JP2008533488A - 反応化学作用を用いるラテラルフロー装置 - Google Patents

Abstract

【課題】検体レベルの検出にラテラルフロー装置を利用する技術を提供する。
【解決手段】吸上げパッドと連通した多孔性膜を有する、試験サンプルにある検体の存在又は量を検出するためのラテラルフローアッセイ装置。多孔性膜は、発色団を有する検出部分を有し、発色団は、検体、又は２次的トリガ、又は検体及びトリガ発生試薬からの反応生成物と化学的に反応し、視覚的に検出可能な信号を発生するように構成されている。様々な色の信号を発生させるために、付加的な発色団部分を第１の発色団部分の下流に配置することができる。視覚的に検出可能な信号を発生することなく検体と反応することによって信号を軽減するために、掃去部分を発色団部分の間に含めることができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、検体レベルの検出にラテラルフロー装置を利用することに関する。

フロースルー又はラテラルフローアッセイは、多くの検体に対してより一般的になってきている。これらの装置は、多孔性固体支持膜を通る体液のような移動相の毛管流の原理に基づいて機能する。従来的なラテラルフロー試験では、関連の検体の存在下で、所定の結合部位内に取り込まれるか又は結合された染色又は金属性ナノ粒子を用いる。検体の濃度が増大すると、これらの結合部位内のナノ粒子の密度が増大する。従って、検体の量は、ナノ粒子の数を定量化することによって判断することができる。これには、一般的に、読取装置を用いることが必要であり、試験の複雑さ及び費用の両方が増大する。
読取装置の必要性を排除する迅速で定量的な試験の必要性が依然として存在する。

米国特許第６，４３６，６５１号 米国特許第４，９７３，５４９号 米国特許出願第６，３５０，５４３号 Ａ．Ｆ．Ｍ．Ｍｏｋｈｌｅｓｕｒ Ｒａｈｍａｎ他、無機化学、２００４年、第４３巻（第２４号）、７５５８〜７５６０頁 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｅｖｉｃｅｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｉｖｄｔ／ａｒｃｈｉｖｅ／９９／０５／００２．ｈｔｍｌ

本発明の一実施形態により、試験サンプルに存在する検体の存在又は量を検出するためのアッセイ装置を開示する。アッセイ装置は、検体自体とすることができる検体トリガ、又は２次的トリガ、又は検体及びトリガ発生試薬からの反応生成物に特異の発色団の複数の部分が正確なパターンで不動化される吸収膜を含む。これらの発色団部分の各々は、トリガのそれに対する発色団の反応性又は応答を調整することによって全か無かの様式で現れるように設計される。発色団は、視覚的に認知可能な変形を受け、発色団部分の数を増大させることにより、トリガ濃度のあらゆる望ましい量又は範囲を符号化することができる。

これらの部分は、同じ発色団を含む必要はない。例えば、検体レベルが許容可能か、境界域にあるか、又は高い範囲であることを伝えることが望ましい場合には、それに続く部分の発色団は、それぞれ、緑色、黄色、及び赤色を生成することができる。
必要に応じて、反応性部分の間に掃去部分を散在させることができる。これらの掃去部分は、反応物質を収容し、これは、トリガと反応するが、視覚的変化は生じず、それによってサンプル中のトリガの量を実質的に軽減する。
本発明の他の特徴及び態様は、以下でより詳細に説明する。

本明細書で用いる場合、「検体」という用語は、一般的に、検出される物質を意味する。例えば、検体には、抗原性物質、ハプテン、抗体、及びその組合せを含むことができる。検体には、以下に限定されるものではないが、毒素、有機化合物、タンパク質、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物（治療目的で投与されるもの、並びに違法の目的で投与されるものを含む）、薬物中間物又は副産物、細菌、ウイルス粒子、イースト、真菌、プロトゾア、及び以上の物質のいずれかの代謝物又はそれに対する抗体が含まれる。一部の検体の特定の例には、フェリチン；クレアチニンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）；ジゴキシン；フェニトイン；フェノバルビタール；カルバマゼピン；バンコマイシン；ゲンタマイシン；テオフィリン；バルプロ酸；キニジン；黄体形成ホルモン（ＬＨ）；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；エストラジオール、プロゲステロン；Ｃ反応性タンパク質；リポカリン；ＩｇＥ抗体；サイトカイン；ビタミンＢ２ミクログロブリン；糖化ヘモグロビン（ＧＩｙ．Ｈｂ）；コルチゾール；ジギトキシン；Ｎ−アセチルプロカインアミド（ＮＡＰＡ）；プロカインアミド；風疹−ＩｇＧ及び風疹ＩｇＭのような風疹に対する抗体；トキソプラズマ症ＩｇＧ（Ｔｏｘｏ−ｌｇＧ）及びトキソプラズマ症ＩｇＭ（Ｔｏｘｏ−ｌｇＭ）のようなトキソプラズマ症抗体；テストステロン；サリチレート；アセトアミノフェン；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）；抗Ｂ型肝炎コア抗原ＩｇＧ及びＩｇＭ（抗ＨＢＣ）のようなＢ型肝炎コア抗原に対する抗体；ヒト免疫不全ウイルス１型及び２型（ＨＩＶ１及び２）；ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型及び２型（ＨＴＬＶ）；Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）；Ｂ型肝炎ｅ抗原に対する抗体（抗ＨＢｅ）；インフルエンザウイルス；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；チロキシン（Ｔ４）；トータルトリヨードチロニン（トータルＴ３）；フリートリヨードチロニン（フリーＴ３）；ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）；リポタンパク質、コレステロール、及びトリグリセリド；及びαフェトプロテイン（ＡＦＰ）が含まれる。乱用薬物及び制限物質には、以下に限定されるものではないが、アンフェタミン；メタンフェタミン；アモバルビタール、セコバルビタール、ペントバルビタール、フェノバルビタール、及びバルビタールのようなバルビツレート；リブリウム及びバリウムのようなベンゾジアゼピン；ハシシュ及びマリファナのようなカンナビノイド；コカイン；フェンタニール；ＬＳＤ；メタカロン；ヘロイン、モルヒネ、コデイン、ヒドロモルフォン、ヒドロコドン、メサドン、オキシコドン、オキシモルホン及びアヘンのようなオピエート；フェンシクリジン；及びプロポキシフェンが含まれる。他の可能な検体は、米国特許第６，４３６，６５１号に説明されていると考えられる。

本明細書で用いる場合、「試験サンプル」という用語は、一般的に、検体を含有することが疑われる材料を意味する。試験サンプルは、例えば、供給源から直接得られる材料、並びに、以下に限定されるものではないが、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、妨害成分の不活化、試薬の付加、及び溶解などのような技術を用いて前処理した材料を含むことができる。試験サンプルは、血液、間質液、唾液、眼水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、乳汁、腹水、粘液、滑液、腹腔液、膣液、月経、又は羊水などを含む生理液のような生物学的供給源から由来するであろう。生理液以外に、水及び食品などのような他の液体サンプルを用いることもできる。更に、検体を含有することが疑われる固体材料も試験サンプルとして用いることができる。

一般的に、本発明は、試験サンプル中にある検体の存在又は量を検出するためのラテラルフローアッセイ装置に関する。
従来のラテラルフロー法では、サンプルは、一般的に、サンプルにより粒子が再懸濁されて試験を進行させるのを助けることができるように、不動化した共役粒子の位置から上流に付加される。しかし、これと対照的に、本発明は、不動化共役粒子を用いずに、反応化学作用を用いて検体の存在を示すものである。本発明のアッセイ装置は、検体自体とすることができる検体トリガ、又は２次的トリガ、又は検体及びトリガ発生試薬からの反応生成物に特異の発色団の複数の部分が正確なパターンで不動化される吸収膜を含む。

反応化学作用は、発色団と検体の間の化学的反応を意味する。検出することが望ましい特定の検体及び示されることが望ましい特定の視覚信号に応じて無数の発色団を選択することができる。
望ましくは、異なる部分の発色団は、同じ反応機構でトリガと反応し、同時に異なる色を生成することができる。好ましくは、このような色変化発色団は、同じ色素群から由来し、同時にその構造及び官能性が様々であるために異なる色を生成する。

本発明に特に有用な発色団の部類の１つは、ジアリールメタン及びトリアリールメタンなどのようなアリールメタン色素である。
トリアリールメタン色素は、例えば、次の一般構造を有することができる。

ここで、Ｒ、Ｒ’、及びＲ”は、独立に、フェニル、ナフチル、アントラセニルなどのような置換及び非置換アリール基から選択される。アリール基は、例えば、アミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、スルホン酸、アルキルのような官能基、及び／又は他の公知の官能基で置換することができる。

医療診断のための一般的な検出手順（グルコースを含む）は、検出する前に検体を過酸化水素に変換する段階を含む。この手順は、当業技術で公知であり、例えば、米国特許第４，９７３，５４９号に教示されている。一般的に、過酸化物は、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの連動する酵素反応から副産物として生成されることになる。混合反応は、検体と反応して検出可能な量の過酸化物を生成するのに必要な全ての適切な酵素、補因子、基質、又は他の添加物を当然含む。コレステロールの場合には、例えば、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの濃度は、一般的に、各々、約０．１〜１００ＩＵ（国際単位）の範囲であり、更に一般的には、各々、約０．５〜１０ＩＵの範囲とされることになる。トリアリールメテン指示薬（例えば、ロイコクリスタルバイオレット）の量は、西洋ワサビ過酸化物、ヘミン、ヘモグロビン、又はチトクロムＣのような触媒を十分な非律速量で用いて、一般的に１００ｐｍｏｌ〜１０００ｐｍｏｌの範囲に含まれるべきであるが、一般的には約２５０ｐｍｏｌである。更に、律速でないように十分な基質及び補因子が供給される必要がある。一般的に、個々の成分の濃度は、約１モルを超えず、通常０．５モルを超えないことになる。通常は、ｐＨが約６〜１０、通常は６．５〜９の範囲で、一般的に約５０〜５００ｍｍｏｌの濃度の緩衝液が存在すべきである。以下に限定されるものではないが、トリス、リン酸、炭酸、及びＭＯＰＳ（４−モルホリンプロパンスルホン酸）を含む様々な緩衝液を用いることができる。用いる特定の緩衝液は、緩衝液によって受ける悪影響を最小にするように選択すべきである。他の添加物には、望ましいイオン強度を得るための塩、安定剤、殺生物剤、及び洗剤及び胆汁塩のような可溶化剤、及びその誘導体を含むことができる。

適切な色素の一例は、下に示すようなロイコクリスタルバイオレット色素群であり、これには、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、塩基性フクシン、及びクレゾールレッドが含まれる。この部類の色素は、過酸化水素のような酸化剤トリガを用いて酸化還元過程を受けると、色を変化させることができる。この色の変化反応は、過酸化水素オキシダーゼ（ＨＲＰ）及びチトクロムＣなどのような酵素触媒を用いることによって実行すると大幅に加速することができる。上述のように、過酸化水素トリガは、サンプルがサンプル付加部分からトリガ発生部分を通って流れる時に、トリガ発生部分で発生させることができる。

過酸化水素及び触媒が存在する時には、ロイコクリスタルバイオレットは、ニクロセルロース上に観察可能な信号を生成する。最終生成物であるクリスタルバイオレットは、セルロース性及びタンパク性材料の両方に親和性を有する陽イオン性トリアリールメタン色素の部類に属するために、色素の大部分は、所定位置に固定されたままであり、容易に除去することはできないことになる。この特性は、例えば、履物及び指紋痕の証拠を改善するために「米国連邦捜査局（ＦＢＩ）」により利用されてきた。ラテラルフロー装置は、共通の原理、すなわち、多孔性固体支持膜を通る移動相（例えば、試験する体液）の毛管流に基づいて作動するために、この特性は重要である。従って、指示薬が支持体表面に配置された状態で、それは、その信号を劣化すると考えられる移動相への分割も、それと共に運ばれることもないことが望ましい。指示薬ロイコクリスタルバイオレット（ＬＣＶ）は、この特性を有すると共に無色であり、益々望ましいものになる。

掃去部分は、必要に応じて、反応性部分の間に散在させることができる。これらの掃去部分は、トリガと反応するが、視覚的な変化を生じないか、又は物理的に遮断することができる視覚的変化を生じる反応物質を含み、それによってサンプル中のトリガの量を実質的に軽減する。
検体の性質に応じて、掃去する目的でいくつかの材料を選択することができる。例えば、コレステロールを検出する場合には、掃去部分は、各部分で正確に検出するために、２つの検出部分の間の過剰な過酸化水素を消費することができることが必要である。この目的に適切な材料には、即時過酸化水素錯化特性を有する過酸化水素分解触媒及び活性金属中心が含まれる。

掃去剤部分は、無色とする必要があるが、掃去剤部分が使用者から見えないように遮蔽されているか、又は用いる指示薬が移動相と共に流れるならば発色団を用いることができる。例えば、公知の過酸化水素指示薬であるアンプレックス・レッドは、ニトロセルロースに殆ど親和性がない。従って、ニトロセルロース上の検出部分の間にこの材料を縞模様に配置すると、試験が完了した状態で、見えなくなる可動掃去部分が生じる。過剰な過酸化水素がアンプレックス・レッドにより掃去されると、蛍光赤色が生じるが、これは、溶媒の前線と共に移動し、最初に縞模様に配置された領域を無色にする。

過酸化水素分解触媒の例は、酸化マンガンＭｎＯ、ＣｏＯ、及びＮｉＯのような低酸化状態の金属酸化物から選択することができる。更に、キンバリー・クラークに譲渡された米国特許出願第６，３５０，５４３号に教示されるような混合した金属水酸化物及び金属酸化物も本発明に適している。
金属酸化物は、膜ストリップの上部の望ましい掃去部分にインク製剤又はペーストにより付加することができる。過酸化水素を掃去又は分解する金属錯体の例は、過酸化水素と反応することが公知の文献に説明したいくつかの有機金属化合物から選択することができる。この種類の錯体の１つの特定な例は、Ａ．Ｆ．Ｍ．Ｍｏｋｈｌｅｓｕｒ Ｒａｈｍａｎ他（無機化学、２００４年、第４３巻（第２４号）、７５５８〜７５６０頁）に見出すことができ、この錯体の構造は以下に示している。

ここで、Ｒ₁〜Ｒ₄は、メチル及びエチル基のようなアルキル基である。

１つの態様では、検出部分間に掃去部分を用いることは、サンプル中の検体の総量に関連する。理想的には、掃去部分の掃去試薬の総量は、検体の総量よりも少ないが、検体の総量から検出部分の色素の総量を引いた量に等しいべきである。別の態様では、異なる検出部分の負荷量は、検出部分の感度により、同じか又は異なるものとすることができる。
一実施形態では、本発明は、５つの反応性部分を有するコレステロールのためのラテラルフロー装置である。第１、第３、及び第５の部分は、現在の治療指針である２００未満、２００〜２３９、及び２４０ｍｇ／ｄＬを超える総コレステロールに対応する。これらの部分の各々は、全か無かの応答であるように設計される。すなわち、これらは、コレステロール又はその誘導体（過酸化物は、コレステロールオキシダーゼ触媒作用の副産物であるために、最も都合の良い選択である）が部分に浸透したか否かのみを示すことになる。第２及び第４の反応性部分は、過剰なコレステロール又はその誘導体を破壊するように設計される。

例えば、２５０ｍｇ／ｄＬのコレステロールを含有するサンプルを装置に付加し、上述のように過酸化物に変換したと仮定すると、過酸化物は、次に、ラテラルフロー膜を通って進んで部分１に到達し、２００ｍｇ／ｄｌ未満であることを示す。この時点で、部分１は、緑色に変わり、過剰な過酸化物は、部分２の掃去部分に入ることになる。過酸化物は、２００ｍｇ／ｄＬを超える量のコレステロールのみが部分３に入るように掃去される。過酸化物が部分３に入ると、それは黄色に変わり、コレステロールが２００と２３９ｍｇ／ｄｌの間であることを示す。部分４である別の掃去部分では、２００〜２３９ｍｇ／ｄＬのコレステロールに対応する過酸化物が掃去される。最後に、サンプルが部分５に入ると、検出部分が赤色に変わり、コレステロールが２４０ｍｇ／ｄｌよりも多いことを示す。従って、２５０ｍｇ／ｄＬの場合の全体的な結果は、３つのバンド、緑色、黄色、及び赤色が出現することである。

装置は、一般的に、サンプル付加部分と検出部分とを有する多孔性膜を用いる。検出する検体によっては、任意的なトリガ発生部分が存在することもある。
検出部分は、試験する検体に特異の発色団を有する。サンプル付加部分は、発色団の上流の装置の端部に位置する。トリガ発生部分は、サンプル付加部分と検出部分の間にある。吸上げパッドは、装置の下流の端部のサンプル付加部分から反対側の多孔性膜の端部と液体連通している。使用時には、サンプルは、サンプル付加部分に付加され、一定時間後に吸上げパッドの毛管現象のために検出部分の方向に移動する。
装置は、任意的に、対照部分に散在する掃去部分を含むことができる。掃去部分の目的は、サンプル中の検体の量を軽減することである。適切な掃去部分反応物質は、試験される検体に依存することになるが、視覚的に観察可能な信号を生成することなく検体と反応することができるべきである。

検出部分色素及び掃去部分材料は、同時に又は別々に多孔性膜に付加することができる。前者の場合には、ストリッパ又はプリンタを用いることによって化学物質を付加することができる。後者の場合には、検出部分及び掃去部分は、別々に生成し、次に、試薬を付加した後に互いに積層化することができる。別の検出部分パッド又は掃去部分パッドは、例えば、繊維材料、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、機械的な膜、及びセルロース紙などのようないくつかの膜材料から作ることができる。

選択した色素及び材料に関係なく、それらは、様々な技術のいずれかを用いて多孔性膜に付加することができる。これは、直接膜に付加することができ、又は付加する前にまず溶液にすることができる。溶液を形成するには、以下に限定されるものではないが、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及び他の極性有機溶媒のような様々な溶媒を用いることができる。溶液中の化学色素の量は、約０．００１〜約１ミリグラム／ミリリットル溶媒の範囲とすることができ、一部の実施形態では、約０．０１〜約０．１ミリグラム／ミリリットル溶媒の範囲とすることができる。溶液は、公知の技術を用いて多孔性膜上に被覆し、その後、乾燥させることができる。

一実施形態では、掃去パッドは、２つの検出部分の間に積層化することができる。流れが積層体掃去パッドを容易に通過するようにするために、２つの検出部分の間にチャンネルを生成することができる。例えば、このチャンネルは、膜を物理的に擦り取って除去するか又は溶媒を用いて検出部分の間の膜材料を溶解する（例えば、メタノールアルコールを用いてニトロセルロース膜を溶解する）ことによって生成することができる。

図１を参照して、形成することができるラテラルフローアッセイ装置２０の一実施形態をより詳細に以下に説明する。装置は、同じ作用を有する別の様式で構成することができるので、「ラテラルフロー」という用語は、説明的なものであり、限定的な意味ではないことに注意すべきである。例えば、本発明の精神から逸脱することなく、本発明と同じ原理を用いて半径方向又は垂直方向フロー装置を容易に想起することができる。図示のように、装置２０は、任意的に硬質材料２４で支持された多孔性膜２２を含む。多孔性膜２２は、検出部分（又は線）３０を有する。

一般的に、多孔性膜２２は、それを検出プローブが通ることができる様々な材料のいずれかで作ることができる。例えば、多孔性膜２２を形成するのに用いられる材料には、以下に限定されるものではないが、多糖類（例えば、紙のようなセルロース材料、及び酢酸セルロース及びニトロセルロースのようなセルロース誘導体）；ポリエーテルスルホン；ポリエチレン；ナイロン；ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）；ポリエステル；ポリプロピレン；シリカ；塩化ビニル、塩化ビニルプロピレンコポリマー、及び塩化ビニル酢酸ビニルコポリマーのようなポリマーの多孔性ポリマーマトリックス中に均一に分散された非活性化アルミナ、珪藻土、ＭｇＳＯ₄、又は他の無機微粉化材料のような無機材料；天然由来（例えば、綿）及び合成（例えば、ナイロン又はレーヨン）の両方の布；シリカゲル、アガロース、デキストラン、及びゼラチンのような多孔性ゲル；ポリアクリルアミドのようなポリマーフィルムなどのような天然、合成、又は合成的に改質された天然からの材料を含むことができる。１つの特定的な実施形態では、多孔性膜２２は、ニトロセルロース及び／又はポリエーテルスルホン材料で形成される。「ニトロセルロース」という用語は、セルロースの硝酸エステルであり、これは、ニトロセルロース単独とすることも、硝酸及び１〜７炭素原子を有する脂肪族カルボン酸のような他の酸の混合エステルとすることもできることを理解すべきである。適切な膜には、米国マサチューセッツ州ビルリカ所在の「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ」のニトロセルロース膜ＨＦ０７５及びＨＦ１２０が含まれる。

装置２０はまた、吸上げパッド２６を収容することができる。吸上げパッド２６は、一般的に、多孔性膜全体２２を通って移行した流体を受け取る。当業技術で公知のように、吸上げパッド２６は、毛管作用及び膜２２を通る流体の流れを促進するのを助けることができる。
試験サンプル中の検体の検出を開始するために、使用者は、試験サンプルを付加部分２８に直接付加、接触、又は堆積させることができる。サンプルは、多孔性膜２２を通って検出部分３０まで進み、望ましい検体が存在する場合は視覚信号が見られる。

再び図１を参照すると、アッセイ装置２０は、検出部分３０を含み、その中に検体と化学的に反応することができる第１の発色団が不動化されている。検体が結合すると、検体が存在するという検出可能な指標が現れるが、このような指標は視覚的である。サンプルを含む検体は、装置内を前方に移動し続け、第２の検出部分３２内の第２の発色団に到達することができ、それにより、再び、視覚的に検出可能な色の変化が起こる。検出部分は、一般的に、あらゆる数の区別可能な検出領域を設けることができ、使用者が試験サンプル中の特定の検体の濃度を更に良好に判断することを可能にする。各領域は、同じ発色団を含むことができ、又は複数の検体を捕捉するために異なる発色団を含むことができる。例えば、検出部分３０は、２つ又はそれよりも多くの区別可能な検出領域（例えば、線、点等）を含むことができる。検出領域は、アッセイ装置２０を通る試験サンプルの流れに実質的に垂直な方向の線の形態で配置することができる。同様に、一部の実施形態では、検出領域は、アッセイ装置を通る試験サンプルの流れに実質的に平行な方向の線の形態で配置することができる。
図２を参照すると、掃去部分を含む実施形態が示されている。掃去部分４０、４２は、検出部分３０、３２、３４の間に配置される。更に、この実施形態は、サンプル付加部分２８と第１の検出部分３２との間にトリガ発生部分５０も含む。
２部分過酸化水素センサの構成に関して、本発明の一実施形態を以下に詳細に示す。

２５ミリメートル幅×３０センチメートル長さのニトロセルロース（「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．」、ＳＨＦ１２００４２５）のストリップを６０ｍｍ×３０ｃｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ裏打ちカード（ＨＦ０００ＭＣ１００）の２５ｍｍ幅の区域に積層し、ニトロセルロースストリップの片側に１５ｍｍの裏打ちカード、反対側に残り（２０ｍｍ）を露出するように残した。１．４ｍＭのＬＣＶの０．５％塩酸溶液を１ミリリットルの１．４ｍｇ／ｍＬウマ肝臓チトクロムＣ（ミズーリ州セントルイス所在の「Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ」）と混合することにより、ロイコクリスタルバイオレット（ＬＣＶ、オハイオ州シンシナチ所在の「Ｈｉｔｏｎ−Ｄａｖｉｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．」）指示薬溶液を調製した。得られる溶液は、使用する前に室温で１時間にわたって平衡化した。次に、最終濃度が容量で３パーセントＬＣＶになるまで、ＨＰＬＣ等級メタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．）を配合物に加えた。ＬＣＶ溶液は、二重非接触スプレーヘッドを装備した（噴出パラメータ０．９ｕＬ色素／ｃｍで縞率が７センチメートル／秒）「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ」（カリフォルニア州トウェイン・ハーテ）の「Ｍａｔｒｉｘ １６００」試薬分配システムを用いて上述のニトロセルロース上に噴出させた。縞は、ニトロセルロース膜の底面縁部からほぼ１０及び１５ミリメートルに配置した。次に、ガラス繊維／セルロース混合吸上げパッド（ＣＦ６、ニュージャージー州クリフトン所在のＷｈａｔｍａｎ）を裏打ちカードの露出した１５ｍｍ幅区域に付加し、吸収性ニトロセルロース膜と１〜１．５ｍｍだけ重なるようにした。カードは、ゼロ湿度環境、３７℃で１時間乾燥させた。乾燥後、はさみを用いて裏打ちカードの非積層体部分、すなわち、約２０ｍｍを除去し、廃棄した。最後に、（この時点で）ほぼ４０ｍｍ幅×３０ｃｍ長さの積層したカードを４ミリメートル幅のストリップに切断し（「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ」の「Ｍａｔｒｉｘ ２３６０」プログラマブルせん断機）、湿気のない状態を保つように乾燥剤袋を含むビニール袋（ＭｉｎｉＰａｘ（登録商標）、「Ｍｕｌｔｉｓｏｒｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．」、ニューヨーク州バッファロー）に入れた。各反応性部分は、１：１化学量論比の触媒が存在すると反応することで公知の２５０ピコモルのＬＣＶを含むことに注意すべきである。従って、第１の検出部分は、試験溶液が過酸化水素を含む時にトリガされるが、第２の検出部分ＬＣＶ縞は、溶液が２５０ピコモルよりも多い過酸化水素を含む場合にのみトリガされる。

装置を試験するために、全ての反応は、以下の周囲室内条件の下に室温で行った。
過酸化水素の１２の２倍連続希釈物（オレゴン州ユージーン所在の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．」の「Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ コレステロールアッセイキット」Ａ１２２１６の成分Ｄ）を１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．８８反応緩衝液に調製した。次に、得られる各溶液の１マイクロリットルを１２の試験ストリップの底面縁部から３ミリメートルにピペットで加えた。ストリップを４０マイクロリットルの１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．８８に入れることによって試験を開始した。反応は、全ての緩衝液が試験ストリップによって吸収されるまでは妨げられることなく進行し、これには約５分かかった。

ＬＣＶのクリスタルバイオレットへの変換は、「Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ」の「ＳｃａｎＪｅｔ ５４７０Ｃ」デジタルスキャナを用いて定量された。簡単に説明すると、スキャナは、工場出荷時の露出設定を用いて、１２００ＤＰＩでグレースケールモードに設定された。走査データは、非圧縮タグ付き画像形式ファイル（ＴＩＦＦ）として保存し、これを次に「Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ」で開き、グレースケールに変換した。データは、グレースケールで収集されるが、ＴＩＦＦファイルのビットフラグにより、量子化ソフトウエアパッケージに直接インポートすることができない。次に、グレースケールの値は、量子化に用いられる画像解析ソフトウエアである「Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ５．２」（「Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ」、ニュージャージー州ピスカタウエイ）内にインポートされると自動的に起こる反転により反転した。それにより、各ファイルの内容が実質的に保存された。次に、ファイルを「Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ」バージョン５．２にインポートし、ソフトウエア内に発現バンドを含む関連の矩形領域（ＲＯＩ）を生成した。各残りのバンドに対して、並びに背景に対するものに対してこのＲＯＩの正確な複製を生成した。非発現膜の異なる区域のランダムな測定値は、互いの３パーセント以内であり（データは示さず）、従って、背景ＲＯＩの位置は、２つの縞の間になるように選択したことに注意すべきである。次に、ソフトウエアは、各領域に対してボリューム（全ＲＯＩにわたる個々のピクセル強度の合計）を計算した。各ＲＯＩは、各縞から背景ＲＯＩ値を引くことによって補正した。各縞のデータは、最高の過酸化物溶液に対して１００の値を用い、相対過酸化水素濃度の関数としてプロットした。

意外にも過酸化水素の濃度に関係なく、両方の反応性部分で同じ程度に色が変化した。これが起こるのは、縞の指示薬部分を通過する時に反応力学が遅すぎて過酸化水素を効率的に捕捉することができないか、又は過酸化物溶液がバンドの周りを進むかのいずれかの場合である。後者の可能性を評価するために、本発明者は、１ミリリットルの反応緩衝液に１滴の緑色食用色素（「ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．」、メリーランド州スパークス）を加えた。次に、ラテラルフローストリップを「Ｄｉｇｉｔａｌ Ｂｌｕｅ ＱＸ５」コンピュータ顕微鏡（「Ｄｉｇｉｔａｌ Ｂｌｕｅ」、カリフォルニア州ヘーワード）の戴物台に固定した。顕微鏡は、６４０×４８０ピクセル解像度及び１５フレーム／秒でデジタルビデオを収集するように設定した。データ収集を開始した後、１０マイクロリットルの緑色色素溶液は、普通実験室用ピペットを用いてニトロセルロースの底面縁部に付加した。

ビデオは、ニトロセルロースマトリックスが緑色色素で飽和されるまで収集した。ビデオ映像を再検討すると、第１のＬＣＶ部分の前には、溶媒前線が全膜にわたってほぼ平坦であることが見出された。最初の縞に浸入しても前線に殆ど変化が誘発されなかった。しかし、縞領域がほぼ１／３濡れると、溶媒の外縁は、中心を通るよりも速くニトロセルロースストリップの縁部を上に移動し始め、Ｕ字形の溶媒前線を生じる。縞の湿潤は、更に遅くなるが、反応緩衝液は、バンドの端部に到達するまで縁部を上に移動し続ける。この時点で、バンドの上方の側方移動は、ストリップの中心に向って継続する。この時点で側方に移動する縁部前線が第１の反応性部分の上のストリップの中心に交わった後、上向き及び下向きの両方に湿潤が続く。従って、第１の反応部分は、特に湿潤し、封入され、その後、上部から下向きに最終的に完全に湿潤する。第２の反応部分は、同一の運命を有する。

この現象は、ラテラルフロー文献で公知であり、「潜り込み現象」と呼ばれている。一般的に、これは、大きく異なる膜表面エネルギによるものである。この場合、乾燥色素は、膜の残りの部分と大きく異なる疎水性パッチを生成する。この問題を補償するために、表面エネルギ整合が起こる必要があり、これは、最も一般的には、当業技術で公知のあらゆる数の技術を用いる後遮断段階により達成される。ニトロセルロース膜の問題解決に関する別の情報は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｅｖｉｃｅｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｉｖｄｔ／ａｒｃｈｉｖｅ／９９／０５／００２．ｈｔｍｌに見ることができる。

当業者は、縞模様にする条件を最適化することによって潜り込み現象の問題を軽減することができる。更に、当業技術でよく用いられるあらゆる数の技術を用いて、触媒の濃度を最適化し、指示薬部分中の過酸化水素を効率的に捕捉して触媒反応させることを容易にし、その結果、特定の所定の用量の過酸化水素（反応部分内のＬＣＶの濃度に基づく）が底部ＬＣＶストリップだけに色の変化を誘発する試験をもたらす必要がある場合がある。

「Ｗｈａｔｍａｎフィルタ」紙（カタログ番号１００３１１０、３１．７５×３１．７５ｍｍの大きさに切断したもの）を最初に０．１ｇ／ｍｌの「Ｈｙｂｒａｎｅ−３２」デンドリマー（ＤＳＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に約３分間浸漬し、次に、１５ｍｌの１３．３ｍｇ／ｍｌのＦｅＣｌ₂水溶液に３分間浸漬した。得られる黄色がかった濾紙は、次に水で完全に洗い、それから３７℃で乾燥させた。乾燥した濾紙は、次に切断し、過酸化水素を掃去するための３×４ｍｍ掃去パッドにした。
２つの発色団バンドの間の過酸化水素の掃去を明らかにするために、実施例１で生成したものと同一の試験ストリップを用い、２つの発色団バンド及び１つの掃去バンドを備えたストリップを組み立てた。

３×４ｍｍ掃去パッドを２つの発色団バンドの間のチャンネルの上部に置いてテープで保持し、ストリップの端部を２マイクロリットルの２５ｍＭ過酸化水素溶液を含有する４０マイクロリットルの１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８８）に入れることによって試験を開始した。第１のバンドでは、激しい色の変化が観察されたが、第２のバンドは、僅かな色の変化を示すだけであった。同じ条件下で、掃去試薬を含まない対照掃去パッドでは、両方の発色団バンドで激しく色が変化することになった。
本発明をその特定的な実施形態に関して詳細に説明したが、以上の事項を理解すると、当業者が、これらの実施形態の変更、変形、及び均等物を容易に考えることができることは認められるであろう。従って、本発明の範囲は、特許請求の範囲及びそのあらゆる均等物の範囲であると判断すべきである。

本発明のラテラルフローアッセイ装置の一実施形態の斜視図である。 掃去部分を含む本発明のラテラルフローアッセイ装置の一実施形態の斜視図である。

符号の説明

２０ ラテラルフローアッセイ装置
２２ 多孔性膜
２４ 硬質材料
３０ 検出部分

Claims (17)

1. 試験サンプルにある検体の存在又は量を検出するためのラテラルフローアッセイ装置であって、
   多孔性膜、
   を含み、
   前記多孔性膜は、吸上げパッドと連通しており、かつ
   前記多孔性膜は、
   検体を含有するサンプルが堆積したサンプル付加部分と、
   前記検体、又は２次的トリガ、又は該検体及びトリガ発生試薬からの反応生成物と化学的に反応し、視覚的に検出可能な信号を発生するように構成された第１の発色団が内部に不動化された検出部分と、
   を形成する、
   ことを特徴とする装置。
2. 前記検体が材料と反応して過酸化水素を生成する、前記サンプル付加部分と前記検出部分の間のトリガ発生部分を更に含むことを特徴とする請求項１に記載のラテラルフローアッセイ装置。
3. 前記検体と化学的に反応して視覚的に検出可能な信号を発生させるように構成された第２の発色団を更に含むことを特徴とする請求項１に記載のラテラルフローアッセイ装置。
4. 前記検体と化学的に反応して視覚的に検出可能な信号を発生させるように構成された第３の発色団を更に含むことを特徴とする請求項３に記載のラテラルフローアッセイ装置。
5. 視覚的に検出可能な信号を発生させることなく前記検体と化学的に反応するように構成された掃去材料を有する掃去部分を更に含むことを特徴とする請求項１に記載のラテラルフローアッセイ装置。
6. 前記発色団は、アリールメタンであることを特徴とする請求項１に記載のアッセイ装置。
7. 前記アリールメタンは、ジアリールメタン及びトリアリールメタンから成る群から選択されることを特徴とする請求項６に記載のアッセイ装置。
8. 前記発色団は、Ｒ、Ｒ’、及びＲ”が、置換及び非置換アリール基から独立に選択される以下の一般構造：
   

   

   を有するトリアリールメタンであることを特徴とする請求項６に記載のアッセイ装置。
9. 前記アリール基の少なくとも１つは、アミノ置換、ヒドロキシル置換、カルボキシル置換、スルホン酸置換、アルキル置換、カルボニル置換、又はその組合せであることを特徴とする請求項８に記載のアッセイ装置。
10. 試験サンプルにある検体の存在又は量を検出するためのラテラルフローアッセイ装置であって、
    多孔性膜、
    を含み、
    前記多孔性膜は、吸上げパッドと連通しており、かつ
    前記多孔性膜は、順に、
    検体を含有するサンプルが堆積したサンプル付加部分と、
    前記検体が材料と反応して過酸化水素を生成するトリガ発生部分と、
    過酸化水素と化学的に反応して視覚的に検出可能な信号を発生させるように構成された第１の発色団が内部に不動化された第１の検出部分と、
    視覚的に検出可能な信号を発生させることなく過酸化水素と化学的に反応するように構成された第１の掃去材料を有する第１の掃去部分と、
    過酸化水素と化学的に反応して視覚的に検出可能な信号を発生させるように構成された第２の発色団が内部に不動化された第２の検出部分と、
    視覚的に検出可能な信号を発生させることなく過酸化水素と化学的に反応するように構成された第２の掃去材料を有する第２の掃去部分と、
    過酸化水素と化学的に反応して視覚的に検出可能な信号を発生させるように構成された第３の発色団が内部に不動化された第３の検出部分と、
    を形成する、
    ことを特徴とする装置。
11. 試験サンプル内の検体の存在又は不在を検出する方法であって、
    ｉ）検出部分を形成する多孔性膜を含むアッセイ装置を１つ又はそれよりも多くの検体を含有する試験サンプルに接触させる段階、
    を含み、
    前記検体と、又は第２のトリガと、又は該検体及びトリガ発生試薬からの反応生成物と化学的に反応すると色の変化が起こる発色団が、前記検出部分内に含まれており、
    ｉｉ）前記試験サンプル内の前記検体のある一定の濃度に対応する前記検出部分での前記発色団の前記色の強度を測定する段階、
    を更に含むことを特徴とする方法。
12. 前記発色団は、アリールメタンであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 前記発色団は、Ｒ、Ｒ’、及びＲ”が、置換及び非置換フェニル基、ナフチル基、及びアントラセニル基から独立に選択される以下の一般構造：
    

    

    を有するトリアリールメタンであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. Ｒ、Ｒ’、又はＲ”の少なくとも１つは、アミノ置換、ヒドロキシル置換、カルボキシル置換、アルキル置換、カルボニル置換、スルホン酸置換、又はその組合せであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
15. 前記試験サンプルは、膣液から得られることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
16. 前記試験サンプルは、創傷滲出液から得られることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
17. 前記試験サンプルは、血液から得られることを特徴とする請求項１４に記載の方法。

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