SU1178761A1

SU1178761A1 - Способ идентификации ингибиторов протеиназ

Info

Publication number: SU1178761A1
Application number: SU833653896A
Authority: SU
Inventors: Александр Васильевич Конарев
Original assignee: Всесоюзный Ордена Трудового Красного Знамени Научно-Исследовательский Институт Защиты Растений
Priority date: 1983-10-11
Filing date: 1983-10-11
Publication date: 1985-09-15

Abstract

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНАЗ путем фракционировани белка в гел х, отличающ и и с тем, что, с целью повышени чувСтвительно(:ти и упрощени способа, на раздел ющий гель после фракционировани накладывают лист фильтровальной бумаги, смоченной раствором протеиназы в буфере с рН, оптимальным дл используемой протеиназы , и с активностью протеиназы , соответствующей активности трипсина в концентрации 0,0250 ,05 мг/мл, через 10-30 мин бумагу удал ют, на гель накладывают фотопленку типов Фото или Аэропленка и инкубируют до визуального обнаружени на фотопленке полос неразрушенного желатина, снимают фотопленку с гел , накладьшают на нее лист влажной фильтровальной бумаги и идентифицируют ингибиторы по зо . нам неразрушенного желатина в виде i темных полос на прозрачном фоне фотопленки или светлых полос на (Л темном. фоне на фильтровальной бумаге .

Description

|

сх

Ч

05

Изобретение относитс к биохимии растений и может быть использовано также в области генетики, селекции и защиты растений, биохш-ши питани и кормлени .

Цель изобретени - повышение чувствительности и упрощение способ

Пример. Идентификаци ингибиторов трипсина среди белков зерна пшеницы.

Зерно пшеницы размалывают, навеску муки зДпивают 4-кратным объемом 2 М мочевины и выдерживают 18 ч при 4 С. Смесь центрифугируют, осадок отбрасывают.

Изофокусирование белков провод т ,в пластине полиакриламидного гел 125Х250 0,2 мм на приборе типа Мултифор фирмы LKB (Швеци ) или другом приборе дл изофокусировани . Состав гел : 6% акриламида, 0,28% метиленбисакриламида, 1% амфолитов типа Сервилат (Serva, ФРГ), можно также использова.ть амфолиты других фирм, например Амфолины (LKB ), с интервалом рН 2-11. Гель полимеризуют на свету после дегазации , добавив к 10 мл раствора гел 0,5 МП раствора рибофлавина (10 мг/100 мл) и 20 мкл ТЕМЕДа. Экстракт белков зерна нанос т на гель капл ми объемом 0,5-25 мкл на образец. Поскольку ингибиторы трипсина отличаютс у фазных сортов и видов пшениц по компонентному составу и активности, объем Ъкстракта нужно подбирать в каждом отдельном случае дл того, чтобы получить контрастный спектр ингибиторов. В описываемых услови х следует наносить 6-9 мкл экстракта из муки м гкой пшениЩ) сорта Безоста Т, твердой пшеницы 20-25 мкл, диплоидной однозерн нки 0,5-1,0 мкл. На одной пластине анализируют одновременно 24 образца (1 см на образец) или 48 образцов (по 0,5 см). На гель накладьшают электродные полоски, смоченные 1 М NaOH (-) и 1 М HjPO (+). Сверху накладывают крьш1ку с

платиновыми- электродами. ИзофокусироваНие ведут 2,5 ч при посто нной мощности тока 10 В. Конечное напр жение 1800 В. Электродные полоски удал ют вместе с тем участком гл , на котором они лежали. На гель накладьшают лист гладкой фильтровальной бумаги, смоченной раствором трипсина (0,03 мг/мл, фирма Spota, Чехословаки ) в 0,2 М фосфатном буфере рН 8,0. Оптимальный рН трипсина около 8,0-9,0. Гель накрывают полимерной пленкой дл предотвращени высыхани . Через 15 мин бумагу убирают и на гель накладывают фотопленку типа Фото-65, предварительно смочив гель фосфатным буфером. Сверху накладьюают жесткую полимерную пленку дл предотвращени подсыхани и деформации краев фотопленки и выдерживают в термостате 35 мин при . Под действием фермента , адсорбированного поверхностью гел , желатин разрушаетс , что можно контролировать по по влению мутной жидкости из-под краев фотопленки. Можно также просматривать гель с пленкой на свету, не наклон гель. Момент завершени инкубации определ етс по мере по лени различных полос - неразрушенными остаютс лишь участки сло желатина, соответствующие ингибиторам данной протеиназы. Фотопленку снимают с гел , накладывают на нее влажную фильтровальную бумагу, которую затем подсушивают листом сухой фильтровальной бумаги. Фотопленку отдел ют от бумаги. Зоны, соответствующие ингибиторам трипсина , обнаруживаютс на фотопленке в виде темных полос на прозрачно фоне. Фотопленку подсушивают на воздухе и фотографируют в проход щем свете. Ингибиторы можно также вы вить на фильтровальной бумаге, которую накладывали на фотопленку после инкубации.Ингибиторам соотв , ствуют светлые полосы на темном фоне

Claims

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНАЗ путем фракционирования белка в гелях, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, на разделяющий гель после фракционирования накладывают лист фильтровальной бумаги, смоченной раствором протеиназы в буфере с pH, оптимальным для используемой протеиназы, и с активностью протеиназы, соответствующей активности трипсина в концентрации 0,0250,05 мг/мл, через 10-30 мин бумагу удаляют, на гель накладывают фотопленку типов Фото или Аэропленка и инкубируют до визуального обнаружения на фотопленке полос неразрушенного желатина, снимают фотопленку с геля, накладывают на нее лист влажной фильтровальной бумаги и идентифицируют ингибиторы по зонам неразрушенного желатина в виде темных полос на прозрачном фоне фотопленки или светлых полос на темном. фон'е на фильтровальной бумаге.

SU ,,„1178761