DD224950A1 - Teststreifen zur bestimmung von h tief 2 o tief 2 bzw. h tief 2 o tief 2-bildenden stoffgemischen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Teststreifen zur Bestimmung von H2O2 bzw. H2O2-bildenden Stoffgemischen, insbesondere von Glucose, Harnsaeure oder Cholesterol. Das Ziel besteht darin, die Anzahl farbbildender Bestandteile von Teststreifen zu verringern, die mehr als einen Farbkuppler enthalten. Das Ziel wird erfindungsgemaess dadurch erreicht, dass der Teststreifen neben den ueblichen Ingredenzien, wie z. B. Enzyme und oxydierbare p-Phenylendiaminderivate, unsymmetrische bifunktionelle Farbkuppler, deren funktionelle Gruppen eine unterschiedliche Kupplungsaktivitaet aufweisen, der allgemeinen Formel X-NH-Y; X-NH-Z; Y-NH-Z, wobei X Derivate des Acet- bzw. Benzoylessigester, Y Naphtholderivate und Z Pyrazolonderivate sind, enthaelt. Der Teststreifen wird in der medizinischen Diagnostik, in der chemischen und biochemischen Analytik eingesetzt.

Description

Dr, Kanrig

Or. Ullraann

Dr. Brandstaedter

"Teststreifen zur Bestimmung von H₂O₂ bzw. H₂Q₂-bildend3n Stoffgemischen"

Anwendungsgebist der Erfindung

Die Erfindung betrifft einen ein- oder mehrschichtigen Teststreifen zur fotoraetrischen» vorzugsweise aber zur visuellen Bestimmung von H₂O₂,, Peroxiden und H„Q,,-bildenden Stoffgenischen,, insbesondere zum Nachweis von Glucose, Harnsäure oder Cholesterol, bei denen HpO₂ als Produkt gebildet wird. Der Einsatz ist in der klinischen Diagnostik raöglich,, z, 3* zur Bestimmung von Glukose mittels GOD., insbesondere zu Prophylaxe und Therapie des Diabetes inellitus,. desweiteren in der chemischen und biochemischen Analytik, in der Produktion für Meß- und Kontrollzwecke sowie in der Nahrungsgütervvirtschaft,. der mikrobiologischen Industrie und der Landwirtschaft ·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Der Nachweis von H₂O₂ bzw. von HpO₂-bildenden Stoffgemischen ist für die medizinische Diagnostik, die Fermentationsindustrie und andere Produktionsbereiche sowie für die chemische und biochemische Analytik von Interesse. Die routinemäßigen Bestimmungsverfahren z. B. in der mikrobiologischen Industrie sind zeit- und raaterialaufwendig.

Mit den bekannten Teststreifen (WP 145 423, WP 135 243, WP 140 175, US-PS 4 042 335, US-PS 4 050 398), die aus mit Indikatorlösungen getränktem Vliesmaterial bzw. aus bekannten schichtbildenden Systemen der Filmindustrie bestehen _r in die

die Nachweisreagentien eingebettet sind, lassen sich insbesondere visuelle Bestimmungen der Konzentration von Inhaltsstoffen über die Variation der Farbtiefe des Indikators bei gleichem Farbton durchführen. Machteilig für diese Systeme ist die geringe Auflösung des Auges bei relativ großen Farbtiefen. Ein weiterer Nachteil der meisten handelsüblichen Teststreifen.ist die Inkonstanz des Farbstoffes, was zur Folge hat, daß ein vorgegebenes Zeitregime bei der Handhabung einzuhalten ist und damit der Einsatz durch ungeschultes Personal nur bedingt möglich ist.

Teststreifen (Deutsches Gesundheitswesen _24 (1969) 1368, Deutsches Gesundheitswesen 2Λ (1969) 1372), die durch Einfärbung des Beobachtungsuntergrundes' eine Farbtonänderung in Abhängigkeit von der Analytkonzentration aufweisen, zeigen diese Farbtcnänderung nur in unzureichendem Ausmaß, oft verbunden mit einer Inkonstanz des Farbstoffes, Teststreifen (Otsch. raed.. Wsch« 107 (1932) 1346, Diabetes 51, Suppl. 2 (1932), 105», Lanzet I (1980),. 653), die einen relativ differenzierten Nachweis in Abhängigkeit von der Analytkonzentration durch verschiedenfarbige isolierte Testbezirke auf dem Teststreifen ermöglichen, haben einen komplizierten Aufbau.

Es wurde bereits vorgeschlagen. Teststreifen mit 2 Farbkupplern zu verwenden, wobei sich die Kupplsrkomponenten entweder in einer Schicht oder in beiden Schichten befinden. Dieser Streifen.-beruht auf unterschiedlichen Reaktionsgeschwindigkeiten bzw. auf unterschiedlichen Konzentrationen der beiden Kuppler und ermöglicht eine deutliche Differenzierung interessierender Konzentrationsbereiche des Analyten. Die Einstellung des Konzentrationsverhältnisses der beiden Kuppler ist jedoch mit einem gewissen Aufwand verbunden.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin,, die Anzahl farbbildender Bestandteile in Teststreifen und damit die Zahl aer notwendigen Schichten zu verringern, ohne auf den Farbtonvaechsei in Abhängigkeit von der Konzentration der zu bestimmenden Substanz zu verzichten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, unter Verringerung der Anzahl der farbbildenden Bestandteile einen Teststreifen zu schaffen, mit dem H-O» bzw. H^O^-bildende Stoffgeniische, insbesondere Glukose,; Harnsäure und Cholesterol in biologischen Flüssigkeiten bestimmt «erden können

Dar erfindungsgemäße Teststreifen, ds'r substrat'spezif ische' ⁱ"ⁱ2⁰2""^erzeu^^enc^^{e unc}^ i-UCU-übertragende Enzyme, oxydierbare p-Phenylendiaminderivate und Farbkuppler, die ein- oder mehrschichtig mit Gelatine als Bindemittel auf transparente oder nichttransparente-Träger-aufgebracht sind, enthält,: ist dadurch gekennzeichnet, daS _;ai_s Kuppler oifun.ktionelle .Farbkuppler mit unterschiedlicher Kupplungsaktivität der beiden kupplungsfähigen Gruppen der allgemeinen Formeln X-NH-Y, X-NH-Z und Y-NH-Z eingesetzt werden, wobei

0 1/

X = R₁-C-CH₀-C-

1 „ d

oder

odar

SO-H , ³ oder

OH

oder

OH

ChL

₂ a S₃ = R₄ = H, SO₃H ₅ ..« H, SO₃H, .Br

R₅ = H, Br

Z =

R₇ = CH₃, C₂H₅,

Ro = H, SO^H, Br •»0 ^

oder

C6

Ci

Bei der Herstellung des Teststreifens werden alle Ingredenzien in Gelatine-Lösung eingearbeitet und nach üblichen Verfahren auf eine flexible,, folienartige _t; transparente oder nichttransparente Unterlage ein- oder mehrschichtig aufgetragen, wobei die Gesamtschichtdicke ca. 100 ,um nicht überschreitet »Beim Auftragen einer - beispielsweise glucosehaltigen - Flüssigkeit entsteht unter Wirkung des Enzyms Glucoseoxidase Wasserstoffperoxid, das unter Mitwirkung von Peroxidase das p-Phenylendiaminderivat oxydiert. Dieses Oxydationsprodukt bildet mit dem anwesenden unsymmetrischen bifunktionellen Kuppler,, wobei die beiden funktionellen Gruppen eine unterschiedliche Kupplungsaktivität aufweisen, einen diffusionsfesten Farbstoff- dessen Farbton und Farbtiefe von der Konzentration des zu bestimmenden Stoffes und vom eingesetzten Kuppler abhängt..

Der entstandene Farbstoff absorbiert entsprechend der chemischen Konstition des chromophoren Kupplersysteins

- im. .bläuen.-und roten Teil des Spektrums entsprechend der allgemeinen Formel X-NH-Y: bisfunktionelle Kuppler, .aus Derivaten des Acetessigesterbzri Benzoylessigester und des Naphthols bzw. Phenols

- im blauen und grünen Bereich des Spektrums entsprechend der allgemeinen Formel X-NH-Z: bisfunktionelle Kuppler aus Derivaten des Acetessigester bzw. Benzoylessigester und 3-Amino-pyrazolonen oder

- im grünen und roten Wellenbereich entsprechend der allgemeinen Formel Y-NH-Z: bisfunktionelis Kuppler aus Derivaten des 3-Araino-pyrazolon und des Naphthols bzw. Phenols oder 8-Hydroxychinolins.

Die Farbverschiebungen werden durch die unterschiedliche Reaktivität der kupplungsaktiven Teilkomponenten des öisfunktionellen Kupplers verursacht, die durch Substitution des Wasserstoffs an der aktiven Methylengruppe im Ringsyst-em durch Br, Ci oder So,H gezielt' beeinflußt werden kann.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 .

50 ml einer 9 %i.gen Gelatinelösung, die 1 ramol N,H -Dimethylp-Phenylendiaroin als Farbentwickler und 2 mmol l-Hydroxy-8-(benzoylessigesteraraid)~naphthalin-5-sulfonsäure als bis funktioneilen Gelb- und Blaugrünkuppler sowie die Enzyme Glucoseoxidase und Peroxidasa enthalten, werden auf einer transparenten Celluloseacetatfolie aufgetragen. Der pH-Wert der Lösung beträgt 7,0. Als Schutzschicht wird ein überzug mit gehärteter Gelatine aufgetragen,

Oer trockene Teststreifen wird durch Glucoselösungen zunehmender Konzentration von Gelb über Grün nach Slaugrün verfärbt . .

Dia Konzentrationsbestiramung der Glucose kann visuell durch Vergleich, mit Farbkoraperatoren und photoraetrisch bei 2 Wellenlängen in kommerziellen Spektrophotornatern durchgeführt werden.

Beispiel.2 - 11

Gemäß-der Verfahrensweise im Beispiel 1 wird der genannte Gelb-3laugrün-Kuppler durch folgende kuppelnde Verbindungen ersetzt: .

2. l-Hydroxy-y-iacetessigsäureamid)- naphthalin-3-sulfonsäure

3. l-Hydroxy-S-^acetessigsäureamid)- naphthalin-3,6-disulfonsäure

4. I-Hydroxy-S-Xacetsssigsäureamid)- naphtnalin-5—sulfonsäure

5* l-Hydroxy-o-(acetassigsäurearaid)- naphthalin-3-sulfonsäure

6. l-Hydroxy-2- siethyl-6-{ acetessigsäureamid)- benzol 7.. 1-Hy d r oxy-7 - (benzoy lass igsä u reamid)-na ph t haiin-3-sulf onsäure

8. l-Hydroxy-8-(benzoylessigsäureamid)-naphthalin-3,5-di-

sulfonsäura 9* l-Hydroxy-8-(benzoylessigsäureamid)-naphthalin-5-sulfon-

säure 10« l-iHydroxy-6-(benzoylessigsäureamid)-naphthalin-3-sulfon-

säure 11. 1-Hydroxy-2-raethy1-6-(benzoylessigsäureamid)-benzol

Beispiel 12

Zur Bestimmung von Glucose in biologischen Flüssigkeiten wird ein transparenter Filmstreifen nach folgendem Verfahren hergestellt : · Eine 7 %ige Gelatinelösung mit 1*5 nmol l-Phenyl-(Acstessigsäurea.mid)-4-brom-4,5,-dihydro-pyrazol-5-on als bis funktional· le.r .Gelbpurpurkuppler*. 3 .cjmol ...eines Derivates der p-Phenylendiaminreihe sowie Glucoseoxidase und Peroxidase und einem Gelatine vernetzenden Mittel zur Erhöhung der Naßfestigkeit werden vergossen und getrocknet.

Mit steigendem Glucosegehalt in der Analysenprobe ,werden Farbänderungen von Gelb über Purpur nach Rot beobachtet«

Beispiel 13 - 24.

Gemäß der Verfahrensweise im Beispiel 12 wird der genannte Gelb-Purpur-Kuppler durch folgende kuppelnde Verbindungen ersetzt: .13. l-Methyl-3-(acetessigsäureamid)-4,5-dihydrapyrazol-5-on

14. l-Äthyl-3-(acetessigsäur3amid)-4,5-dihydropyrazol-5-on

15. 1-Pheny1-3-(acetessigsäureamid)-4_r5-dihydropyrazol-5-on

16. l-(2,4,6-Trichlorphenyl)-3-(acetessigsäureamid)-4,5-dihydropyrazol-5-on

17. l-Methyl-3-(acetessigsäureamid)-4-sulfo-4-j5-dihydropy razol-5-on

18. l-Äthyl-3-(acetessigsäureamid)-4-sulfo-4,5-dihydropyrazol-5-on

19« l>-Phenyl-3-(acetessigsäursamid)-4-sulfo-4,5-dihydropyrazol-5-on

20. 1-(2,4,6-Trichlorphenyl)-(ac3tessigsäureamid)-4-sulfo-4,5-dihydropyrazol-5~on

21. l-Methyl-3-(acetessigsäureamid)-4-Brom-4,5-dihydropyra~ zol-5-on

22. l-Äthyl-3-{acetessigsäureamid)-4-Bro(n-4,5-dihydropyrazol~5-on

23· l-Phenyl-3-(acetessigsäureamid)-4~8rom-4,,5-dihydropy ra-

zoI-5-on 24. l-(2„.4_#5-Trichlorphenyl)-3-(acetessigsäureaniid)-4-arora-4„5-dihydropyrazol-5-on

oder analog zu den vorher angeführten Beispielen anstelle der Derivate der Acetessigsäure durch Derivate der Senzoylessigsäure,., wobei entsprechend den unterschiedlichen Aktivitäten der Kuppler Farbtiefe und Farbton variieren.

Beispiel 25

Zur Bestimmung von Harnsäure wird ein Teststreifen nach der herkömmlichen Beschichtungstechnologie aus einer Gelatinelösung», die die aktiven Zusätze enthält, auf Fotorohpapier hergestellt,

Oie Schicht enthält 0^5 mtnol l-Phenyl-3-(5-hydroxy-8-broinchinolin-6-carbamido)-4_r5-dihydro-pyrazol-5-on als bisfunktionellen Kuppler und 1 ramol fJjNjDiäthyl-p-phenylendiamin sowie Uricase und Peroxidase.

Auf die; Reaktionsschicht wird eine zusätzliche Schutzschicht von gehärteter Gelatine aufgetragen und ein Schicht-pH von 8 eingestellt. Bei'Einwirkung von Harnsäure ändert sich in Abhängigkeit von der Konzentration die Farbe von Purpur über Blau-Grün nach Blau.

Beispiel 26 - 36

Gemäß der Verfahrensweise im Beispiel 25 wird der genannte Purpur-Blaugrün-Kuppler durch folgende kuppelnde Verbindungen ersetzt:

26. l-Phenyl-3-(1-hydroxy-naphthalin-2-carbatnido)-4,5-dihydropyrazol-5-on

27. l-Phenyl-3-(1-hydroxy-naphthalin-2-carbamido)^-brora^,5-dihydropyrazol-5-on

28. l-Phenyl-3-(l-hydroxy-naphtbalin-2-carbaraido)-4-sulfo-4»5-dihydropyrazol-5-on

29. l-Phenyl-3-(5-hydroxy-8-bromchinolin-6-carbaraido)-4-brom-4_r5-dihydropyrazol-5-on

30. l-Phenyl-3-(5-hydroxy-8-brorachinolin-6-carbamido}~4-sulfo-4„5-dihydropyrazol-5-on

31. 1-Pheny1—3-(5-hydroxychinolin-6-carbarnido)-A₁ 5-dihydropy razol-5-on

32. l-Phenyl-3-(5-hydroxychinolin-6-carbaroido)-4-brom-4,5-dihydropyrazol-5-on

33. 1-Pheny1-3-(5-hydroxychinolin-6-carbaraido)-4-sulf0-4,5-dihydropyrazol-5-on

34. l-Phenyl-3-(2-hydroxy-3-raethyl-benzaraid)-4,5-dihydropyrazol-5-on

35. l-Phenyl-3-(2-hydroxy-3-msthyl-benzaniid)-4-broin-4,.5-dihydropy razol-5-on

36· l-Phenyl-3-{2-hydroxy-3-methyl-benzaraid)-4-sulfo-4,5-dihydropyrazol-5-on

wobei außerdem die 1-Pheny!gruppe im 4,5-dihydropyrazolon-5-on-lRing durch Methyl-, Äthyl- und 2,4,5-Trichlorphsny!gruppen ausgetauscht werden kann.

Claims (1)

1. £rfindungsanspruch

   Teststreifen zur Bestimmung von Glucose, Harnsäure und/oder Cholesterol auf der Grundlage der Wirkung substratspezifischer H-Op-erzeugender und HpQp-übertragender Enzyme,, oxydierbarer p-Phenylendiaminderivaten und Farbkupplern, die ein- oder mehrschichtig mit Gelatine als Bindemittel auf transparente oder nichttransparente Träger aufgebracht sind, dadurch gekennzeichnet, daß der Teststreifen als Kuppler bisfunktioneile Farbkuppler mit unterschiedlicher Kupplungsaktivität der beiden kupplungsfähigen Gruppen der allgemeinen Formel X-NH-Y, X-NH-Z und Y-NH-Z enthält, wobei

   0 11

   χ = R-C -CH₀- C-1 II 2

   oder

   -* oder

   OH

   oder

   oder

   R₂= R₃= R₄= H, SO₃H

   R₅= H, 3O₃H, Br

   R,= H, 3r

   -ΛΛ -

   *+

   R.

   R_Q= H, SO-H, Br

   oder

   CL

   b w