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Hintergrund
der Erfindung
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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bewertung der Wirksamkeit
eines Arzneimittels mit Protease-inhibitorischer
Aktivität.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Bewertung der Wirksamkeit eines Arzneimittels mit Protease-inhibitorischer
Aktivität
vor der Verabreichung des Arzneimittels für eine therapeutische Behandlung
einer Erkrankung, bei der eine Beteiligung einer Protease vermutet
wird.
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Verwandter
Stand der Technik
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Verschiedene
Proteasen, z.B. Matrixmetalloproteinasen (MMP), Plasminogenaktivatoren
(PA), Serinproteasen, wie z.B. Plasmin und ähnliche, nehmen bekanntlich
an der Infiltration und Metastase von Krebszellen, dem Fortschreiten
von Periodontalerkrankungen, wie einer Periodontitis, dem Fortschreiten
einer Gewebezerstörung,
wie z.B. bei der rheumatoiden Arthritis und ähnlichem teil. Als Verfahren zur
quantitativen Messung solcher Proteasen sind Immunoassayverfahren
und Immunoblotverfahren unter Verwendung von Antikörpern, elektrophoretische
Zymographieverfahren usw. bekannt. Weiterhin ist als Verfahren zur
Messung der Proteaseaktivität
in Geweben das sogenannte in situ Zymographieverfahren bekannt,
beschrieben in FASEB Journal, Band 9, Juli, Seiten 974–980, 1995
oder WO 97/32035. Zum Zweck einer Inhibition einer exzessiven Proteaseaktivität und dadurch
eines Unterdrückes
des Fortschreitens pathologischer Zustände wurden verschiedene Arzneimittel
mit Protease-inhibitorischer
Aktivität
entwickelt oder befinden sich in der Entwicklung.
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Die
EP-A-1181939 (veröffentlicht
am 27.02.2002) betrifft ein teilweise in-vivo-Verfahren, worin ein
Inhibitor einem Säuger
verabreicht wird, bevor die Bioprobe isoliert wird. Demgegenüber betrifft die
vorliegende Anmeldung ein in-vitro-Verfahren, worin eine Bioprobe nach
der Isolierung aus dem Patienten in Kontakt mit dem Arzneimittel
gebracht wird.
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Schabet
M. et al. offenbaren ein Verfahren zur Bewertung der Wirksamkeit
eines Arzneimittels mit Proteaseaktivität, wobei es sich um ein in-vivo-Verfahren,
folgend klinischen Anzeichen, handelt (Schabet M. et al., J. Neuroimmunol.
31 (1991) Seiten 262–272).
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Die
Proteaseaktivitäten
von MMP, Plasmin und ähnlichen
werden durch Expressionsmengen und Aktivierungsgrade dieser Enzyme
kontrolliert, wie auch durch die Mengen der endogenen Inhibitoren.
Es ist bekannt, dass unter den Erkrankungen, bei denen eine Beteiligung
einer Protease vermutet wird, z.B. rheumatoider Arthritis, es signifikante
Unterschiede im Hinblick auf den Grad der Proteaseaktivität in den
Läsionen
gibt, obwohl die Erkrankungen ähnliche
klinische Symptome zeigen. In einigen Fällen zeigt ein Arzneimittel
mit einer Protease-inhibitorischen Aktivität eine deutliche Wirksamkeit
und in anderen Fällen
werden die klinischen Symptome kaum durch Verabreichung eines Arzneimittels
mit Protease-inhibitorischer
Aktivität
verbessert. Daher ist es klinisch sehr wichtig, die Proteaseaktivität in Läsionen akkurat
zu messen und die Eignung der Verabreichung eines Arzneimittels
mit Protease-inhibitorischer Aktivität zu bewerten. Obwohl die konventionell
bekannten Immunoassayverfahren, Immunoblotverfahren und elektrophoretischen
Zymographieverfahren für
den Nachweis und die Quantifizierung der Proteasen effektiv sind,
können
sie die Proteaseaktivität per
se nicht akkurat messen. Daher können
sie nicht zum Zweck der Bewertung der Eignung der Verabreichung
eines Arzneimittels mit Protease-inhibitorischer Aktivität verwendet
werden.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bewertung
bereitzustellen, ob ein Arzneimittel mit Protease-inhibitorischer
Aktivität
für die
therapeutische Behandlung einer Erkrankung effektiv ist oder auch
nicht, bei der die Beteiligung einer Protease vermutet wird, vor
Verabreichung des Arzneimittels. Genauer gesagt ist es die Aufgabe
der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bewertung bereitzustellen,
ob ein Arzneimittel mit Protease-inhibitorischer
Aktivität
für die
therapeutische Behandlung einer Erkrankung effektiv ist oder auch
nicht, worin eine Beteiligung einer Protease vermutet wird, durch
Verwendung des Verfahrens zur Messung der Proteaseaktivität, wie offenbart
in der WO 97/32035.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung führten verschiedene Studien
durch, um das vorstehende Ziel zu erreichen. Im Ergebnis stellten
sie fest, dass eine umfassende Proteaseaktivität, einschließlich Faktoren,
wie z.B. Expressionsmenge und Aktivierung von Proteasen in entzündlichen
Geweben usw. akkurat unter Verwendung einer dünnen Membran, umfassend Gelatine
oder ähnliches,
wie offenbart in der WO 97/32035 messbar war und dass eine akkurate
Bewertung möglich
war, ob ein Arzneimittel mit Protease-inhibitorischer Aktivität für eine therapeutische
Behandlung eines Patienten mit der Proteaseaktivität unter
Verwendung des Ergebnisses der Messung effektiv sein würde oder
nicht. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Feststellungen
bewirkt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt so ein Verfahren zur Bewertung der
Wirksamkeit eines Arzneimittels mit Protease-inhibitorischer Aktivität bereit, das
die folgenden Schritte umfasst:
Ein in vitro-Verfahren zur
Bewertung der Wirksamkeit eines Arzneimittels mit Protease-inhibitorischer
Aktivität,
das die folgenden Schritte umfasst.
- (1) Kontaktieren
einer Bioprobe, gesammelt oder isoliert von einem Patienten mit
einer Erkrankung, bei der die Teilnahme einer Protease vermutet wird,
dem das Arzneimittel mit Protease-inhibitorischer Aktivität nicht
verabreicht wurde, mit einer dünnen
Membran, die ein Proteasesubstrat enthält und auf einer Oberfläche eines
Trägers
gebildet ist;
- (2) Kontaktieren einer Bioprobe, gesammelt oder isoliert von
einem Patienten mit einer Erkrankung, bei der die Teilnahme einer
Protease vermutet wird, dem das Arzneimittel mit Protease-inhibitorischer
Aktivität
nicht verabreicht wurde, mit einer dünnen Membran, die ein Proteasesubstrat
und einen Proteaseinhibitor enthält
und auf der Oberfläche
eines Trägers
gebildet ist, und
- (3) Bewertung, dass das Arzneimittel effektiv ist, wenn die
Spur des Verdaus auf der dünnen
Membran, erhalten im obigen Schritt (2), im Vergleich mit der Spur
des Verdaus, gebildet auf der dünnen Membran
erhalten im obigen Schritt (1), vermindert ist.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zur
Bewertung der Eignung der Verabreichung eines Arzneimittels mit
Protease-inhibitorischer Aktivität
an einen Patienten mit einer Erkrankung, bei der eine Beteiligung
einer Protease vermutet wird, verwendet werden.
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Bei
den vorstehenden Verfahren kann die Beteiligung einer Protease akkurater
bestimmt werden, indem eine Probe, die im wesentlichen dieselbe ist
wie die in Schritt (1) verwendete, mit einer dünnen Membran in Kontakt gebracht
wird, enthaltend ein Proteasesubstrat und einen Proteaseinhibitor
und gebildet auf einer Oberfläche
eines Trägers
und dann Vergleich der Spuren des Verdaus auf der obigen Membran
mit den Verdauspuren auf der dünnen Membran,
die in Schritt (1) erhalten wurde und so kann eine akkuratere Bewertung
realisiert werden. Bei dieser Ausführungsform wird es besonders
bevorzugt, zwei oder mehr dünne
Membranen zu verwenden, die jeweils unterschiedliche Proteaseinhibitoren
enthalten. Weiterhin kann die Wirksamkeit eines Arzneimittels zur
Behandlung des Patienten genauer bewertet werden, indem die gesammelte
Probe mit einem Proteaseinhibitor vor der Behandlung mit dem Inhibitor
kontaktiert wird, dann durch Durchführung der Schritte (1) und
(2), gefolgt von einem Vergleich des Ergebnisses mit dem, das von
einer nicht behandelten Probe erhalten wurde.
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Gemäß den bevorzugten
Ausführungsformen
der vorstehenden Verfahren wird das vorstehende Verfahren bereitgestellt,
wobei die Bioprobe Krebsgewebe, Lymphknoten, Periodontalerkrankungs-Gewebe,
die Zahnfleischtasche betreffendes Gingiva-Exsudat, destruktives
krankes Gewebe oder Extrakt (z.B. Synovialflüssigkeit von rheumatischer Morbidität, Exsudat
von alveolärem
Pyorrhoegewebe), Pleuraleffusion, Ascites, Cerebrospinalflüssigkeit,
Bronchialwaschflüssigkeit,
abnormale Brustdrüsensekretionsflüssigkeit,
intraovar-Retentionsflüssigkeit,
Sputum oder Urin ist; das vorstehende Verfahren, wobei die Protease
eine Matrixmetalloproteinase oder Serinprotease ist; das vorstehende
Verfahren, wobei die dünne
Membran, die verwendet wird, eine dünne Gelatinemembran, eine dünne Casein-
oder eine dünne
Collagenmembran ist, gebildet auf der Oberfläche des Trägers; das vorstehende Verfahren, wobei
die zu verwendende dünne Membran
eine Fluoreszenz-markierte dünne
Gelatinemembran, eine Fluoreszenz-markierte dünne Caseinmembran oder eine
Fluoreszenz-markierte dünne
Collagenmembran ist, gebildet auf der Oberfläche des Trägers ist; die vorstehenden
Verfahren, wobei die Verdauspuren auf der dünnen Membran durch Färbung der
Membran mit einem Farbstoff nachgewiesen werden; das vorstehende
Verfahren, wobei die Verdauspuren auf der dünnen Membran durch ein Fluoreszenzmikroskop
nachgewiesen werden; das vorstehende Verfahren, wobei die Verdauspuren
auf der dünnen
Membran durch visuelle Bewertung unter Verwendung eines Mikroskops
nachgewiesen werden und das vorstehende Verfahren, wobei die Quantifizierung
oder Nummerierung der Verdauspuren unter Verwendung eines Bildverarbeitungsapparats
durchgeführt
wird.
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Durch
das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine akkurate Bewertung
erreicht, ob oder ob nicht ein Arzneimittel mit Protease-inhibitorischer Aktivität für einen
Patienten mit rheumatoider Arthritis, Krebs oder ähnlichem
effektiv ist, wobei eine Beteiligung einer Protease vermutet wird.
Daher ist eine akkurate Richtlinie über die Eignung der Verabreichung
des Arzneimittels erhältlich
und die therapeutische Effizienz kann verbessert werden.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung
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Bei
den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird das Proteasesubstrat
in der dünnen
Membran abhängig
von der Aktivität
der Protease, die in einer Probe enthalten ist, verdaut und daher
werden Verdauspuren auf der dünnen
Membran, abhängig von
der Aktivität
der Protease gebildet. Solche Verdauspuren können unter einem Mikroskop,
z.B. durch Veränderung
der Fluoreszenz oder Färbung der
dünnen
Membran nachgewiesen werden und die Stärke der Proteaseaktivität in einer
Probe kann generell durch Bestimmung von Größe und Tiefe der Verdauspuren
durch visuelle Inspektion gemessen werden. Weiterhin kann durch
Durchführung
eines ähnlichen Verfahrens,
separat auf einer dünnen Membran,
die einen Proteaseinhibitor umfasst (die Bezeichnung "Proteaseinhibitor" wie hier verwendet, beinhaltet
alle Substanzen, die eine Protease-inhibitorische Aktivität besitzen,
einschließlich
Arzneimitteln mit inhibitorischer Aktivität gegen Proteasen, z.B. eine
Substanz mit inhibitorischer Aktivität gegen Matrixmetalloproteinase
oder Serinprotease, die bevorzugt werden), die Art der Protease,
die eine Aktivität in
der Probe ausübt,
identifiziert werden und es kann eine Bewertung durchgeführt werden,
ob oder nicht ein Arzneimittel mit potenter inhibitorischer Aktivität gegen
die Protease dem Patienten verabreicht werden sollte. Zusätzlich ist
es auch möglich,
durch Kontaktieren einer Probe mit einem Arzneimittel mit Protease-inhibitorischer
Aktivität
und dann Durchführung des
vorstehenden Verfahrens zu bewerten, ob oder nicht das Arzneimittel
dem Patienten verabreicht werden sollte.
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Beispiele
für die
Protease, die das Objekt der vorliegenden Erfindung sein kann, beinhalten
Metalloproteinasen und Serinproteasen. Diese Enzyme werden im Detail
in "Molecular Mechanism
of Cancer Metastasis",
herausgegeben von T. Tsuruo, Seiten 92–107, Medical View Co., Ltd.,
1993, erklärt.
Beispiele für
Proteasen, die für
die Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders geeignet sind,
beinhalten z.B. Matrixmetalloproteinasen, wie z.B. interstitielle
Collagenase (MMP-1), Gelatinase A (MMP-2) und Gelatinase B (MMP-9);
Serinproteasen, wie z.B. den Plasminogenaktivator (PA) und ähnliche.
Proteasen als Objekte der Verfahren der vorliegenden Erfindung sind
jedoch nicht auf diese spezifischen Proteasen begrenzt.
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Die
Proteasesubstrate sind nicht besonders begrenzt, solange es sich
um Makromoleküle
handelt, die durch eine Protease als Substrat abbaubar sind. Zum
Beispiel können
Collagen, Gelatine, Proteoglycan, Fibronectin, Laminin, Elastin,
Casein und ähnliche
verwendet werden. Vorzugsweise können Collagen, Gelatine,
Fibronectin, Elastin oder Casein verwendet werden und Gelatine,
Casein und Collagen werden besonders bevorzugt verwendet. Wenn Gelatine
verwendet wird, ist die Art der Gelatine nicht besonders begrenzt.
Zum Beispiel können
alkalibehandelte Rinderknochengelatine, alkaliextrahierte Schweine-Cutis-Gelatine,
säureextrahierte
Rinderknochengelatine, Phthalationen-behandelte Rinderknochengelatine,
säureextrahierte
Schweine-Cutis-Gelatine
usw. verwendet werden. Als Proteasesubstrat kann eine der vorstehenden
Substanzen allein oder zwei oder mehr der Substrate können in Kombination
verwendet werden. Weiterhin kann zur Erleichterung des Nachweises
des Abbaus eines Substrats durch eine Protease ein Proteasesubstrat mit
einem fluoreszierenden Farbstoff verwendet werden. Die Art des fluoreszierenden
Farbstoffs ist nicht besonders begrenzt und es können z.B. Fluorescein, Rhodamin,
Texas Rot, Resorfin, Cy3, Cy5 und ähnliche verwendet werden.
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Als
dünne Membran,
die ein Proteasesubstrat enthält,
können
die in WO 97/32035 beschriebenen verwendet werden. Herstellungsverfahren
und Verwendung der dünnen
Membranen, Verfahren zum Nachweis von Verdauspuren, Schritte zum
Vergleich von Verdauspuren unter Verwendung einer dünnen Membran,
die einen Proteaseinhibitor enthält
und ähnliche
sind ebenfalls spezifisch in der vorstehenden WO 97/32035 offenbart,
deren Offenbarung hier durch Inbezugnahme inkorporiert ist. Die
Leistung der dünnen
Membran kann durch Verwendung eines Härtemittels verbessert werden
und Beispiele hierfür werden
ebenfalls in der vorstehenden WO 97/32035 offenbart. Eine dünne Membran
mit einer trockenen Dicke von 0,1 bis 10 μm wird vorzugsweise verwendet.
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Als
Proteaseinhibitor können
verschiedene Arten von Chelatbildnern, von denen bekannt ist, dass
sie Matrixmetalloproteinasen inhibieren, insbesondere EDTA oder
1,10-Phenanthrolin, verwendet werden. Weiterhin können als
Inhibitoren, die für
Matrixproteasen spezifisch sind, Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen
(TIMP), Batimastat, Marimastat, CGS27023A und andere Inhibitoren
verwendet werden. Diese Inhibitoren werden beispielsweise in Sosiki
Baiyou Kogaku (The Tissue Culture Engineering), Band 25, Seiten
356, 1999 beschrieben. Als Serinproteaseinhibitoren können Phenylmethansulfonylfluorid,
Plasminogenaktivatorinhibitor 1 und ähnliche verwendet werden. Diese
Inhibitoren werden in "Protease
and Biological Mechanism" (Gendai
Kagaku [Modern Chemistry], Spezialausgabe Nr. 22), Seite 224, 1993
beschrieben. Die Inhibitoren sind jedoch nicht auf diese Verbindungen
begrenzt.
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Als
Proben, die für
die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können beispielsweise
Bioproben verwendet werden, die von einem Patienten isoliert oder
entnommen werden. Beispiele für
verwendbare Bioproben beinhalten z.B. Krebsgewebe oder Lymphknoten,
die durch chirurgische Operationen oder histologische Überprüfung isoliert
oder entnommen, wurden von Tumorgeweben, wie z.B. Lungenkrebs, Magenkrebs, Ösophaguskrebs,
Colonkrebs, Brustkrebs, Uteruskrebs, Eierstockkrebs, Thyroidkrebs,
Leberkrebs, Intraoralkrebs, Prostatakrebs, Nierenkrebs, Blasenkrebs
und ähnliche,
Gewebe von Periodontalerkrankungen, Gewebe, wie z.B. eine Synovialmembran
und Knochengewebe, isoliert oder gesammelt aus Geweben einer rheumatoiden
Arthritis durch chirurgische Operation oder histologische Überprüfung, Gingiva-Zahnfleischtaschenflüssigkeiten,
Flüssigkeiten, die
in destruktiven kranken Geweben enthalten sind (z.B. Synovialflüssigkeit
von einer rheumatoiden Erkrankung, Exsudat aus alveolärem Pyorrhoegewebe),
Pleuraleffusionen, Aszites, Cerebrospinalflüssigkeiten, unübliche Sekretionsflüssigkeiten
aus der Brustdrüse,
Ovarretentionsflüssigkeiten,
Sputum, Blut und ähnliche.
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Wenn
die Probe ein Gewebe ist, kann z.B. ein Schnitt mit einer Dicke
von 1 bis 10 μm,
vorzugsweise 4 bis 6 μm,
von einer Probe hergestellt werden, die schnell in flüssigem Stickstoff
unter Verwendung eines Cryostats eingefroren wurde und dann kann der
Schnitt auf eine dünne
Membran aufgebracht werden, um die Probe mit der dünnen Membran
zu kontaktieren. Eine Gewebeprobe, gesammelt durch Paracentese und
Sog kann ebenfalls schnell mit einer Verbindung eingefroren und
zu Schnitten auf ähnliche
Weise zur Verwendung verarbeitet werden. Wenn eine Gewebeprobe,
gesammelt durch Paracentese und Sog, einer cytologischen Überprüfung unterzogen
wird, kann die angesogene Probe auf eine dünne Membran, enthaltend ein
Proteasesubstrat, so ausgegeben werden, dass die Probe an die Membran
in dispergiertem Zustand anhaften kann, damit die Probe die dünne Membran
kontaktieren kann. Weiterhin kann bei einer Gewebeprobe Feuchtigkeit
von einem gesammelten Gewebe vorsichtig abgewischt werden und dann
kann die Probe vorsichtig auf eine dünne Membran, enthaltend ein
Proteasesubstrat, gepresst werden, damit die Probe die dünne Membran
kontaktieren kann. Eine endocervikale oder Endometriumsmucosaprobe
kann unter Verwendung eines Tupfers oder einer Bürste gesammelt werden und dann
wird die Probe vorsichtig auf eine dünne Membran gepresst, um die
Probe auf die dünne
Membran zu transferieren.
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Wenn
eine flüssige
Probe, wie z.B. Synovialflüssigkeit,
die von einem Patienten mit rheumatoider Arthritis genommen wurde,
als Probe verwendet wird, kann die Probe auf eine geeignete Konzentration
verdünnt
oder einer notwendigen Vorbehandlung unterzogen werden und dann
können
ungefähr
1 bis 50 μl,
vorzugsweise ungefähr
1 bis 20 μl
der Probe auf die dünne
Membran getropft werden. Wenn Gingiva-Zahnfleischtaschenflüssigkeit einer Periodontalerkrankung
als Probe verwendet wird, kann ein Stück Filterpapier in die Gingivatasche
inseriert werden, um ungefähr
5 bis 10 μl
der Gingiva-Zahnfleischtaschenflüssigkeit
zu sammeln und das Filterpapier kann auf eine dünne Membran aufgebracht werden.
Nach dem Sammeln der Gingiva-Zahnfleischtaschenflüssigkeit
kann diese optional von dem Filterpapier unter Verwendung von destilliertem Wasser
oder einem geeigneten Puffer (z.B. 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM
CaCl2, 0,2 M NaCl) extrahiert werden und
der Extrakt kann auf eine dünne Membran
getropft werden. Wenn Zellen, die im Blut, Urin, abnormaler Brustdrüsensekretionsflüssigkeit, Aszites,
pleuralen Effusionen, Sputum und ähnlichen enthalten sind, als
Probe verwendet werden, können sie
durch Zentrifugation und ähnliches
gewaschen werden, falls nötig,
und dann auf eine dünne
Membran dispergiert und adsorbiert werden, enthaltend ein Proteasesubstrat,
durch Verwendung einer Zentrifuge.
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Nachdem
eine Bioprobe mit einer dünnen Membran
kontaktiert wurde, enthaltend ein Proteasesubstrat, wird die Membran
bei einer geeigneten Temperatur für die Expression der Proteaseaktivität, z.B.
37°C, unter
einer gesättigten
feuchten Bedingung für
eine ausreichende Zeitspanne für
einen Verdau eines Substrats inkubiert. Wenn eine Protease in der
Probe vorliegt, werden Verdauspuren auf der dünnen Membran gebildet. Für den Kontakt
zwischen der dünnen
Membran und einer Bioprobe kann ein Verfahren, umfassend das Aufbringen
eines Gewebeteils, ein Verfahren, umfassend das Tropfen einer flüssigen Probe,
ein Verfahren, umfassend die Dispersion von Zellen für eine Adsorption
oder ähnliches
verwendet werden. Die für
die Inkubation benötigte
Zeit kann abhängig
von der Probenart variieren und kann vorzugsweise bei ungefähr 1 bis
48 Stunden, noch bevorzugter 6 bis 30 Stunden bei 37°C für einen
Gewebeschnitt oder Zellen oder 0,5 bis 24 Stunden, noch bevorzugter
ungefähr
1 bis 16 Stunden für
eine flüssige
Probe liegen. Die auf der dünnen
Membran durch eine Protease in der Probe gebildeten Verdauspuren
können
durch Färben
der Membran mit einem Farbstoff, falls nötig, und Beobachtung der Spuren
durch ein optisches Mikroskop nachgewiesen werden. Wenn ein Fluoreszenz-markiertes
Substrat verwendet wird, kann die Färbung weggelassen werden und
die Membran kann per se in geeigneter Weise unter einem Fluoreszenzmikroskop
beobachtet werden.
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Farbstoffe,
die für
das Färben
der dünnen Membran,
enthaltend ein Proteasesubstrat, verwendet werden, sind nicht besonders
begrenzt. Zum Beispiel kann die Färbung unter Verwendung eines Farbstoffes
durchgeführt
werden, der gewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus roten, orangen und gelben Farbstoffen.
Die Bezeichnungen "Rot", "Orange" und "Gelb", wie hier verwendet,
sollten in ihrem breitesten Sinn verstanden werden und sie sollten
in keiner begrenzenden Weise interpretiert werden. Solche Farbstoffe
haben allgemein eine maximale Absorption im Bereich von 400 nm bis
580 nm. Als rote Farbstoffe beinhalten bevorzugte Farbstoffe Red
1 (C. I. 18050), Acid Red 4 (C. I. 14710), Acid Red 8 (C. I. 14900),
Acid Red. 37 (C. I. 17045), Acid Red 40 (C. I. 18070), Acid Red
44, Acid Red 106 (C. I. 18110), Acid Red 183 (C. I. 18800), Xylidin
Ponceau 2R (C. I. 16150), Mordant Red 19, Nitro Red und Ponceau
3R und Ponceau 3R wird besonders bevorzugt. Als orange Farbstoffe
beinhalten Beispiele Methyl Orange, Ethyl Orange, Crocein Orange
G, Orange II, Orange G, Acid Orange 8 (C. I 15575) und Acid Orange
74 (C. I. 18745). Als gelbe Farbstoffe können vorzugsweise Mordant Yellow
10, Mordant Yellow 7, Acid Yellow 99 (C. I. 13900), Acid Yellow
65 (C. I. 14170), Acid Yellow 17 (C. I. 18965) und Nitrazine Yellow
(C. I. 14890) verwendet werden.
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Als
Farbstoff können
auch blaue Farbstoffe verwendet werden. Zum Beispiel können Amido Black
10B und Coomassie Brilliant Blue verwendet werden. In dem in der
WO 97/32035 offenbarten Verfahren, wobei Gelatine unter Verwendung
von Amido Black 10B gefärbt
wird, wird die Gelatine beispielsweise in einem dunkelblau gefärbt und
die Färbekonzentration
ist nur in Bereichen reduziert, in denen die Gelatine durch Wirkung
einer Protease zur Bildung weißer
Flecken verdaut ist. Wenn die dünne
Membran in rot mit Ponceau 3R gefärbt ist, kann beispielsweise
ein gesamtes Gewebe auf der Membran beobachtet werden und es ist
einfach, mikroskopisch zu bestimmen, wo Verdauspuren in dem Gewebe
existieren, obwohl die maximale Absorption der dünnen Membran in der Regel 2
oder mehr erreicht. Wenn weiterhin ein konventionelles Kernfärben unter
Verwendung von Hämatoxylin
oder Methyl-Grün
in Kombination verwendet wird, können
die Kernmorphologie und Verdauspuren simultan als Signale mit unterschiedlichen
Farbtönen
unter einem optischen Mikroskop beobachtet werden.
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Für eine Bestimmung
der Stärke
des Verdaus in den Verdauspuren beinhalten anwendbare Verfahren
beispielsweise Verfahren der Verwendung einer visuellen Inspektion
unter einem optischen Mikroskop oder einem Fluoreszenzmikroskop,
Verfahren, die den Meßschritt
der optischen Dichte oder der Fluoreszenzintensität unter
Verwendung eines Spektrofotometers umfassen und ein Verfahren, das
die Schritte der Eingabe von Bildern umfasst, die von einem optischen
oder einem Fluoreszenzmikroskop erhalten wurden, und zwar in einen
Computer, und dann die numerische Analyse der Verdauspuren durch
Bildanalyse.
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Gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung wird, wenn Verdauspuren auf der dünnen Membran,
enthaltend ein Proteasesubstrat, beobachtet werden, dies so gewertet,
dass eine Protease in der Probe, die von einem Patienten genommen wurde,
existiert und ein Arzneimittel mit Protease-inhibitorischer Aktivität für die therapeutische
Behandlung des Patienten effektiv ist. Die Arten der Arzneimittel
mit Protease-inhibitorischer Aktivität, die die Ziele der Bewertung
durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung sind, sind nicht
besonders begrenzt und es können
alle Arzneimittel verwendet werden, soweit sie eine inhibitorische
Aktivität
gegen mindestens eine Protease aufweisen und auf Säuger, einschließlich den
Menschen, anwendbar sind. Wenn dasselbe Verfahren mit einer dünnen Membran,
enthaltend einen Proteaseinhibitor, zum Vergleich durchgeführt wird
und die Größe der Verdauspuren
reduziert ist, kann dies als Bewertung betrachtet werden, dass ein
Arzneimittel mit Protease-inhibitorischer
Aktivität
für die
therapeutische Behandlung des Patienten besonders effektiv ist.
Wenn andererseits Verdauspuren nicht substanziell auf der dünnen Membran,
enthaltend das Proteasesubstrat, beobachtet werden, oder wenn nur
einige wenige Verdauspuren gebildet werden, wird dies so bewertet,
dass ein Arzneimittel mit Protease-inhibitorischer Aktivität keine
Wirksamkeit in dem Patienten zeigen kann und die Verabreichung allgemein
nutzlos sein wird.
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Wenn
zwei oder mehr dünne
Membranen, die jeweils einen unterschiedlichen Proteaseinhibitor enthalten,
verwendet werden und wenn die Größe der Verdauspuren
in einer dünnen
Membran, enthaltend einen bestimmten Proteaseinhibitor, reduziert ist,
kann dies so gewertet werden, dass eine Klasse von Protease, die
durch den Proteaseinhibitor, der in der dünnen Membran enthalten ist,
inhibiert wird, in der Probe vorliegt, und ein Arzneimittel mit
inhibitorischer Aktivität
gegen diese Klasse von Protease ist für die therapeutische Behandlung
des Patienten effektiv. Wenn weiterhin eine Probe mit einem Proteaseinhibitor
vorher kontaktiert und behandelt wird und dann den vorher erwähnten Schritten
unterworfen wird und die Größe der Verdauspuren
im Vergleich mit denjenigen, die ohne Vorbehandlung erhalten werden,
reduziert ist, kann angenommen werden, dass ein Arzneimittel mit
Protease-inhibitorischer
Aktivität
für die
therapeutische Behandlung des Patienten effektiv ist. Ein Verfahren
zum Kontaktieren und Behandeln einer chirurgisch genommenen Probe
mit einem Proteaseinhibitor im vorhinein wird z.B. in Cancer Research,
59, Seiten 467–473,
1999, beschrieben.
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird genauer unter Bezugnahme auf die folgenden
Beispiele erklärt. Der
Umfang der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele
begrenzt.
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Beispiel 1
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Eine
Brustkrebsprobe, die durch chirurgische Operation extrahiert und
eingefroren wurde, wurde bei –25°C in Schnitte
mit einer Dicke von 4 μm unter
Verwendung eines Cryostats geschnitten und an eine dünne Gelatinemembran,
wie offenbart in der WO 97/32035, angehaftet. Die Dicke der Gelatine
lag bei 7 μm.
Diese Gelatinemembran wurde 16 Stunden bei 37°C unter 100% relativer Feuchtigkeit
inkubiert und dann an Luft getrocknet. Eine durch Vermischen einer
Lösung,
worin Ponceau 3R mit einer Konzentration von 0,8% gelöst war,
in einer 6%igen wässrigen
Trichloressigsäurelösung und
Ethanol in einem Volumenverhältnis
von 3:7 erhaltene Lösung
wurde als Färbelösung verwendet.
Die Membran wurde in die Lösung
bei Raumtemperatur für
4 Minuten zum Anfärben
eingetaucht. Nachdem die Membran 10 Minuten mit Wasser gewaschen
wurde, wurde die Membran dann in eine Mayer's Hämatoxylinlösung für 2 Minuten
für eine
Kernfärbung
eingetaucht und weiter 10 Minuten mit Wasser gewaschen und an Luft getrocknet.
Nach dem Trocknen wurde ein Cover Aid Film (Sakura Seiki Co., Ltd.)
an die Membran unter Verwendung von Xylol zum Einschließen des
Brustkrebsschnittes angehaftet. Der Film wurde auf einer Kunststoffbefestigung
festgehalten und unter einem optischen Mikroskop beobachtet. Ein
Gelatineverdau wurde an Stellen beobachtet, an denen die Krebszellen
vermutlich vorlagen, basierend auf der Morphologie der Kerne, und
wo wurde die Proteaseaktivität
verifiziert. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass ein
Arzneimittel mit Protease-inhibitorischer
Aktivität
für die
therapeutische Behandlung des Patienten effektiv war.
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Wenn
derselbe Test für
jede von ungefähr
20 Proben von Brustkrebs durchgeführt wurde, wurde ein Gelatineabbau
bei 2 Proben nicht beobachtet und es wurde angenommen, dass die
Verabreichung eines Arzneimittels mit Protease-inhibitorischer Aktivität für diese
Patienten nicht notwendig war. Unter den verbliebenen 18 Proben
wurde bei 8 Proben eine starke Aktivität und bei 10 Proben eine schwache
Aktivität
beobachtet. Für
die Patienten, deren Proben die starke Proteaseaktivität ergaben,
wurde geschlossen, dass ein Arzneimittel mit Protease-inhibitorischer
Aktivität
mit einer täglichen
Dosis, angehoben bis zur Obergrenze, verabreicht werden sollte. Für die Patienten,
deren Proben schwache Aktivitäten
ergaben wurde geschlossen, dass andere Therapien zunächst angewendet
werden sollten, um einen Fortschritt zu sehen und danach die Verabreichung eines
Arzneimittels wieder in die Betrachtung einbezogen werden sollte.
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Beispiel 2
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Die
Proteaseaktivität
von Brustkrebsproben, die durch chirurgische Operation extrahiert
und dann eingefroren wurden, wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel
1 unter Verwendung von dünnen
Gelatinemembranen, enthaltend einen Matrixmetalloproteinaseinhibitor
(1,10-Phenanthrolin), wie offenbart in WO 97/32035, gemessen. Die
Tests wurden für
20 Proben von Brustkrebs durchgeführt, wie diejenigen, die in
Beispiel 1 verwendet wurden. Die Proteaseaktivität war bei allen Proben unterdrückt und
bei allen Proben wurden kaum Verdauspuren beobachtet. Die Bewertungen
wurden im Hinblick auf die Ergebnisse des Beispiels 1 durchgeführt. Da
eine starke MMP-Aktivität
bei 8 von 20 getesteten Proben ausgedrückt wurde, wurde geschlossen,
dass ein Arzneimittel mit MMP-inhibitorischer Aktivität für die therapeutische
Behandlung effektiv war. Da die zwei Proben ohne Proteaseaktivität keine
abnormale Expression einer MMP-Aktivität zeigten,
wurde geschlossen, dass die Verabreichung eines Arzneimittels mit MMP-inhibitorischer
Aktivität
nicht notwendig war. Im Hinblick auf die Patienten, von denen die
verbliebenen 10 Proben abstammten, bei denen die Expression einer
schwachen MMP-Aktivität
beobachtet wurde, wurde geschlossen, dass andere Therapien zunächst angewandt
werden sollten, um einen Fortschritt zu sehen und danach die Anwendung
eines Arzneimittels mit MMP-inhibitorischer Aktivität wieder in
die Betrachtung einbezogen werden sollte.
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Beispiel 3
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Eine
Brustkrebsprobe, die durch Paracentese und Sog genommen worden war,
wurde in einem Phosphatpuffer, enthaltend 0,5% Polyvinylpyrrolidon suspendiert
und an eine dünne
Gelatinemembran, wie offenbart in der WO 97/32035 angehaftet, wobei ein
Cytospin-Apparat der Shandon Co., Ltd. mit einer Geschwindigkeit
von 400 Upm verwendet wurde. Die Membrandicke der Gelatine lag bei
7 μm. Die
Gelatinemembran wurde bei 37°C
für 16
Stunden unter 100% relativer Feuchtigkeit inkubiert und dann an Luft
getrocknet. Eine Lösung,
worin Ponceau 3R mit einer Konzentration von 0,8% in einer 6%igen
wässrigen
Trichloressigsäurelösung gelöst war,
wurde als Färbelösung verwendet.
Die Membran wurde in die Lösung
bei Raumtemperatur für
20 Sekunden für
das Anfärben
eingetaucht. Nachdem die Membran für 1 Minute mit Wasser gewaschen
worden war, wurde sie in einer Mayer's Hämatoxylinlösung für 2 Minuten für die Kernfärbung eingetaucht
und dann 10 Minuten mit Wasser gewaschen und an Luft getrocknet.
Nach dem Trocknen wurde ein Cover Aid Film (Sakura Seiki Co., Ltd.)
an die Membran unter Verwendung von Xylol zum Einschließen der
Zellprobe angehaftet. Der Film wurde auf einer Kunststoffbefestigung
gehalten und unter einem optischen Mikroskop beobachtet. Ein Gelatineverdau
wurde an Stellen beobachtet, an denen die Krebszellen vermutlich
vorlagen, basierend auf der Morphologie der Kerne, und so wurde
die Proteaseaktivität
verifiziert. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass ein
Arzneimittel mit Protease-inhibitorischer Aktivität für die therapeutische
Behandlung des Patienten effektiv war.
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Wenn
dieselben Tests für
5 Proben von Brustkrebs durchgeführt
wurden, wurden starke Aktivitäten
bei 4 Proben beobachtet und eine schwache bei einer Probe. Für die Patienten,
deren Proben starke Aktivitäten
ergaben wurde geschlossen, dass ein Arzneimittel mit Protease-inhibitorischer
Aktivität mit
einer täglichen
Dosis, angehoben bis zur oberen Grenze, verabreicht werden sollte.
Für die
Patienten, deren Probe eine schwache Aktivität ergab, wurde geschlossen,
dass zunächst
andere Therapien zur Beobachtung eines Fortschritts verwendet werden sollten
und dass danach die Anwendung eines Arzneimittels mit MMP-inhibitorischer
Aktivität
wieder in die Betrachtung einbezogen werden sollte.
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Beispiel 4
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Eine
Brustkrebsprobe, genommen durch Paracentese und Sog, wurde in einem
Phosphatpuffer, enthaltend 0,5% Polyvinylpyrrolidon und 10 μg/ml TIMP-1
(Gewebeinhibitor der Metalloproteinase-1) und TIMP-2 suspendiert
und an eine dünne
Gelatinemembran angehaftet, wie offenbart in WO 97/32035, wobei
ein Cytospin-Apparat von Shandon Co., Ltd. mit einer Geschwindigkeit
von 400 Upm verwendet wurde. Die Membrandicke der Gelatine lag bei
7 μm. Die
Gelatinemembran wurde bei 37°C
für 16
Stunden unter 100% relativer Feuchtigkeit inkubiert und dann an
Luft getrocknet. Eine Lösung,
worin Ponceau 3R mit einer Konzentration von 0,8% in einer 6%igen wässrigen
Trichloressigsäurelösung gelöst war,
wurde als Färbelösung verwendet.
Die Membran wurde in die Lösung
bei Raumtemperatur für
20 Sekunden für
das Anfärben
eingetaucht. Nachdem die Membran für 1 Minute mit Wasser gewaschen
worden war, wurde sie in einer Mayer's Hämatoxylinlösung für 2 Minuten
für die
Kernfärbung
eingetaucht und dann 10 Minuten mit Wasser gewaschen und an Luft
getrocknet. Nach dem Trocknen wurde ein Cover Aid Film (Sakura Seiki
Co., Ltd.) an die Membran unter Verwendung von Xylol zum Einschließen der
Zellprobe angehaftet. Der Film wurde auf einer Kunststoffbefestigung
gehalten und unter einem optischen Mikroskop beobachtet. Ein Gelatineverdau
wurde an Stellen nicht beobachtet, an denen die Krebszellen vermutlich
vorlagen, basierend auf der Morphologie der Kerne, was so zeigte,
dass die Proteaseaktivität
inhibiert war. Wenn Verdauspuren auf ähnliche Weise nachgewiesen
wurden, außer
für die
Behandlung mit TIMP-1 und TIMP-2 als Kontrolle, wurde die Gegenwart
von distinkten Verdauspuren beobachtet. Aus diesen Ergebnissen wurde
geschlossen, dass ein Arzneimittel mit MMP-inhibitorischer Aktivität für die therapeutische
Behandlung des Patienten effektiv war.
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Wenn
dieselben Tests für
5 Proben von Brustkrebs durchgeführt
wurden, wurden kaum Aktivitäten
bei allen Proben mit TIMP-Behandlungen
beobachtet, jedoch distinkte bei allen ohne. Aus den obigen Ergebnissen
wurde geschlossen, dass bei den Patienten, von denen die 5 getesteten
Proben stammten, die MMP-Aktivität
an Tumorstellen abnormal exprimiert wurde und es wurde geschlossen, dass
ein Arzneimittel mit MMP-inhibitorischer
Aktivität
für diese
Patienten als therapeutische Behandlung effektiv war.