ジアゾニウム法と同様にＤ−３〜ヒドロキン酪酸を検
出することができず、感度も低い（検出感度５００〜１
０００μＭ）（日本臨床４７巻、１９８９年増刊号、９
．４８４）。

更にまた、ガスクロマトグラフィー法は、操作が煩雑で
、臨床検査等多検体を取り扱う分野には適さない。

又、酵素法は、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸デヒロゲナーゼ
（ＥＣ１，１，１，３０）を用いるものであり、アセト
酢酸を測定する場合には該酵素の逆反応、すなわちアセ
ト酢酸と還元型ＮＡＤよりＤ−３−ヒドロキシ醋酸とＮ
ＡＤとなす反応において消費される還元型ＮＡＤの減少
量を、又、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸を測定する場合には
咳酵素反応の正反応、すなわちＤ−３−ヒドロキシ酪酸
とＮＡＤよリアセト酢酸と還元型ＮＡＤとなす反応にお
いて増加する還元型ＮＡＤの増加量をそれぞれ経時的に
測定するウィリアムソン（Ｗｉ　］　１　ｉ　ａｍｓ　
ｏ　ｎ）法〔Ｍｅｔｈｏｄ　　ｏｒ　　Ｅｎｚｙｍａｔ
ｉｃ　　Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒ
ｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１８３６　１８４３　　（１
９７４））およびその変法がある。またその他の酵素法
として、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの存
在下、１）−３−ヒドロキシ酪酸を測定するため、Ｄ−
３−ヒドロキシ酪酸とＮＡＤよりアセト酢酸と還元型Ｎ
ＡＤとを生成せしめ、生した還元型ＮＡＤの増加量に比
例してテトラヅリム塩をホルマザン色素として試験紙上
で検出するペーパーストリップテスト（Ｄｉａｂｅｔｅ
ｓ　　Ｃａｒｅ、７，４８１　　（１９８４））もある
。

これらの酵素法においでは、ケトン体として重要なり−
３−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸を片一方しか測定
できないばかりか、高感度測定もできない。また、アセ
ト酢酸を酵素的に測定するその他の方法として、アセト
アセチル−ＣｏＡシンセターゼ（ＥＣ６，２，１，１６
）および３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ２，
３，１，１６）を用いてアセト酢酸をアセチル−ＣｏＡ
に転換し、次いでアリルアミンアセチラーゼ（ＥＣ２，
３゜１．５）の作用によりアニリンをアセチル化し、そ
れに伴う４０５ｎｍの吸光度の減少から求める測定法も
報告されている（Ａｃｔａ　　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｈｕｎｇ、７゜１４３
（１９７２））が、工程が複雑であり、また高感度測定
でもないことから、普及するに至っていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

前述の如くＤ−３−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸の
酵素を用いた測定について種々の方法が試みられている
が、これらはいずれも高感度測定とは言えないばかりか
、臨床検査値として重要なケトン体のｔＳｔについての
直接の測定ができないものであった。

ケトン体の正常値は、血清または血しようでアセト酢酸
は４１±１．４　（平均力ＳＥ、ｐｍｏｌ／ｌ）、Ｄ−
３−ヒドロキシ酪酸は３４±２．１、また総ケトン体と
して７４±２．４と少量であり　（日本臨床４７巻、１
９８９年増刊号、ｐ、４８２）、高感度の測定方法が望
まれている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記の問題点につき鋭意検討した結果、
Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸またはアセト酢酸の定量におい
てＮＡＤのアナログである還元型チオＮＡＤと還元型Ｎ
ＡＤの極大吸収波長がそれぞれ４０Ｑｎｍ付近、３４Ｏ
ｎｍ付近と異なっていることを利用し、チオＮＡＤ類お
よびチオＮＡＤＰＲからなる群より選ばれた１つとＮＡ
Ｄ類およびＮＡＤＰ類からなる群より選ばれた１つの補
酵素に作用するＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナー
ゼを用いることにより、吸光度の測定に際し、他物質の
吸収波長の混雑が回避できる酵素的サイクリング反応が
実施でき、高感度な測定が可能であることをｌｊＵし、
本発明を完成するに至った。

本発明は、上記のような知見に基いて完成されたもので
あって、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸から
なる群より選ばれた１つまたはそれ以上のケトン体を含
有する被検液に、 ■チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェ
ート類（以下、チオＮＡＤＰＭという）およびチオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、チオＮＡ
Ｄ類という）からなる群より選ばれた１つと、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類（以下、
ＮＡ　Ｄ　Ｐ類という）およびニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド類（以下、Ｎ、ａ、ＤｔＪという）から
なる群より選ばれた１つとを補酵素とし、少な（ともＤ
−３−ヒドロキシ酪酸を基質としてアセト酢酸を生成す
る可逆反応をなすＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナ
ーゼ、■Ａ＋　、 ■Ｂ、、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式ＡＩＤ−３
−ヒドロキシ酪Ａ２ Ｂｚ　　　　　　　　　　　　Ｂ。

（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ、がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤｉを示し、Ｂ２はＢ、
の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング反応を
形成せしめ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の
量を決定することを特徴とするＤ−３−ヒドロキシ酪酸
およびアセト酢酸からなる群より選ばれた１つまたはそ
れ以上のケトン体の高感度定量法を提供するものである
。

また、本発明はＤ−３−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢
酸からなる群より選ばれた１つまたはそれ以上のケトン
体を含有する被験液に、 ■チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より選
ばれた１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤｌｆｉからなる
群より選ばれた１つとを補酵素とし、少なくともＤ−３
−ヒドロキシ酪酸を基質としてアセト酪酸を生成する可
逆反応をなすＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ
、 ■Ａ９、 ■Ｂ＋　または／およびＢ２、 ■Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸に作用せず、Ｂ２から８１へ
の反応を形成する第二のデヒドロゲナーゼおよび該第二
のデヒドロゲナーゼの基質、を含有する試薬を作用せし
めて、次の反応式 ＡＩＤ３−ヒドロキシ酸Ａｔ （式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ、の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ、がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ、がＮＡＤＰ類またはＮ　Ａ、　Ｄ類のときは還元型
チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２
はＢ、の酸化型生成物を示し、Ｂ２からＢ、への反応は
Ｂ２を補酵素として第二のデヒドロゲナーゼにてＢ１を
生成する酵素反応を示す）で表されるサイクリング反応
を形成せしめ、該反応によって変化するＡ２の量を決定
することを特徴とするＤ−３−ヒドロキシ酪酸およびア
セト酢酸からなる群より選ばれた１つまたはそれ以上の
ケトン体の高感度定量法を提供するものである。

更に本発明はＤ−３−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸
からなる群より選ばれた１つまたはそれ以上のケトン体
を含有する被験液に、 ■チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より選
ばれた１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれた１つとを補酵素とし、少なくともＤ−３−ヒ
ドロキシ酪酸を基質としてアセト酢酸を生成する可逆反
応をなすＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、 ■Ａ、または／およびＡ２、 ■Ｂ１・ ■Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸に作用せず、Ａ２からＡ１へ
の反応を形成する第三のデヒドロゲナーゼおよび該第三
のデヒドロゲナーゼの基質、を含有する試薬を作用せし
めて、次の反応式 Ａ、Ｄ−３−ヒドロキシ酸Ａ２ Ｂｚ　　　　　　　　　　　　Ｂ＋ （式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ、の還元型生成物
を示し、Ｂ、はＡ、がチオＮＡＤＰＩまたはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ’類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ
、の酸化型生成物を示し、Ａ２からＡ、への反応はＡｔ
を補酵素として第三のデヒドロゲナーゼにてＡ１を生成
する酵素反応を示す）で表されるサイクリング反応を形
成せしめ、該反応によって変化するＢ１０量を決定する
ことを特徴とするＤ−３−ヒドロキシ酪酸およびアセト
酢酸より選ばれた１つまたはそれ以上のケトン体の高感
度定量法を提供するものである。

更にまた本発明は、次の成分■〜■ ■チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤＩＱからなる群より
選ばれた１つと、ＮＡｐｐｌおよびＮＡＤ類からなる群
より選ばれた１つとを補酵素とし、少なくともＤ−３−
ヒドロキシ酪酸を基質としてアセト酢酸を生成する可逆
反応をなすＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒロゲナーゼ、 ■Ａ１、 ■Ｂ５、 （但し、ＡＩはチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ｂ、はＡ１がチオＮＡＤＰ
ｉまたはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または
還元型ＮＡＤ類を、Ａ、がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類の
ときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤｌ
ｉを示す）を含有することを特徴とするＤ−３−ヒドロ
キシ酪酸およびアセト酢酸からなる群より選ばれた１つ
またはそれ以上のケトン体の定量用組成物を提供するも
のである。

更に本発明は、次の成分■〜■ ■チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤｉからなる群より選
ばれた１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれた１つとを補酵素とし、少な（ともＤ−３−ヒ
ドロキシ酪酸を基質としてアセト酢酸を生成する可逆反
応をなすＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、 ■Ａ、、 ■Ｂ、または／およびＢ２、 ■Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸に作用せず、Ｂ２からＢ、へ
の反応を形成する第二のデヒドロゲナーゼおよび該第二
のデヒドロゲナーゼの基質、（但し、Ａ１はチオＮＡＤ
Ｐ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し
、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤＩＩの
ときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、Ａ、
がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤ
Ｐ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１の酸
化型生成物を示す）を含有することを特徴とするＤ−３
−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸からなる群より選ば
れた１つまたはそれ以上のケトン体の定量用組成物を提
供するものである。

さらに本発明は、次の成分■〜■および■■チオＮＡＤ
ＰｉおよびチオＮＡＤ類のいずれか１つと、ＮＡＤＰ類
およびＮ　Ａ、　Ｄ類からなる群より選ばれた１つとを
補酵素とし、少なくともＤ−３−ヒドロキシ酪酸を基質
としてアセト酢酸を生成する可逆反応をなすＤ−３−ヒ
ドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、 ■Ａ、または／およびＡ２、 ■Ｂ１、 ■Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸に作用せず、Ａ２からＡＩへ
の反応を形成する第三のデヒドロゲナーゼおよび該第三
のデヒドロゲナーゼの基質、（但し、Ａ１はチオＮＡＤ
Ｐ類、チオＮＡＤｉ、、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示
し、Ｂ１はＡ、がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類の
ときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、Ａ、
がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤ
Ｐ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還
元型生成物を示す）を含有することを特徴とするＤ−３
−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸からなる群より選ば
れた１つまたはそれ以上のケトン体の定量用組成物を提
供するのである。

本発明において用いられる、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸デ
ヒドロゲナーゼとは、少なくともＤ−３−ヒドロキシ酪
酸＋ＮＡＤ　（Ｐ）　　←→アセト酢酸＋ＮＡＤ　（Ｐ
）Ｈ＋Ｈ”なる反応を触媒するものであって、チオＮＡ
ＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より選ばれた１つ
と、ＮＡＤＰｌｆｉおよびＮＡＤＩからなる群より選ば
れた１つを補酵素とするものなら特に限定されない。

上記酵素の具体例としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
　ｓｐ、由来の酵素（東洋紡社製）、ロドシュードモナ
ス　スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　　５ｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）由来の酵素、ロドスビリ
ルム　ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　　ｒ
ｕｂｒｕｍ）由来の酵素、シュードモナス　レモイゲネ
イ　（Ｐｓ　ｅｕｄ　ｏｍｏｎａ　ｓｌ　ｅｍｏ　ｉ　
ｇｎｅ　ｉ）由来の酵素、動！Ｉｌ！７１（ラット肝ミ
トコンドリア）由来の酵素等があげられる（東洋結社酵
素カタログ３５０・ＨＢＤ　、酵素ハンドブック第１１
〜１２頁、朝倉書店１９８２年；Ｂｊｏｃｈｅｍ、Ｊ、
、１０２，４２３−４３１　　（１９６７）；Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、２３７，６０３−６０７　　（１９６
２）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、’
１４，２２７　２３１　　（１９６９）、このうち、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｓｐ、由来の酵素は特に好ま
しく、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオＮＡＤ。

チオＮＡＤＰをいずれも補酵素とするものである。

本酵素のＮＡＤＰに対する特異性はＮＡＤに比して４．
７４％（東洋結社酵素カタログ、３５０・ＨＢＤ）であ
り、チオＮＡＤに対する特異性はＮＡＤに比して約１０
％程度、チオＮＡＤＰに対する特異性はＮＡＤＰに比し
て約１０％程度であった。他の起源の酵素については主
にＮＡＤ類とチオＮＡＤ類を補酵素とするものが多いが
、適宜の系により使用可能である。

又、Ａ、およびＢ２で示される補酵素はチオＮＡＤＰ類
、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類を示すが、チオ
ＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類としては、例えばチオニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート　（
チオＮＡＤＰ）　、チオニコチンアミドヒボキサンチン
ジヌクレオチドホスフェート、およびチオニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）　、チオニコ
チンアミドヒボキサンチンジヌクレオチドが挙げられ、
又、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類としては、例えばニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤ
Ｐ）　、アセチルビリジンアデニンジヌクレオチオドホ
スフエート（アセチルＮＡＤＰ）　、アセチルピリジン
ヒボキサンチンジヌクレオチドホスフェート、ニコチン
アミドヒボキサンチンジヌクレオチドホスフェート（デ
アミノＮＡＤＰ）；及びニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジヌク
レオチド（アセチルＮＡＤ）　、アセチルピリジンヒボ
キサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒボキサン
チンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）が挙げられる。

本発明のＡ１およびＢ１において例えばＡ、がチオＮＡ
Ｄ　（Ｐ）類である場合Ｂ、はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類である
ことが必要であり、Ｂ、がチオＮＡＤ　（Ｐ）Ｈｌであ
る場合ＡＩはＮＡＤ　（Ｐ）類であることが必要であり
、Ａ、およびＢ１の関係において１つのチオ型補酵素を
使用するものである。

又、定量に用いるＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナ
ーゼがチオＮＡＤ類とＮＡＤ類を補酵素とする場合は、
上述のチオＮＡＤ類とＮＡＤ類より、また、用いるＤ−
３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼがチオＮＡＤ　（
Ｐ）類およびＮＡＤ　（Ｐ）類を共に補酵素とする場合
は、上述のチオＮＡＤ類及びチオＮＡＤＰ類とＮＡＤ類
及びＮＡＤＰ類より適宜選択して用いればよい。

Ａ１およびＢ１の量は、被検体中のＤ−３−ヒドロキシ
酪酸とアセト酢酸の合計量に比較して過剰量であること
、かつＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼのＡ、
およびＢ１それぞれに対するＫｍ値に比較して過剰量で
あることが必要であり、特にＤ−３−ヒドロキシ酪酸と
アセト酢酸の合計量の２０〜］、０．０００倍モルが好
ましい。

本発明のＤ−３−ヒドロキシ酪酸またはアセト酢酸定量
用組成物においては、Ａ１およびＢ、の濃度は０．０２
〜１００ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、Ｄ
−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの量は５〜Ｉ　
ＯＯＯｕ／ｍ！！、特に２０〜４００ｕ／ｍβが好まし
いが、その量は被検体の種類等により適宜決定すること
ができ、これ以上の量を用いることもできる。

また、本発明定量法は、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸デヒド
ロゲナーゼがＮＡＤ類及びＮＡＤＰＩＴを共に補酵素と
する場合において、２つの補酵素にチオＮＡＤ類とＮＡ
Ｄ類もしくはＮＡＤＰ類との組み合わせを選んだときに
は、更に被検体に■成分のＤ−３−ヒドロキシ酪酸に作
用せず、Ｂ　ｔ　−Ｂ　ｌの反応を形成する第二のデヒ
ドロゲナーゼ及び該第二のデヒドロゲナーゼの基質を作
用せしめることにより、後記反応式（ＩＩ）のごとく、
Ｂ、と８２の間に８１の再生のための反応系を付与せし
めることにより当該サイクリング反応を形成せしめ得る
。この場合、第二のデヒドロゲナーゼに関しては、この
測定系において実質的にＡ１に作用し得ない条件を設定
することが好ましく、例えばＡ、を本質的に補酵素とし
て利用しない酵素を選択する組み合わせ、Ａ１とＢ。

の量的関係により第二のデヒロゲナーゼが実質的にＡ、
に作用しない条件を選択する組み合わせ等が例示される
。定量の際には反応により生成したＡ２の量を測定する
。

Ａ、Ｄ−３−ヒドロキシ酸Ａ２ 第二のデヒドロゲナーゼ　　（ＩＴ） （式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ、の還元型生成物
を示し、Ｂ、はＡ＋がチオＮＡＤＰ類またはＮＡＤＰ類
のときは還元型チオＮＡＤ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ、がチオＮＡＤ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオ
ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤＰ類を示し、Ｂ２はＢ１
の酸化型生成物を示し、Ｂ、−Ｂ、はＢ２を補酵素とし
てＢ、を生成する酵素反応を示す） すなわち、第二のデヒドロゲナーゼはＢ、の再生のため
に補助的に添加するものであり、これによってＢ、の使
用量を少なくすることが可能となり、特にＢ、が高価な
場合は有効である。又、Ｂ、の代わりに８２あるいはＢ
、とＢ２の混合物を用いて反応を行ってもよい。この場
合、Ｂ、または／及びＢ２の使用量は特に限定されるも
のではないが、−ａ的にはＡ１の１／１０モル以下が好
ましい。

上記の成分■を用いるＤ−３−ヒドロキシ酪酸およびア
セト酢酸からなる群より選ばれた一つまたはそれ以上の
ケトン体の定量用組成物において、Ａ１の４度は０．０
２〜１００ｍＭ、特にｏ、０５〜２０ｍＭが好ましく、
Ｂ２または／及びＢ、の濃度は０．０５〜５０００ｃｒ
Ｍ、特に５〜５ｏｏμＭが好ましく、Ｄ−３−ヒドロキ
シ酪酸デヒドロゲナーゼ（Ｄａ度ハ５〜］　０００　ｕ
　／　ｍ　ｌ　、特に２０〜４ｏ。

ｕ　／　ｍ　ｌが好ましく、第二のデヒドロゲナーゼは
Ｂ２に対するＫｍ値（ｍＭ単位）の２０倍量（ｕ　／　
ｍ　ｊ！単位）以上になるように＃Ａ製すればよく、例
えば１〜１００ｕ／ｍ１が好ましく、また第二のデヒド
ロゲナーゼの基質は過剰量、例えば０．０５〜２０．ｍ
Ｍが好ましい。これらの量は被検体の種類等により適宜
決定することができ、これ以上の量を用いることもでき
る。

第二のデヒドロゲナーゼ及びその基質としては、例えば
Ｂ２がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のときは、アルコー
ルデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１゜１）とエタノー
ル、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，
６）（Ｅ、Ｃｏ１１由来）とグリセロール、グリセロー
ル−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，８
）（ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロール−３−リン酸
、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，３７）
　　（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とＬ−リンゴ酸、グリ
セロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，
１，１２）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、Ｅ、Ｃｏ１１由
来）とＤ−グリセロアルデヒドリン酸とリン酸、Ｂ２が
ＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤＰ類のときは、グルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーセ（Ｅｃｌ、１．１．４９
）（酵母由来）とグルコース−６−リン酸、イソクエン
酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，４２）（酵母、
ブタ心筋由来）とイソクエン酸、グリオキシル酸デヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ１，２，１，１７）（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　　。

ｘａｌａｔｉｃｕｓ由来）とＣｏＡとグリオキシル酸、
ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，
４４）（ラット肝、ビール酵母、ＥＣ。

］Ｉ由来）と６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、グリセロア
ルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ］。

２．１．１３）（植物葉緑体由来）とＤ−グリセロアル
デヒド−３−リン酸とリン酸、ベンズアルデヒドデヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ１，２，１，７）　　（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来）とベンズ
アルデヒド等が挙げられる。

更にまた、本発明定量法はＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒ
ドロゲナーゼがＮＡＤ類及びＮＡＤＰ類を共に補酵素と
する場合において、２つの補酵素にチオＮＡＤ類とＮＡ
Ｄ類もしくはＮＡＤＰ類との組み合わせを選んだときに
は、更に被検体に■成分のＤ−３−ヒドロキシ醋酸に作
用せず、Ａ２−Ａ、の反応を形成する第三のデヒドロゲ
ナーゼ及び該第三のデヒドロゲナーゼの基質を作用せし
めることにより、咳記反応式（ｎｌ）のごとく、Ａ、と
Ａ２の間にＡ。

の再生の為の反応系を付与せしめることにより当該サイ
クリング反応を形成し得る。この場合、第三のデヒドロ
ゲナーゼに関しては、この測定系において実質的にＢ、
に作用し得ない条件を設定することが好ましく、例えば
Ｂ１を本質的に補酵素として利用しない酵素を選択する
組み合わせ、Ｂ、とＡ２の量的関係により第三のデヒド
ロゲナーゼが実質的にＢ。

に作用しない条件を選択する組み合わせ等が例示される
。定量の際にはＢ１の消費量を測定する。

Ａ、Ｄ−３−ヒドロキシ酸Ａ２ ８２　　　　　　　　　　　　Ｂ、　　ＣＩ［ｌ）（式
中、ＡＩはチオＮＡＤＰ類、チオＮ　Ａ、　Ｄ類、ＮＡ
ＤＰＩまたはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ、の還元型生成
物を示し、ＢｉはＡ１がチオＮＡＤｐｌまたはＮＡＤＰ
類のときは還元型チオＮＡＤ類または還元型ＮＡＤ類を
、Ａ、がチオＮＡＤ類またはＮＡＤ類のときは還元型チ
オＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤＰｉを示し、Ｂ２はＢ
、の酸化型生成物を示し、Ａ、−Ａ、はＡアを補酵素と
してＡ、を生成する酵素反応を示す） すなわち、第三のデヒドロゲナーゼはＡ１の再生の為に
補助的に添加するものであり、これによってＡ、の使用
量を少なくすることが可能となり、特にＡ１が高価な場
合には有効である。又、Ａ、の代わりにＡ２あるいはＡ
１とＡ！の混合物を用いて反応を行ってもよい。この場
合、Ａ１または／及びＡ２の使用量は特に限定されるも
のではないが、−船釣にはＢ１の１／１０モル以下が好
ましい。

この成分■を用いるＤ−３−ヒドロキシ酪酸およびアセ
ト酢酸からなる群より選ばれた一つまたはそれ以上のケ
トン体の定量用組成物において、Ｂ１の濃度は０．０２
〜１００ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、Ａ
２または／及びＡ、の濃度は０．０５〜５ｏｏｏμＭ、
特に５〜５００μＭが好ましく、Ｄ−３−ヒドロキシ酪
酸デヒドロゲナーゼの濃度は５〜１０００ｕ／ｍｌ、特
に２０〜４００ｕ／ｍｌが好ましく、第三のデヒドロゲ
ナーゼはＡｔに対するＫｍ値（ｍＭ単位）の２０倍量（
ｕ／ｍｌ単位）以上になるように調製すればよく、例え
ば１〜１．００ｕ／ｒｒ＋ｊ！が好ましく、また第三の
デヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば０．０５〜２
０ｍＭが好ましい。これらの量は被検体の種類等により
適宜決定することができ、これ以上の量を用いることも
できる。

第３三のデヒドロゲナーゼ及びその基質としては、例え
ばＡ、がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のときは、アルコ
ールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１゜１．１）とアセト
アルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，
１，１，６）　　（Ｅ、Ｃｏ１１由来）とジヒドロキシ
アセトン、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ１，１，１゜８）　（ウサギ筋肉由来）とジヒド
ロキシアセトンリン酸、リンゴ酸デヒドロゲーゼ（ＥＣ
１，１，１，３７）（ブタ心筋由来、ウシ心筋由来）と
オキザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ１，１，１，１２）（ウサギ骨格筋、肝、酵
母、Ｅ、Ｃｏ１１由来）と１．３−ジホスホーＤ−グリ
セリン酸、Ａ１がＮＡＤＰＩＩまたはチオＮＡＤＰ類の
ときは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ１，１，１，４９）（酵母由来）とグルコノラクトン
−６−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ１，２，１゜１３）（植物葉緑体由来）と１
，３−ジホスホーＤ−グリセリン等が挙げられる。

反応液組成については、使用するＤ−３−ヒドロキシ酪
酸デヒドロゲナーゼの各種補酵素間の相対活性等を考慮
して２種の補酵素を適宜選択し、その後圧反応／逆反応
の至適ｐＨ条件を酵素サイクリング反応が効率よく進行
するように設定すればよい、これら使用する酵素は単独
でも、あるいは適宜２種以上を組み合わせて用いてもよ
い。

かくして、調製された本発明のＤ−３−ヒドロキシ酪酸
またはアセト酢酸定量用組成物によって被検体中のＤ−
３−ヒドロキシ酪酸またはアセト酢酸を測定するには、
前記の成分■〜■、■〜■、あるいは■〜■及び■を含
有する組成物に被検液、例えば血清、血漿、尿等の０゜
００１〜１ｍｆを加え、約３７℃の温度にて反応させ、
反応開始一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、例
えば３分後と４分後の１分間、または３分後と８分後の
５分間における生成されたＡ２の量または消費されたＢ
１の量を、それぞれの吸収波長に暴く吸光度の変化によ
って測定すればよい。例えばＡ２がチオＮＡＤＨ，Ｂ。

がＮＡＤＨの場合、Ａ２の生成を４００ｎｍの吸光度の
増加により測定するか、あるいはＢ、の消費を３４０ｎ
ｍの吸光度の減少により測定し、既知濃度のＤ−３−ヒ
ドロキシ酪酸またはアセト酢酸を用いて測定したときの
値と比較すれば、被検液中のＤ−３−ヒドロキシ酪酸ま
たはアセト酢酸量をリアルタイムで求めることができる
。

特に被検体が血清あるいは血漿の場合にはＤ−３−ヒド
ロキシ酪酸とアセト酢酸の合計値、すなわち、ひとつの
操作で総ケトン体が測定できるわけで、このような方法
は従来知られていない。これは総ケトン体の個々の成分
、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸がＤ−３−
ヒドロキシ醋酸デヒドロゲナーゼの基質であるというこ
とと、これら２成分を直接酵素サイクリング反応に導い
ているという本発明の特徴による。更に、総ケトン体だ
けでなく個々の成分の値を測定したい場合には、被検体
をあらかじめどちらかの成分のみに作用する酵素によっ
て前処理したのち、酵素サイクリング反応に導けばよい
。

例えば、アセト酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４，１，
１，４）により前処理を行えばアセト酢酸はアセトンと
炭酸ガスに転換されるので、引続き本発明による酵素サ
イクリング反応を実施することによりＤ−３−ヒドロキ
シ酪酸のみを定量することもできる。また、総ケトン体
の量から前記Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸の量を差し引（こ
とにより、アセト酢酸のみの定量値を算出することもで
きる。

また、本発明の定量法は、被検液中のＤ−３−ヒドロキ
シ酪酸またはアセト酢酸そのものを酵素サイクリング反
応に導くものであり、被検液中の共存物質の影響を受け
にくいため、被検液のブランク測定を省略することがで
き、レイトアッセイによる簡便な測定を成し得る。

尚、本発明においてはＡ２またはＢ１の測定に当たり、
吸光度測定の代わりに他の公知の測定法を試用しで定■
を行うこともできる。

〔発明の効果〕

以上のように、本発明は還元型の吸収波長の異なる補酵
素を用いるため測定誤差が生じず、また、酵素サイクリ
ング反応を組み合わせることによって感度を増大させる
ことができるため、少量の検体で迅速かつ正確に被検体
中のＤ−３−ヒドロキシ酪酸またはアセト酢酸を定量す
ることができる。

〔実施例〕

次いで、本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本
発明はこれによって何ら限定されるものではない。

実ＩＬ−１ 〈反応液〉 １００　　　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ８，
５）０．１ｍＭ　　還元型ＮＡＤ　（オリエンタル酵母
社製） ４　　　ｍＭ　　チオＮＡＤ　（シグマ社製）４５ｕ／
ｍｌ　Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（東洋
紡社製、シュ ウトモナス　エスピー由来） 〈操作〉 上記試薬１ｍｌをキュベツトにとり、予め３７℃にて加
温した。０．１０．２０．３０．４ｏ、５０μＭのＤ−
３−ヒドロキシ酪酸溶液をそれぞれ２０μ！添加し、３
７℃にて反応を開始させた。反応開始後２分目と５分目
の４００ｎｍにおける吸光度を読み取りその差を求めた
。その結果は第１図に示した。第１図から明らかなよう
に、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸量に対する吸光度変化量は
良好な直線を示した。

ス［ 実施例１と同様の反応液を用い、Ｄ−３−ヒドロキシ酪
酸溶液をアセト酢酸溶液に代えて、実施例１と同様の操
作を行った。その結果は第２図に示した。

第２図から明らかなように、実施例１と同様、良好な直
線性を得た。

実［ 〈反応液〉 １００　　　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８，５
）０．１ｍＭ　　還元型ＮＡＤ　（オリエンタル酵・帰
社製） ５　　　ｍＭ　　チオＮＡＤ　（シグマ社製）６０ｕ／
ｍｌ　Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（東洋
紡社製、シュ ードモナス　エスピー由来） ０．２　％　トリトン　Ｘ−１００（シグマ社製） く操作〉 上記反応液１ｍｌをキュベツトにとり、あらかじめ３７
℃にて加熱した。次いで正常人血清４種類につき、各々
反応液中に２０μｌを添加し、３７℃にて反応を開始さ
せた。反応開始後の２分目と５分目の４００ｎｍにおけ
る吸光度を読み取りその差を求めた。別に、標準液とし
て５０μＭＤ−３−ヒドロキシ酪酸溶液を、また試薬ブ
ランクとしてサンプルの代わりに蒸留水を加えたちのそ
れぞれについて同様の測定を行った。血清中のＤ−３−
ヒドロキシ酪酸とアセト酢酸の合計量を標準液の値より
換算して下記第１表に示す結果を得た。

〈反応液Ｉ〉 ｌＱ　　　ｍＭ　　リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）０．２
　％　トリトン　Ｘ−１００（シグマ社製） １０ｕ／ｍβ　アセト酢酸デカルボキシラーゼ（バチル
ス　ポリミクサ（Ｂａｃｉ ＋１ｕｓ　　ｐｏｌｙｍｙｘａ）和 光純藁社製） 〈反応液■〉 ２００　　　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ９，０
）０．２ｍＭ　　還元型ＮＡＤ　（オリエンタル酵母社
製） １０　　　ｍＭ　　チオＮＡＤ　（シグマ社製）１２０
ｕ／ｍＩ！　Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ
（東洋紡社製、シュ ドモナス　エスピー由来） 〈操作〉 上記反応液Ｉを０．４５ｍ１キユベア）にとり、あらか
じめ３７℃にて加温した。次いで実施例３に用いた正常
人血清４種類それぞれについて、血清２０μｌを添加し
、３７℃５分間反応させ、内在性のアセト酢酸を消去す
る。その後、０．２Ｎの塩酸を０．０５ｍｊ！加えてア
セト酢酸デカルボキシラーゼを失活させたのち、反応液
■を０．５ｍｌ加え、酵素サイクリング反応を３７℃に
て実施した０反応液■添加後の２分目と５分目の４００
ｎｍにおける吸光度を読み取りその差を求めた。別に、
標準液として５０μＭＤ−３−ヒドロキシ酪酸？容液を
、また試薬ブランクとしてサンプルの代わりに蒸留水を
加えたちのそれぞれについて同様の測定を行い、それぞ
れの血清につきＤ−３−ヒドロキシ酪酸濃度を算出した
。実施例３の結果と併せてアセト酢酸濃度についても計
算し、下記第２表に示す結果を得た。

スｆｆｉ 〈反応液〉 ４０　　ｍＭ　　Ｎａｇ　ｃｏ！　−Ｎａ　ＨＣＯｚ緩
衝液（ｐＨ１０，０） ２０　　ｍＭ　　ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）５
０８Ｍ　チオＮＡＤ　（シグマ社製）０．４Ｍ　エタノ
ール ３Ｑｕ／ｒｒ＋ｊ！アルコールデヒドロゲナーゼ（オリ
エンタル酵母社製） ３５０　ｕ　／　ｍ　ｌ　Ｄ　−３−ヒドロキシ酪酸デ
ヒドロゲナーゼ（東洋紡社製、シュードモナ ス　エスピー由来） 〈操作〉 上記１ｍｌをキュベツトにとり、０．２０．４０．６０
．８０．１００μＭのアセト酢酸溶液をそれぞれ５０μ
ｌ添加し、３７℃にて反応を開始させた。

反応開始後３分目と８分目の３４０ｎｍにおける吸光度
を読み取りその差を求めた。濃度０の値を試薬ブランク
とし、２０〜１００μＭのそれぞれのアセト酢酸の値か
らこの値を引き、その結果を第３図に示した。

実施ｌ−亙 〈反応液〉 ５Ｑ　　　　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ７！緩衝液（ｐＨ
８，０） ０．２５ｍＭ　　還元型ＮＡＤＰ　　（オリエンタル酵
母社製） ５０　　８Ｍ　チオＮＡＤ　（シグマ社製）５　　　　
ｍＭ　　ジヒドロキシアセトンリン酸１０ｕ／ｒｒ＋１
　グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ベーリ
ンガー社 製；ウサギ筋肉由来） ３５０　　ｕ／ｍｌ’　　Ｄ−３−ヒ）ｊロキシ酪酸テ
ヒロゲナーゼ（東洋紡社製、シュー ドモナス　エスピー由来） く操作〉 上記試薬１ｍｌをキュベツトにとり、０１５０．１００
．１５０．２００．２５０μＭのＤ−３−ヒドロキシ酪
酸溶液をそれぞれ５０μｌ添加し、３７℃にて反応を開
始させた。反応開始後３分目と８分目の３４０ｎｍにお
ける吸光度を読み取りその差を求めた。実施例５と同様
試薬ブランクとの差を求め、その結果を第４図に示した
。

【図面の簡単な説明】

第１図はＤ−３−ヒドロキシ酪酸量に対する吸光度変化
量を示す曲線、第２図はアセト酢酸溶液量に対する吸光
度変化量を示す曲線、第３図はアセト酢酸に対する３４
０ｎｍにおける吸光度差を示す曲線、第４図はＤ−３−
ヒドロキシ酪酸に対する３４０ｎｍにおける吸光度差を
示す曲線である。 アート！ｉ牛駿　（）ＩＭ） 第３図 ア乞ト！ｌ乍妊　（１Ｍ） 第４図 Ｄ−３−とド°Ｕ代ン酩蔽　（ｐＭ） 手続補正書 平成３年８月１５日 平成　２年　特許側　第２８６７１８号２、発明の名称 Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸またはアセト酢酸の高感度定量
法および定量用組成物 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町三福６３２番１世の１名称　
東洋醸造株式会社 ４、代理人　〒１７０ 東京都豊島区北大塚１−２５−１ 太陽生命大塚ビル３階 電話（３９１７）　１９１７　　　　　　　−ｒ。 （７５２８）弁理士小林和憲　゛、工 ５、補正の対象 （１）、明細書の特許請求の範囲の欄 ６、補正命令の日付 自発 ７、補正の内容 （１）、明細書の特許請求の範囲の欄を別紙の通り訂正
する。 （２）、明細書第１８ページ下から１行目「被験液」と
あるを「被検液」と訂正する。 （３）、明細書第２９ページ下から４行目ｒＮＡＤ類及
びＮＡＤＰ類」とあるを「（チオ）ＮＡＤ類及び（チオ
）ＮＡＤＰ類」と訂正する。 （４）、同ページ下から１行目「せを選んだときには、
」とあるを「せ、又はチオＮＡＤＰ類とＮＡＤ類もしく
はＮＡＤＰ類との組み合わせを選んだときには、」と訂
正する。 （５）、明細書第３４ページ上から１２２行目ｒＮＡＤ
類びＮＡＤＰ類」とあるを「（チオ）ＮＡＤ類及び（チ
オ）ＮＡＤＰ類」と訂正する。 （６）、同ページ下から６行目「わせを選んだときには
、」とあるを「わせ、又はチオＮＡＤＰ類とＮＡＤ類も
しくはＮＡＤＰ類との組み合わせを選んだときには、」
と訂正する。 （７）、明細書第３８ページ上から９行目「−グリセリ
ン等」とあるを「−グリセリン酸等」と訂正する。 （８）、明細書第４１ページ上から３行目ないし４行目
「試用して」とあるを「使用して」と訂正する。 戸−−量　ン　　の ｒ（１）Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸から
なる群より選ばれた１つまたはそれ以上のケトン体を含
有する被検液に、 ■チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェ
ートＭ（以下、チオＮＡＤＰ類という）およびチオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、チオＮＡ
Ｄ類という）からなる群より選ばれた１つと、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類（以下、
ＮＡＤＰ類という）およびニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド類（以下、ＮＡＤｌｉという）からなる群よ
り選ばれた１つとを補酵素とし、少なくともＤ−３−ヒ
ドロキシ酪酸を基質としてアセト酢酸を生成する可逆反
応をなすＤ−３−ヒドロキシ醋酸デヒドロゲナーゼ、 ■Ａ１、 ■Ｂ＋　、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式Ａ、Ｄ−３
−ヒドロキシ酪Ａ。 Ｂ　ｔ　　　　　　　　　　　　Ｂ　。 （式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ、はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰｌｉまたは還元型ＮＡＤ類を
、Ａ、がＮＡＤＰ＠またはＮＡＤ類のときは還元型チオ
ＮＡＤＰＩ［または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２は
Ｂ１の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング反
応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ２またはＢ
１０量を決定することを特徴とするＤ−３−ヒドロキシ
酪酸およびアセト酢酸からなる群より選ばれた１つまた
はそれ以上のケトン体の高感度定置法。 （２）Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸からな
る群よ、り選ばれた１つまたはそれ以上のケトン体を含
有する被検液に、 ■チオＮＡＤＰＩＩおよびチオＮＡＤｌｉからなる群よ
り選ばれた１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる
群より選ばれた１つとを補酵素とし、少なくともＤ−３
−ヒドロキシ酪酸を基質としてアセト酪酸を生成する可
逆反応をなすＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ
、 ■Ａ１、 ■Ｂ＋または／およびＢｔｓ ■Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸に作用せず、Ｂ２からＢ、へ
の反応を形成する第二のデヒドロゲナーゼおよび該第二
のデヒドロゲナーゼの基質、を含有する試薬を作用せし
めて、次の反応式８式％ （式中、Ａ、はチオＮＡＤＰ＠、チオＮＡＤＭ、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ、はＡ１がチオＮＡＤ　Ｐ類またはチオＮＡ
Ｄ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を
、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオ
ＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤＩＩを示し、Ｂ２は
Ｂ１の酸化型生成物を示し、Ｂ２から８１への反応はＢ
ｔを補酵素として第二のデヒドロゲナーゼにてＢ、を生
成する酵素反応を示す）で表されるサイクリング反応を
形成せしめ、該反応によって変化するＡ２の量を決定す
ることを特徴とするＤ−３−ヒドロキシ酪酸およびアセ
ト酢酸からなる群より選ばれた１つまたはそれ以上のケ
トン体の高感度定量法。 （３）　Ｄ　−３−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸か
らなる群より選ばれた１つまたはそれ以上のケトン体を
含有する被枝液に、 ■チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より選
ばれた１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれた１つとを補酵素とし、少なくともＤ−３−ヒ
ドロキシ酪酸を基質とじてアセト酢酸を生成する可逆反
応をなすＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、 ■Ａ１または／およびＡ、、 ■Ｂ８、 ■Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸に作用せず、Ａ２がらＡ、へ
の反応を形成する第三のデヒドロゲナーゼおよび該第三
のデヒドロゲナーゼの基質、を含有する試薬を作用せし
めて、次の反応式８式％ （式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ７の還元型生成物
を示し、Ｂ、４よＡ、がチオＮＡＤ　Ｐ類またはチオＮ
ＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類
を、Ａ、がＮＡＤＰ類またはＮＡＤＩＩのときは還元型
チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２
はＢ１の酸化型生成物を示し、Ａ２がらＡ、への反応は
Ａ２を補酵素として第三のデヒドロゲナーゼにてＡ、を
生成する酵素反応を示す）で表されるサイクリング反応
を形成せしめ、該反応によって変化するＢ。 の量を決定することを特徴とするＤ−３−ヒドロキシ酪
酸およびアセト酢酸より選ばれた１つまたはそれ以上の
ケトン体の高感度定量法。 （４）チオＮＡＤＰ類が、チオニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフェート（チオＮＡＤＰ）またはチ
オニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフ
ェートである請求項（１）がら（３）のいずれかの請求
項に記載の高感度定量法。 （５）チオＮＡＤ類が、チオニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（チオＮＡＤ）またはチオニコチンアミド
ヒボキサンチンジヌクレオチドである請求項（１）から
（３）のいずれかの請求項に記載の高感度定量法。 （６）　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ類が、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）　、アセチル
ピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（アセチ
ルＮＡＤＰ）、アセチルビミジンヒポキサンチンジヌク
レオチドホスフェートおよびニコチンアミドヒボキサン
チンジヌクレオチドホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）
からなる群より選ばれた補酵素である請求項（１）から
（３）のいずれかの請求項に記載の高感度定量法。 （７）ＮＡＤｉが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオ
チド（アセチルＮＡＤ）　、アセチルピリジンヒボキサ
ンチンジヌクレオチドおよびニコチンアミドヒボキサン
チンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）からなる群より
選ばれた補酵素である請求項（１）から（３）のいずれ
かの請求項に記載の高感度定量法。 （８）次の成分■〜■ ■チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より選
ばれた１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれた１つとを補酵素とし、少なくともＤ−３−ヒ
ドロキシ酪酸を基質としてアセト酢酸を生成する可逆反
応をなすＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、 ■Ａ８、 ■Ｂ４、 （但し、Ａ、はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ｂ１はＡ、がチオＮＡＤＰ
ｉまたはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または
還元型ＮＡＤ類を、Ａ、がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類の
ときは還元型チオＮＡＤＰＩまたは還元型チオＮＡＤ類
を示す）を含有することを特徴とするＤ−３−ヒドロキ
シ酪酸およびアセト酢酸からなる群より選ばれた１つま
たはそれ以上のケトン体の定量用組成物。 （９）次の成分■〜■ ■チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より選
ばれた１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれた１つとを補酵素とし、少なくともＤ−３−ヒ
ドロキシ酪酸を基質としてアセト酢酸を生成する可逆反
応をなすＤ−３−ヒドロキン酪酸デヒドロゲナーゼ、 ■Ａ、、 ■Ｂ、または／およびＢ２、 ■Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸に作用せず、Ｂ２からＢ、へ
の反応を形成する第二のデヒドロゲナーゼおよび該第二
のデヒドロゲナーゼの基質、（但し、Ａ、はチオＮＡＤ
Ｐ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰＲまたはＮＡＤ類を示し
、Ｂ、はＡ１がチオＮＡＤＰｉまたはチオＮＡＤｌｉの
ときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、Ａ、
がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤ
Ｐ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ＋の酸
化型生成物を示す）を含有することを特徴とするＤ−３
−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸からなる群より選ば
れた１つまたはそれ以上のケトン体の定量用組成物。 ００次の成分■〜■および■ ■チオＮＡＤＰｉおよびチオＮＡＤｇのいずれか１つと
、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれた１
つとを補酵素とし、少なくともＤ−３−ヒドロキシ酪酸
を基質としてアセト酢酸を生成する可逆反応をなすＩ）
−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、 ■Ａ１または／およびＡ２、 ■Ｂ１、 ■Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸に作用せず、Ａ２からＡ１へ
の反応を形成する第三のデヒドロゲナーゼおよび該第三
のデヒドロゲナーゼの基質、（但し、Ａ１はチオＮＡＤ
Ｐ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し
、Ｂ１はＡ、がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤｉのと
きは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、Ａ、が
ＮＡＤＰ類またはＮＡＤＩのときは還元型チオＮＡＤＰ
類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ、の還元
型生成物を示す）を含有することを特徴とするＤ−３−
ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸からなる群より選ばれ
た１つまたはそれ以上のケトン体の定量用組成物。」 以上

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸からな
   る群より選ばれた１つまたはそれ以上のケトン体を含有
   する被検液に、 ［１］チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
   フェート類（以下、チオＮＡＤＰ類という）およびチオ
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、チオ
   ＮＡＤ類という）からなる群より選ばれた１つと、ニコ
   チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類（以
   下、ＮＡＤＰ類という）およびニコチンアミドアデニン
   ジヌクレオチド類（以下、ＮＡＤ類という）からなる群
   より選ばれた１つとを補酵素とし、少なくともＤ−３−
   ヒドロキシ酪酸を基質としてアセト酢酸を生成する可逆
   反応をなすＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、 ［２］Ａ＿１、 ［３］Ｂ＿１、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式▲数式、化
   学式、表等があります▼ （式中、Ａ＿１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡ
   ＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ＿２はＡ＿１の還元型
   生成物を示し、Ｂ＿１はＡ＿１がチオＮＡＤＰ類または
   チオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型Ｎ
   ＡＤ類を、Ａ＿１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
   還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し
   、Ｂ＿２はＢ＿１の酸化型生成物を示す）で表されるサ
   イクリング反応を形成せしめ、該反応によって変化する
   Ａ＿２またはＢ＿１の量を決定することを特徴とするＤ
   −３−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸からなる群より
   選ばれた１つまたはそれ以上のケトン体の高感度定量法
   。
2. （２）Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸からな
   る群より選ばれた１つまたはそれ以上のケトン体を含有
   する被験液に、 ［１］チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群よ
   り選ばれた１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる
   群より選ばれた１つとを補酵素とし、少なくともＤ−３
   −ヒドロキシ酪酸を基質としてアセト酪酸を生成する可
   逆反応をなすＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ
   、 ［２］Ａ＿１、 ［３］Ｂ＿１または／およびＢ＿２、 ［４］Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸に作用せず、Ｂ＿２から
   Ｂ＿１への反応を形成する第二のデヒドロゲナーゼおよ
   び該第二のデヒドロゲナーゼの基質、を含有する試薬を
   作用せしめて、次の反応式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａ＿１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡ
   ＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ＿２はＡ＿１の還元型
   生成物を示し、Ｂ＿１はＡ＿１がチオＮＡＤＰ類または
   チオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型Ｎ
   ＡＤ類を、Ａ＿１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
   還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し
   、Ｂ＿２はＢ＿１の酸化型生成物を示し、Ｂ＿２からＢ
   ＿１への反応はＢ＿２を補酵素として第二のデヒドロゲ
   ナーゼにてＢ＿１を生成する酵素反応を示す）で表され
   るサイクリング反応を形成せしめ、該反応によって変化
   するＡ＿２の量を決定することを特徴とするＤ−３−ヒ
   ドロキシ酪酸およびアセト酢酸からなる群より選ばれた
   １つまたはそれ以上のケトン体の高感度定量法。
3. （３）Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸からな
   る群より選ばれた１つまたはそれ以上のケトン体を含有
   する被験液に、 ［１］チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群よ
   り選ばれた１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる
   群より選ばれた１つとを補酵素とし、少なくともＤ−３
   −ヒドロキシ酪酸を基質としてアセト酢酸を生成する可
   逆反応をなすＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ
   、 ［２］Ａ＿１または／およびＡ＿２、 ［３］Ｂ＿１、 ［５］Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸に作用せず、Ａ＿２から
   Ａ＿１への反応を形成する第三のデヒドロゲナーゼおよ
   び該第三のデヒドロゲナーゼの基質、を含有する試薬を
   作用せしめて、次の反応式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａ＿１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡ
   ＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ＿２はＡ＿１の還元型
   生成物を示し、Ｂ＿１はＡ＿１がチオＮＡＤＰ類または
   チオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型Ｎ
   ＡＤ類を、Ａ＿１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
   還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し
   、Ｂ＿２はＢ＿１の酸化型生成物を示し、Ａ＿２からＡ
   ＿１への反応はＡ＿２を補酵素として第三のデヒドロゲ
   ナーゼにてＡ＿１を生成する酵素反応を示す）で表され
   るサイクリング反応を形成せしめ、該反応によって変化
   するＢ＿１の量を決定することを特徴とするＤ−３−ヒ
   ドロキシ酪酸およびアセト酢酸より選ばれた１つまたは
   それ以上のケトン体の高感度定量法。
4. （４）チオＮＡＤＰ類が、チオニコチンアミドアデニン
   ジヌクレオチドホスフェート（チオＮＡＤＰ）またはチ
   オニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフ
   ェートである請求項（１）から（３）のいずれかの請求
   項に記載の高感度定量法。
5. （５）チオＮＡＤ類が、チオニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチド（チオＮＡＤ）またはチオニコチンアミド
   ヒポキサンチンジヌクレオチドである請求項（１）から
   （３）のいずれかの請求項に記載の高感度定量法。
6. （６）ＮＡＤＰ類が、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンア
   デニンジヌクレオチドホスフェート（アセチルＮＡＤＰ
   ）、アセチルピリジンアデニンヒポキサンチンジヌクレ
   オチドホスフェートおよびニコチンアミドヒポキサンチ
   ンジヌクレオチドホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）か
   らなる群より選ばれた補酵素である請求項（１）から（
   ３）のいずれかの請求項に記載の高感度定量法。
7. （７）ＮＡＤ類が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
   チド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオ
   チド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンヒ
   ポキサンチンジヌクレオチドおよびニコチンアミドヒポ
   キサンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）からなる
   群より選ばれた補酵素である請求項（１）から（３）の
   いずれかの請求項に記載の高感度定量法。
8. （８）次の成分［１］〜［３］ ［１］チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群よ
   り選ばれた１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる
   群より選ばれた１つとを補酵素とし、少なくともＤ−３
   −ヒドロキシ酪酸を基質としてアセト酢酸を生成する可
   逆反応をなすＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒロゲナーゼ、 ［２］Ａ＿１、 ［３］Ｂ＿１、 （但し、Ａ＿１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡ
   ＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ｂ＿１はＡ＿１がチオＮ
   ＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類
   または還元型ＮＡＤ類を、Ａ＿１がＮＡＤＰ類またはＮ
   ＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオ
   ＮＡＤ類を示す）を含有することを特徴とするＤ−３−
   ヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸からなる群より選ばれ
   た１つまたはそれ以上のケトン体の定量用組成物。
9. （９）次の成分［１］〜［４］ ［１］チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群よ
   り選ばれた１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる
   群より選ばれた１つとを補酵素とし、少なくともＤ−３
   −ヒドロキシ酪酸を基質としてアセト酢酸を生成する可
   逆反応をなすＤ−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ
   、 ［２］Ａ＿１、 ［３］Ｂ＿１または／およびＢ＿２、 ［４］Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸に作用せず、Ｂ＿２から
   Ｂ＿１への反応を形成する第二のデヒドロゲナーゼおよ
   び該第二のデヒドロゲナーゼの基質、 （但し、Ａ＿１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡ
   ＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ｂ＿１はＡ＿１がチオＮ
   ＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類
   または還元型ＮＡＤ類を、Ａ＿１がＮＡＤＰ類またはＮ
   ＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオ
   ＮＡＤ類を示し、Ｂ＿２はＢ＿１の酸化型生成物を示す
   ）を含有することを特徴とするＤ−３−ヒドロキシ酪酸
   およびアセト酢酸からなる群より選ばれた１つまたはそ
   れ以上のケトン体の定量用組成物。
10. （１０）次の成分［１］〜［３］および［５］［１］チ
    オＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類のいずれか１つと、Ｎ
    ＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれた１つと
    を補酵素とし、少なくともＤ−３−ヒドロキシ酪酸を基
    質としてアセト酢酸を生成する可逆反応をなすＤ−３−
    ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、 ［２］Ａ＿１または／およびＡ＿２、 ［３］Ｂ＿１、 ［５］Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸に作用せず、Ａ＿２から
    Ａ＿１への反応を形成する第三のデヒドロゲナーゼおよ
    び該第三のデヒドロゲナーゼの基質、 （但し、Ａ＿１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡ
    ＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ｂ＿１はＡ＿１がチオＮ
    ＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類
    または還元型ＮＡＤ類を、Ａ＿１がＮＡＤＰ類またはＮ
    ＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオ
    ＮＡＤ類を示し、Ａ＿２はＡ＿１の還元型生成物を示す
    ）を含有することを特徴とするＤ−３−ヒドロキシ酪酸
    およびアセト酢酸からなる群より選ばれた１つまたはそ
    れ以上のケトン体の定量用組成物。