JP7297979B1 - 歯周病菌プロテアーゼ活性を測定する方法及びその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
項1.
(A)被験物質、及び歯周病菌培養液若しくは培養上清とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
(B)前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、プロテアーゼ活性阻害能を測定する方法。
項2.
(A-1)被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
(A-2)歯周病菌培養液若しくは培養上清とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
(B)被験物質、及び歯周病菌培養液若しくは培養上清と接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
前記被験物質の、プロテアーゼ活性阻害能を測定する方法。
項3.
前記歯周病菌培養液若しくは培養上清が、歯周病菌プロテアーゼを含む、項1又は2に記載の方法。
項4.
前記歯周病菌プロテアーゼが、ジンジパインを含む、項3に記載の方法。
項5.
前記歯周病菌がPorphyromonas gingivalisである、項1~4のいずれか1項に記載の方法。
項6.
前記コラーゲン含有固形物が、I型コラーゲン含有固形物である、項1~5のいずれか1項に記載の方法。
項7.
(A)被験物質、及び歯周病菌培養液若しくは培養上清とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
(B)前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
プロテアーゼ活性阻害能を有する物質をスクリーニングする方法。
項8.
(A-1)被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
(A-2)歯周病菌培養液若しくは培養上清とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
(B)被験物質、及び歯周病菌培養液若しくは培養上清と接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
プロテアーゼ活性阻害能を有する物質をスクリーニングする方法。
項9.
前記歯周病菌培養液若しくは培養上清が、歯周病菌プロテアーゼを含む、項7又は8に記載の方法。
項10.
前記歯周病菌プロテアーゼが、ジンジパインを含む、項9に記載の方法。
項11.
前記歯周病菌がPorphyromonas gingivalisである、項7~10のいずれか1項に記載の方法。
項12.
前記コラーゲン含有固形物が、I型コラーゲン含有固形物である、項7~11のいずれか1項に記載の方法。
本開示は、(A)被験物質、及び歯周病菌培養液若しくは培養上清とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに(B)前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、前記被験物質の、プロテアーゼ阻害能を測定する方法を包含する。本明細書において、当該方法を、「本開示の測定方法」と表記することがある。また、前記(A)及び(B)の各工程を「(A)工程」、「(B)工程」等と表記することがある。
また、「本開示の測定方法」は、(A-1)被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、(A-2)歯周病菌培養液若しくは培養上清とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに(B)被験物質、及び歯周病菌培養液若しくは培養上清と接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、前記被験物質の、プロテアーゼ阻害能を測定する方法をも包含する。また、前記(A-1)、(A-2)及び(B)の各工程を「(A-1)工程」、「(A-2)工程」、「(B)工程」等と表記することがある。
培養上清の回収方法は、特に限定されず、当該技術分野において公知の方法および条件を採用することができる。例えば、遠心分離法等が挙げられる。
培養温度としては、例えば、25~40℃程度、又は30~40℃程度、好ましくは35~39℃等とすることができる。
培養期間としては、例えば、12時間~36時間程度、又は20~30時間程度等とすることができる。
培養に用いる培地としては、例えば、変法GAM培地(0.5質量%ペプトン、0.3質量%ダイズペプトン、0.5質量%プロテオーゼペプトン、1.0質量%消化血清末、0.25質量%酵母エキス、0.22質量%肉エキス、0.12質量%肝臓エキス、0.05質量%ブドウ糖、0.5質量%溶性デンプン、0.02質量%L-トリプトファン、0.03g質量%L-システイン塩酸塩、0.03g質量%チオグリコール酸ナトリウム、0.1g質量%L-アルギニン、0.0005質量%ビタミンK1、0.001質量%ヘミン、0.25質量%リン酸二水素カリウム、及び0.3質量%塩化ナトリウム含有、pH7.3)、0.0001%メナジオンと、0.0005%ヘミンとを添加したトリプチックソイ培地(1.7質量%カゼイン製ペプトン、0.3質量%ダイズ製ペプトン、0.5%質量%塩化カリウム、0.25質量%リン酸水素二カリウム、及び0.25質量%ブドウ糖含有、pH7.3)等が挙げられる。
培養は、静置条件下で行われてもよく、振盪等が行われてもよい。また、培養は嫌気条件下で行われることが好ましい。
また、コラーゲン含有固形物は、例えば、コラーゲン含有乾燥固形物等であってもよい。
また、コラーゲン含有固形物は、例えば、コラーゲンにより形成されるポア(孔)構造(例えば、ハニカム構造等)等を有していてもよい。
コラーゲン含有固形物中、コラーゲンの含有量は、特に限定されないが、例えば、1.5質量%以上であることが好ましい。当該範囲の上限又は下限は、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、又は100質量%程度であってもよい。より具体的には、60~100質量%程度等であってもよい。
被験物質及び歯周病菌培養液若しくは培養上清を予め混合する場合、被験物質と歯周病菌培養液若しくは培養上清との接触時間としては、例えば、10秒~7日程度又は3分~1日程度等とすることができる。
被験物質及び歯周病菌培養液若しくは培養上清を予め混合する場合、接触方法としては、特に限定されない。例えば、被験物質を含む水溶液に歯周病菌培養液若しくは培養上清を添加する方法、歯周病菌培養液若しくは培養上清を含む水溶液に被験物質を添加する方法等が挙げられる。また、接触は、嫌気条件下で行われることが好ましい。
被験物質及び歯周病菌培養液若しくは培養上清を予め混合する場合、接触時の温度としては、特に限定されない。例えば、25~40℃程度、又は30~40℃程度、好ましくは35から39℃等とすることができる。
歯周病菌培養上清とコラーゲン含有固形物との接触時における歯周病菌培養上清は、例えば、吸光度(O.D600)が0.3~5.0程度等の歯周病菌培養液から得られる上清であってもよい。当該範囲の上限又は下限は、例えば、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、又は4.5程度であってもよい。より具体的には、0.5~4.0程度等の歯周病菌培養液から得られる上清であってもよく、0.5~3.0程度等の歯周病菌培養液から得られる上清であってもよい。
例えば、本開示の測定方法が、歯周病菌培養液若しくは培養上清とコラーゲン含有固形物とを接触した後に、被験物質と当該コラーゲン含有固形物とを接触し、コラーゲン含有固形物の分解の程度が抑制された場合、当該被験物質は、歯周病菌が産生するプロテアーゼによるコラーゲンを含むタンパク質分解の進行を抑制することが期待される。
例えば、本開示の測定方法が、被験物質及び歯周病菌培養液若しくは培養上清を同時にコラーゲン含有固形物と接触し、コラーゲン含有固形物の分解の程度が抑制された場合、当該被験物質は、歯周病菌が産生するプロテアーゼによるコラーゲンを含むタンパク質分解を予防することが期待される。
例えば、本開示の測定方法が、歯周病菌培養液若しくは培養上清とコラーゲン含有固形物とを接触する前に、被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触し、コラーゲン含有固形物の分解の程度が抑制された場合、当該被験物質は、歯周組織破壊の早期段階において歯周病菌が産生するプロテアーゼによるコラーゲンを含むタンパク質分解を予防することが期待される。
また、「本開示のスクリーニング方法」は、(A-1)被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、(A-2)歯周病菌培養液若しくは培養上清とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに(B)被験物質、及び歯周病菌培養液若しくは培養上清と接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、プロテアーゼ阻害能を有する物質をスクリーニングする方法をも包含する。また、前記(A-1)、(A-2)及び(B)の各工程を「(A-1)工程」、「(A-2)工程」、「(B)工程」等と表記することがある。
106個/mLのPorphyromonas gingivalis W83株(以下、「P.g」と表記することがある。)を解凍し、10mL変法GAM培地を含む試験管に播種した。その後、試験管を37℃嫌気条件下で1日培養し、前培養とした。前培養で得られた菌液1mLを新しい10mL変法GAM培地を含む試験管に移し、37℃嫌気条件下で1日培養し、本培養とした。本培養で得られたP.gを変法GAM培地にてO.D600=0.5、1.0、2.0、3.0の各濃度に調整し、培養液とした。培養液を5000Gで5分間遠心分離することで、培養上清及び菌体を得た。なお、菌体はPBSで懸濁して試験に用いた。
供試素材としては、銅クロロフィリンナトリウム(銅クロ)、KYT-1(Rgp阻害剤(ペプチド研究所))、及びKYT-36(Kgp阻害剤(ペプチド研究所))を用いた。各素材とも培養液、培養上清、又は菌体を溶媒とし、銅クロは0.05%、Rgp阻害剤及びKgp阻害剤は混合してそれぞれ終濃度10μMに調整した(阻害剤Mix)。なお、ジンジパインには基質特異性の異なるRgp及びKgpの2つが存在しており、Rgp阻害剤及びKgp阻害剤は、それぞれの阻害剤である。また、銅クロロフィリンナトリウムには、Rgp及びKgpに対する阻害効果が報告されている(特許文献1)。
調製したP.g(素材を含む若しくは含まない、培養液、培養上清、又は菌体)をコラーゲンディスク(AteloCell ハニカムディスク96(ウシ皮由来I型コラーゲン含有)、高研社製)に200μL処理した。37℃嫌気条件下で培養し、ディスク添加直後と、添加から1日おきに顕微鏡で観察した。なお、P.gを用いずに溶媒だけを用いてコントロールとした。
Claims (3)
- (A)被験物質、及びPorphyromonas gingivalis培養液若しくは培養上清とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、並びに
(B)前記コラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
ジンジパイン活性阻害能を有する物質をスクリーニングする方法であり、
前記Porphyromonas gingivalis培養液若しくは培養上清が、ジンジパインを含み、
前記コラーゲン含有固形物が、ハニカム構造を有するディスク状のコラーゲン含有固形物である、方法。 - (A-1)被験物質とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
(A-2)Porphyromonas gingivalis培養液若しくは培養上清とコラーゲン含有固形物とを接触する工程、
並びに
(B)被験物質、及びPorphyromonas gingivalis培養液若しくは培養上清と接触したコラーゲン含有固形物の分解の程度を評価する工程を含む、
ジンジパイン活性阻害能を有する物質をスクリーニングする方法であり、
前記Porphyromonas gingivalis培養液若しくは培養上清が、ジンジパインを含み、
前記コラーゲン含有固形物が、ハニカム構造を有するディスク状のコラーゲン含有固形物である、方法。 - 前記コラーゲン含有固形物が、I型コラーゲン含有固形物である、請求項1又は2に記載の方法。
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