DE1648817A1 - Verfahren und diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw.peroxidatisch wirksamen Substanzen - Google Patents
Verfahren und diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw.peroxidatisch wirksamen SubstanzenInfo
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Description
G m Ta II
Mannheim 1496'
Mannheim 1496'
Verfahren und diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden
bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung
von Hydroperoxiden, bzw. von Substanzen, aus denen durch eine vorgeschalt.ete Reaktion Wasserstoffperoxid oder andere Hydroperoxide freigesetzt
werden, sowie von Peroxidase bzw. anderen peroxidatisch wirkenden Substanzen. Von besonderem diagnostischem Interesse ist der
Nachweis von Glucose im Harn, Blut und Serum bei Diabetes, sowie der Kachweis peroxidatisch wirkender Substanzen, wie Hämoglobin im
Harn und Blut und der Nachweis von Hydroperoxiden z.B. in der Milohwirtschaft,
Kosmetik und Polymerohemie.
Es sind eine Reihe von Verbindungen bekannt, die von Wasserstoffperoxid
und Peroxidase als Katalysator zu einem Farbstoff oxidiert werden. Substanzen, die bevorzugt verwendet werden sind z.B. Benzidin,o-Dianisidin,
o-Tolidin, Guajakol usw. Diese Verbindungen sind aber teilweise nicht
sehr stabil und können nach den neuesten Erkenntnissen gesundheitsschädlich sein, so daß ihre Handhabung nicht ungefährlich ersaheint.
E3 wurde nun überraschenderweise eine Substanzgruppe gefunden, die z. T.
bessere Indikator - eigenschaften als die bisher verwendeten Benzidinkörper
zeigt. Die Substanzklasse ist geeignet, Wasserstoffperoxid und andere Hydroperoxide sowohl in optisohen Tests, als auoh mit Hilfe
von Reagenzpapieren und Reagenzfilmen (gemäß unserer Anmeldung Aktenzeiohen
B 89 944 IXb/42 l) zu bestimmen.
•A
10982S/0255 bad
Die Substanzen sind physiologisch sehr gut verträglich und besitzen
die folgende allgemeine Formel Ii
(D,
in veloher bedeuten:
R eine Hydroxy- oder Amino-gruppe, welche gegebenenfalls einen
ein- oder mehrfach duroh Hydroxy-, Amino- und Alkoxygruppen substituierten aliphatischen, araliphatischen, cyoloaliphatisohen,
heterocyclischen oder aromatischen Rest tragen,
Rp, R, und Rc Wasserstoff oder eine Amino-, Hydroxy- oder Alkoxygruppe,
und R. Wasserstoff, oder den Rest R-.
Es ist bekannt, daß die Substanzen I im alkalischen - vorzugsweise
im ammoniak-alkalischen-Medium Haare färben können, wenn größere
Mengen Wasserstoffperoxid (3-10 $) anwesend sind; vgl. DAS 1 I4I 748,
DAS 1 142 045, DAS 1 149 496, Fette-Seifen-Anstriohmittel 6χ, (1965),
S. 222-227· Es war nicht vorherzusehen, daß diese Verbindungsklasse
auch im neutrplen bis schwach sauren pH-Bereich, mit sehr geringen Mengen
Wasserstoffperoxid (bis etwa 0,0005 $)und peroxidatisch wirkenden Substanzen
starke Farbreaktionen zeigen würde, welche je nach Anwendungsart außerdem noch verschieden nuanciert sind. Die Empfindlichkeit der
Substanzen I gegenüber Wasserstoffperoxid bzw. Systemen, die Wasserstoffperoxid freisetzen, steigt jedenfalls um mehr als 3 Zehnerpotenzen j
wenn Feroxidase anwesend ist. Gleichzeitig verkürzt sich die beim Haarfärben
übliche Reaktionszeit von oa. 10-30 Minuten (z.T. auch bei erhöhter
Temperatur bis 60 ) bei der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode auf 1 Minute und weniger (jeweils bei Zimmertemperatur).
109825/0255 ßAD original
Die Bestimmung von Hydroperoxiden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist vorzugsweise für gekoppelte und ungekoppelte Enzymreaktionen geeignet, beispielsweise für die Bestimmung von Glucose,
Galactose, Aminosäuren, Harnsäure, Peroxiden, Hämoglobin, Peroxidase oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen sowie Enzymaktivitäten.
Die routinemäi. ; ge Bestimmung von derartigen Substraten ist wegen ihrer
elementaren Wichtigkeit aus der klinischen Chemie und aus der Lebensmittelchemie
nicht mehr wegzudenken. Bei der Bestimmung von Gluoose beispielsweise; v.ird diese von Glucoseoxidase zu Gluconsäure oxidiert,
wobei der Luftsauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert wird. Das
Wasserstoffperoxid oxidiert dann mittels Peroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz den erfindungsgemäß verwendeten Indikator
zum entsprechenden Farbstoff. Außer den einzelnen Substanzen I können
erfindungsgemäß auch Gemische derselben oder Mischungen mit anderen
Farbstoffindikatoren verwendet werden, wobei man besonders gut unterscheidbare Ff.rbnuancen erhält.
Weitere Beispiele für analytisch brauchbare Enzymsysteme, die unter
Freisetzung von Wasserstoffperoxid reagieren, sind L-Aminosäureoxidase + !-Aminosäure, Uricnse + Harnsäure, Xanthinoxidase ψ Hypoxanthin bzw.
Xanthin, Glycinoxidase + Glycin, Monoaminooxidase + Monoamin (wie Adrenalin, Mescalin etc.), Diamin-oxidase + Diamine (wie Histamin),
Luciferase + Luciferin, D-Asparaginsäureoxidase + D-Asparaginsäure,
Leber-Aldehydoxidase + Aldehyd, Galactoseoxidase + Galaotose, Edson's
Flavinenzym + Milchsäure.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren,
sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion
der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisoh wirksamen Substanzen durch Aus\iertung der Verfärbung ist demnach dadurch
gekennzeichnet, daß nan als Chromogene Substanzen der allgemeinen Formel I oder Gemische solcher Substanzen verwendet. Die Auswertung
erfolgt beispielsweise durch optische Ausmessung im Spektrophotometer
oder bei Verwendung von Teatpapierstreifen und Testfilmen durch Vergleich der Farbstärke mit Blindproben bekannter
Zusammensetzung bzw. Farbtafeln.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die diagnostischen Mittel sind in folgenden Beispielen näher erläutert.
1 0 9 8 2 5 / 0,? 5 5 BAD OBlGINAL
Ieispiel 1
50 ng Peroxidase werden in 100 ml eines 0,1 m Citrat- oder Phosphatpuffers
vom pH 5,6 eel est und damit ein Filterpapier (2316 der Firma
Schleicher & Sohüll) inprägniert. Danach werden JOO mg 2-Phenylamino-5-asino-pyridin-hydrochiorid
in 100 ml Methanol gelöst und das Filterpapier nochmals imprägniert. Beim Eintauchen in Lösungen von Wasserstoffperoxid
verschiedener Konzentrationen werden die Papiere entsprechend der Konsentration verschieden stark weinrot "bis dunkel-blaurot
gefärbt. Mit Wasserstoffperoxidlösungen von 5y/nl erhält man noch eine
deutliche Farbreaktion«
100 mg Glucoseoxidase und 50 mg Peroxidase und 3OO ng 2-Dimethylamino-5-aiaino-pyridin-dihydrochlorid
werden in 100 ml eines 0,1 m Citrat- oder
Phosphatpuffers von: pH 5,6 gelöst. Mit dieser Lösung imprägniert man ein
Filterpapier (23I6 der Firma Schleicher & Sohüll). Beim Eintauchen in
glucosehaltigen Harn zeigt das Papier je nach Glucosekonzentration verschieden stark blauviolette Töne. Schon bei 50 mg % Glucose ist eine
deutliche Farbreaktion zu sehen.
9C g wässrige Polyvinylpropior.at-Dispersion ("Propiofan")» 1,30 g Natriumsalz
einer Polymannuronsäure ("Algipon"), 70 ml eines 0,5 m Citrat- oder
Phosphatpuffers, 2 g organisches Natriumeulfonat ("Texapon P")« 320 ng=
31ucoseoxidase, 300 ΰ,ς Peroxidase und 600 ag 2-Cyolohexylamino-5-aminopyridin
in 20 ml "ethanol, werden zu einer homogenen Misohung verrührt, in einer Schichtdicke von 300 /u auf eine Folie aufgetragen und getrocknet.
109825/02S5 bad oR,g,NAl
Bringt nan auf den so hergestellten FiIa einen Tropfen Blut und entfernt
diesen wieder nach o·-. 1 Miaute, so färbt sich der Film je naoh Glucosekonzentration
rötlich bis braun-rötlich.
90 g Polyvinylpropionat-Dispersion ("Propiofan"), 1,30 g liatriuasalz
einer Poiycannuror.säure ("Algipon11), 70 al eines 0,5 m Citrat- oder
Phcsphatpuffers, 2 g organische Natriur.3ulf onate ("Texapon P"), 320 mg
Giucoseoxidase, 300 ag Peroxidase und Lösungen von 300 mg 2,3-Oiaininopyridin-hydrochloria
und 300 =g 2, 6-Diamino-pyridin-hydrochlorid in
jeweils 12 al V/asser, werden zu einer homogenen Mischung verrührt, in
einer Schichtdicke von 300 /U auf eine Folie aufgetragen und getrocknet.
3ringt nan auf einen sd hergestellten Film einen Tropfen Serum und entfernt
diesen wieder nach ca. einer Minute, so färbt sich der Film je nach Gluoosekonzentration verschieden stark grün.
In der folgenden Tabelle sind die Farbreaktionen und Farbnuanoen zusar.^er.gestellt,
die eir.e Reihe weiterer Substanzen I mit Glucose (50 mg %
und aehr) liefert, wobei die Testpapiere genä3 Beispiel 2 und die Filme
gesäi Beispiel 3 r.ergestellt werden. Für die Tüpfelreaktionen wurden
Lösungen analog Beispiel 2 verwendet. Bei Substanzen, die nicht wasserlöslich
sind, wurden Lösungen in entsprechenden Lösungsmitteln oder Suspensionen eingesetzt.
Substanz I | FiIa | Papier | Tüpfelplatte | |
1. | 2,3-Biaaino-pyrilin. | grau-braun | rosa-braun | rotbraun |
2. | 2,6-Diaoinc-pyridLn | blau | blau-grau« blau |
blau |
109825/0255
ßAD ORIGiNAl.
I ο *- d ο- · ι
Substanz I
FiIa
Papier ' Tüpfelplatte
2 , 5-3ian;inodihydrochlor:
gelblich= braun
rotbraun rotbraun
roaa-blau
blau
grünlich
hydrochloric.
karninrot
pyridin-hyär^chlorid
weinrotdunkelblau
dunkelroJ
2-(2-Hydroxyi-:.yl-u..ino) - braun
5-ä=ino-pyriii:;-dihydrochiorid
rotbraun
ro χ, ο raun
7. | 2-3is-(ii-hydro:iyi;hyl- aaino)-5-acir.o-pyridin- hydrochlorid |
braun | rotbraun | rotbraun |
3. | 2-Cyclohexylatino-5- anino-pyridir. |
hellbraun | braunrot | orange |
9- | 2- (γ-D ine thy 1 n.= i no- propyl-aaino}-3- aciho-pyridir. |
braun | orange | orange |
10. | 2-Diaethylan:ino-5-aniir.o- pyridin-dihydrochlorid · |
blauviolett | blau | blaugrau |
11. | 5,5' -DiamirlOK^-pyridyliy - amin ! |
rot | rot | rot |
12. | 2-(Y-Methoxypropylaaino)- 5-amino-pyridir. I I |
rötlich | rotbraun | rotbraun |
-A
109825/0255
Beispiel 6
} ho ten, etri s eher ]'r.c:.ve:s vcr. Glucose
Ic z-s Glucoseoxiü--se, ^ z.c Peroxidase werden in 10 ml Phosphatpuffer
von pK 6,0 gelost. Je 1 r-,1 dieser Lösung, 1 ml einer 0,0005 π wässrigen
lösung von 2,5-1. .· ir.^-pyriair.-dihydrochlorid, 1 nl der zu untersuchenden
ilucoselösung Ei-. ]\.ysclogisch interesssierenden Glucosekonzentrationen
werden zusanaenpi^ettiert und sit Phosphatpuffer (pH 6,0) auf 10 ml aufrefüllt.
Die Sxtir.kticr. dieser Lösung ia Vergleich zu einer BlindproTse
•wird bei 435 nE geressen und der Glucoaegehalt anhand einer vorher aufgestellten
Sichkurve errechnet.
109825/0?55 BAD ORISINAt.
Claims (2)
- P c. t ο η t η r. s ρ r ü c h e ,Verfahren zur Besti;r.rr.ung von Hydroperoxiden bzw, von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung in an sich bekannter Weise, dadurch gekennzeichnet, daß man .Chroroogene der allgemeinen Formel I(D,in welcher bedeuten:R eine Hydroxy- oder Amino-gruppe, welche gegebenenfalls einen ein- oder -ehrfach durch Hydroxy-, Amino- und Alkoxygruppen substituierten aliphatischen, araliphatischen, oycloaliphatischen, heterocyclischen oder aromatischen Rest tragen,Rg, R- und s< V.'asserstoff oder eine Amino-, Hydroxy- oder Alkoxygruppe,und R. Wasserstoff, oder den Rest R1,.oder Gemische solcher Substanzen verwendet.109825/0255 s^ 0R1QINau
- 2. Diagnostisches Vi-.tel zur Bestimmung von. Ilydroperoxiden bzw. Substanzen, die ιΐ;.-ί;Γ Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Peroxidaso oder einer peroxidatisch wirkaaaea Substanz und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie ala Ohroffiogen Substanzen der Formel I enthalten.5- Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch -!.rksarr.en Substanzen bestehend aus Hydroperoxid oder Hydroperoxid b:."'.- endfii Substanzen und einesn Gavpmogen, dadurch gekennzeichnet, C:. ire als Ghromogen Substanzen der Formel I enthalten.1 0 9 i3 / s / ■: > ■'■BAD
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |