DE2130340A1 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Substanzen - Google Patents
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von SubstanzenInfo
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Description
Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Weickmann,
Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke
DiPL.-lNG. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
int. Ur. 1739 R
f MÜNCHEN 86, DEN POSTFACH «60 820
<983921/22>
BOEHRIITGER MANNHEIM ÜMBE, Mannheim
Sandhofer Straße 112 - 152
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Substanzen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung
von Substanzen in sauerstoffhaltiger wässriger Lösung durch Oxydation oder Reduktion in Gegenwart von Sauerstoff übertragenden
Enzymen sowie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Substrate von Sauerstoff übertragenden Enzymen werden in der Technik wie auch im klinischen Labor in großem Umfang laufend
quantitativ bestimmt. Hierbei besteht ganz allgemein das Problem, diese Bestimmungen rasch und einfach, da.h. ohne Anwendung
besonderer Reinigungs- und Trennverfahren so durchzuführen,.daß die zu bestimmende Substanz chemisch zu einem quantitativ erfaßbaren
Produkt umgesetzt wird. Häufig bedient man sich hierzu enzymatischer Umsetzungen. So wird beispielsweise die
D-Glucose mit Hilfe des Enzyms Glucoseoxydase unter Beteiligung
molekularen Sauerstoffs zur Gluconsäure oxydiert. Dabei gleichzeitig entstehendes Wasserstoffperoxyd wird mit einem Leukofarbstoff
umgesetzt unter Bildung eines Farbstoffs, dessen
Extinktion im Photometer gemessen wird und der Glucosemenge äquivalent ist. Dieses Verfahren, das als grundsätzliches
209852/0430 ς
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Beispiel für viele Substratbestimraungen, beispielsweise von
Harnsäure, Galactose und dgl. steht, hat zahlreiche ITachteile. Im allgemeinen muß bei biologischen Proben enteiweißt werden,
was einen zusätzlichen Arbeitsschritt bedeutet. Das Verfahren erfordert einen relativ großen Zeitaufwand, so daß die Probenfrequenz
bei Serienanalysen nur unter Verwendung sehr aufwen-"
diger Analysenautomaten groß gehalten werden kann.
Zur Blutzuckerbestiramung wurden daher auch bereits Geräte entwickelt,
die sich der Sauerstoff bestimmung als Meßprinzip bedienen und einige der erwähnten ITachteile nicht aufweisen. Hierbei
wird id it Hilfe von sauerstoffsenßitiven Elektroden der Sauerstoffgehalt einer Lösung gemessen. Zugesetzte Glucose«
oxydase. führt unter Verbrauch von Sauerstoff zur Oxydation von Glucose. Die Änderung der Sauerstoffkonzentration wird mit der
Elektrode gemessen und ist der umgesetzten Glucoseraenge proportional.
Hierbei entfällt die Notwendigkeit zur Enteiweißung der Proben, der Zeitraum zwischen Probenapplikation und Vorliegen
des Meßergebnisses wird verkürzt und die Spezifität wegen Fortfalls angeschlossener unspezifischer Indikatorreaktionen,
ist hoch.
Aucb dieses Verfahren weist jedoch noch zahlreiche ITachteile
auf. So muß das Volumen der zu bestimmenden Probe mit Hilfe geeichter Meßpipetten festgelegt werden» was nicht nur Arbeitsauf
v/and bedeutet, sondern auch beträchtliche Fehlermöglichkeiten ergibt. So sind Methoden bekannt, die diskontinuierlich arbeiten.
Hierbei muß eine die sauerstoffsensitive Elektrode enthaltende Meßzelle mit einer definierten Menge an Reagens gefüllt werden..
Ein ITachteil ist hierbei die Möglichkeit der Bildung von Luftblasen
an der Elektrodenoberfläche, welche die Bestimmung stören. Eine definierte Probemenge muß in die gerührte Lösung
eindosiert werden und nach einer festgelegten Zeitdauer muß ein Meßwert abgelesen werden. Vor Durchführung einer neuen
Messung muß die Zelle entleert v/erden. x;Ieim das System einige '
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Stunden, nicht in Betrieb war, wird eine umständliche und langwierige
ifeueichung erforderlich, die wohl auf Veränderungen an
der Elektrodenoberfläche zurückzuführen ist. Es wurde daher auch schon ein Verfahren beschrieben, bei welchem eine säuerst
off sensitive Elektrode ständig von einem Reagens umströmt
wird, das gelöste Glucoseoxydase enthält. Die Probenapplikätioft
erfolgt hierbei aus einem Sekundärstrom, der die zu bestimmende
Glucose enthält, indem durch eine semipermeable Membran Glucose in den Reagensstrom hineindialysiert. Dieses Verfahren hat den
Nachteil, daß der Zeitraum bis zum Vorliegen des Meßergebnisses relativ groß ist,, da die Dialyse langsam verläuft. Ferner ist
ein Verfahren bekannt, bei welchem an der Elektrodenoberfläche unmittelbar immobilisierte Glucoseoxydase angebracht ist. Die
Oxydation der Glucose erfolgt an der Oberfläche der Elektrode. Dieses Verfahren eignet sich praktisch nur zur diskontinuierliehen
Glucosebestimmung, da nur begrenzte Enzymmengen an der Oberfläche der Elektrode fixiert werden können, so daß für die
Umsetzung der Glucose ein relativ langer Seitraum notwendig ist..
Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens»
welches die beschriebenen Nachteile vermeidet und insbesondere eine rasche fehlerfreie und jederzeit sofort einsetzbare Methode
zur Durchführung auch größerer Bestimraungsreihen darstellt.
Gelöst wird diese Aufgabe erfinäungsgemäß durch ein Verfahren
zur quantitativen Bestimmung von Substanzen in sauerstoffhaltiger wässriger Lösung durch Oxydation oder Reduktion in Gegenwart von Sauerstoff übertragenden Enzymen und Messung der Veränderung
der Sauerstoffkonzentration mittels sauerstoffsensitiver Elektrode, welches darin besteht, daß eine bestimmte Menge
der die zu bestimmende Substanz enthaltenden Lösung luftblasenfrei in einen mit konstanter Geschwindigkeit fließenden Strom
einer Pufferlösung bestimmter Sauerstoffkonzentration blockartig ohne Änderung der Strömungsgeschwindigkeit eingegeben,
über Träger gebundenes Enzym geleitet und anschließend zur
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sauerstoffsensitiven Elektrode geführt wird.
Für das erfindungsgemäße -Verfahren geeignet sind solche Substanzen,
welche sich in Gegenwart von Sauerstoff übertragenden Enzymen unter Aufnahme oder Abgabe von Sauerstoff umsetzen lassen.
Beispiele für derartige Substanzen sind Zucker wie Glucose und Galactose, Harnsäure, Nucleosidbasen wie Xanthin und Hypo-.
xanthin, Cytochrom, Aminosäuren, polyungesättigte Fettsäuren,
Wasserstoffperoxyd und anorganische Peroxyde.
j
AIb Sauerstoff übertragende Enzyme, die im Rahmen der Erfindung ah einen Träger gebunden eingesetzt werden, seien erwähnt Glucoseoxydase, Galactoseoxydase, Uricase, Xanthinoxydase, Oytochromoxydase, Arainosäureoxydasen, Lipoxygenase, Peroxidase und Katalase.
AIb Sauerstoff übertragende Enzyme, die im Rahmen der Erfindung ah einen Träger gebunden eingesetzt werden, seien erwähnt Glucoseoxydase, Galactoseoxydase, Uricase, Xanthinoxydase, Oytochromoxydase, Arainosäureoxydasen, Lipoxygenase, Peroxidase und Katalase.
Die Sauerstoff übertragenden Enzyme raüseen" im Rahmen des erfindungsgemäßen
Verfahrens an einen Träger gebunden vorliegen. Der Träger muß zweckmäßig so beschaffen sein, daß das Enzym
in hoher spezifischer Aktivität gebunden wird und eine Zersetzung
des Trägers und ein Verlust an Enzymaktivität weitestgehend ausgeschaltet ist. Ein geeigneter Träger ist beispielsweise
in der OS ' beschrieben.
Der Träger soll vorzugBwei.se teilchenföfmig vorliegen, so daß
er als Säulenfüllung geeignet ist, welche von der Pufferlösung durchströmt wird und dabei eine gewisse Vermischung des im .
Pufferlösungsstroa blockartig oder pfropfenartig eingesetzten
Probevolutuens mit der Pufferlösung hervorruft. Eine hohe spesifische
Aktivität des trägergebundenen Enzyms ist erwünscht, da dies die Anwendung sehr kleiner Mengen an trägergebundenem
Enzym ermöglicht,, wodurch die Vermischung des Probe~"Blooksn mit
der Pufferlösung gering gehalten und die Probeafrequens erhöht
wird und leicht und rasch auswertbare Heßergebnisse erzielt v/erden» Zweckmäßig sollte die spezifische Aktivität des verwendeten
trägerg-ebundensn Enzyms wenigstens 10 U/g, vorzugsweise
mehr als 50 U/g, ■ und beson-
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de.rs "bevorzugt mehr als 10Ö U/g "betragen.
Ein. wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht
in der luftblasenfreien blockartigen Einführung der Lösung, welche die zu bestimmende Substanz (beispielsweise die
Glucose) enthält in den Pufferlösungsstrom. Die Lösung soll· da*7
bei unter möglichst geringer "Vormischung mit dem Pufferlösungsstrom
so eingeführt werden, daß sie nach Art eines Flüssigkeitspfropfens im fließenden Strom wandert. Eine derartige Einführung
läßt sich beispielsweise mit Hilfe eines Schiebers erzielen, welcher in einer Bohrung . die abgemessene Menge der Lösung enthält
und so in den fließenden Pufferlösungsstrora gebracht wird,
daß die Probelösung blockartig bzw. pfropfenartig in der Pufferlösung mitgeführt wird.
Ein weiteres wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens
besteht darin, daß ein mit konstanter Geschwindigkeit fließender Strom einer geeigneten Pufferlösung als Träger und
Reaktionsmittel für die Umsetzung verwendet wird. Unter konstanter
Geschwindigkeit wird hierbei 'eine solche Konstanz der Geschwindigkeit verstanden, 'daß die unvermeidlich auftretenden
Geschwindigkeitsschwankungen so gering sind, daß sie von dem mit der Elektrode verbundenen Anzeigegerät praktisch
nicht registriert werden. Diese Bedingung ist ideal erfüllt, wenn eine konstante Sauerstoffkonzentration angezeigt wird, so
lange kein Probelösungsblock die Elektrode passiert. Wird diese konstante Geschwindigkeit nicht eingehalten, so wird
durch das ständig anzeigende Gerät eine Änderung der Sauerstoffkonzentration vorgetäuscht. Eine solche Änderung würde auch vorgetäuscht
werden, wenn bei der Einführung der Probelösung Luftblasen
in. den Reagensstrom gebracht werden.
Wesentlich ist weiter, daß die blockartige Einführung der Probelösung keine Änderung der Strömungsgeschwindigkeit des mit kon-
£5tanter Geschwindigkeit fließenden Stroms der Pufferlösung her*·
vorruft, da auch hierdurch die Gefahr einer Verfälschung des ■
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Meßergebnis3es hervorgerufen würde. Erst die gleichzeitige Er-
füllung aller oben angegebenen wesentlichen Merkmale des ererfindungsgemäßen
Verfahrens ermöglicht es, die weiter unten beschriebenen Vorteile zu erzielen und.eine ständig betriebsbereite
vollautomatisch arbeitende Vorrichtung zu schaffen, welche die gewünschten Messungen durchführt, ohne daß irgendwelche
Pipettierschritte, Voluroenmessungen, Zeitmessungen oder
dgl. notwendig sind.
Geeignete sauerstoffsensitive Elektroden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind bekannt. Beispiele für geeignete
sauerstoffsensitive Elektroden sind Sauerstoff-Elektrode von L. Escbweiler und Co., Polarographic Oxygen Sensor 39 550
von Beckmann Instruments, Säuerstoffelektrode von Hartmann und
Braun AG, Frankfurt.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren so durchgeführt, daß die Pufferlösung nach Passieren der Elektrode im
Kreislauf geführt wird, wobei verbrauchte Komponenten wieder ergänzt werden. Wird beispielsweise das Verfahren unter Verwendung
einer zu bestimmenden Substanz durchgeführt, welche unter
Sauerstoffverbrauch oxydiert wird, so wird der Sauerstoffgehalt
der Pufferlösung wieder ergänzt, indem beispielsweise Luft durchgaleitet wird, was zweckmäßig in einem etwas größeren Behälter
mit entsprechender Verweilaeit der Pufferlösung erfolgt. Palis die zu bestimmende Substanz reduziert wird unter Erhöhung
des Sauerstoffgehaltes der Lösung, wird der überschüssige Sauerstoff wieder entfernt, indem in entsprechender Weise ein säuerst offfreies Trägergas, beispielsweise Stickstoff oder ein Edelgas,
durchgeleitet wird.
Die Pufferlösung selbst stellt eine wässrige Lösung eines für das jeweils verwendete Enzym geeigneten Puffers in üblicher
Konzentration dar. Die geeigneten Puffer und Puffcrkouzentrationon
sov/ie die günstigen pK~V/erte für die jeweils verwendeten
sind bekannt.
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BADÖRlÄAt 'H
BADÖRlÄAt 'H
Bis Pufferlösung kann gegebenenfalls noch andere Substanzen
außer den puffernden Verbindungen enthalten, welche für die
enayraatische Umsetzung notwendig oder erforderlich sind. Beispiele
hierfür sind Salze, welche etwa erforderliche Ionen, wie z,B. Magnesiumionen, Sulfationen und dgl. enthalten oder stabilisierend
v/irkende Verbindungen, oberflächenaktive Substanzen und dgl.
Die blockartige Eingabe der Probelöaung ohne Änderung-der Strömungsgeschwindigkeit
wird vorzugsweise so durchgeführt, daß der Pufferlösungsstrora geteilt wird und die Teilströrae abwechselnd
unterbrochen werden und die die" zu bestimmende Substanz enthaltende
Lösung (Probelösung) in den jeweils unterbrochenen Strom eingegeben wird. Besonders günstig ist es hierbei, die Probelösung
an der Unterbrechungsstelle selbst zuzugeben. Hierbei wird vorzugsweise ein Überschuß an Probelösung, beispielsweise
an Serum, zugegeben und durch Öffnen, des Teilstromes der Überschuß
abgetrennt. Dies kann beispielsweise wie oben bereits angedeutet erfolgen, indem in einen leilström des Pufferlösungsstromes
eine schieberartige Vorrichtung eingeschaltet v/ird, deren Schieber eine zur Aufnahme einer bestimmten Menge Probelösung
geeichte Bohrung enthält. Durch Eintauchen dieser Schieberöffnung in überschüssige Probelösung, z.B. überschüssiges
Probeserum, oder Öffnen der Bohrung zu einem größeren Behälter, der derartige Probelösung enthält, und Einfließenlassen der
Probe wird eine abgemessene Menge Probelösung bei Verschieben des Schiebers abgetrennt und blockartig'in den Pufferlösungsstrom
eingegeben, wenn die Bohrung des Schiebers in den unterbrochenen !Peilstrom der Pufferlösung so gebracht wird, daß durch
diese Bohrung die Öffnung des unterbrochenen Stromes erfolgt. Vorzugsweise wird hierbei gleichzeitig der andere, bis zu diesem
Zeitpunkt nicht unterbrochene Teilstrora unterbrochen, was durch
den gleichen Schieber erfolgen kann.
Eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist gekennzeichnet durch eia Pufferreservoir, einen Probeapplikator, eine Säule mit trägergebundenem Enzym und eitie
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BAD QRIGINAt.
Bauerstoffsensitive Elektrode rait Verstärker und Registriergerät,
die miteinander in dieser Reihenfolge durch Rohrleitungen verbunden sind.
Der Probeapplikator besitzt vorzugsweise wenigstens zwei durch
einen Sperrschieber mit wenigstens zwei korrespondierenden Bohrungen abwechselnd zu sperrende Durchlässe und eine der Bohrun^·
gen steht mit einer Zuflußleitung für die die zu bestimmende Substanz enthaltende Lösung in Verbindung, wenn der korrespondierende
Durchlaß gesperrt ist.
G-emäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform steht der
Applikator mit einer einen Unterdruck liefernden Vorrichtung, z.B. einer Vakuumpumpe in Verbindung, mit der die Zuflußleitung
für die Probelösung und die Probebohrung im Schieber evakuiert
werden können»
In einer bevorzugten Ausführungsfortn besteht der Applikator aus
einer Hülse mit verschiebbarem Kern, wobei Hülse und 'Kern je
drei Durchlässe aufweisen, die durch Verschieben des Kerns zur Deckung gebracht werden können. Besonders zweckmäßig ist ein
derartiger Applikator gekennzeichnet durch eine Hülse mit einer ersten und zweiten Einlaßbohrung, einer ersten und zweiten Auslaßbohrung,
einer Lufteinlaßbohrung, einer Vakuumbohrung und einer Probelösungsbohrung, sowie einem in der Hülse verschiebbar
angeordneten Kern mit drei Bohrungen, die so angeordnet sind, daß durch Verschieben des Kerns die erste Einlaß- mit der
ersten Auslaßbohrung, die zv/eite Einlaß- mit der zweiten Auslaßbohruog,
die Lufteinlaß- mit der Vakaumbohrung und die Probelösungsbohrung
mit der Vakuumbohrung verbunden werden können, wobei nicht gleichzeitig die erste Einlaßbohrung mit der ersten
Auslaßbohrung und die zweite Einlaßbohrung mit der zweiten Auslaßbohrung verbunden werden.
Vorzugsweise enthält die erfindungsgemäße Vorrichtung weiter
eine Pumpe mit konstanter Förderleistung in der Leitung· vor
oder hinter dein Applikator. Hierbei kann beispielsweise eine
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Schlauchpumpe Verwendung finden. Eine bevorzugte Sohlauchpumpe
wird in der deutschen Patentschrift (Patentanmeldung
P 20 25 056.0) beschrieben.
Der erforderliche mit konstanter Geschwindigkeit fließende^Strom
der Pufferlösung läßt sich jedoch auch ohne Pumpe erreichen, indem die Lösung mit konstanter Druckdifferenz durch die Vorrichtung
geführt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung
v/erden nachstehend anhand der beigefügten Zeichnung näher erläutert. In dieser stellen dar:
Figur 1 eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Figur 2 eine scheraatiscbe Darstellung der Führung des Pufferlösungsstromes
an der SauerstofiSLektrode,
Figur 3 eine Ansicht der mit, trägergebundenein Enzym gefüllten
Säule im Schnitt,
Figur 4 eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Applilcators
mit Verbindungsleitungen öov?ie im Längsschnitt und Querschnitt,
Figur-5 eine Regist rierlcurve,
Figur 6 eine Eichlcurve,
Figur 7 eine weitere Registrierkurve, und
Figur G die zugehörige Eichlcurve.
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Wie in. Figur 1 gezeigt enthält ein Reservoir R einen Torrat
an Pufferlösung. Die Pumpe P fördert die Pufferlösung aus dem
Reservoir R in den Probenapplikator A und von dort in die mit
den) trägergebundenen Enzym beschickte Säule S und weiter in den
die Meßelektrode enthaltenden Detektor B sowie schließlich wieder in das Reservoir zurück. Am Detelrtor angeschlossen sind
ein elektronischer Verstärker Y, der die Meßsignale der Elektrode verstärkt und sie zur Registrierung an das Registriergerät G-,
welches "beispielsweise ein Schreiber sein kann, weiterleitet. '
Das Reservoir R kann aus einem beliebigen Gefäß bestehen, welches eine Ablauföffnung für Pufferlösung enthält. Bei der vorzugsweisen
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Kreislauf der Pufferlösung enthält es weiter eine Zulauföffnung
für Pufferlösung sowie zweckmäßig eine Öffnung zur Einleitung von Luft. Bei dieser Ausführungsform dient eine Pumpe M zur Erzeugung
eines Luftstroms. Beispielsweise sind hierfür die bei
Aquarien verwendeten Pumpen geeignet. Vorzugsweise besteht das Reservoir aus einem Gefäß in thermostatiaierter Ausführung. Die
Pumpe P, die zur Förderung des Pufferstromes dient, kann wie bereits erwähnt, als Schlauchpumpe oder auch als Kolben- oder
Kreiselpumpe gestaltet sein. Vorzugsweise ist ihre Förderlei~ stung regelbar.
Der in Figur 2 schematisch im Schnitt gezeigte Detektor besteht
aus einer Durchflußselle 1, die vorzugsweise tnermostatisierbar gebaut ist. Sie enthält eine sauerstoffsensitive Elektrode 2'
sowie einen Lösungskanal 3, in den die Heßelektrode hineinragt.
Unter der Bezeichnung "Verstärker V" sind alle funktionalen
2}eile zu verstehen, die die Meßelektrods zur Arbeit benötigt,
also Stromquelle, Anschlußleitungen zur Stromquelle, elektronische Verstärkung usw.
Das Registriergerät G dient zur Registrierung der Meßergebnisse.
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Es. können "beliebige Geräte verwendet v/erden, bevorzugt wird •jedoch
ein Schreiber, der an den Verstärker Y angeschlossen v/erden kann. Anstelle des Schreibers können auch andere Analogoder
Digitalgeräte verwendet werden. Pur die Messung erforderlich
ist nur die Anzeige des Meßsignals in Relation zum Zeitablauf. In manchen Fällen genügt auch die Registrierung des"
Meßsignalmaximums*
Die in Figur 3 im Schnitt gezeigte Säule S besteht aus einer
Säulenwand 4, die vorzugsweise zylindrische -Form aufweist und
an den Enden geschlossen ist und an einem Ende eine Einströmöffnung
5 und am anderen Ende eine Ausströmöffnung 6 für Pufferlösung aufweist. Sie ist gefüllt mit Körnern 7, die aus
Enzym auf festem unlöslichen Träger gebunden bestehen. Die Größe der Säule hängt von der gewünschten Meßempfindlichkeit,
der Meßprobemenge und der Aktivität des Enzyms ab. Torzugsweise wird eine Säule in therraostatisierter Ausführung verwendet.
Zweckmäßig ist, die Säule so gestaltet, daß sie einfach ausgewechselt werden kann, falls die Aktivität des trägergebundenen
Enzymes nachgelassen hat oder aus einem anderen Grunde ein Austausch erforderlich ist, beispielsweise, um die Vorrichtung
für die Bestimmung einer anderen Substanz einzurichten und damit ein anderes trägergebundenes Enzym einzuführen.
Der Probenapplikator A dient wie weiter* oben bereits beschrieben
zum luftblasenfreien, blockartigen Einbringen der Probelösung in den Pufferstrom. Er bewirkt die Abmessung der Probelösung
und die ständige Aufrechterhaltung des Pufferstrome3 ohne größere Geschwindigkeitsschwankungen.
In der in Figur 4 gezeigten Ausführungsform besteht der Applikator
aus einer Hülse 10 und einem darin verschiebbaren Kern Eine Einlaßleitung 12 für den Pufferstrom führt zur Bohrung 12a
in der Hülse 10. Eine Zweigleitung 13 zweigt von der Leitung
ab und führt zur Bohrung 13a der Hülse 10. Desgleichen führt · eine Aualaßleitung 14, die mit der Bohrung 14a verbunden ist
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und 25UtD Auelaß der Pufferlösung dient, an der anderen Seite der
Hülse 10 weiter. Eine Zweigleitung 15 verbindet die Auslaß-"bohrung
15a in der Hülse 10 mit der Auslaßleitung 14. Eine
Leitung 16, die mit einer Bohrung 16a in der Hülse 10 in Verbindung
steht, ist an ein Vakuum angeschlossen. Der verschiebbare
Kern 11 weißt Bohrungen 17, 18 und 19 auf, welche bei •entsprechender
Schieberstellung jeweils die Bohrungen 12a und 14a, 15a und 15a sowie '16a mit Bohrung 17 und Irichterbohrung 18 in
der Hülse 10 verbinden können. -
Bei der in Figur 4a gezeigten Normaletellung des Kerns 11 wird
in die trichterförmige Öffnung 18 die zu untersuchende Probelösung,
beispielsweise Serum, eingegossen und von dort in die Bohrung 18 des Kerns 11. Die Füllhöhe in der trichterförmigen
Bohrung 18 der Hülse 10 spielt hierbei keine Rolle, soweit nur Bohrung 18 im Kern 11 vollständig gefüllt wird. Während die
Probe eingefüllt wird, fließt der Pufferstrom von 1'3a nach 15a. Nach Abschluß des Füllens wird der Kern in Pfeilrichtung ge- .
schoben, bis sich die Bohrung 18 mit den Bohrungen 12a und 14a deckt. Die Probelösung, deren Volumen dem Volumen der Bohrung
18 im Kern 11 genau entspricht, wird vom Pufferstrom zur Säule S hin blockartig mitgeführt. Bei dieser Stellung des Kernes 11
ist der Strom von 15a nach 15a unterbrochen, gleichzeitig wird
die in der Einfüllöffnung'18 verbliebene Lösungsmenge durch die
Bohrung 19, Bohrung 16a und Leitung 16 abgesaugt. Sobald die Probelösung im Pufferstrora abgeleitet ist, wird der Kern 11 entgegen
der Pfeilrichtung Verschoben, bis sich die Bohrung 18 mit der Lufteinlaßbohrung 17 und der Auslaßbobrung 16a deckt. Die
Bohrung 13 wird dabei vom Puffer entleert und der Pufferstrom
von Bohrung 13a zu Bohrung 15a wieder freigegeben. Schließlich
wird der Kern wieder in Pfeilrichtung bis zur Ausgangsstellung
bewegt und der Vorgang kann wiederholtvsrden.
Die Größe des Applikators, insbesondere das Volumen der Bohrung
18, hängt von der Empfindlichkeit des Verfahrens, der Strömungsgeschwindigkeit
der Pufferlösung und der Größe der Säule S
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at). Palls für die Bohrung 18 ein kapillarer Durchmesser gewünscht
wird, kann zur Erleichterung des Füllvorgangs eine entsprechende Öffnung in der Hülse 10 gegenüber der Einfüllöffnung 18 angebracht
werden. Die Probe wird nicht auslaufen können, da die Oberflächenspannung des unten hängenden Tropfens ein Abreiben
verhindert.
Der Applikator kann aus beliebigem Material sein, soweit dieses
Material gegenüber den verwendeten Lösungen inert ist und einen dichten Sitz von Kern und Hülse ermöglicht. Geeignete Materialien
sind z.B. Glas, Kunststoff oder Metall. Der Applikator kann auch aus verschiedenen Materialien bestehen, beispielsweise
aus Metall mit Oberflächen aus einem gleitfähigen Kunststoff, wie z.B. Polytetrafluoräthylen.
Der Applikator läßt sich im Rahmen des oben angegebenen Prinzips auch anders gestalten, z.B. zylindrisch entsprechend einem Mehrwegehahn.
Der Parallelstrom wird in diesem Fall zweckmäßig in ■ einem zweiten Hahn gesteuert, dessen Kern auf der gleichen Achse
sitzt wie der Kern, in den die Probelösung appliziert v/ird.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung
v/eist eine Reihe besonderer Vorteile auf. Es gestattet, außerordentlich rasche Analysen durchzuführen, da das Meßergebnis
schon nach ganz kurzer Zeit (etwa 10 Sekunden bis 1 Minute) vorliegt. Durch den konstanten Flüssigkeitsstrom wird eine sehr
stabile Einstellung der Elektrode gewährleistet, die langwieriges Nacheichen überflüssig macht und ständige Betriebsbereitschaft
garantiert. Die Verwendung geeichter Meßpipetten wird überflüssig, oo daß hieraus resultierende Fehlermöglichkeiten
eliminiert werden« Durch die Verweadung trägergebundener Enzyme wird"zudem noch eine erhebliche Kosteneinsparung erzielt, da das
Enzym nicht nur ein einziges Mal- verwendet werden kann, wie bei gelösten Enzymen, sondern außerordentlich oft wieder verwendet
werden kann. Beispielsweise int eine erfindungsgemäße Vorrichtung
mit trägergebundener Glucoseoxydaae bereits seit mehr als
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einera halben Jahr in Betrieb, ohne daß ein Wechsel des Enzyms
oder eine Nacheichung der Elektrode erforderlich wurde.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Beispiel 1
Bestimmung von D-Glucose im Serum mittels Glucoseoxydase nach
der Gleichung: Glucose + O9 + H9O gir uooseoxase>
Gluconsäure
Es wurde die in Figur 1 der Zeichnung dargestellte Vorrichtung verwendet. Die Säule S wies einen Durchmesser von 1 cm und eine
Füllhöhe von 1 cm auf und war mit in Wasser gequollener Glucoseoxydase
auf Träger mit einer spezifischen Aktivität von 200 U/g beschickt. . '
Als Detektor wurde eine von der Firma Yf T ¥ in Weilheira/Obb.
erhältliche sauerstoffsensitive Elektrode mit einem von der gleichen Firma erhältlichen Sauerstoffmeßgerät der Bezeichnung
Oxi 610 E und angeschlossenem Potentioiaetersohreiber Re 511 der
.Firma Servogor verv/endet.
Die Anströmgeschwindigkeit der Elektrode betrug 7»5 cm/Sek»,
der Durchmesser der Eintrittsbohrurig in die Durchflußzelle wie in Figur 2 dargestellt 1 mm.
Der vorwendete Applikator wies im Prinzip die in Figur 4 der
Zeichnung gezeigte Konstruktion auf. Die Bohrung 18 im Kern 11
hatte 2 mm Durchmesser und 10 nra Länge. Der Applikator bestand aus Glas.
Die einzelnen Torrichtuagateile waren mit Silikonschlauch von
.1 ωά Durchmesser verbuntlan. Als Puf±*er wurde 0,2 M Kalinraphosphatpuffer
pH 6,0 verv-.'ondet, enthaltend 18 raH Kalium j οά id,
7τ 1J QiI Amaoniui'ihsptamolybtiaL- unä 500 uH Natriumchlorid.
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In den Applikator wurden iia Abstand von etwa einer Minute
Serumproben mit bestimmtem Glucosegehalt eingegeben. Die Proben '
1 bis 3 enthielten je 100 rag Glucose/ 100 ml Serum. Probe 4
enthielt 200, Probe 5 300, Probe 6 400 und Probe 7 500 mg/100 ml. Die auf dem Registriergerät aufgezeichneten Meßkurven zeigt
Figur 5, Die erhaltenen Werte sind in Figur 6 als Eichkurve v/iedergegeben und zeigen, daß die Höhe der Gipfel über der
Mull-Linie des Meßscbreibers direkt proportional dem Glucosegehalt
der Probe ist.
Beispiel 2 . /
Bestimmung von Harnsäure mittels Uricase nach der Gleichung:
Harnsäure + 2H2O + O2
Allantoin + HgO2 + 0O2
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Anwendung der gleichen Vorrichtung zur Bestimmung von Harnsäure verwendet. Die Säule S
war mit Uricase auf Träger gefüllt. Die Säule S wies einen
Durchmesser von 1 cm und eine Füllhöhe wn 5 cm auf. Die spezifische
Aktivität der trägergebundenen Uricase betrugt 3 U/g.
Es wurde- die in Beispiel 1 "beschriebene Vorrichtung verwendet.
Die Anströmgeschwindigkeit der Elektrode betrug 3,5 cm/Sek; der Durchmesser der Eintrittsbohrung in die Durchflußzelle,
wie in F^gur 2 dargestellt, betrug 1 mm:
Der verwendete Applikator wies im Prinzip die in Figur 4 der Zeichnung gezeigte Konstruktion auf. Die Bohrung 18 im Kern
hatte einen Durchmesser von 2,5 mm und eine Länge von 13 mm. Der Applikator bestand aus Glas.
Die einzelnen Vorrichtungsteile waren mit Silikonschlauch von
1 am Durchmesser verbunden. Als Puffer wurde 0,2 M Boratpuffer '.
pH 6,5 verwendet, in dem 600 U/ial ICatalase gelöst waren.
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In den Applikator wurden im Abstand von etwa 6 Minuten Proben von Harasäurelösungen bestimmten Gehaltes eingegeben. Probe 1
enthielt 5 mg Harnsäure/ 100 ml, Probe 2 10 mg, Probe 3 15 tag»
Probe 4 30 mg, Probe 5 45 mg und Probe,.6 60 mg/ 100 ml.
Die auf dem Registriergerät aufgezeichnete Meßkurve zeigt Figur
7 der Zeichnung. Die erhaltenen Werte sind in Figur 8 als Eichkurve
wiedergegeben. Man erkennt daraus, daß die Höhe der Gipfel über der Null-Linie deB Meßschreibers direkt proportional dem
Harneäuregehalt der Probe ist. ,'
Daß obige Beispiel zeigt, daß auch mit trägergebundenen Enzymen
geringer spezifischer Aktivität die Erfindung vorteilhaft durchgeführt
werden kann.
209862/0430
Claims (12)
- PatentansprücheM «J Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Substanzen in sauerstoffhaltiger wässriger lösung durch Oxydation oder Reduktion in Gegenwart von Sauerstoff übertragenden Enzymen undv-Messung der Veränderung der Sauerstoffkonzentration mittels sauerstoffsensitiver Elektrode, dadurch gekennzeichnet, daß eine bestimmte Menge der die zu bestimmende Substanz enthaltenden Lösung luftblasenfrei in einen mit konstanter Geschwindigkeit fließenden Strom einer Pufferlösung bestimmter Sauerstoffkonzentration blookartig ohne Änderung der Strömungsgeschwindigkeit eingegeben, über trägergebundenes Enzym geleitet und anschließend zur Elektrode geführt wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung nach Passieren der Elektrode im Kreislauf zurückgeführt und gegebenenfalls verbrauchte Komponenten ergänzt werden..
- 3. Verfahren,, nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung mit sauerstoffhaltigem Gas bzw. sauerstofffreiem'ί · rInertgas durchströmt wird. jj · ι
- 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Pufferlösungs^trora geteilt wird, die > Teilströrae abwechselnd unterbrochen werden und die die zu bestimmende Substanz enthaltende Lösung in den unterbrochenen Strom eingegeben wird.
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die die zu bestimmende Substanz enthaltende Lösung an der Unterbrechungsstelle im Überschuß zugegeben ujid durch Öffnen des leilstromeo der Überschuß abgetrennt wird'.BAD ORIGINAL
209852/0430 - 6. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens naoh Anspruch V bis 5» gekennzeichnet durch ein Pufferreservoir, einen Probe- ' applikator, eine Säule mit trägergefeundenem Enzym und eine • Sauerstoffelektrode tu it Verstärker und Registriergerät, die miteinander in dieser Reihenfolge durch Rohrleitungen verbunden sind. '·· ■
- 7« Vorrichtung nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch eine Rezirktilaiionsleitung von der Elektrode zum Puffer- ·reservoir. ·.
- 8. Vorrichtung nach Anspruch β oder 7» gekennzeichnet durch eine Pumpe mit konstanter Förderleistung in der Leitung vor oder hinter dem Applikator«
- 9. Vorrichtung aaeh einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet s daß äer Applikator wenigstens zwei durch einen Sperrschieber Kit wenigstens zwei korrespondierenden Bohrungen abwechselnd ssu sperrende Durchlässe aufweist und eine der Bohrungen mit einer Zuflußleitung für die die zu bestimmende Substanz enthaltende lösung in Verbindung steht, wenn der korrespondierende Durchlaß gesperrt ist.
- 10. Vorsichtuöf naob Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Applikator mit einer Vakuumpumpe in»Verbindung steht, mit;| der die guflußleijtung und die damit verbundene Bohrung evakuiertwerden können. t' iti ε , .!
- 11. Vorrichtung nach Anspsueb 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet,\ daß der Applikator aus einer Hülse mit verschiebbarem Kern be-steht und Hülse und Kern je drei Durchlässe aufweisen, die'■ durch Verschieben; des Kerna sur Deckung gebracht werden können.
- 12. Vorrichtung naob Anapjjuoh 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Applikator eine Hülse (10) mit Sinlaßbohrungen (12a, 13a), ·(Ha, 15®)» Luft einlaßbohr ung (20), Proben-209852/0430BAD ORIGINAL"bohrung (21) und Yakuurabohrung (16a) sowie einen in der Hülse (10) verschiebbaren Kern (11) mit Bohrungen (17, 18, 19), die so angeordnet sind, daß durch Verschieben von Kern (11) Bohrungen (13a, 17 und 15a) bzw. (12a, 18,und Ha) bzw. (20, 18 und 16a) bzw. (21, 19 und 16a) sowie (21 und 18) derart verbunden werden können, daß die Leitung (13a, 17, 15a) gesohlossen ist, wenn Leitung .(12a, 18, Ha) geöffnet ist, aufweist.209852/0430Leerseite
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