DE1648817B2 - Verfahren und diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen - Google Patents

Description

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in welcher bedeutet R₁ eine Hydroxy- oder Aminogruppe, welche gegebenenfalls einen ein- oder mehrfach durch Hydroxy-, Amino- und Alkoxygruppen substituierten aliphatischen, araliphatischen, cycloaliphatischen, heterocyclischen oder aromatischen Rest tragen, R₂, R₃ und R₅ Wasserstoff oder eine Amino-, Hydroxy- oder Alkoxygruppe und R₄ Wasserstoff oder den ReStR₁, oder Gemische solcher Substanzen verwendet.

2. Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Pcroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz und einem Chromogcn, dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen Substanzen der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1 enthalten sind.

3. Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen, bestehend aus Hydroperoxid oder Hydroperoxid bildenden Substanzen und einem Chromogen. dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen Substanzen der allgemeinen Formcl 1 gemäß Anspruch 1 enthalten sind.

Es sind eine Reihe von Verbindungen bekannt, die von Wasserstoffperoxid und Peroxidase als Katalysator zu einem Farbstoff oxidiert werden. Substanzen, die bevorzugt verwendet werden sind z. B. Benzidin, o-Dianisidin, o-Tolidin, Guajakol usw. Diese Verbindungen sind aber teilweise nicht sehr stabil und können nach den neuesten Erkenntnissen gesundheitsschädlich sein, so daß ihre Handhabung nicht ungefährlich erscheint.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde. Substanzen zu finden, die als Chromogene für ein Verfahren der obengenannten Art geeignet und zuuleich stabil und unschädlich sind.

Es wurde nun überraschenderweise eine Subsiun/-gruppegefunden, die zum Teil bessere Indikator-Eigenschaften als die bisher verwendeten Benzidinkörp_LT zeigt. Die Substanzklasse ist geeignet. Wasserstoffperoxid und andere Hydroperoxide sowohl in optischen Tests, als auch mit Hufe von Reagenzpapieren und Rcagenzfilmen zu bestimmen.

Die Substanzen sind physiologisch sehr gut vertraulich und besitzen die folgende allgemeine Formel I

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirkenden Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung. Die < >o Frfindung bezieht sich ferner auf ein diagnostisches Mittel zur Durchführung eines derartigen Verfahrens.

Von besonderem diagnostischem Interesse ist der Nachweis von Glucose im Harn. Blut und Serum bei Diabetes sowie der Nachweis peroxidatisch wir- 6s kender Substanzen, wie Hämoglobin im Harn und Blut und der Nachweis von Hydroperoxiden z. B. in der Milchwirtschaft. Kosmetik und Polymerchemie.

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in welcher bedeutet R₁ eine Hydroxy- oder Aminogruppc, welche gegebenenfalls einen ein- oder mehrfach durch Hydroxy-, Amino- und Alkoxygruppen substituierten aliphatischen, araliphatischen, cycloaliphatischen, heterocyclischen oder aromatischen Rest tragen, R₂, R.i und R₅ Wasserstoff oder eine Amino-, Hydroxy-oder Alkoxygruppe und R₄ Wasserstoff, oder den Rest R₁.

Es ist bekannt, daß Substanzen gemäß 1 im alkalischen vorzugsweise im ammoniak-alkalischen Medium Haare färben können, wenn größere Mengen Wasserstoffperoxid (3 bis 10%) anwesend sind; vgl. DT-AS 11 41 748, DT-AS 11 42 045, DT-AS 11 49 496. Fettc-Seifen-Anstrichmittel 67, (1965), S. 222 bis 227. Es war jedoch nicht vorherzusehen, daß diese Vcrbindungsklassc im neutralen bis schwach sauren pH-Bereich sehr geringe Mengen Wasserstoffperoxid (bis etwa 0,0005%) und peroxidatisch wirkende Substanzen durch starke Farbreaktionen, welche je nach Anwendungsart außerdem noch verschieden nuanciert sind, anzeigen würde. Die Empfindlichkeit der Substanzen 1 gegenüber Wasserstoffperoxid bzw Systemen, die Wasserstoffperoxid freisetzen, steigt jedenfalls um mehr als 3 Zchnerpotenzen, wenn Peroxidase anwesend ist. Gleichzeitig verkürzt sich die beim Haarfärben übliche Reaktionszeit von etwa 10 bis 30 Minuten (zum Teil auch bei erhöhter Temperatur bis 60 C) bei der erfindungsgcmäßcn Verwendung auf I Minute und weniger (jeweils bei Zimmertemperatur).

Die Aufgabe der Erfindung wird somit dadurch gelöst, daß man in einem Verfahren der eingangs genannten Art als Chromogene Substanzen der obenangegebenen, allgemeinen Formel 1 oder Gemische solcher Substanzen verwendet

Die Bestimmung von Hyuropcroxiden nach dem erfindunpsgcmäßen Verfahren ist vorzugsweise für gekoppelte und ungckoppeltc F.nzymreaktionen ge-

eignet, beispielsweise für die Bestimmung von Glucose. Galactose, Aminosäuren. Harnsäure. Peroxiden. Hämoglobin, Peroxidase oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen sowie von Fnzymaktivnuten. Bei der Bestimmung von Glucose beispielsweise wird diese von Glucoseoxidase zu Gluconsäure oxidiert. wobei der Luftsauersloff zu Wasserstoffperoxid reduziert wird. Das Wasserstoffperoxid oxidiert dann mittels Peroxidase oder einer peroxidatiich wirksamen Substanz den erfindungsgemäß verwendeten Indikator zum entsprechenden Farbstoff.

Weitere Beispiele für analytisch brauchbare Fnzymsysteme. die unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid reagieren. sind L -.-immosäureexidase + L-Arninosäure. Uricase -*- Harnsaure. Xanthin- .> oxidasc + Hypoxanthin bzw. Xanthin. Glycinoxidase -r Glycin, Monoaminooxidase - Monoamiti (wie Adrenalin, Mcscalin usw.). Diamin-oxidase - Diamine (wie Histamin). Luciferase - Luciferin. D-Asparaginsäurcoxidase f D-Asparaginsäure. Leber- :o Aldehydoxidase + Aldehyd. Galaetoseoxidase - Galactose, Edsons Flavinenzvm - Milchsäure.

Die Auswertung der Verfärbung erfolgt in bekannter Weise, z. B. durch optische Ausmessung im Spektrophotometer oder bei Verwendung von 'Festpapierstreifen und Testfilmen durch Vergleich der Farbstärke mit Blindproben bekannter Zusammensetzung bzw. Farbtafeln.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die diagnostischen Mittel werden an Hand der folgenden Bei- jo spiele näher erläutert.

Beispiel 1
Nachweis von Hydroperoxiden in Flüssigkeiten

50 mg Peroxidase werden in 100 ml eines 0.1m C'itrat- oder Phosphatpuffers von pH 5.6 gelöst und damit ein Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) imprägniert. Danach werden 300 mg 2-Phenylamino-5-amino-pyridin-hydrochlorid in 100 ml Methanol gelöst und das Filterpapier nochmals imprägniert. Beim Eintauchen in Lösungen von Wasserstoffperoxid verschiedener Konzentrationen werden die Papiere entsprechend der Konzentration verschieden stark weinrot bis dunkel-blaurot gefärbt. Mit Wasserstoffpcroxidlösungen von 5; m! erhält man noch eine deutliche Farbreaktion.

Beispiel 2
Nachweis von Glucose im Harn

100 mg Glucoseoxidase und 50 mg Peroxidase und 300 ma 2-Dimcthylamino-5-amino-pyridin-dihydrochlorid werden in 100 ml eines 0.1-ni Citrat- oder

so Phosphatpuffers von pH 5.6 gelöst. Mit dieser Lösung imprägniert man ein Filterpapier (2316 der Firma Schleicher ά; Schüll). Beim Eintauchen in glucosehaltigem Harn zeigt das Papier je nach Glucosekonzentration verschieden stark blauvioiette Töne. Schon hei 50 mg °« Glucose ist eine deutliche Farbreaktion /u sehen.

Beispiel 3

Nachweis von Glucose im Blut

¹JOg wäßrige Polyvin)lpropionat-Dispersion. 1.30 g Nairiumsalz einer Polymannuronsüure, 70 ml eines 0.5-m Ciirai- oder Phosphatpuffers. 2 g organisches Nairiumsulfonai. 320 mg Glucoseoxidase. 300 mg Peroxidase und 600 mg 2-Cvclohex\lamino-5-amino-p\ridin in 20 ml Methanol, werden zu einer homogenen Mischung verrührt, in einer Schichtdicke \on 300 ;j auf eine Folie aufgetragen und getrocknet. Bringt man auf den so hergestellten Film einen Tropfen Blut und entfernt diesen wieder nach etwa einer Minute, so färbt sich der Film je nach Glucosekonzentration rötlich bis braunrötlich.

Beispiel 4

Nachweis von Glucose in Serum mit einem
Indikatorgemisch

90 g Pohvinylpropionat-Dispersion. 1.30 g Natriumsalz einer Polymannuronsäure. 70 ml eines 0.5-m C'itrat- oder Phosphatpuffers. 2 g organische Natriumsulfonate. 320 mg Glucoseoxidase. 300 mg Peroxidase und Lösungen von 300mg 2.3-Diamino-pyridin-hydrochlorid und 300 mg 2.6-Diamino-pyridin-hydrochlond in jeweils 12 ml Wasser, werden zu einer homogenen Mischung verrührt, in einer Schichtdicke von 300 -x auf eine Folie aufgetragen und getrocknet. Bringt man auf einen so hergestellten Film einen Tropfen Serum und entfernt diesen wieder nach etwa einer Minute, so färbt sich der Film je nach Glucose konzentration verschieden stark grün.

Beispiel 5
Nachweis von Glucose in Flüssigkeiten

In der folgenden Tabelle sind die Farbreaklionen und Farbnuancen zusammengestellt, die eine Reihe weilerer Substanzen I mit Glucose (50 mg °o und mehr) liefen, wobei die Testpapiere gemäß Beispiel 2 und die Filme gemäß Beispiel 3 hergestellt werden. Für die Tüpfelreaktionen wurden Lösungen analog Beispiel 2 verwendet. Bei Substanzen, die nicht wasserlöslich sind, wurden Lösungen in entsprechenden Lösungsmitteln oder Suspensionen eingesetzt.

Subslun/ I

2,3-Diamino-pv ridin
2.6-Diamino-pv ridin

2,5-Diamino-pvridin-dihvdrochlorid

2.6-Dihydrox \-p\ ridin ium-hydrochlorid 2-Phenvlamino-5-ammo-pyridin-h\droch!t

1 ihn	!'.ipici	Tu pfel pulle
grau-braun	rosa-braun	rotbraun
blau	blau-craii-	blau
	blau "
gelblich-	rotbraun	rotbraun
braun
rosa-blau	biau	grünlich
karminrot	weinroi-	dunkelrot
	dunkelblau

Fortsetzung

Substanz I

1'iipn.T

! iiplcipi ι

2-(/i-Hydroxyüthylamino)-5-amino-pyridin-dihydru-

chiorid

2-Bis-(//-hydroxyäthylamino)-5-amino-p>ridin-hydro-

chlorid

2-Cyclohexylamino-5-amino-pyridin

2-()'-Dimethylamino-propyl-amino)-5-amino-pyridin

2-Dimethylamino-5-amino-pyridin-dihydrochlorid

5,5'-Diamino-bis-pyridyl-2-amin

2-(y-Methoxypropylamino)-5-amino-pyridin

braun	rotbraun	rotbraun
braun	rotbraun	rotbraun
hellbraun	braunrot	orange
braun	orange	orange
blauviolett	blau	blaugrau
rot	rot	rot
rötlich	rotbraun	rotbraun

Beispiel 6
Photometrischer Nachweis von Glucose

16 mg Glucoseoxidase. 9 mg Peroxidase werden in 10 ml Phosphatpuffer von pH 6,0 gelöst. Je 1 ml dieser Lösung, 1 ml einer 0,0005-m wäßrigen Lösung von 2,5-Diamino-pyridin-dihydrochlorid, 1 ml der zu untersuchenden Glucoselösung mit physiologisch interessierenden Glucosekonzentrationen werden zusammenpipettiert und mit Phosphatpuffer (pH 6,0) auf 10 ml aufgefüllt. Die Extinktion dieser Lösung im Vergleich zu einer Blindprobe wird bei 435 nm gemessen und der Glucoscgehalt an Hand einer vorher aufgestellten Eichkurve errechnet.

Beispiel 7
Nachweis von Blut im Urin

20 hin Filterpapier (2312 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit einer 0,1-m wäßrigen Lösung eines Phosphatpuffers (pH 7.0) imprägniert und getrocknet Danach wird das Papier mit einer 0.5" niger melh.inolischen Lösung von 2-Phenylamino-5-aminopyiidmhydrochlorid imprägniert und getrocknet. Biingt man auf ein so hergestelltes Testpapier einen Tropfen eines bluthaltigen Harns und einen Tropfen 3'Oiger Wasserstoffperoxidlösung, so verfärbt sich das "leslpapier noch bei einer Konzentration 1 : KX)(KH) von Weiß nach Rotviolett.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung, d a durch gekennzeichnet, daß man als Chromogene Substanzen der allgemeinen Formel I