DK146399B - Fremgangsmaade til enzymatisk bestemmelse af oxyderbare eller reducerbare stoffer og apparat til gennemfoerelse af fremgangsmaaden - Google Patents

Description

(19) DANMARK

|É (12, FREMLÆGGELSESSKRIFT ο„146399 Β

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Patentansøgning nr.: 3032/72 (51) Int.CI.3: G01N 31/14 (22) Indleveringsdag: 16 jun 1972 (41) Aim. tilgængelig: 19 dec 1972 (44) Fremlagt: 26 aep 1983 (86) International ansøgning nr.: -(30) Prioritet: 16 Jun 1971 DE 2130340 (71) Ansøger: ‘BOEHRINGER MANNHEIM GMBH; 68 Mannhelm-Waldhof, DE.

(72) Opfinder: Alexander ‘Hagen; DE, Wolfgang ‘Gruber; DE, Hans Ulrich ‘Bergmeyer; DE, Dieter Maworek;

DE

(74) Fuldmægtig: Firmaet Chaa. Hude_ (54) Fremgangsmåde til enzymatisk bestemmelse af oxyderbare eller reducerbare stoffer og apparat til gennemførelse af fremgangsmåden

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af stoffer i en oxygenholdig vandig opløsning ved oxydation eller reduktion i nærværelse af et oxygen-overførende bærerbundet enzym, ved hvilken en vandig opløsning af det stof, der skal bestemmes, indføres i en med konstant hastighed flydende strøm af en pufferopløsning med bestemt oxygenkoncentration, hvorefter opløsningen ledes henover det bærerbundne enzym,og forandringen i oxygenkoncentrationen måles ved hjælp af en oxygensensitiv elektrode.

Substrater af oxygen-overførende enzymer bliver løbende bestemt kvantitativt i teknikken og i det kliniske laboratorium i stort omfang. Her foreligger der i almindelighed det problem at gennemføre disse bestemmelser hurtigt og simpelt, dvs. uden anvendelse af særlige rensnings- og adskillelsesmetoder, således at det stof, der skal bestemmes, bliver omsat kemisk til et kvantitativt måleligt produkt.

2 146399

Hyppig betjener man sig her af enzymatiske processer. Således bliver eksempelvis D-glucose oxyderet ved hjælp af enzymet glucose-oxydase under deltagelse af molekulært oxygen til gluconsyre. Det på denne måde samtidig opståede hydrogenperoxyd omsættes med et leuko-farvestof under dannelse af et farvestof, hvis ekstinktion bestemmes i fotometret, og som er ækvivalent med glucosemængden. Denne fremgangsmåde, der er et typisk eksempel på mange substratbestemmelser, eksempelvis af urinsyre, galactose og lignende, har talrige ulemper.

I almindelighed må man ved biologiske prøver fjerne proteinet, hvilket betyder et yderligere arbejdstrin. Fremgangsmåden kræver et relativt stort tidsforbrug, så at prøvefrekvensen ved serieanalyser kun kan være stor, hvor der anvendes meget kostbare analyseautomater.

Til blodsukkerbestemmelser blev der derfor også tidligt udviklet apparater, som betjener sig af oxygenbestemmelse som måleprincip, og som derfor ikke udviser nogle af de omtalte ulemper. Her bliver oxygenindholdet i opløsningen målt ved hjælp af en oxygensensitiv elektrode. Den tilsatte glucoseoxydase bevirker under forbrug af oxygen en oxydation af glucose. Ændringen af oxygenkoncentrationen måles med elektroden og er proportional med den omsatte glucose-mængde. Herved bortfalder nødvendigheden af proteinfjernelse i prøverne, idet tidsrummet mellem prøveapplikation og måleresultatets realisering forkortes, og nøjagtigheden i den specifikke analyse bliver derfor på grund af bortfald af tilsluttede laspecifikke indikatorreaktioner stor.

Også denne fremgangsmåde har dog endnu talrige ulemper. Således må volumenet af den prøve, der skal bestemmes, fastlægges ved hjælp af justerede målepipetter, hvad der ikke blot betyder arbejdsforbrug, men også giver betydelige fejlmuligheder. Således kendes der fremgangsmåder, som arbejder diskontinuerligt. Her må en den oxygen= sensitive elektrode indeholdende målecelle fyldes med en bestemt mængde reagens. En ulempe er her muligheden for dannelse af luftblærer ved elektrodeoverfladen, hvad der forstyrrer bestemmelsen.

En defineret prøvemængde må indføres i den omrørte opløsning, og efter en fastlagt tid må der aflæses en måleværdi. Før gennemføringen af en ny måling må cellen tømmes. Hår systemet i nogle timer ikke har været i drift, bliver en omstændelig og langvarig ny justering nødvendig, som vel skyldes forandringer ved elektrodens overflade.

3 146399

Der er derfor allerede beskrevet en fremgangsmåde, ved hvilken en oxygensensitiv elektrode stadig omstrømmes af et reagens, som indeholder glucoseoxydase. Prøveapplikationen sker her fra en sekundær-strøm, som indeholder den glucose, der skal bestemmes, idet glucose bliver inddialyseret i reagensstrømmen gennem en semipermeabel membran. Denne fremgangsmåde har den ulempe, at tiden, indtil der foreligger et måleresultat, er relativt lang, da dialysen forløber langsomt. Fremdeles kendes der en fremgangsmåde, ved hvilken der ved elektrodeoverfladen umiddelbart er anbragt immobiliseret glucose-oxydase. Oxydationen af glucosen sker ved elektrodeoverfladen.

Denne fremgangsmåde egner sig i praksis kun til diskontinuerlig glu-cosebestemmelse, da kun begrænsede enzymmængder kan fikseres ved elektrodens overflade, så der er en relativ lang tid nødvendig for gluco-sens omsætning.

Opfindelsen går derfor ud på at tilvejebringe en fremgangsmåde, som undgår de beskrevne ulemper og navnlig frembyder en hurtig,fejlfri og til enhver tid driftparat metode til gennemførelse af selv større bestemmelsesrækker.

Ifølge opfindelsen løses denne opgave ved en fremgangsmåde, som er kendetegnet ved, at man indgiver en bestemt mængde af opløsningen, der indeholder det stof, der skal bestemmes, luftblærefrit i en med konstant hastighed flydende strøm af en pufferopløsning med bestemt oxygenkoncentration på blokagtig måde unden ændring af strømningshastigheden, leder den over et bærerbundet enzym og i tilslutning hertil fører den til elektroden.

Til fremgangsmåden ifølge opfindelsen egner sig sådanne stoffer, som lader sig omsætte i nærværelse af oxygenoverførende enzymer under optagelse eller afgivelse af oxygen. Eksempler på sådanne stoffer er sukkerarter som glucose og galactose, urinsyre, nucleosidbaser som xanthin og hypoxanthin, cytochrom, aminosyrer, polyumættede fedtsyrer, hydrogenperoxyd og uorganiske peroxyder.

if 148399

Som oxygen-overførende enzymer, som inden for opfindelsens rammer, bundet til én bærer, kan indsættes, skal nævnes glucoseoxydase, galactoseoxydase, uricase, xanthinoxydase, cytochromoxydase, amino= syreoxydaser, lipoxygenase, peroxydase og katalase.

De oxygen-overførende enzymer må inden for rammerne af fremgangsmåden ifølge opfindelsen være bundet til en bærer. Bæreren må hensigtsmæssig være således beskaffen, at enzymet bindes i høj specifik aktivi= tet, og at en ødelæggelse af bæreren og et tab af enzymaktiviteten er vidtgående udelukket. En egnet bærer er eksempelvis beskrevet i tysk offentliggørelsesskrift nr. 19 08 290.

Bæreren skal fortrinsvis foreligge i partikelform, så at den er egnet som søjlefyldning, der gennemstrømmes af pufferopløsningen og derved fremkalder en vis sammenblanding af det i pufferopløsningen blokagtigt eller propagtigt indbragte prøvevolumen med pufferopløsningen. En høj specifik aktivitet hos det bærerbundne enzym er ønskelig, da dette muliggør anvendelsen af meget små mængder bærerbundet enzym, hvorved sammenblandingen af prøve-”blokken" med pufferopløsningen bliver ringe, og prøvefrekvensen forhøjes, og man får let og hurtigt brugbare måleresultater. Hensigtsmæssig bør den specifikke aktivitet i det anvendte bærerbundne enzym udgøre mindst 10 U/g, fortrinsvis mere end 50 U/g og navnlig mere end 100 U/g.

Et væsentligt kendetegn for fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i den luftblærefri, blokagtige indføring af opløsningen, som indeholder det stof, som skal bestemmes (eksempelvis glucosen), i pufferopløsningsstrømmen. Opløsningen skal derhos indbringes under så ringe sammenblanding som mulig med pufferopløsningsstrømmen, således at den vandrer på samme måde som en prop i den flydende strøm. En sådan indføring kan eksempelvis gennemføres ved hjælp af en skyder, som i en boring indeholder den afmålte mængde af opløsningen, som indbringes således i den flydende pufferopløsningsstrøm, at prøve-opløsningen medføres blokagtigt eller propagtigt i pufferopløsningen.

Et yderligere væsentligt kendetegn for fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i, at der anvendes en med konstant hastighed flydende strøm af en egnet pufferopløsning som bærer og reaktionsmiddel for omsætningen. Ved konstant hastighed skal der her forstås en sådan 5 146399 konstanthed i hastigheden, at de uundgåeligt optrædende hastighedsvariationer er så ringe, at de praktisk talt ikke registreres mærkbart på det med elektroden forbundne registreringsinstrument. Denne betingelse er ideelt opfyldt, når der registreres en konstant oxygenkoncentration, så længe ingen prøveopløsningsblok passerer elektroden. Bliver denne konstante hastighed ikke opretholdt, vil der med det stadig registrerende instrument kunne mistydes en ændring af oxygenkoncentrationen. En sådan ændring ville også kunne mistydes, når der ved indføring af prøveopløsningen indbragtes luftblærer i reagensstrømmen.

Væsentligt er det yderligere, at den blokagtige indføring af prøveopløsningen ikke fremkalder nogen ændring af strømningshastigheden i den med konstant hastighed flydende strøm af pufferopløsningen, da der også herved ville opstå en fare for en mistydning af måleresultatet. Først den samtidige opfyldelse af alle de ovenfor angivne væsentlige kendetegn for fremgangsmåden ifølge opfindelsen gør det muligt at opnå de nedenfor beskrevne fordele og at skabe et stadigt driftparat fuldautomatisk arbejdende apparat, som gennemfører de ønskede målinger, uden nogen som helst pipetteringer, volumenafmålinger, tidsmålinger eller lignende er nødvendige.

Egnede oxygensensitive elektroder til gennemførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er velkendte. Eksempler på sådanne egnede oxygensensitive elektroder er Saurstoff-Elektrode fra L. Eschweiler und Co., Polarographic Oxygen Sensor 39 550 fra Beckmann Instruments, Sauerstoff-elektroden fra Hartmann und Braun AG, Frankfurt.

Fortrinsvis gennemføres fremgangsmåden således, at pufferopløsningen efter at have passeret elektroden føres i kredsløb, idet forbrugte komponenter igen suppleres. Bliver eksempelvis fremgangsmåden gennemført til bestemmelse af et stof, som oxyderes under et oxygenforbrug, bliver oxygenindholdet i pufferopløsningen igen suppleret, idet der eksempelvis gennemledes luft, hvilket hensigtsmæssigt sker i en noget større beholder ved en passende opholdstid af pufferopløsningen der. Hvis det stof, der skal bestemmes, reduceres under forhøjelse af oxygenindholdet i opløsningen, bliver det overskydende oxygen igen fjernet, idet man på tilsvarende måde 6 148399 gennemleder en oxygenfri bærergas, eksempelvis nitrogen eller en inaktiv luftart.

Selve pufferopløsningen udgøres af en vandig opløsning af en for det hver gang anvendte enzym egnet puffer i passende koncentration.

De egnede puffere og pufferkoncentrationer samt de gunstige pH-vær-dier for de stadigt anvendte enzymer er bekendte.

Pufferopløsningen kan eventuelt yderligere indeholde andre stoffer foruden de pufrende forbindelser, som er nødvendige for den enzymatiske omsætning. Eksempler herpå er salte, som indeholder de nødvendige ioner, som f. eks. magnesiumioner, sulfationer og lignende, eller stabiliserende forbindelser, pyerfladeaktiye stoffer øg lignende.

Den blokagtige indføring af prøveopløsningen uden ændring af strømningshastigheden bliver fortrinsvis gennemført således, at pufferopløsningsstrømmen opdeles i to delstrømme, og delstrømmene afvekslende afbrydes, og en bestemt mængde af opløsningen af det stof, der skal bestemmes (prøveopløsning), indføres i den ene delstrøm under samtidig afbrydelse af den anden delstrøm. Særlig gunstigt er det her at tilføre prøveopløsningen ved selve afbrydningsstedet.

Her bliver der fortrinsvis tilført et overskud af prøveopløsningen, f.eks. af serum, og ved åbning af delstrømmen skilt fra overskuddet. Dette kan eksempelvis ske som allerede antydet ovenfor, idét der i en delstrøm af pufferopløsningen er indskudt en skyderlignende indretning, hvis skyder har en til optagelse af en bestemt mængde prøveopløsning justeret boring. Ved inddypning af denne skyderåbning i overskuddet af prøveopløsningen, f.eks. overskuddet af prøveserum, eller ved åbning af boringen til en større beholder, som indeholder en sådan opløsning, og ved at man lader prøven flyde ind, bliver en afmålt mængde prøveopløsning ved forskydning af skyderen fraskilt og blokagtigt indgivet i pufferopløsningsstrømmen, når skyderens boring bringes således ind i den afbrudte delstrøm af pufferopløsningen, at der ved denne boring sker en genåbning af den afbrudte strøm, Fortrinsvis bliver herved samtidigt den anden indtil dette tidspunkt ikke afbrudte delstrøm afbrudt, hvad der kan ske ved den samme skyder.

Et apparat til gennemføring af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er 7 146399 kendetegnet ved et pufferreservoir, en prøveapplikator med i det mindste to ved en spærreskyder med mindst to korresponderende boringer afvekslende spærrebare gennemløb, hvoraf den ene boring står i forbindelse med en tilløbsledning for opløsning af det stof, der skal bestemmes, når det korresponderende gennemløb er spærret, en pumpe med konstant ydelse i ledningen foran eller bagved applikatoren, en søjle med bærerbundet enzym, og en detektor med en oxygensensitiv elektrode forbundet med en forstærker og et registreringsinstrument, hvilke elementer er forbundet indbyrdes i denne rækkefølge ved rørledninger.

Ifølge en særlig foretrukket udførelsesform står applikatoren 1 forbindelse med en et undertryk leverende indretning, f. eks. en vakuumpumpe, med hvilken tilførselsledningen for prøveopløsningen og prøveboringen i skyderen kan evakueres.

I en foretrukket udførelsesform består applikatoren af et hylster med forskydelig kerne, idet hylster og kerne hver har tre gennemgange, som ved forskydning af kernen kan bringes til dækning. Særlig hensigtsmæssig er en sådan applikator kendetegnet ved et hylster med en første og en anden indgangsboring, en første og en anden udgangsboring, en luftindgangsboring, en vakuumboring og en prøveopløsningsboring samt en i hylsteret forskydeligt anbragt kerne med tre boringer, som er således anbragte, at ved forskydning af kernen kan den første indgangsboring forbindes med den første udgangsboring, den anden indgangsboring forbindes med den anden udgangsboring, luftindgangsboringen forbindes med vakuumboringen og prøveopløsningsboringen med vakuumboringen, idet den første indgangsboring ikke kan forbindes med den første udgangsboring samtidigt med, at den anden indgangsboring forbindes med den anden udgangsboring.

Som pumpe med konstant ydelse i ledningen før eller bagved appli-kat oren kan eksempelvis anvendes en slangepumpe. En foretrukket . slangepumpe er angivet i tysk offentliggørelsesskrift nr.

20 25 056.

146399 δ

Fremgangsmåden og apparatet ifølge opfindelsen skal forklares nærmere i det følgende under henvisning til den vedføjede tegning. På denne er: fig. 1 en skematisk fremstilling af apparatet ifølge opfindelsen, fig. 2 en skematisk fremstilling af føringen af pufferopløsningsstrømmen ved oxygenelektroden, fig. 3 et billede af den med det bærerbundne enzym fyldte søjle i snit, fig. b en fremstilling af en applikator ifølge opfindelsen med forbindelsesledninger samt i længdesnit og tværsnit, fig. 5 en registreringskurve, fig. 6 en justeringskurve, fig. 7 en yderligere registreringskurve og fig. 8 den tilhørende justeringskurve.

Som vist på fig. 1 indeholder reservoiret R et forråd af pufferopløsning. Pumpen P fører pufferopløsningen fra reservoiret R ind i prøveapplikatoren A og derfra ind i den med det bærerbundne enzym fyldte søjle S og videre ind i den måleelektroden indeholdende detektor D samt endelig igen tilbage til reservoiret. Detektoren er tilsluttet en elektronisk forstærker V, som forstærker målesignalerne fra elektroden og leder dem videre til registrering af registreringsinstrumentet G, som eksempelvis kan være en skriver.

Reservoiret R kan bestå af en passende beholder, som har en afgangsåbning for pufferopløsning. Ved den foretrukne gennemføring af fremgangsmåden ifølge opfindelsen med pufferopløsningen i kredsløb 9 146399 har den yderligere en tilgangsåbning for pufferopløsning samt hensigtsmæssigt en åbning til indledning af luft. Ved denne udførelsesform tjener en pumpe M til frembringelse af en luftstrøm. Eksempelvis er her den ved akvarier anvendte pumpe egnet. Fortrinsvis består reservoiret af en beholder i termostat!seret udførelse. Pumpen P, _ der tjener til at føre pufferstrømmen, kan som allerede omtalt være udformet som slangepumpe eller som stempel- eller turbinepumpe. Fortrinsvis er dens ydelse regulerbar.

Den på fig. 2 skematisk i snit viste detektor består af en gennemløbscelle 1, som fortrinsvis er bygget termostatisk. Den indeholder en oxygensensitiv elektrode 2 samt en opløsningskanal 3? i hvilken måleelektroden rager ind.

Ved betegnelsen "forstærker V" skal forstås alle funktionelle dele, som måleelektroden behøver for at kunne arbejde, såsom strømkilde, tilslutningsledninger til strømkilden, elektronisk forstærkning o. s.v.

Registreringsinstrumentet G tjener til registrering af måleresultaterne. Man kan anvende forskellige redskaber, idet man dog foretrækker en skriver, der kan tilsluttes forstærkeren V. I stedet for skriveren kan også andre analog- eller digitalinstrumenter anvendes. Til målingen er det kun nødvendigt at angive måleresultatet i relation til tidsforløbet. I mange tilfælde er også blot en registrering af målesignalmaksimet tilstrækkeligt.

Den på fig. 3 i snit viste søjle S består af en søjlebeholder k, som fortrinsvis har cylindrisk form, og som er lukket for enderne og ved den ene ende har en tilstrømningsåbning 5 og ved den anden ende en udstrømningsåbning 6 for pufferopløsning. Den er fyldt med korn 7, som består af enzym bundet på en fast uopløselig bærer. Størrelsen af søjlen afhænger af den ønskede målefølsomhed, af måleprøvemængden og af enzymets aktivitet. Fortrinsvis anvendes en søjle i termosta-teret udførelse. Hensigtsmæssigt er søjlen således indrettet, at den let kan udveksles, hvis aktiviteten af det bærerbundne enzym er blevet for ringe,eller af en anden grund en udveksling er nødvendig, f.

10 146399 eks. hvis apparatet skal indrettes til bestemmelse af et andet stof, og der derfor skal indføres et andet bærerbundet enzym.

Prøveapplikatoren A tjener som ovenfor angivet til luftblærefri, blokagtig indføring af prøveopløsningen i pufferstrømmen. Den bevirker afmålingen af prøveopløsningen og den stadige opretholdelse af pufferstrømmen uden større hastighedsvariationer.

I den på fig. viste udførelsesform består applikatoren af et hylster 10 og en deri forskydelig kerne 11. En indgangsåbning 12 for pufferstrømmen fører til boringen 12a i hylsteret 10.. En grenledning 13 udgår fra ledningen 12 og fører til boringen 13a i hylsteret 10.·” På samme måde fører en udgangsledning lH, som er forbundet med boringen l'+a, og som tjener til udgang for pufferopløsningen, på den anden side af hylsteret 10, videre. En grenledning 15 forbinder udgangsboringen 15a i hylsteret 10 med udgangsledningen l*t. En ledning 16, der står i forbindelse med en boring 16a i hylsteret 1Q, er tilsluttet et vakuum.

Den forskydelige kerne har boringer 17, 18 og 19, som ved tilsvarende skyderstilling hver gang kan forbinde boringen 12a og l^+a, 13a og 15a samt 16a med boringen 20 eller ·tragtboringen 21 i hylsteret 10.

Yed den på fig. Va viste normalstilling af kernen 11 bliver den prøveopløsning, der skal undersøges, eksempelvis serum, indført i den tragtformede åbning .21 og derfra ind i boringen 18 på kernen 11. Fyldehøjden i den tragtformede boring 21 på hylsteret 10 spiller her ingen rolle, når blot boringen 18 i kernen 11 fyldes helt. Medens prøven indfyldes, flyder pufferstrømmen fra 13a til 15a. Efter fyldningens afslutning bliver kernen skubbet i pilretningen, indtil boringen 18 dækker sig med boringerne 12a og l^-a. Prøveopløsningen, hvis volumen nøje svarer til volumenet af boringen 18 i kernen 11, bliver af pufferstrømmen indført blokagtigt i søjlen S. Yed denne . stilling af kernen 11 er strømmen afbrudt fra 13a til 15a, og samti-. dig bliver den i indfyldningsåbningen 21 tilbageblevne opløsningsmængde afsuget ved boringen 19, boring 16a og ledningen 16. Så snart - prøveopløsningen er bortledt i pufferstrømmen, bliver kernen 11 skubbet imod pilretningen, indtil boringen 18 dækker sig med luftindgangsboringen 20 og udgangsboringen l6a. Boringen 18 bliver derved tømt for puffer og pufferstrømmen fra boring 13a til boring 15a frigivet 11 146399 igen. Til slut bliver kernen igen bevæget i pilretningen ind til udgangsstillingen, og processen kan gentages.

Størrelsen af applikatoren, navnlig af boringen 18's volumen, afhænger af fremgangsmådens følsomhed, af pufferopløsningens strømningshastighed og af størrelsen af søjlen S. Hvis der til boringen 18 ønskes en kapillar diameter, kan der til lettelse af fyldningen anbringes en tilsvarende åbning i yæggen 10 over for indfyldningsåbningen 21. Prøven vil ikke kunne løbe ud, da overfladespændingen i den forneden hængende dråbe forhindrer en afrivning.

Applikatoren kan bestå af et vilkårligt materiale, hvis dette er inert over for de anvendte opløsninger og muliggør et tæt sæde af kerne og hylster. Egnede materialer er f. eks. glas, kunststof eller metal. Applikatoren kan også bestå af forskellige materialer, eksempelvis af metal med overflader af et glidedygtigt kunststof, som f. eks. polytetrafluorethylen.

Applikatoren kan også inden for rammerne af det ovenfor angivne princip udføres på anden måde, f. eks. cylindrisk i overensstemmelse med en flervejshane. Parallelstrømmen styres i dette tilfælde hensigtsmæssigt i en anden hane, hvis kerne sidder på den samme akse som ker- nen, i hvilken prøveopløsningen applikeres.

Fremgangsmåden og apparatet ifølge opfindelsen udviser en række særlige fordele. De tillader gennemførelse af overordentligt hurtige analyser, da måleresultatet allerede foreligger i løbet af ganske kort tid (ca. 10 sekunder til 1 minut). Ved den konstante væskestrøm kan der sikres en meget stabil indstilling af elektroden, som gør en langvarig efterjustering overflødig, og som garanterer et stadigt driftsberedskab. Anvendelsen af justerede målepipetter bliver overflødig, så at herfra stammende fejlmuligheder elimineres. Ved anvendelse af bærerbundne enzymer bliver der tilmed opnået endnu en væsentlig besparelse, da enzymet ikke.blot kan anvendes en enkelt gang, som ved opløste enzymer, men overordentligt ofte igen kan benyttes. Eksempelvis har et apparat ifølge opfindelsen med bærerbundet glucoseoxydase allerede i mere end et halvt år været i drift, uden at en udskiftning af enzymet eller en efterjustering af elektroden blev nødvendig.

12 146399

De følgende eksempler skal yderligere forklare opfindelsen.

Eksempel 1

Bestemmelse af D-glucose i serum med glucoseoxydase efter ligningen: Glucose + 02 + EGjO ^lucoseo.xydase y gluconsyre + H^Og

Man anvendte det på tegningens fig. 1 viste apparat. Søjlen S havde en diameter på 1 cm og en fyldehøjde på 1 cm og var fyldt med i vand kvældet glucoseoxydase på bærer med en specifik aktivitet af 200 U/g.

Som detektor anvendtes en af firmaet W T W i Weilheim/Obb. forhandlet oxygensensitiv elektrode med et af det samme firma forhandlet oxygenmåleapparatur med betegnelsen Oxi 610 E og den tilsluttede potentiometerskriver Ee 511 fra firmaet Servogor.

Udstrømningshastigheden i elektroden var 7?5 cm/sek., diameteren af ... indgangsboringen i gennemløbscellen, der fremgår af fig. 2, var 1 mm.

Den anvendte applikator havde i princippet den på tegningens fig. h viste konstruktion. Boringen 18 i kernen 11 havde en diameter på 2 mm og en længde på 10 mm. Applikatoren bestod af glas.

De enkelte apparatdele var forbundet med silikonslanger af 1 mm’s diameter. Som puffer anvendtes 0,2 M kaliumphosphatpuffer med pH-værdien 6,0, indeholdende 18 mM kaliumjodid, 7,5 mM ammoniumheptamo= lybdat og 800 mM natriumchlorid.

I applikatoren blev der med en afstand af et minut indgivet serumprøver med et bestemt glucoseindhold. Prøverne 1 til 3 indeholdt hver 100 mg glucose/100 ml serum. Prøven ^ indeholdt 200, prøven 5 300, prøven 6 ^00 og prøven 7 500 mg/100 ml. De på registreringsinstru mentet optegnede målekurver fremgår af fig. 5· De erholdte værdier er gengivet på fig. 6 som justeringskurve og viser, at højden af toppene over måleinstrumentets nullinie er direkte proportional med glucoseindholdet i prøven.

Eksempel 2 13 146399

Bestemmelse af urinsyre ved hjælp af urlease efter ligningen:

Urinsyre + 21^0 + O2 UI>--—se > allantoin + 1^2 + CO2

Fremgangsmåden efter eksempel 1 benyttedes under anvendelse af det samme gpparat til bestemmelse af urinsyre. Søjlen S var fyldt med uricase på bærer. Søjlen S havde en diameter på 1 em og en fylde-højde på 5 cm. Den specifikke aktivitet hos den bærerbundne uricase var 3 U/g.

Man anvendte det i eksempel 1 beskrevne apparat. Tilstrømningshastigheden til elektroden var 35 5 cm/sek., diameteren af indgangsboringen i gennemløbscellen, som fremgår af fig. 2, var 1 mm.

Den anvendte applikator havde i princippet den på tegningens fig. h viste konstruktion. Boringen 18 i kernen 11 havde en diameter på 2,5 mm og en længde på 13 mm. Applikatoren bestod af glas.

De enkelte apparatdele var forbundet med silikonslanger med en diameter på 1 mm. Som puffer anvendtes 0,2 M boratpuffer med pH-værdien 6,5, i hvilken der var opløst 600 U/ml katalase.

I applikatoren blev der med en afstand af ca. 6 minutter indgivet prøver af urinsyreopløsninger med et bestemt indhold. Prøve 1 indeholdt 5 mg urinsyre/100 ml, prøve 2 10 mg, prøve 3 15 mg, prøve k 30 mg, prøve 5 ^5 mg og prøve 6 60 mg/100 ml.

Den på registreringsinstrumentet optegnede målekurve fremgår af tegningens fig. 7· De erholdte værdier er gengivet på fig. 8 som justeringskurve. Man ser, at toppenes højde over måleskriverens nullinie er direkte proportional med prøvens urinsyreindhold.

Det ovenanførte eksempel viser, at man også med fordel kan gennemføre opfindelsen med bærerbundne enzymer af ringere specifik aktivitet.

Claims (4)

14 146399

1. Fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af stoffer i oxygen-holdig vandig opløsning ved oxydation eller reduktion i nærværelse af et oxygen-overførende bærerbundet enzym, ved hvilken en vandig opløsning af det stof, der skal bestemmes, indføres i en med konstant hastighed flydende strøm af en pufferopløsning med bestemt oxygenkoncentration, hvorefter opløsningen ledes henover det bærer-bundne enzym,og forandringen i oxygenkoncentrationen måles ved hjælp af en oxygensensitiv elektrode, kendetegnet ved, at man indgiver en bestemt mængde af opløsningen, der indeholder dét stof, der skal bestemmes, luftblærefrit i en med konstant hastighed flydende strøm af en pufferopløsning med bestemt oxygenkoncentration på blokagtig måde (dvs. som en sammenhængende væske-streng, der erstatter en tilsvarende væskestreng i pufferstrømmen) uden ændring af strømningshastigheden, leder den over et bærerbundet enzym og i tilslutning hertil fører den til elektroden.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at pufferopløsningen opdeles i to delstrømme, og delstrømmene afvekslende afbrydes, og en bestemt mængde af opløsningen af det stof, der skal bestemmes, indføres i den ene delstrøm under samtidig afbrydelse af den anden delstrøm.

3. Apparat til gennemførelse af fremgangsmåden ifølge kravene 1 og 2, kendetegnet ved et pufferreservoir (R), en prøve-appliktor (A) med i det mindste to ved en spærreskyder (11) med mindst to korresponderende boringer (17, 18 og 19) afvekslende spærrebare gennemløb (13a, 15a og 12a, 14a og 20, 16a), hvoraf den ene boring (18) står i forbindelse med en tilløbsledning for opløsningen af det stof, der skal bestemmes, når det korresponderende gennemløb er spærret, en pumpe (P) med konstant ydelse i ledningen foran eller bagved applikatoren (A)., en søjle (5) med bærerbundet enzym, og en detektor med en oxygenelektrode (D) forbundet med en forstærker (V) og et registreringsinstrument (G), hvilke elementer er forbundet indbyrdes i denne rækkefølge ved rørledninger .

4. Apparat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at appli-