DE69721507T2

DE69721507T2 - Verfahren zur analyse von proteasen und dünne membran zur verwendung in diesem verfahren

Info

Publication number: DE69721507T2
Application number: DE69721507T
Authority: DE
Inventors: Ogawa; Tsutomu Hamaoka; Tamura; Tetsuhiko Tachikawa; Ikuo Hasegawa; Shusaku Yoshiki; Kohji Hasegawa; Nishigaki
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 1996-02-29
Filing date: 1997-02-27
Publication date: 2004-03-25
Anticipated expiration: 2017-02-28
Also published as: CA2248272A1; CA2248272C; EP0884393B1; EP1295948B1; ATE405672T1; EP0884393A1; EP1295948A2; JP3302020B2; EP1295948A3; DE69721507D1; DE69738933D1; ATE239092T1; WO1997032035A1; EP0884393A4

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Messung von Protease. Insbesondere bezieht sie sich auf ein Verfahren zur Messung von Protease, welches die genaue Diagnose maligner Krebszellen ermöglicht, wie etwa in infiltrativer und metastatischer Aktivität, dem Grad des Fortschreitens periodontaler Krankheiten wie etwa alveolarer Pyorrhae, destruktiver pathologischer Zustände in rheumatoider Arthritis und dergleichen.
Verwandter Stand der Technik
Das Vorliegen oder die Abwesenheit der Infiltration in interstitielles Bindegewebe ist einer der Faktoren, welche den Unterschied zwischen gutartigen und bösartigen Tumoren bestimmen. Um die pathologischen Zustände zu klären ist es erforderlich, Veränderungen der Wachstumsdynamik von Tumorzellen per se zu beobachten und Faktoren zu finden, welche die Wechselwirkung zwischen Tumorzellen und interstitiellem Bindegewebe beeinflussen. Insbesondere wurde offenbart, dass Proteasen bei der Infiltration und Metatase von Tumorzellen beteiligt sind und dass entsprechend die Inhibierung der Infiltration und Metastase bösartiger Tumorzellen durch die Bontrolle von Proteasen erwartet wird. Unter derartigen Proteasen (extrazellulären Matrixlyasen) wurde eine wichtige Rolle der Matrixmetalloproteinasen (MMP) insbesondere bei dem Wachstum und der Infiltration von Krebszellen und der Arterialisierung aufgeklärt (siehe "Molecular Mechanism of Tumor Metastasis", Herausgeber T. Tsuruo, Kapitel 8; R. Miyazaki, "Matrix Proteases and Infiltration/metastasis of Cancer", Seiten 92 bis 107, Medical View Co., Ltd., 1993).
Periodontale Krankheiten schreiten fort unter Zerstörung des crevikularen Epithels und des Bindegewebes, welches hauptsächlich aus Collagen besteht, als frühem Krankheitsherd, und die Beteiligung von Matrixmetalloproteinase ist auch bekannt bei der Zerstörung von Geweben (hinsichtlich der Beteiligung von Proteinasen bei der Zerstörung von periodontalen Geweben und dem Zusammenhang zwischen pathologischen Zuständen und Proteasen, siehe "Science of Periodontal Treatment", Herausgeber M. Aono, Kapitel VII, M. Shirakawa, "Pathology of Periodontal Tissues", Seiten 99–109, Ishiyaku Shuppan; Hasegawa et al., "Gelatinase Actitivty in Gingival Crevicular Fluids (GCF) of Periodontal Disease Patients", Presentation No. A-44, 37th Fall Congress of Japan Periodental Disease Society und andere).
Die Matrixmetalloproteinasen bauen extrazelluläre Substrate wie etwa Collagen, Proteoglycan, Laminin, Fibronectin und Gelatine ab und das Vorliegen von 8 Typen, z. B. MMP-1, 2, 3, 7, 9, 10 ist bekannt. Interstitielle Collagenase (MMP-1), die am längsten bekannte Matrixmetalloproteinase, verteilt sich über Fibroblasten, Rnorpelgewebe und andere, und spaltet intestitielles Collagen in 1/4 und 1/3 Portionen. In periodontalen Krankheiten zerstören hauptsächlich MMP-2 (Gelatinase A) und MMP-9 (Gelatinase B) beispielsweise Typ IV-Collagen, Laminin, Fibronectin und Proteoglycan als Komponenten periodontaler Gewebe. Die Sekretion von Matrixmetalloproteinasen wird durch EGF und TGF-β als Zellwachstumsfaktoren stark gefördert, und die Sekretion und Expression der Aktivität werden durch endogene Inhibitoren im Gewebe kontrolliert. Die Arten der Suppression von dessen Expression bei der Beteiligung von Wachstumsfaktoren wurden jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt.
Plasminogen-Aktivator (PA), eine der Serinproteasen, ist eine weitere Protease, die an der Infiltration und Metastase von Tumorzellen beteiligt ist. Der Plasminogen-Aktivator überführt Plasminogen in Plasmin und durch die Wirkung von Plasminogen gebildetes Plasmin überführt Prometalloproteinase in Metalloproteinase als aktive Form. Entsprechend wird angenommen, dass Infiltration und Metastase von Krebszellen fortschreiten und beschleunigt werden durch eine zwischen Matrixinetallo-Proteinase und Plasminogenaktivator gebildete Kaskade.
Protease kann beteiligt sein an zerstörerischen pathologischen Zuständen wie etwa der Zerstörung von Knochengewebe und der Wurzelhaut, welches verursacht ist durch alveoläre Pyorrhoe und die Zerstörung von Periost und Knochengewebe, welche verursacht ist durch rheumatoide Arthritis, zusätzlich zur Infiltration und Metastase von Krebszellen und dem Fortschreiten periodontaler Krankheiten (für Beteiligung von Proteasen an Rheumatismus siehe Nippon Rinsho [Japan Clinic], 50(3), Seiten 463–467, 1992). Folglich kann die Messung von Protease in Zellen und Geweben eine genaue Diagnose der Bösartigkeit von Krebszellen auf Basis der infiltrativen und metastatischen Aktivität, pathologischer Zustände von periodontalen Krankheiten und dem Grad des Fortschreitens destruktiver pathologischer Zustände, wie etwa Rheumatismus, ermöglichen (zum Zusammenhang zwischen den Graden der Infiltration von Krebszellen und der Protease-Aktivität, siehe beispielsweise Yamagata, et al., Cancer Lett., 59, 51, 1991; Azzam et al., J. Natl., Cancer Inst., 85, 1758, 1993; Brown et al., Clin. Exp. Metastasis, 11, 183, 1993; Davies et al., Br. J. Cancer, 67, 1126, 1993).
Als Verfahren zur Messung von Protease wurden eingesetzt zymographische Verfahren, wobei die Enzymaktivität bestimmt wird basierend auf dem Grad des Substratabbaus, Immunoblottingverfahren unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch sind auf jede Protease, oder andere. Beispielsweise ist ein Verfahren bekannt umfassend die Schritte des Homogenisierens von Krebszellen oder periodontosen Zellen, Unterwerfen des Extrakts einer Elektrophorese unter Verwendung eines gelatinehaltigen SDS-Polyacrylamidgels, Färben des Gels nach der Elektrophorese unter Verwendung von Amidschwarz, gefolgt von der Bestimmung einer Probe als proteasepositiv, welche eine weiße klare nicht gefärbte Bande ergibt. Gemäß dieses Verfahrens ist jedoch die Herstellung eines SDS-Polyacrylamidgels für jede Messung erforderlich und das Verfahren dauert etwa 30 Stunden bevor die Messergebnisse erhalten werden.
Ein anderes Verfahren ist erhältlich, wobei ein Gel nach einer Elektrophorese gemäß der SDS-PAGE Technik auf eine Membran plaziert wird und nach dem Blotting Enzyme mittels monoklonaler Antikörper selektiert werden. Dieses Verfahren verwendet jedoch ebenfalls Elektrophorese, welches der selbe Nachteil ist wie bei der vorher genannten Methode. Zudem hat dieses Verfahren den weiteren Nachteil, dass es Renntnisse zur Bedienung erfordert und teure monoklonale Antikörper verwendet. Weiterhin ermöglichen diese Verfahren nicht die Messung von Protease in jeder individuellen Zelle, sondern sie messen lediglich die gesamten Proteasen in dem gesamten Gewebe. Folglich haben sie auch den Nachtei, keine Informationen bezüglich infiltrativer und metastatischer Aktivität individueller Krebszellen zu liefern.
Kürzlich wurde ein Verfahren vorgeschlagen, wobei die Protease-Aktivität in vaskulären Geweben basierend auf Zymographie gemessen wird (The FASEB Journal, Band 9, Juli, Seiten 974–980, 1995). Gemäß diesem Verfahren wird mit einer fluoreszierenden Verbindung modifiziertes Casein oder Gelatine als Substrat für Proteinase eingesetzt und das Verfahren umfaßt die Schritte der Bildung einer dünnen Membran auf Agarose, enthaltend das Substrat auf einem Mikroskopträger, Plazieren eines unfixierten Gewebeschnitts (6 bis 10 μm) auf der Oberfläche der dünnen Membran und Inkubieren des Schnitts bei 37° und Observieren des Abbaus des Substrats mittels eines Fluoreszenz-Mikroskops (siehe das Protokoll auf Seite 975, rechte Spalte, Zeilen 6–18). Obwohl dieses Verfahren den Vorteil einer direkten Messung von Proteasen in Geweben hat, erfordert Agarose als essentielle Komponente eine Fixierung des Substrats für die Protease auf einem Mikroskopträger, welches Fluktuationen in dem Substratabbau durch die Protease verursacht und zu dem Problem niedriger Reproduzierbarkeit führt.
EP 0 319 334 offenbart ein Assay-Verfahren zur Messung collagenolytischer Aktivität biologischer Fluide von Säugetieren, umfassend
das Gewinnen einer Probe des besagten Gewebefluids; Auftragen der Probe auf einen Träger, auf dessen Oberfläche ein Collagen-Substratfilm gebunden ist;
Inkubieren des Trägers;
Waschen des Trägers;
Färben des Trägers mit einer Lösung eines Farbstoffes der geeignet ist zur Färbung von Collagen; und
Bestimmen des Ausmaßes der Auflösung des Collagensubstrats aus dem Ausmaß der ungefärbten Flächen des Trägers.
Die Inkubierung des Trägers wird erzielt durch Erhitzen des Trägers unter Vernetzung des Collagens und dessen Bindung auf die Trägeroberfläche.
US 4 137 082 offenbart ein photographisches lichtempfindliches Material mit zumindest einer hydrophilen Colloidschicht, enthaltend (a) Gelatine und/oder ein Gelatinederivat und (b) zumindest eine Verbindung enthaltend zwei oder drei Vinylsulfonyl-Gruppen. Letztere Verbindungen können als Gelatine-Härtungsmittel in Silberhalogenid photographischen lichtempfindlichen Materialien eingesetzt werden.
SU 1 178 761 lehrt ein Verfahren zur Identifizierung von Proteinase-Inhibitoren mittels Fraktionierung von Proteinen in Gelen, gekennzeichnet dadurch, dass ein Bogen mit einer, Lösung einer Proteinase in einem Puffer benetztes Filterpapier auf ein Separierungsgel aufgetragen wird und nach der Fraktionierung das Papier entfernt wird, ein photographischer Film auf das Gel aufgetragen wird und inkubiert wird, bis Banden nicht abgebauter Gelatine auf dem photographischen Film detektiert werden, der photographische Film wird von dem Gel entfernt, ein Bogen angefeuchtetes Filterpapier wird darauf aufgetragen und Inhibitoren werden in den Bereichen nicht abgebauter Gelatine in Form von schwarzen Banden auf einem transparenten Hintergrund auf dem photographischen Film oder heller Banden auf einem dunklen Hintergrund des Filterpapiers identifiziert.
Offenbarung der Erfindung
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer bequemen und genauen Methode zur Messung von Protease. Insbesondere ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Messung von Protease, welches schnelle und genaue Bestimmung der Bösartigkeit von Krebszellen wie etwa infiltrativer und metastatischer Aktivität, pathologischer Zustände periodontaler Krankheiten und dergleichen, Grade des Fortschreitens destruktiver pathologischer Zustände wie etwa bei Rheumatismus, ermöglicht und welches geeignet ist zur genauen Diagnose von, beispielsweise, Krebsprognosen, dem Grad des Fortschreitens destruktiver pathologischer Zustände.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Messung von Protease, welches die obengenannten charakteristischen Merkmale aufweist und geeignet ist zur genauen Messung von aus Krebszellen stammender oder anderer lokalisierter Protease in Testgeweben.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer dünnen Membran zur Verwendung in dem obengenannten Verfahren zur Messung von Proteasen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten vielerlei Studien durch, um die obengenannten Ziele zu erreichen. Im Ergebnis fanden sie, dass in einer Probe erhaltene Proteasen eine dünne Membran abbauen und Abbauspuren auf der Oberfläche der dünnen Membran bilden, wenn ein Schnitt eines Gewebes wie etwa Krebsgewebes, in Kontakt gebracht wird mit einer Oberfläche einer dünnen Membran, enthaltend ein Proteasesubstrat wie etwa Gelatine zusammen mit einem Härtungsmittel, oder wenn ein aus einem morbiden Gewebe gesammeltes Exudat, wie etwa ein Gewebe einer periodontalen Krankheit, auf die dünne Membran gebracht wird. Sie fanden weiterhin, dass das Verfahren eine sehr viel höhere Reproduzierbarkeit hatte im Vergleich zu dem Verfahren, bei dem eine dünne Agarose enthaltende Membran verwendet wird (The FASEB Journal, Band 9, Juli, Seiten 974–980, 1995), und erzielten genaue Messung der Protease-Aktivität in den Proben. Weiterhin wurde auch gefunden, dass in individuellen Zellen exprimierte Proteasen durch Herstellung histopathologischer Präparationen und der obigen dünnen Membran-Präparationen nachgewiesen werden können, jeweils unter Verwendung kontinuierlicher Gewebeschnitte und unter Vergleich der resultierenden Präparationen. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Erkenntnisse erzielt.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Messung von Proteasen bereit, umfassend die folgenden Schritte (1) In-Kontakt-Bringen einer Protease enthaltenden Probe mit einer dünnen Membran, welche ein Proteasesubstrat zusammen mit einem Härtungsmittel umfasst und auf der Oberfläche eines Trägers gebildet ist; und (2) Nachweisen von Abbauspuren, die auf der dünnen Membran durch die Wirkung der Protease gebildet werden.
Gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Messung von Protease bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte (1) In-Kontakt-Bringen eines von zwei im wesentlichen kontinuierlichen Schnitten einer biologischen Probe mit einer dünnen Membran, die ein Proteasesubstrat zusammen mit einem Härtungsmittel umfasst und auf der Oberfläche eines Trägers gebildet ist; (2) Nachweisen der Abbauspur, die auf der dünnen Membran durch die Wirkung der Protease gebildet wird; und (3) Vergleichen der Abbauspur mit einer histopathologischen Präparation, die aus dem anderen Schnitt hergestellt wurde.
Gemäß der dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis von Proteasen bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte (1) In-Kontakt-Bringen einer von zwei oder mehreren im wesentlichen kontinuierlichen Schnitten einer biologischen Probe mit einer dünnen Membran, die ein Proteasesubstrat zusammen mit einem Härtungsmittel umfasst und auf der Oberfläche eines Trägers gebildet ist; (2) In-Kontakt-Bringen der verbleibenden Schnitte mit einer dünnen Membran, die ein Proteasesubstrat, ein Härtungsmittel und einen Protease-Inhibitor umfasst und die auf der Oberfläche eines Trägers gebildet ist; (3) Nachweisen der auf jeder der dünnen Membranen durch die Wirkung der Protease gebildeten Abbauspuren; und (4) Vergleichen der Abbauspur auf der in Schritt (1) verwendeten dünnen Membran mit der Abbauspur auf der in Schritt (2) verwendeten dünnen Membran. Eine bevorzugte Ausführungsform des obengenannten Verfahrens umfasst den Schritt (2), einen Schritt des In-Kontakt-Bringens der zwei oder mehreren verbleibendes Schnitte mit dünnen Membranen, die jeweils verschiedene Protease-Inhibitoren enthalten.
Gemäß der vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis von Protease bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte (1) In-Kontakt-Bringen einer von zwei oder mehreren im wesentlichen kontiniuierlichen Schnitten einer biologischen Probe mit einer dünnen Membran, die ein Proteasesubstrat zusammen mit einem Härtungsmittel umfasst und die auf der Oberfläche eines Trägers gebildet ist; (2) In-Kontakt-Bringen der verbleibenden Schnitte mit einer dünnen Membran, die ein Proteasesubstrat umfasst, welches verschieden ist von dem in der in Schritt (1) verwendeten dünnen Membran enthaltenen Substrat, zusammen mit einem Härtungsmittel und gebildet ist auf der Oberfläche eines Trägers; (3) Nachweisen der Abbauspur, die auf jeder der dünnen Membranen durch die Wirkung der Protease gebildet wird; und (4) Vergleichen der Abbauspur auf der in Schritt (1) verwendeten dünnen Membran mit der Abbauspur der auf der in Schritt (2) verwendeten dünnen Membran. Eine bevorzugte Ausführungsform des obengenannten Verfahrens umfasst in Schritt (2) einen Schritt des In-Kontakt-Bringens der zwei oder mehreren verbleibenden Schnitte mit dünnen Membranen, die jeweils verschiedene Proteasesubstrate enthalten.
Gemäß der fünften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis von Proteasen bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte (1) In-Kontakt-Bringen einer Protease enthaltenden Probe mit einer dünnen Membran, die zumindest die folgenden zwei Schichten umfaßt: Schicht (a), welche ein Proteasesubstrat, ein Härtungsmittel und einen Protease-Inhibitor enthält und die gebildet ist auf der Oberfläche eines Trägers, und Schicht (b), die ein Proteasesubstrat und ein Härtungsmittel umfasst und die auf Schicht (a) laminiert ist; (2) Nachweisen der Abbauspur, die auf der dünnen Membran durch die Wirkung der Protease gebildet wird; und (3) Vergleichen der Abbauspur auf Schicht (a) mit der Abbauspur auf Schicht (b).
Gemäß der sechsten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis von Protease bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte (1) In-Kontakt-Bringen einer Protease enthaltenden Probe mit einer dünnen Membran, die zumindest die folgenden zwei Schichten umfasst: Schicht (a), welche ein Proteasesubstrat zusammen mit einem Härtungsmittel umfasst und auf der Oberfläche eines Trägers gebildet ist und Schicht (b), welche ein Proteasesubstrat umfasst, das sich von dem in Schicht (a) enthaltenen Proteasesubstrat unterscheidet, zusammen mit einem Härtungsmittel und die auf Schicht (a) laminiert ist; (2) Nachweisen der Abbauspur, die durch die Wirkung der Protease auf der dünnen Membran gebildet wird; und (3) Vergleichen der Abbauspur auf Schicht (a) mit der Abbauspur auf Schicht (b).
Diese Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, dass eine Protease enthaltende Probe oder eine biologische Probe in Kontakt gebracht wird mit der Oberfläche einer dünnen Membran und nicht mit einem Träger.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden dünne Membranen zum Nachweis von Protease gemäß den obengenannten Verfahren bereitgestellt.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindungen werden bereitgestellt die obengenannten Verfahren und dünne Membranen, wobei das Proteasesubstrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Collagen, Gelatine, Proteoglycan, Fibronectin, Laminin, Elastin und Casein; die obengenannten Verfahren und dünnen Membranen, worin die Probe eine biologische von einem Patienten isolierte oder gesammelte Probe ist; die obengenannten Verfahren und dünnen Membranen, worin die biologische Probe ein Krebsgewebe-Schnitt ist, ein gingivales Exsudat der Zahnfleischtasche ist, oder ein Schnitt eines destruktiven morbiden Gewebes ist oder ein Extrakt (beipielsweise ein Extrakt eines rheumatoiden morbiden Gewebes oder eines Alveolarpyorrhoegewebes) ist; die obengenannten Verfahren und dünnen Membranen, worin die Protease eine Matrixmetalloprotease ist; die obengenannten Verfahren und dünnen Membranen, worin die Abbauspur mittels Färben nachgewiesen wird; die obengenannten Verfahren, worin der Nachweis durchgeführt wird unter Verwendung einer dünnen Membran, enthaltend eine oder mehrere Substanzen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Metallen, Metalloxiden, Pigmenten und Farbstoffen, und die eine maximale Transmissionsdichte von 0,01 oder mehr bei einer Wellenlänge von zwischen 400 nm und 700 nm aufweisen; und die obengenannten Verfahren und dünnen Membranen, worin Gelatine als Proteasesubstrat eingesetzt wird, und die Abbauspur gefärbt wird mittels einer Färbung der Gelatine unter Verwendung von Amidschwarz oder Coomassie Blue.
Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen der dünnen Membranen der vorliegenden Erfindung werden bereitgestellt die obengenannten dünnen Membranen, welche eine oder mehrere Substanzen umfassen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Metallen, Metalloxiden, Pigmenten und Farbstoffen, und die eine maximale Transmissionsdichte von 0,01 oder mehr bei einer Wellenlänge im Bereich von 400 nm bis 700 nm aufweisen; die obengenannten dünnen Membranen, worin der Träger ausgewählt ist aus einem Mikroskopträger und einem Polyethylenterephthalatfilm; die obengenannten dünnen Membranen, worin eine Unterbeschichtungsschicht zwischen dem Träger und der dünnen Membran vorgesehen ist; und die obengenannten dünnen Membranen, welche photographische Filme nach der Belichtung, Entwicklung und Fixierung sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Diagnose einer Krankheit, in der Protease involviert ist, bereitgestellt gemäß den in jeder der vorgenannten Methoden beschriebenen Schritten. Als bevorzugte Ausführungsformen der obengenannten Verfahren werden Verfahren bereitgestellt, worin die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Krebs, rheumatischen Krankheiten, periodontalen Krankheiten und alveolarer Pyorrhea.
Feste Form der Ausführung der Erfindung
Die Verfahren zum Nachweis von Protease gemäß den obengenannten Ausführungsformen umfassen im wesentlichen einen Schritt des In-Kontakt-Bringens einer Protease enthaltenden Probe mit einer dünnen Membran (erster Schritt), und einen Schritt des Nachweises der Abbauspur auf der dünnen Membran, die gebildet wird durch die Wirkung der Protease (zweiter Schritt). Die dünnen in den Verfahren eingesetzten Membranen zum Nachweis der Protease werden gebildet auf der Oberfläche eines Trägers in Form einer Monoschicht oder von Multischichten, und sind gekennzeichnet dadurch, dass sie ein Proteasesubstrat und ein Härtungsmittel als wesentliche Bestandteile enthalten. Folglich ist der Prozeß gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung gekennzeichnet dadurch, dass die Probe nicht in Kontakt gebracht wird mit dem Träger zu Beginn des Schrittes des In-Kontakt-Bringens der Probe mit der dünnen Membran. Da die obengenannten dünnen Membranen ein Härtungsmittel enthalten und frei sind von Bindemitteln wie etwa Agarose, enthalten die Membranen weiterhin eine hohe Dichte des Proteasesubstrats, wie etwa Gelatine, zum Abbau durch Protease, und das Brechen der Abbauspur wird durch die Vernetzung des Proteasesubstrats, wie etwa Gelatine, verhindert. Aus diesen Gründen haben die Verfahren eine ausgezeichnete Sensitivität und Reproduzierbarkeit des Protease-Nachweises als charakteristische Eigenschaften.
Der hier verwendete Begriff "Nachweismethode" sollte in seinem breitesten Sinne ausgelegt werden umfassend qualitative und quantitative Analysen. In den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird das Proteasesubstrat durch in der Probe enthaltene Proteasen abgebaut und Abbauspuren werden auf der dünnen Membran gebildet. Diese Abbauspuren können beispielsweise unter einem Mikroskop gegebenenfalls nach Färbung detektiert werden um die Gegenwart von Proteasen in der Probe zu bestätigen.
Proteasen als der Gegenstand der Messung gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen beispielsweise Matrixmetalloproteinasen (MMP) und Matrixserinproteasen (MSP). Diese Enzyme werden im Detail in "Molecular Mechanism of Cancer Metastasis", Herausgeber T. Tsuruo, Seiten 92–107, Medical View Co., Ltd. 1993) beschrieben. Beispiele von für die Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders geeigneten Proteasen umfassen, beispielsweise, Matrixmetalloproteinasen wie etwa interstitielle Collagenase (MMP-1), Gelatinase A (MMP-2) und Gelatinase B (MMP-9); Matrix-Serin-Proteasen wie etwa Plasminogen-Aktivator (PA) und dergleichen. Der Gegenstand des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf diese Proteasen beschränkt.
Die Proteasesubstrate sind nicht sonderlich beschränkt solange sie makromolekulare Verbindungen sind, die als Substrate von Proteasen abgebaut werden können.
Beispielsweise können Collagen, Gelatine, Proteoglycan, Fibronectin, Laminin, Elastin, Casein und dergleichen verwendet werden. Vorzugsweise können Collagen, Gelatine, Fibronectin, Elastin oder Casein verwendet werden und Gelatine, Fibronectin und Casein werden stärker bevorzugt verwendet. Die obengenannten Substanzen können alleine oder in Kombination zweier oder mehrerer als Proteasesubstrate eingesetzt werden.
Bei Verwendung zweier oder mehrerer verschiedener Proteasesubstrate in Kombination kann manchmal der Typ der in der biologischen Probe enthaltenen Protease genau identifiziert werden. Beispielsweise kann ein Verfahren eingesetzt werden, worin eine von zwei oder mehreren im wesentlichen kontinuierlichen Schnitten einer biologischen Probe in Kontakt gebracht werden mit einer dünnen Membran, die ein Proteasesubstrat enthält, und die verbleibenden Schnitte werden in Kontakt gebracht mit einer dünnen Membran, die ein Proteasesubstrat enthält, welches sich von dem Proteasesubstrat der obengenannten dünnen Membran unterscheidet; und dann werden die auf jeder der dünnen Membranen gebildeten Abbauspuren verglichen. Gemäß dem Verfahren kann der Nachweis durchgeführt werden unter Verwendung dreier oder mehrerer dünner Membranen, die jeweils ein verschiedenes Proteasesubstrat enthalten. Weiterhin kann beispielsweise auch ein Verfahren eingesetzt werden, worin eine einzelne dünne Membran hergestellt wird, die eine erste Schicht, enthaltend ein Proteasesubstrat und eine zweite Schicht, enthaltend ein von dem in der ersten Schicht enthaltenen Proteasesubstrat verschiedenes Proteasesubstrat enthält, umfasst; eine Probe enthaltend Protease wird in Kontakt gebracht mit der dünnen Membran; und anschließend werden die auf jeder der Schichten gebildeten Abbauspuren verglichen. Gemäß dem obengenannten Verfahren ist es auch möglich, eine dünne Membran, umfassend drei oder mehr laminierte Schichten, die jeweils ein verschiedenes Proteasesubstrat enthalten, zu verwenden.
Durch Verwendung eines Protease-Inhibitors wird es erleichtert, die dem Inhibitor entsprechende Protease zu identifizieren oder Eigenschaften der Protease zu bestimmen. Beispiele dieser Protease-Inhibitoren umfassen, beispielsweise, den Gewebe-Inhibitor der Metaproteinase 1 (TIMP1), den Gewebe-Inhibitor der Metaproteinase 2 (TIMP2), den großen Inhibitor der Metalloproteinase (LIMP), den Huhn-Inhibitor der Metalloproteinase (ChIMP), Opostatin, Platelet Factor IV (PF-4), α₂-Makroglobulin, EDTA, 1,10-Phenanthrolin, BB94, Minocyclin, Matristatin, SC-44463, Dithiothreitol (DTT) und dergleichen. Beispielsweise kann ein Verfahren eingesetzt werden, worin eine von zwei oder mehreren im wesentlichen kontinuierlichen Schnitten einer biologischen Probe in Kontakt gebracht wird mit einer dünnen Membran, enthaltend ein Proteasesubstrat, und die verbleibenden Schnitte werden in Kontakt gebracht mit anderen dünnen Membranen, enthaltend ein Proteasesubstrat zusammen mit einem Protease-Inhibitor, und anschließend werden die auf jeder der dünnen Membranen gebildeten Abbauspuren verglichen. Zusätzlich können beispielsweise Verfahren eingesetzt werden, worin eine einzelne dünne Membran hergestellt wird, welche eine erste Schicht enthält, die ein Proteasesubstrat enthält, und eine zweite Schicht, enthaltend ein Proteasesubstrat zusammen mit einem Protease-Inhibitor. Eine Probe, enthaltend Protease, wird in Kontakt gebracht mit der dünnen Membran; und dann werden die auf jeder der Schichten gebildeten Abbauspuren verglichen. Die Verfahren unter Verwendung von Protease-Inhibitoren können weiterhin kombiniert werden mit den obengenannten Verfahren unter Verwendung zweier oder mehrerer verschiedener Proteasesubstrate.
Das für die Herstellung der dünnen Membran der vorliegenden Erfindung eingesetzte Härtungsmittel hat die Wirkung der Förderung des Aushärtens der dünnen Membran während der Herstellung der das Proteasesubstrat enthaltenden dünnen Membran und/oder der Verhinderung des Aanschwellens der dünnen Membran nach der Bildung der dünnen Membran. Die Art des Härtungsmittels ist nicht sonderlich beschränkt, solange das Mittel die obigen Eigenschaften aufweist und die Reaktion der Protease mit dem Proteasesubstrat nicht wesentlich inhibiert, und es können anorganische oder organische Härtungsmittel eingesetzt werden. Beispielsweise können Härtungsmittel wie etwa Chromsalze (Chromalaum, Chromacetat und andere), Aldehyde (Formaldehyd, Glyoxal, Glutaraldehyd und andere), N-Methylol-Verbindungen (Dimethylolharnstoff, Methyloldimethylhydantoin und andere); Dioxanderivate (2,3-Dihydroxydioxan und andere), Verbindungen, die durch die Aktivierung von Carboxylgruppen Aktivität zeigen (Carbeniumverbindungen, 2-Naphthalensulfonate, 1,1-Bispyrrolidino-1-chloro-, Pyridinium, 1-Morpholinocarbonyl-3-(sulfonatoaminomethyl)- und andere); aktivierte Vinylverbindungen (1,3-Bisvinylsulfonyl-2-propanol, 1,2-Bis(vinylsulfonylacetamido)-ethan, Bis(vinylsulfonylmethyl)ether, Vinylpolymere mit Vinylsulfonylgruppen in den Seitenketten, 1,3,5-Triacryloyl-hexahydro-s-triazin, Bis(vinylsulfonyl)methan und andere), aktivierte Halogenverbindungen (2,4-Dichloro-6-hydroxy-striazin, dessen Natriumsalz und andere); Mucohalogensäuren (Mucochlorsäure, Mucophenoxychlorsäure und andere); Isoxazolverbindungen; Dialdehydstärke; 2-Chlor-6-hydroxytriazinylierte Gelatine können alleine oder in Kombination von zweien oder mehreren eingesetzt werden. Unter diesen sind die Härtungsmittel vom Vinylsulfonsäuretyp bevorzugt. Die Menge des Härtungsmittels ist nicht sonderlich beschränkt. Beispielsweise können hinsichtlich der Nachweisleistung bei Verwendung von Gelatine als Proteasesubstrat etwa 0,1 bis 20 mmol, stärker bevorzugt etwa 0,3 bis 10 mmol pro 100 g Gelatine eingesetzt werden.
Als für das Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzte Proben können beispielsweise biologische Proben, die von Säugetieren, einschließlich des Menschen, isoliert oder gesammelt wurden, eingesetzt werden. Die biologischen Proben können Gewebe oder Gewebeexsudate und dergleichen sein. Beispielsweise können Krebsgewebe von festen Tumorgeweben von Lungenkrebs, Magenkrebs, Speiseröhrenkrebs, Brustkrebs, Hirntumoren und dergleichen, die durch chirurgische Operationen oder histologische Untersuchung isoliert oder gesammelt wurden; Synovialflüssigkeit und Knochengewebe rheumatoider Arthritis; destruktive morbide Gewebe wie etwa periodontale Bänder oder Knochengewebe und Exsudate alveolarer Pyorrhea; gingivales crevikulares Exsudat periodontaler Krankheiten und dergleichen können verwendet werden.
Wenn ein Gewebe als Probe verwendet wird, kann beispielsweise ein Schnitt mit einer Dicke von 1 bis 10 μm, vorzugsweise 5 μm aus einer schnell in flüssigem Stickstoff gefrorenen Probe hergestellt werden unter Verwendung eines Apparates zur Herstellung gefrorener Schnitte, und dann kann der Schnitt auf die dünne Membran aufgebracht werden, um die Probe in Kontakt mit der dünnen Membran zu bringen. Wenn von einem Patienten mit rheumatoider Arthritis gesammelte Synovialflüssigkeit als Probe verwendet wird, können etwa 5 bis 50 μl, vorzugsweise etwa 20 μl der Synovialflüssigkeit auf die dünne Membran getropft werden. Wenn gingivale creviculare Flüssigkeit einer periodontalen Krankheit als Probe verwendet wird, kann ein Filterpapier in die gingiviale Höhle eingeführt werden, um etwa 5 bis 10 μl der gingivialen crevikularen Flüssigkeit zu sammeln, und das Filterpapier kann auf die dünne Membran aufgetragen werden. Nach dem Sammeln der gingivialen crevikularen Flüssigkeit kann die gingiviale crevikulare Flüssigkeit gegebenenfalls unter Verwendung destillierten Wassers oder eines geeigneten Puffers (beispielsweise 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl₂, 0,2 M NaCl) extrahiert werden, und das Extrakt kann auf die dünne Membran getropft werden.
Die dünne Membran wird vorzugsweise gebildet auf einem transparenten oder durchscheinenden Träger, so dass die Gegenwart der Protease in einem Gewebe unter einem Mikroskop beobachtet werden kann. Beispiele derartiger transparenter oder durchscheinender Träger umfassen beispielsweise Glas und transparente oder durchscheinende Plastikfilme, die aus Polyethylenterephthalat, Polycarbonat, Polyimid, Nylon, Cellulose, Triacetat und dergleichen hergestellt werden. Als Glas ist die Verwendung mikroskopischer Träger bevorzugt und als Plastikfilm ist Polyethylenterephthalatfilm bevorzugt. Der Träger ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt und jedes Material kann eingesetzt werden, soweit es gleichmäßige dünne Membranen zu liefern imstande ist, welche geeignet sind für die mikroskopische Betrachtung.
Wenn eine Probenlösung wie etwa gingiviale crevikulare Flüssigkeit auf die Oberfläche der dünnen Membran getropft wird, können Abbauspuren längs des periphären Umfangs der kreisförmigen aufgetragenen Fläche, die durch den Tropfen gebildet wird, detektiert werden. In diesem Fall ist eine Detektion unter einem Mikroskop nicht notwendigerweise erforderlich und entsprechend können undurchsichtige Träger zusätzlich zu den oben erläuterten Trägern eingesetzt werden. Beispielsweise können Papier, Plastikpapier, mit synthetischem Harz (beispielsweise Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyethylennaphthalat und anderen) laminiertes Papier, Metallplatten (beispielsweise Platten aus Aluminium, Aluminiumlegierungen, Zink, Eisen, Kupfer und anderen), Papier oder Plastikfilme, auf die die obengenannten Metalle laminiert oder mittels Verdampfung abgeschieden sind, und dergleichen verwendet werden. In der obengenannten Ausführungsform kann der Träger farbig sein.
Die Dicke des Trägers ist nicht besonders beschränkt. Bei Glasträgern können solche bevorzugt sein, die eine übliche Dicke fürmikroskopische Träger (beispielsweise etwa 2 bis 3 mm) aufweisen. Hinsichtlich der Polyethylenterephthalatfilme können solche verwendet werden, die eine Dicke von etwa 100 bis 250 μm, stärker bevorzugt etwa 150 bis 200 μm und am meisten bevorzugt etwa 175 μm aufweisen. Die dünne Membran auf dem Träger kann als Monoschicht oder als Multischicht gebildet sein und die dünne Membran sollte so hergestellt sein, dass sie eine Oberfläche hat, die so gleichförmig wie möglich ist. Beispielsweise kann die dünne Membran vorzugsweise so gebildet sein, dass sie eine Dicke von etwa 1 bis 10 μm, stärker bevorzugt etwa 4 bis 6 μm nach dem Trocknen aufweist.
Für die Herstellung der dünnen Membran kann beispielsweise ein Proteasesubstrat, welches in Wasser oder einem organischen Lösungsmittel wie etwa Methylenchlorid, Aceton, Methanol und Ethanol oder einem daraus gemischten Lösungsmittel dispergiert ist, auf eine Oberfläche des Trägers gesprüht und dann getrocknet werden. Als Verfahren zum Auftragen können Tauchbeschichtungs-Verfahren, Rollerbeschichtungs-Verfahren, Vorhangbeschichtungs-Verfahren, Extrusionsbeschichtungs-Verfahren und dergleichen eingesetzt werden. Die Verfahren zur Herstellung der dünnen Membran sind jedoch nicht begrenzt auf diese Beispiele und üblicherweise eingesetzte Verfahren zur Herstellung dünner Membranen in dem Bereich der photographischen Filme beispielsweise, können passenderweise eingesetzt werden. Wenn Gelatine als Proteasesubstrat eingesetzt wird, ist der Typ der Gelatine nicht sonderlich beschränkt. Beispielsweise können Alkali-extrahierte Rinderknochen-Gelatine, Alkali-extrahierte Schweine-Lederhaut-Gelatine, Säureextrahierte Rinderknochen-Gelatine, Phthalation-behandelte Rinderknochen-Gelatine, Säure-extrahierte Schweine-Lederhaut-Gelatine und dergleichen eingesetzt werden.
Wenn die dünne Membran auf einem Träger gebildet wird, kann eine Unterschicht zwischen der dünnen Membran und dem Träger vorgesehen werden um die Adhäsion der dünnen Membran auf den Träger zu verbessern. Beispielsweise kann die Unterschicht gebildet werden unter Verwendung eines Polymers oder Copolymers, welches erhalten wird durch Polymerisation von einem oder mehreren Monomeren, ausgewählt aus Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Butadien, Methacrylsäure, Acrylsäure, Itaconsäure, Maleinsäureanhydrid und dergleichen, oder aus einem Polymer wie etwa Polyethylenimin, Epoxidharz, gepfropfte Gelatine, Nitrocellulose und dergleichen. Wenn ein Polyesterträger eingesetzt wird, kann die Adhäsion zwischen dem Träger und der dünnen Membran in manchen Fällen verbessert werden durch Unterwerfen der Oberfläche des Trägers einer Corona-Entladungsbehandlung, ultravioletter Bestrahlung oder Glimm-Entladungs-Behandlung anstelle des Vorsehens einer Unterschicht.
Der Begriff "eine auf einer Oberfläche des Trägers gebildete dünne Membran" und dessen Äquivalente, sollte nicht so ausgelegt werden, dass er jene mit einer oder mehreren Unterschichten und/oder Oberflächenbehandlungen des Trägers ausschließt. Mittel zur Verbesserung der Adhäsion der dünnen Membran und des Trägers sind nicht beschränkt auf die oben genannten und die beispielsweise in dem Gebiet photographischer Filme üblicherweise eingesetzten und andere können geeigneterweise angewendet werden.
Zur Herstellung der dünnen Membran können andere Komponenten wie etwa Farbstoffe, Pigmente, Antiseptika, Stabilisatoren und dergleichen gegebenenfalls zusätzlich zu den obengenannten Komponenten zugegeben werden. Diese Komponenten können geeigneterweise ausgewählt und eingesetzt werden, solange sie die Reaktion der Protease mit dem Proteasesubstrat nicht wesentlich stören. Beispielsweise können als Farbstoffe jene eingesetzt werden, die offenbart sind in der ungeprüften Japanischen Patentveröffentlichung KOKAI) Nr. (Hei)6-102624/1994 (spezifische Farbstoffe, dargestellt durch Formel 1-1 auf Seite 9 bis Formel 63 auf Seite 47). Als Verfahren zur Zugabe von Farbstoffen können jene eingesetzt werden die offenbart sind in der ungeprüften Japanischen Patentveröffentlichung (KOKAI) Nr. (Hei)5-313307/1993 (Verfahren, die spezifisch erläutert sind von Paragraph [0037] auf Seite 11 bis Paragraph [0044] auf Seite 12). Die Zugabe eines Farbstoffs oder eines Pigments kann den Nachweis der Abbauspuren erleichtern. Für diesen Zweck können ein Metall und ein Metalloxid, die sich von dem Farbstoff und dem Pigment unterscheiden, ebenso formuliert werden. Wenn eine Substanz wie etwa ein Metall, Metalloxid, Farbstoff und Pigment zugegeben wird, kann die dünne Membran als Endprodukt vorzugsweise eine maximale Transmissionsdichte von 0,01 oder höher bei einer Wellenlänge von 400 nm bis 700 nm aufweisen. Eine oder mehrere dieser Substanzen können in der dünnen Membran formuliert werden und verschiedene Substanzen wie etwa Farbstoffe in verschiedenen Farben, können zu jeder der Schichten, die die dünne Membran bilden, zugegeben werden. Wenn Agarose zur Herstellung der dünnen Membran eingesetzt wird, kann die Reproduzierbarkeit des Proteasenachweises erniedrigt sein. Daher ist es nicht bevorzugt, Agarose zur Herstellung der dünnen Membran gemäß der vorliegenden Erfindung einzusetzen.
Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Protease enthaltende Probe in Kontakt gebracht mit einer dünnen Membran mittels, beispielsweise, Auftragen einer Gewebeschicht auf die dünne Membran oder Auftropfen einer flüssigen Probe auf die dünne Membran, und anschließendes Inkubieren wird durchgeführt vorzugsweise in einer befeuchteten Zelle bei 37°C über einen Zeitraum von, beispielsweise, etwa 1 bis 24 Stunden, bevorzugt etwa 2 bis 12 Stunden, stärker bevorzugt etwa 3 bis 6 Stunden für Gewebeschnitte oder etwa 0,5 bis 12 Stunden, bevorzugt etwa 1 bis 6 Stunden, stärker bevorzugt etwa 1 bis 3 Stunden für flüssige Proben. Wenn in der Probe Proteasen enthalten sind, wird das Proteasesubstrat in der dünnen Membran durch die Proteasen abgebaut und die Abbauspuren werden auf der dünnen Membran gebildet. Die dünne Membran wird einer Betrachtung mit dem nackten Auge oder unter einem Mikroskop, gegebenenfalls nach Anfärbung, unterworfen, um die Gegenwart der Protease zu bestätigen. Die Auswertung kann spektrometrisch mittels eines Spektrophotometers durchgeführt werden.
Wenn Gelatine als Proteasesubstrat eingesetzt wird ist es bevorzugt, die Abbauspuren nach einer Gelatineanfärbung zu beobachten. Die Gelatineanfärbung kann durchgeführt werden gemäß konventioneller Verfahren unter Verwendung von beispielsweise 1% Amidschwarz oder Coomassie Blue. Beispielsweise wird eine dünne Gelatinemembran schwarz bis dunkelblau gefärbt durch Gelatineanfärbung unter Verwendung von Amidschwarz. Wenn die Abbauspuren der Gelatine auf der Oberfläche der dünnen Gelatinemembran mittels einer Protease gebildet werden, erscheinen weiße ungefärbte Flecken, da Gelatine in den Gebieten der Abbauspur abwesend ist. Dünne Gelatinemembranen werden auf photographischen Filmen gebildet und entsprechend können photographische Filme (beispielsweise Neopan F, Fuji Photo Film Co., Ltd.) eingesetzt werden als die dünne Membran nach deren Belichtung und konventioneller Entwicklung, Fixierung, Spülen und Trocknungsbehandlung. In diesem Fall können Abbauspuren beobachtet werden als weiße Bereiche auf einem mit Schwarzlicht belichteten Film.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann die Gegenwart aus individuellen Zellen stammender Protease in einem Gewebe genau bestimmt werden mittels Herstellung kontinuierlicher gefrorener Schnitte aus einem Krebsgewebe oder anderer Gewebe, Herstellung einer konventionellen histopathologischen Präparation von einer oder zweier im wesentlichen kontinuierlicher Schnitte wie etwa eines Hematoxylin/Eosin Färbungsschnittes, Behandlung des anderen Schnittes gemäß dem Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung, und Vergleich der Ergebnisse einer jeden Beobachtung. Diese Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Proteasen ermöglicht die genaue Bestimmung der Bösartigkeit individueller Krebszellen (infiltrative und metastatische Aktivität), die in Geweben vorliegen, und eine eindeutige Diagnose hinsichtlich der Krebsprognose. Weiterhin können durch quantitative Messung der Protease in einer Probe von Synovial-Flüssigkeit aus rheumatoider Arthritis, gingivaler crevikularer Flüssigkeit und dergleichen pathologische Zustände und der Grad des Fortschreitens von Krankheiten genau bestimmt werden. Für die quantitative Bestimmung von Protease in einer Probe ist es bevorzugt, eine Eichkurve unter Verwendung von zuvor hergestellten Standardlösungen herzustellen.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele ausführlicher erläutert. Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist jedoch auf diese Beispiele nicht beschränkt.
Beispiel 1:
Herstellung einer dünnen Membran zur Messung von Protease
Alkali-extrahierte Rinderknochen-Gelatine (10 g) wurde in reinem Wasser (127 g) gelöst und die Lösung wurde zu 1,2-Bis(vinylsulfonylacetamido)ethan (2%, 0,8 ml) als Härtungsmittel zugegeben. Die Lösung wurde gleichförmig auf einen mit einer Unterschicht versehenen Polyethylenterephthalatfilm aufgetragen unter Erhalt einer getrockneten Membran mit einer Dicke von etwa 5 μm, und dann wurde die Membran getrocknet unter Erhalt einer dünnen Gelatinemembran. Die dünne Gelatinemembran wurde bei Raumtemperatur vor deren Verwendung gelagert.
Beispiel 2:
Herstellung einer dünnen Membran zum Nachweis von Protease
Alkali-extrahierte Rinderknochen-Gelatine-Lösung wurde auf dieselbe Art wie in Beispiel 1 hergestellt und die Lösung wurde auf einen Mikroskopträger aufgetragen unter Erhalt einer Membran mit einer Dicke von etwa 6 μm nach dem Trocknen, und dann wurde die Membran unter Erhalt einer dünnen Gelatinemembran getrocknet. Weiterhin wurden dünne Gelatinemembranen hergestellt unter Verwendung von jeweils Alkali-extrahierter Schweine-Lederhaut-Gelatine, Säureextrahierter Rinderknochen-Gelatine, Phthalation-behandelter Rinderknochen-Gelatine, Säure-extrahierter Schweine-Lederhaut-Gelatine (#G2625, Sigma) und Säure-extrahierter Schweine-Lederhaut-Gelatine (#G2500, Sigma) anstelle der Alkali-extrahierten Rinderknochen-Gelatine.
Beispiel 3:
Messung von Proteasen
Als flüssige Proteasenproben wurden Lösungen, die jeweils Matrix-Metalloproteinase MMP-1, MMP-2 und MME-9 (Yagai Co., Ltd) bei einer Konzentration von 2 pg/ml bis 200 ng/ml enthielten, eingesetzt. Als biologische Proben wurden verwendet Gingiva und Gingival crevikulare Flüssigkeit (GCF), die von Patienten mit periodontalen Krankheiten gesammelt wurden und Überstände von Kulturen pathogener Bakterien, die periodontale Krankheiten verursachen (P. Gingivalis #381 Stamm; A. actinomycetemcomitans Y4 Stamm; und P. intermedia ATCC 25611 Stamm). Etwa 10 μl der flüssigen Proben wurde auf jede der in Beispiel 2 erhaltenen dünnen Gelatinemembranen getropft und aus gefrorenen Schnitten von etwa 5 μm gewonnene Gewebeproben wurden auf jede der dünnen Gelatinemembranen aufgetragen. Die dünnen Gelatinemembranen wurden in eine befeuchtete Zelle platziert und bei 37°C über 4 bis 16 Stunden inkubiert und dann mit Coomassie Blue angefärbt.
Im Ergebnis wurden durch den Gelatineabbau mittels der Protease nicht gefärbte Bereiche (Bereiche weißer Flecken: Spuren des Gelatineabbaus) in allen der dünnen Gelatinemembranen beobachtet. Insbesondere ergaben die dünnen Membranen der Phthalation-behandelten Rinderknochen-Gelatine auffälligen Gelatineabbau bei flüssigen Proben und dünne Gelatinemembranen aus Säure-extrahierter Schweine-Lederhaut-Gelatine gaben ebenso ausgeprägte Spuren des Gelatineabbaus für flüssige Proben und für Gewebeschnitte. Hinsichtlich MMP-1, MMP-2 und MMP-9 wurden Protease-Aktivitäten bei Konzentrationen von 200 ng/ml nach 4 Stunden beobachtet, bei 20 ng/ml nach 8 Stunden und bei Konzentrationen im Bereich von 20 bis 200 pg/ml nach 16 Stunden. Die meisten der gingivalen crevicularen Flüssigkeiten erforderten 8 bis 16 Stunden bis die Protease-Aktivität erkannt wurde und es wurde vorgeschlagen, dass die Menge der Protease in einem Bereich von 2 pg/ml bis 20 ng/ml lag. Protease-Aktivitäten in Gewebeschnitten wurden erkannt an Stellen des crevicularen Epithels, des umfänglichen Epithels und des subepithelialen Bindegewebes, wo starke entzündliche Zellinfiltration beobachtet wurde.
Beispiel 4:
Messung von Protease in Krebsgeweben
Als Test-Gewebeproben wurden chirurgische Proben von glossa epidermoidem Krebs, Lungenkrebs und Speiseröhrenkrebs in Stücke von etwa 0,5 cm Dicke × 2 cm Breite geschnitten, schnell in flüssigem Stickstoff gefroren und dann bei –80°C gelagert. Kontinuierliche Schnitte mit einer Dicke von 5 μm wurden aus diesen Proben unter Verwendung eines Apparates zur Herstellung gefrorener Schnitte hergestellt, und einer dieser Schnitte wurde auf einem Mikroskopträger fixiert und getrocknet. Dann wurde der Schnitt mit 10% Formalin über 5 Minuten fixiert und mit Hematoxylin/Eosin auf eine konventionelle Art angefärbt. Die anderen kontinuierlichen Schnitte wurden auf die in Beispiel 2 und Beispiel 3 hergestellten dünnen Gelatinemembranen fixiert und die Membranen wurden in eine befeuchtete Zelle plaziert und bei 37°C über 3 bis 6 Stunden inkubiert.
Nach der Inkubierung wurden die dünnen Gelatinemembranen mit 1% Amidschwarz-Lösung angefärbt, getrocknet und mikroskopisch untersucht. Bereiche, in denen Protease-Aktivitäten ausgedrückt wurden ergaben Spuren von Gelatineabbau als weiße Flecken, wohingegen andere Bereiche dunkelblau bis schwarz waren. Bei allen Krebsgeweben wurden die Spuren des Gelatineabbaus in individuellen Krebszellen, die Krebsalveolen-Läsionen bilden, erkannt und die in der Peripherie der Krebsalveolen-Läsionen angeordneten Zellen ergaben besonders charakteristische Spuren des Gelatineabbaus. Schwacher Gelatineabbau wurde auch in normalen Platycyten beobachtet und ein stärkerer Gelatineabbau wurde im Zusammenhang mit dem Fortschreiten von atypischem Epithelwachstum erkannt.
Beispiel 5:
Klinischer Fall (buccale Höhle maxillarer gingivaler Krebs)
Krebszellen in der Probe waren jene mit niedrigdifferenzierten epidermoidem Krebs, welcher eine alveoluse Läsionsstruktur bildete, und sie zerstörten Knochengewebe und zeigten starke Infiltration. Bereiche der dünnen Gelatinemembran, entsprechend den Krebszellen in den Krebsalveolusen Läsionen wurden abgebaut unter Bildung von Spuren von Gelatineabbau als weiße Punkte aus der dünnen Gelatinemembran-Präparation, und Bereiche der dünnen Gelatinemembran entsprechend den in der Peripherie der Krebs-alveolusen Läsionen angeordneten Zellen zeigten besonders charakteristische Spuren des Gelatineabbaus. In Bereichen entsprechender fokaler entzündlicher Zell-Infiltrations-Orte werden bemerkenswerte granuläre Spuren von Gelatineabbau gebildet. Bei Beobachtung Krebsalveolusen-Läsionen in Vergrößerung wurden charakteristische Spuren des Gelatineabbaus in den Zellen der Wachstumsorte, die an der Peripherie der Krebsalveolusen-Läsionen angeordnet waren, erkannt, und granuläre Spuren von Gelatineabbau wurden auch beobachtet bei Fibroblasten in dem den Krebsalveolusen-Läsionen benachbarten Interstitium.
Beispiel 6:
Klinischer Fall (Zungenkrebs)
Die Krebszellen in der Probe waren solche von undifferenziertem epidermoidem Krebs und sie bildeten Krebsalveolusen-Läsionen in verschiedenen Größen. Jeder Bereich entsprechend den in der Peripherie der Krebsalveolusen-Läsionen angeordneten Zellen zeigte charakteristische Spuren des Gelatineabbaus und die Spuren des Gelatineabbaus an Orten entsprechend den Zellen der Wachstumsregionen waren besonders beachtlich. Granuläre Spuren des Gelatineabbaus wurden auch in Bereichen entsprechend fokaler entzündlicher Zellinfiltrationsorte beobachtet.
Beispiel 7:
Klinischer Fall (schwere Epitheldysplasie oraler Mucosa)
In einer Hematoxylin/Eosin-angefärbten Probe wurde schwere. Epitheldysplasie im Epithelium erkannt und Hyperplasie von Stachelzellen und multiple Stratifikation basaler Zellen wurden beobachtet. Insbesondere wurden Polymorphismus und atypisches Zellwachstum in basalen Zellen beobachtet. Auf der dünnen Gelatinemembran wurden charakteristische Spuren des Gelatineabbaus erkannt in Bereichen entsprechend der hyperplastischen Stachelzellen-Schicht und der Granulozytenschicht, wobei lediglich punktierte Spuren des Gelatineabbaus in der Basalzellenschicht erkannt wurden. Diese Ergebnisse schlagen vor, dass der Umsatz von Epithelzellen sehr schnell verlief, wohingegen basale Zellen in das epitheliale Bindegewebe infiltrierten.
Wenn die Hyperplasie von Stachelzellen und die multiple Stratifikation basaler Zellen in Vergrößerung beobachtet wurden, konnten Spuren des Gelatineabbaus in Bereichen entsprechend beiden Zellschichten erkannt werden, und insbesondere wurde Gelatine merklich abgebaut in Bereichen entsprechend den Stachelzellen und den stratifizierten Basalzellen. Andererseits wurde Gelatine weniger abgebaut durch Basalzellen in Monoschichten oder Doppelschichten, verglichen mit stratifizierten Basalzellen. Die stratifizierten Basalzellen wurden in Spindelform deformiert und Polymorphismus und Heteromorphismus der Zellen wurden beobachtet. Bereiche entsprechend den Heteromorphismus sowie Wachstumstendenzen zeigenden Zellen ergaben charakteristische Spuren des Gelatineabbaus auf der dünnen Gelatinemembran.
Beispiel 8:
Proteasenachweis in einer flüssigen Probe
Etwa 20 μl synovialer Flüssigkeit rheumatischer Patienten wurde auf eine dünne Gelatinemembran getropft und die Membran wurde in einer befeuchteten Zelle bei 37°C über 1 bis 3 Stunden inkubiert. Die dünne Gelatinemembran wurde anschließend mit 1% Amidschwarz angefärbt. Charakteristische Spuren des Gelatineabbaus Kurden beobachtet im peripheren Ring um den durch das Auftropfen auf die dünne Gelatinemembran gebildeten kreisförmigen Bereich. Insbesondere wurden besonders auffällige Spuren des Gelatineabbaus beobachtet, wenn eine dünne Membran aus Phthalation-behandelter Rinderknochen-Gelatine eingesetzt wurde.
Beispiel 9:
Nachweis der Protease-Aktivität in periodoatalen Krankheiten
Speichel und Zahnbelag auf Zahnoberflächen wurden mit Tupfern so vollständig wie möglich zum einfachen Ausschluß von Feuchtigkeit entfernt, und anschließend wurde ein Stück Perio-Papier in die gingivale Höhle eingeführt und dort für 90 Sekunden belassen, um eine Absorption der gingivalen Flüssigkeit der Zahnfleischtasche (etwa 5 bis 10 μl) in das Perio-Papier zu ermöglichen. Das Perio-Papierstück wurde mit 150 μl eines Puffers (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl₂, 0,2 M NaCl) extrahiert, und Protease wurde gemäß dem selben Verfahren wie in Beispiel 3 nachgewiesen unter Verwendung des Extraktes als Probenlösung. Im Ergebnis wurden charakteristische Spuren des Gelatineabbaus entlang des peripheren Kreises um den durch das Auftropfen der gingivalen Flüssigkeit der Zahnfleischtasche auf die dünne Gelatinemembran gebildeten kreisförmigen Bereich beobachtet.
Beispiel 10:
Herstellung der dünnen Membran zum Nachweis von Proteasen
Alkali-extrahierte Rinderknochen-Gelatine (15 g) wurde in reinem Wasser (123 g) aufgelöst und zu der Lösung wurde 1,2-Bis(vinylsulfonylacetamido)ethan (4% wässrige Lösung, 0,6 ml) als Härtungsmittel zugegeben. Die Lösung wurde gleichförmig auf ein Objektglas mittels eines Drahtbarren-Beschichters aufgetragen unter Erhalt einer getrockneten Membran mit einer Dicke von etwa 7 μm, und dann wurde die Membran getrocknet unter Erhalt einer dünnen Gelatinemembran (dünne Einzelschichtmembran: Probe 101). Die dünne Membran wurde vor ihrer Verwendung bei Raumtemperatur gelagert. Durch Verwendung der in Tabelle 1 dargestellten Proteasesubstrate anstelle der Alkali-extrahierten Rinderknochen-Gelatine und Wechseln oder Ergänzen des Härtungsmittels, des Additivs und des Trägers, wie in Tabelle 1 dargestellt, wurden die Proben 102 bis 130 auf dieselbe Art wie Probe 101 hergestellt. Bei dem Auftragen wurde nach Bedarf eine Auftragungshilfe eingesetzt. In der Tabelle repräsentiert Farbstoff 1 Amidschwarz und Pigment 1 repräsentiert Kupferphthalocyanin.
Beispiel 11:
Herstellung einer dünnen Membran für einen Protease-Assay
Eine Collagen I-Lösung (Wako Pure Chemical Industries, 3 mg/ml) wurden gleichförmig auf einen Mikroskopträger mittels eines Drahtbarren-Beschichters aufgetragen unter Erhalt einer getrockneten Membran mit einer Dicke von etwa 1 μm, und dann wurde die Membran getrocknet unter Erhalt einer dünnen Gelatinemembran (dünne Einzelschicht-Membran: Probe 131). Die dünne Membran wurde vor ihrer Verwendung bei Raumtemperatur gelagert. Unter Verwendung der in Tabelle 2 dargestellten Proteasesubstrate anstelle von Collagen I, und durch Wechseln oder Ergänzen des Härtungsmittels, des Additivs und des Trägers, wie in Tabelle 2 dargestellt, wurden die Proben 132 bis 160 auf dieselbe Art wie Probe 131 hergestellt. Bei dem Auftragen wurde nach Bedarf eine Auftragshilfe eingesetzt.
Proben 161 bis 170 wurden auf dieselbe Art hergestellt wie Proben 121 bis 130, mit der Ausnahme, dass ein Gleitbeschichter (slide coater) anstelle des Drahtbarren-Beschichters zum Auftragen eingesetzt wurde. Als Trocknungsbedingungen wurden Verfahren angewendet, worin die Proben gegebenenfalls nach Bedarf einmal auf 10°C gekühlt wurden und bei Raumtemperatur und normaler Luftfeuchtigkeit getrocknet wurden.
Beispiel 12:
Protease-Aktinitäts-Assay
Etwa 10 μl der in Beispiel 3 beschriebenen MMP-2 wurde als flüssige Proteaseprobe eingesetzt und die Lösung wurde auf jede der in Beispiel 11 erhaltenen dünnen Membranen getropft. Die dünnen Membranen wurden in eine befeuchtete Zelle gegeben und bei 37°C über 4 bis 16 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die transparenten Proben mit Amid-Schwarz-Lösung angefärbt. Zur Beurteilung der Aktivität wurden bei jeder der Probe (1) eine Betrachtung mit dem bloßen Auge, (2) die Dichtemessung von Mikroportionen mittels Mikrodensitometrie, und (3) die Messung der Membrandecke unter Verwendung eines Kontakt-Membrandicke-Messungsapparates durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3
In all den von von Protease-Inhibitoren freien dünnen Membranen wurden weiße Flecken beobachtet, wo das Protease-Substrat durch die Protease abgebaut wurde (Abbauspuren), und die optische Dichte und die Membrandicke dieser Bereiche waren im Vergleich zu den umgebenden Bereichen reduziert. Andererseits wurden in den mit Protease-Inhibitoren versehenen Proben keine Abbauspuren beobachtet, da die Protease-Aktivität inhibiert war. Proben 160 bis 170, welche unter Herstellung eines Gleitbeschichters hergestellt wurden, ergaben dieselben Ergebnisse wie die mit einem Barrenbeschichter hergestellten Proben.
Beispiel 13:
Messung der Protease-Aktivität
Die in Beispiel 11 erhaltene Probe 101 wurde der Messung gemäß dem Verfahren aus Beispiel 12 unter Verwendung von Matrix-Metallo-Proteinase (MMP)-1 enthaltenden Lösungen bei einer Konzentration von 2 pg/ml bis 200 ng/ml enthaltenden Lösungen als flüssige Proteasenproben unterworfen, um eine Eichkurve zu erhalten. Die Ergebnisse sind in, Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4
Die Ergebnisse von Tabelle 4 wurden in einem Diagramm aufgetragen unter Erhalt der Konzentration der Metalloproteinase (MMP)-1, welche die optische Dichte der Abbauspuren (2,6) ergab, wenn biologische Proben eingesetzt wurden. Als Ergebnis wurde gefunden, dass die Konzentration der Protease in den biologischen Proben etwa 40 pg/ml betrug.
Beispiel 14:
Protease-Aktivitäts-Assay
Biologische Proben von Gingiva, Gingivaler crevikularer Flüssigkeit und periodontalen Gewebeproben, welche aus Patienten mit peridontalen Krankheiten gesammelt wurden, wurden auf Proben 101–160 der dünnen Membran als etwa 5 μm gefrorene Schnitte aufgebracht. Die dünnen Membranen wurden in eine befeuchtete Zelle gegeben und bei 37°C über 4 bis 16 Stunden inkubiert. Anschließend wurden transparente Proben mit einer Amidschwarz-Lösung angefärbt. Für die Bereiche der Proben, wo die Aktivität eindeutig beobachtet wurde, wurde die Beurteilung der Aktivität durchgeführt mittels (1) Beobachtung mit dem bloßen Auge, (2) Dichtemessung von Mikroportionen mittels Mikrodensitometrie und (3) Messung der Membrandicke unter Verwendung eines Kontakt-Membrandicken-Meßapparates. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5
In dem Verfahren, in dem gefrorene Schnitte biologischer Proben direkt aufgetragen wurden, wurden auch Abbauspuren des Protease-Substrats durch die Protease (Bereiche weißer Flecken) auf jeder dünnen Membran gebildet, und die optische Dichte und Membrandicke dieser Bereiche war im Vergleich zu den umliegenden Bereichen verringert.
Beispiel 15:
Herstellung dünner Membranen für Protease-Assays
Alkali-extrahierte Rinderknochen-Gelatine (15 g) wurde in reinem Wasser (123 g) gelöst und zu der Lösung wurde 1,2-Bis(vinylsulfonylacetamido)ethan (4% wässrige Lösung, 0,6 ml) als Härtungsmittel zugegeben. Die Lösung wurde mittels eines Drahtbarren-Beschichters gleichförmig auf einen Mikroskopträger aufgetragen unter Erhalt einer getrockneten Membran mit einer Dicke von etwa 7 μm, und dann wurde die Membran getrocknet unter Erhalt einer dünnen Membran. Alkali-extrahierte Rinderknochen-Gelatine (15 g) wurde in reinem Wasser (123 g) gelöst, und zu der Lösung wurde 1,2-Bis(vinylsulfonylacetamido)ethan (4%ige wässrige Lösung, 0,6 ml) als Härtungsmittel sowie Polymethylmethacrylat-Partikel (mittlerer Durchmesser: 2 μm) zugegeben. Diese Lösung wurde gleichförmig auf die Oberfläche der bereits präparierten dünnen Membran mittels eines tragbaren Beschichters aufgetragen unter Erhalt einer getrockneten Membran mit einer Dicke von etwa 7 μm, und dann wurde die Membran getrocknet unter Erhalt einer dünnen Membran (dünne Mehrschicht-Membran: Probe 301). Die dünnen Membranen wurden vor deren Verwendung bei Raumtemperatur gelagert. Jene in Tabelle 6 dargestellten dünnen Membranen wurden hergestellt durch Wechseln oder Ergänzen des Protease-Substrats und des Härtungsmittels. Für das Auftragen wurden Auftragungshilfen und Viskositätsveränderer nach Bedarf eingesetzt. Als in der Tabelle angegebener blauer Farbstoff 1, grüner Farbstoff 1 und roter Farbstoff 1 wurden jeweils die folgenden Verbindungen eingesetzt.
(Blauer Farbstoff 1)
(Grüner Farbstoff 1)
(roter Farbstoff)
Proben 331 bis 360 wurden auf dieselbe Art hergestellt, wie bei der Herstellung der Proben 301 bis 330, mit der Ausnahme, dass ein Gleitbeschichter anstelle des Drahtbarren-Beschichters zur Auftragung eingesetzt wurde. Als Trocknungsbedingungen wurde ein Verfahren angewendet, worin die Proben gegebenenfalls nach Bedarf einmal auf 10°C gekühlt wurden und bei Raumtemperatur und normaler Luftfeuchtigkeit getrocknet wurden.
Beispiel 16:
Protease-Aktivitäts-Assay
Der Protease-Aktivitäts-Assay wurde auf dieselbe Art durchgeführt wie in Beispiel 12. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Aus diesen Ergebnissen wurde gefunden, dass Protease-Aktivität mit äußerster Genauigkeit mittels dünnen Mehrschicht-Membranen selektiert werden konnte. Proben 331 bis 360, welche unter Verwendung eines Gleitbeschichters hergestellt wurden, ergaben dieselben Resultate wie die mit einem Barren-Beschichter hergestellten Proben.
Beispiel 17:
Herstellung dünner Membranen zum Nachweis von Protease und zur Messung der Protease-Aktivität
Alkali-extrahierte Rinderknochen-Gelatine (15 g) wurde in reinem Wasser (123 g) gelöst und zu der Lösung wurden 1,2-Bis(vinylsulfonylacetamido)ethan (4%, 0,6 ml) als Härtungsmittel zugegeben. Proben 501 bis 530 wurden auf dieselbe Art hergestellt wie bei der Herstellung der Proben 331 bis 360, mit der Ausnahme, dass die obige Lösung als Rückschicht unter Verwendung eines Gleitbeschichters aufgetragen wurde und unter Erhalt dünner Membranen getrocknet wurde. Proben 531 bis 560 wurden durch Auftragen einer polymeren Latexschicht auf die Rückschicht der Proben 501 bis 530 und Trocknen dieser Schicht hergestellt. Die Messung der Protease-Aktivität unter Verwendung dieser Proben auf dieselbe Art wie in den obengenannten Messungen unter Verwendung der Proben 331 bis 360 ergab vergleichbare Ergebnisse. In diesen Proben trat kein Aufrollen auf und die Membranen waren ausgezeichnet in ihren Handhabungs-Eigenschaften.
Beispiel 18:
Nachweis von Protease unter Verwendung photographischer Filme
Neopan F (monochromer Film für Photographien, Fuji Photo Film Co., Ltd.) wurde komplett belichtet und dann wurde der Film auf übliche Art entwickelt, fixiert, gespült und getrocknet. Der photographische Film wurde als dünne Gelatinemembran zum Nachweis von Protease eingesetzt und die Messung der Protease-Aktivität wurde durchgeführt auf dieselbe Art wie in Beispiel 4 durch Aufbringen der in Beispiel 4 hergestellten Schnitte von Krebsgeweben auf diesen Film. Im Ergebnis blieben die Bereiche, wo Protease abwesend war, schwarz, wohingegen Abbauspuren als weiße Flecken beobachtet wurden ähnlich derer, welche auf den in Beispiel 4 hergestellten angefärbten dünnen Membranen beobachtet wurden. Die Nachweis-Sensitivität des Filmes war jedoch geringer als die der in den Beispielen 1, 2, 10, 11, 15 und 17 hergestellten dünnen Membranen.
Beispiel 19:
Nachweis von Protease unter Verwendung einer Emulsion für Radiographie und Ergebnisse der Messung (Vergleichsbeispiel)
Biologische Proben von Gingiva, gingivaler Flüssigkeit der Zahnfleischtasche und periodontale Gewebeproben, welche von Patienten mit periodontalen Krankheiten gesammelt wurden, wurden auf einem mikroskopischen Träger als etwa 5 μm dicke gefrorene Schnitte aufgebracht. Mit Wasser verdünnte Emulsionen für Radiographie NRM2 oder NRH2 (KONICA CORPORATION) wurden auf die Schnitte aufgetragen und unter Bildung dünner Membranen getrocknet. Die dünnen Membranen wurden in eine befeuchtete Zelle gegeben und bei 37°C über 4 bis 16 Stunden inkubiert. Dann wurden die Membranen mit Amidschwarz angefärbt oder einer monochromatischen Entwicklung unterworfen. Im Ergebnis wurde nahezu keine Protease-Aktivität detektiert. Spuren von Aktivität wurden beobachtet in Proben, welche über 14 Stunden inkubiert wurden und einer monochromatischen Entwicklung unterworfen wurden, die Anzeige des Aktivitätsbereiches war jedoch sehr undeutlich und die Nachweisleistung war der der dünnen Membranen der vorliegenden Erfindung weit unterlegen.
Industrielle Anwendbarkeit
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine genaue und bequeme Messung von Proteasen aus in spezifischen Geweben lokalisierten Läsionen oder indivudueller Zellen in Geweben ermöglichen und zusätzlich kann die Bestimmung in einer kurzen Zeitdauer vollendet werden. Folglich sind die Verfahren der vorliegenden Erfindung auch geeignet für die genaue Diagnose der Bösartigkeit von Krebszellen wie etwa der Infiltration und Metastase-Aktivität, dem Grad des Fortschreitens periodontaler Krankheiten wie etwa Periodontitis, destruktiver pathologischer Zustände wie etwa Rheumatismus, alveolärer Pyorrhoe und dergleichen. Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann Protease-Aktivität anhand einer extrem geringen Probenmenge durchgeführt werden, und die dünnen Membranen können nach der Messung dauerhaft als fixierte Präparationen gelagert werden.

Claims

Verfahren zum Nachweis von Proteasen, umfassend die folgenden Schritte: (1) Inkontaktbringen eines von zwei kontinuierlichen Schnitten einer biologischen Probe mit einer dünnen Membran, die ein Proteasesubstrat zusammen mit einem Härtungsmittel umfaßt und auf der Oberfläche eines Trägers gebildet ist; (2) Nachweisen der Abbauspur, die auf der dünnen Membran durch die Wirkung der Protease gebildet wird; und (3) Vergleichen der Abbauspur mit einer histophatologischen Präparation, die aus dem anderen Schnitt hergestellt wurde.
Verfahren zum Nachweis von Protease, umfassend die folgenden Schritte: (i) Inkontaktbringen von zwei oder mehr kontinuierlichen Schnitten einer biologischen Probe mit einer dünnen Membran, die ein Proteasesubstrat zusammen mit einem Härtungsmittel umfaßt und auf der Oberfläche eines Trägers gebildet ist; (2) Inkontaktbringen der verbleibenden Schnitte mit einer dünnen Membran, die ein Proteasesubstrat, ein Härtungsmittel und einen Proteaseinhibitor umfaßt, und die auf der Oberfläche eines Trägers gebildet ist; (3) Nachweisen der auf den dünnen Membranen durch die Wirkung der Protease gebildeten Abbauspuren; und (4) Vergleichen der Abbauspur auf der in Schritt (1) verwendeten dünnen Membran mit der Abbauspur auf der in Schritt (2) verwendeten dünnen Membran.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Proteasesubstrat ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Collagen, Gelatine, Proteoglycan, Fibronectin, Laminin, Elastin und Casein.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Probe eine von einem Patienten isolierte oder gesammelte biologische Probe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Nachweis durchgeführt wird unter Verwendung einer dünnen Membran enthaltend einen oder mehrere Stoffe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pigmenten und Farbstoffen mit einer maximalen Transmissionsdichte von 0,01 oder mehr und einer Wellenlänge im Bereich von 400 bis 700 nm.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Protease eine Matrixmetalloproteinase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Verfahren verwendet wird zur Diagnose einer Protease involvierenden Krankheit.
Verfahren nach Anspruch 7, worin die Krankheit Krebs ist.
Verwendung einer dünnen Membran, die ein Proteasesubstrat zusammen mit einem Härtungsmittel enthält und gebildet ist auf der Oberfläche eines Trägers, für eines der Verfahren nach Ansprüchen 1 bis B.