JP2010220561A - コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法 - Google Patents
コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010220561A JP2010220561A JP2009072185A JP2009072185A JP2010220561A JP 2010220561 A JP2010220561 A JP 2010220561A JP 2009072185 A JP2009072185 A JP 2009072185A JP 2009072185 A JP2009072185 A JP 2009072185A JP 2010220561 A JP2010220561 A JP 2010220561A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- collagen
- cells
- screening
- degradation inhibitor
- inhibitor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000011382 collagen catabolic process Effects 0.000 title claims abstract description 65
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 65
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 17
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 113
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 113
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 113
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 96
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 49
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 48
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 27
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 claims description 14
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 claims description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 14
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims description 14
- 210000001648 gingival epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 10
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 10
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 10
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 10
- 201000001245 periodontitis Diseases 0.000 claims description 8
- JIRXORZYIXSWOB-UHFFFAOYSA-N n-hydroxy-2-[(4-methoxyphenyl)sulfonyl-(2-methylpropyl)amino]acetamide Chemical compound COC1=CC=C(S(=O)(=O)N(CC(C)C)CC(=O)NO)C=C1 JIRXORZYIXSWOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000002379 periodontal ligament Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- UKHKZGJCPDWXQY-UHFFFAOYSA-N 1-methoxy-4-(4-methoxyphenyl)sulfanylbenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1SC1=CC=C(OC)C=C1 UKHKZGJCPDWXQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- IBCXZJCWDGCXQT-UHFFFAOYSA-N LY 364947 Chemical compound C=1C=NC2=CC=CC=C2C=1C1=CNN=C1C1=CC=CC=N1 IBCXZJCWDGCXQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 28
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 24
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 14
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 230000003239 periodontal effect Effects 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 6
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 5
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 2-[benzyl-(4-methoxyphenyl)sulfonylamino]-n-hydroxy-4-methylpentanamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1S(=O)(=O)N(C(CC(C)C)C(=O)NO)CC1=CC=CC=C1 VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 4-methoxyphenylsulfonyl Chemical group 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- HTUBKQUPEREOGA-UHFFFAOYSA-N PD 168393 Chemical compound BrC1=CC=CC(NC=2C3=CC(NC(=O)C=C)=CC=C3N=CN=2)=C1 HTUBKQUPEREOGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100030416 Stromelysin-1 Human genes 0.000 description 3
- 101710108790 Stromelysin-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- OCSMOTCMPXTDND-OUAUKWLOSA-N marimastat Chemical compound CNC(=O)[C@H](C(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)[C@H](O)C(=O)NO OCSMOTCMPXTDND-OUAUKWLOSA-N 0.000 description 3
- 229950008959 marimastat Drugs 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 239000004637 bakelite Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 2
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 125000004105 2-pyridyl group Chemical group N1=C([*])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102100027995 Collagenase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108050005238 Collagenase 3 Proteins 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010019909 Hernia Diseases 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229940124761 MMP inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010016113 Matrix Metalloproteinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 208000007048 Polymyalgia Rheumatica Diseases 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 229940122055 Serine protease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710102218 Serine protease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 206010041591 Spinal osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 208000031737 Tissue Adhesions Diseases 0.000 description 1
- 208000008312 Tooth Loss Diseases 0.000 description 1
- 102000014172 Transforming Growth Factor-beta Type I Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010011702 Transforming Growth Factor-beta Type I Receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- RPBJOYICBFNIMN-RDWMNNCQSA-M dexamethasone sodium m-sulfobenzoate Chemical compound [Na+].O=C([C@]1(O)[C@@]2(C)C[C@H](O)[C@]3(F)[C@@]4(C)C=CC(=O)C=C4CC[C@H]3[C@@H]2C[C@H]1C)COC(=O)C1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 RPBJOYICBFNIMN-RDWMNNCQSA-M 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000004195 gingiva Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 208000028169 periodontal disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
【解決手段】三次元細胞培養を用いることで、より生体に近い状態でのスクリーニングが可能なコラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法を提供した。
【選択図】なし
Description
そこで、近年では再生医療のひとつとして、コラーゲンを担体とした人工皮膚、人工骨の提供や、歯牙を再生する方法の開発等がされている(例えば、特許文献1参照)。
例えば、歯周組織破壊を抑制・改善する有効成分のスクリーニング方法として、歯周病菌の内毒素と被験物質とを歯肉線維芽細胞に接触させ、コラーゲン分解に関連する遺伝子やコラーゲン合成に関連するタンパク質の遺伝子の発現量を調べる方法等が報告されている(例えば、特許文献2参照)。
本発明のスクリーニング方法によって得られるコラーゲン分解阻害剤は、コラーゲンの分解を病因とする、歯周炎等の疾病に対する治療薬の有効成分として用いることができる。
(1)被験物質を加えた状態で、コラーゲン分解能を有する細胞を三次元細胞培養するコラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法。
(2)さらにコラーゲン分解能を高める細胞を加えて、コラーゲン分解能を有する細胞を三次元細胞培養する上記(1)に記載のコラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法。
(3)三次元細胞培養において、コラーゲンを含む担体を用いる上記(1)または(2)に記載のスクリーニング方法。
(4)コラーゲンを含む担体内にコラーゲン分解能を有する細胞を含めて培養する上記(3)に記載のスクリーニング方法。
(5)コラーゲン分解能を有する細胞が歯肉線維芽細胞および/または歯根膜線維芽細胞である上記(1)〜(4)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(6)コラーゲンを含む担体上にコラーゲン分解能を高める細胞を播いて培養する上記(2)〜(5)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(7)コラーゲン分解能を高める細胞が歯肉上皮細胞である上記(6)に記載のスクリーニング方法。
(8)コラーゲン分解能を有する細胞によるコラーゲンの分解が、被験物質によって阻害されるか否かを調べ、コラーゲンの分解が阻害されている場合に、該被験物質をコラーゲン分解阻害剤と判断する、上記(1)〜(7)のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(9)上記(1)〜(8)のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得られたコラーゲン分解阻害剤。
(10)Aprotinin、ALK5 Inhibitor I([3−(Pyridin−2−yl)−4−(4−quinonyl)]−1H−pyrazole)またはNNGH(N−isobutyl−N−(4−methoxyphenylsulfonyl)−glycylhydroxamic Acidである上記(9)に記載のコラーゲン分解阻害剤。
(11)上記(9)または(10)に記載のコラーゲン分解阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬。
(12)コラーゲン分解能を有する細胞、コラーゲンを含む担体を含むコラーゲン分解阻害剤スクリーニングキット。
(13)コラーゲン分解能を有する細胞が、歯肉線維芽細胞、歯根膜線維芽細胞および/または歯肉上皮細胞の一種以上である上記(12)に記載のコラーゲン分解阻害剤スクリーニングキット。
ここで、本発明の三次元細胞培養とは、コラーゲンゲル等のコラーゲンを含む担体を用いてコラーゲン分解能を有する細胞を培養することをいう。
本発明のスクリーニング方法における三次元細胞培養は、コラーゲンゲル等のコラーゲンを含む担体を用いて、その担体内または担体上でコラーゲン分解能を有する細胞を培養することが好ましい。
本発明の三次元培養においては、培養用プレート等の中にコラーゲンを含む担体を入れて、その担体内または担体上にコラーゲン分解能を有する細胞を培養してもよく、さらに、このコラーゲンを含む担体をプレート等から取り出し、メッシュ等の上に載せ、空気に曝した状態でコラーゲン分解能を有する細胞を培養してもよい。
このような細胞として、マクロファージ、単球、好中球等の血球系の付着細胞や浮遊細胞、滑膜細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、破骨細胞、がん細胞等が挙げられる。
線維芽細胞としては、例えば、歯肉線維芽細胞、歯根膜線維芽細胞等が挙げられ、これらの線維芽細胞はコラーゲンを含む担体内に含ませて培養することが好ましい。炎症性細胞は結合組織に浸潤することから、例えば線維芽細胞とマクロファージを、コラーゲンを含む担体内に含ませて混合培養することもできる。
また、「コラーゲン分解能を有する細胞」が、がん細胞、血球系の付着細胞等の場合には、コラーゲンを含む担体上に播いて培養することが好ましい。
ここで、「コラーゲン分解能を高める細胞」とは、「コラーゲン分解能を有する細胞」のコラーゲン分解能を高め、この細胞によるコラーゲン分解を促進する細胞のことをいう。本発明の「コラーゲン分解能を高める細胞」としては、「コラーゲン分解能を有する細胞」のコラーゲン分解能を高められる細胞であればいずれの細胞であっても良いが、例えば、歯肉上皮細胞等の上皮細胞が挙げられる。また、「コラーゲン分解能を有する細胞」であり、さらに「コラーゲン分解能を高める細胞」でもあるマクロファージなどの炎症性細胞やがん細胞が挙げられる。
「コラーゲン分解能を有する細胞」のひとつである上皮細胞を、例えば、「コラーゲン分解能を有する細胞」の一つである線維芽細胞と組み合わせた場合には、細胞同士の相互作用により、線維芽細胞のMMP産生およびその活性化を刺激し、線維芽細胞のコラーゲン分解能を高めることができる。
本発明の「コラーゲン分解能を高める細胞」は、細胞の種類によって、コラーゲンを含む担体内に含ませても、コラーゲンを含む担体上に播いて培養してもよいが、歯肉上皮細胞等の上皮細胞は、コラーゲンを含む担体上に播いて培養することが好ましい。
そして、コラーゲン分解能を有する細胞によるコラーゲンの分解が、被験物質によって阻害されるか否かを調べ、コラーゲンの分解が阻害されている場合に、該被験物質をコラーゲン分解阻害剤と判断することが好ましい。被験物質によって該細胞によるコラーゲンの分解が阻害されるか否かは、コラーゲンゲルの収縮の程度、残存コラーゲン量の定量等、コラーゲンを含む担体の目視による変化やマトリックス金属プロテアーゼ(以下、MMPとする)等のコラーゲン分解関連遺伝子の発現変化を、被験物質を加えない場合と比較して判断することがさらに好ましい。
本発明においては、この被験物質のうち、コラーゲン分解能を有する細胞によるコラーゲンの分解を阻害する物質のことを、「コラーゲン分解阻害剤」とする。
本発明の「歯周炎治療薬」は、このような有効成分に加え、歯周ポケット内への貼薬等、経口投与、経皮投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した固体または液体の医薬用無毒性担体を含むことができる。このような担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜含むこともできる。
本発明の「治療薬」は、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などの形態で用いる事ができ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。
このキットには、コラーゲン分解能を有する細胞、コラーゲン分解能を高める細胞またはコラーゲンを含む担体がそれぞれ個別に含まれており、まとめて包装されているものや、コラーゲンを含む担体内にコラーゲン分解能を有する細胞が含まれた状態のものまたは該担体上にコラーゲン分解能を有する細胞が播かれた状態のものも含まれる。
コラーゲンゲルの調製
1)コラーゲン分解能を有する細胞の培養
歯肉線維芽細胞(GF:Gingival fibroblasts)
歯周外科手術の際に切除され不要となった歯肉片、または抜去歯より、Ohshimaらの方法(参考文献1)によって、ヒト歯肉線維芽細胞を得た。
ヒト歯肉由来線維芽細胞を得るにあたり歯肉片を細切後、組織片をプレートの底に静置し、組織片から外生した細胞を第1代として第6継代目の細胞を実験に用いた。得られたヒト歯肉線維芽細胞は、GF1、GF2と名付けた。
参考文献1:J Periodontal Res 29, 421−429, 1994
培養ヒト歯肉上皮細胞(GE:Gingival epithelial cells)
歯周外科手術の際に切除され、不要となった歯肉片より、Ohshimaらの方法(参考文献2)によって、ヒト歯肉上皮細胞を得た。
ヒト歯肉上皮細胞を得るにあたり歯肉片をDispase処理した後、上皮組織部分を結合組織部分から剥離した。上皮組織を細切後、組織片をプレートの底に静置し、組織片から外生した細胞を第1代として第4〜8継代目の細胞を実験に用いた。得られたヒト歯肉上皮細胞は、由来ごとにGE1、GE2と名付けた。
培養にはI型コラーゲンがコートされたプレートまたはフラスコ(住友ベークライト)を用い、細胞はEpi Life medium(Invitrogen)に増殖添加剤(S7、Invitrogen)および1%の抗生物質溶液(PSN、Sigma)を加えたもの(EL+)を用いて増殖させ、trypsin−EDTA溶液を用いて適宜継代培養を行った。
参考文献2:J Periodontol 79, 912−918, 2008.
A.コラーゲン分解能を有する細胞を含むコラーゲンゲルの構築
セルマトリックスtype I−A(新田ゼラチン)、5×DMEM、再構成用緩衝液(新田ゼラチン)を混合し、コラーゲン混合溶液を作成した。
ここに上記1)で培養しておいたコラーゲン分解能を有する細胞をトリプシンで分散させてFBSに浮遊させて懸濁した後、6穴プレート内に播種して30分間硬化(ゲル化)させ、コラーゲン分解能を有する細胞を含むコラーゲンゲルを構築した。
上記A.で構築したコラーゲンゲル上に、上記2)で培養しておいた上皮細胞をトリプシンで分散させた後播種し、コラーゲン分解細胞の単層を形成させ、コラーゲン分解能を有する細胞とコラーゲン分解能を高める細胞とを含むコラーゲンゲルを構築した。
A.コラーゲンゲル内への添加
コラーゲンゲルの構築時に、コラーゲン混合溶液(上記3)、A.)に被験物質を加え、この被験物質を含むコラーゲン混合溶液に、コラーゲン分解能を有する細胞を加え、被験物質とコラーゲン分解能を有する細胞とを含むコラーゲンゲルを構築してスクリーニングに用いた。また、この被験物質とコラーゲン分解能を有する細胞とを含むコラーゲンゲルの上に、さらにコラーゲン分解能を高める細胞を播種し、被験物質とコラーゲン分解能を有する細胞とコラーゲン分解能を高める細胞とを含むコラーゲンゲルを構築してスクリーニングに用いた。
上記3)A.において構築したコラーゲン分解能を高める細胞を含むコラーゲンゲルに、コラーゲン分解能を高める細胞と被験物質とを混ぜたものを播種し、被験物質とコラーゲン分解能を有する細胞とコラーゲン分解能を高める細胞とを含むコラーゲンゲルを構築してスクリーニングに用いた。
上記4)で構築したゲルを、24時間後にプレートの底から浮かせ、コラーゲンゲル浮遊培養を開始した(培養1日目)。浮遊培養開始時点に、再度被験物質を加えた。浮遊培養開始後5日目の段階でコラーゲンゲルの収縮が見られるようであれば、コラーゲンゲルの収縮レベルおよび湿重量や残存コラーゲン量を定量することで、被験物質によるコラーゲン分解阻害の有無や程度を調べ、コラーゲン分解阻害剤のスクリーニングを行った。
また、この段階では十分なコラーゲンゲルの収縮が見られない場合には、浮遊培養開始後5日目に、ゲルをメッシュ上に載せ、ゲル表面が空気に曝される状態でさらに5日間培養を行い、培養開始後11日目に回収したゲルについて、同様に調べ、コラーゲン分解阻害剤のスクリーニングを行った。
上記の実施例に従い、コラーゲン分解阻害剤のスクリーニングを行った。
1.被験物質
DX(デキサメタゾン(セルフチゾン、メタスルホ安息香酸デキサメタゾンナトリウム)、昭和薬品化工株式会社)、PD098059(Biomol)、anti−IL−1α antibody(R&D Systems)、Indomethacin(Sigma)、PD168393(Calbiochem)、SB203580(Calbiochem)、SP600125(Calbiochem)、Aprotinin(Wako)、NNGH(N−isobutyl−N−(4−methoxyphenylsulfonyl)−glycylhydroxamic Acid、 MMP−3 inhibitor II、 Calbiochem)またはALK5 Inhibitor I(Calbiochem)をそれぞれ被験物質として用いた。
またコラーゲン分解阻害剤として知られているMMP阻害剤(Marimastat、TOCRIS)をポジティブコントロールとして用いた。
これらの被験物質はいずれもコラーゲンゲル内に含ませ、さらに培養1日目に培地に添加して試験を行った。各被験物質の終末濃度は、DX 1μM、PD098059 5μM、抗IL−1α抗体 10μg/ml、Indomethacin 10μM、PD168393 5μM、SB203580 2μM、SP600125 2μM、Aprotinin 1%、Marimastat 10μM、NNGH 10μM、ALK5 inhibitor I 5μMであった。
実施例に従い、構築したコラーゲンゲルを用い、被験物質のスクリーニングを行った。被験物質を加えていないコラーゲンゲルをネガティブコントロールとして用いた。
被験物質による、コラーゲン分解阻害の有無を目視およびHE染色によるゲル収縮の観察、ゲルにおける残存コラーゲンの定量等によって調べ、コラーゲン分解阻害剤であるか否かを判断した。
1)目視およびHE染色によるゲル収縮の観察
図1に被験物質としてAprotinin、Marimastat、NNGH、PD168393およびALK5 Inhibitor Iをそれぞれ用いて三次元細胞培養を行った際の浮遊培養開始後5日目のゲル全体の収縮の状態を示した。その結果、AprotininまたはALK5 Inhibitor Iを加えたゲルでは、他の被験物質を加えたゲルと比較してゲルの収縮が小さく、AprotininおよびALK5 Inhibitor Iはコラーゲン分解能を有する細胞によるコラーゲンの分解を抑制し得ることが示された。
図2に被験物質およびポジティブコントロールとしてMarimastat、Aprotinin、およびALK5 inhibitorを用いて三次元細胞培養を行った際のゲル全体の収縮の状態を示した。また図3に培養開始後11日目のゲルをHE染色した結果を示した。被験物質を加えない場合(コントロール)には、線維芽細胞が周囲のコラーゲンを分解したためにできた空胞が観察されたが、AprotininやALK5 Inhibitor Iを加えた場合には、そのような空胞は観察されなかった。
従って、被験物質を加えない場合には、ゲルが収縮するが、AprotininやALK5 Inhibitor Iを加えた場合には、ポジティブコントロールを加えた場合と同様に、ゲルの収縮が抑制されることが確認された。
被験物質およびポジティブコントロールを用いて三次元細胞培養を行った際のゲルの収縮レベルを、sircol collagen assay(biocolor)を用いて、熱処理によって可溶化した残存コラーゲンの定量を行うことで調べた。ゲルは浮遊細胞培養開始後5日目のものを用いた。
その結果、図4に示したように、AprotininやALK5 Inhibitor Iを加えた場合には、ポジティブコントロールを加えた場合と同様にコラーゲンの分解量が減少することが示された。
被験物質およびポジティブコントロールを加えた状態で三次元細胞培養を行った際の、コラーゲン分解能を有する細胞によるゲル内のMMP遺伝子発現レベルを調べた。
コラーゲンゲル浮遊培養開始後3日目に、ゲルからTrizolを用いてtotal RNAを抽出し、cDNAを作成してreal−time qPCR (Takara)を行い、ゲル収縮に関与すると考えられるMMP遺伝子の発現レベルを調べた。
その結果、図5に示したように、ALK5 Inhibitor Iを加えた場合には、線維芽細胞で主に発現し、コラーゲン分子を一箇所切断する機能を有するMMP−1、MMP−13、この切断によって変性したコラーゲンから得られるゼラチンをさらに細分解するMMP−2、MMP−9、これらのMMPを活性化する役割を有するMMP−3および上皮細胞に由来して線維芽細胞を刺激することでそのMMP産生を誘導するIL−1αのいずれにおいても遺伝子発現が低下していることが確認された。
Claims (13)
- 被験物質を加えた状態で、コラーゲン分解能を有する細胞を三次元細胞培養するコラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法。
- さらにコラーゲン分解能を高める細胞を加えて、コラーゲン分解能を有する細胞を三次元細胞培養する請求項1に記載のコラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法。
- 三次元細胞培養において、コラーゲンを含む担体を用いる請求項1または2に記載のスクリーニング方法。
- コラーゲンを含む担体内にコラーゲン分解能を有する細胞を含めて培養する請求項3に記載のスクリーニング方法。
- コラーゲン分解能を有する細胞が歯肉線維芽細胞および/または歯根膜線維芽細胞である請求項1〜4のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- コラーゲンを含む担体上にコラーゲン分解能を高める細胞を播いて培養する請求項2〜5のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- コラーゲン分解能を高める細胞が歯肉上皮細胞である請求項6に記載のスクリーニング方法。
- コラーゲン分解能を有する細胞によるコラーゲンの分解が、被験物質によって阻害されるか否かを調べ、コラーゲンの分解が阻害されている場合に、該被験物質をコラーゲン分解阻害剤と判断する、請求項1〜7のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 請求項1〜8のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得られたコラーゲン分解阻害剤。
- Aprotinin、ALK5 Inhibitor I([3−(Pyridin−2−yl)−4−(4−quinonyl)]−1H−pyrazole)またはNNGH(N−isobutyl−N−(4−methoxyphenylsulfonyl)−glycylhydroxamic Acidである請求項9に記載のコラーゲン分解阻害剤。
- 請求項9または10に記載のコラーゲン分解阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬。
- コラーゲン分解能を有する細胞、コラーゲンを含む担体を含むコラーゲン分解阻害剤スクリーニングキット。
- コラーゲン分解能を有する細胞が、歯肉線維芽細胞、歯根膜線維芽細胞または歯肉上皮細胞である請求項12に記載のコラーゲン分解阻害剤スクリーニングキット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009072185A JP5679140B2 (ja) | 2009-03-24 | 2009-03-24 | コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009072185A JP5679140B2 (ja) | 2009-03-24 | 2009-03-24 | コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010220561A true JP2010220561A (ja) | 2010-10-07 |
JP5679140B2 JP5679140B2 (ja) | 2015-03-04 |
Family
ID=43038456
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009072185A Active JP5679140B2 (ja) | 2009-03-24 | 2009-03-24 | コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5679140B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7204983B1 (ja) | 2022-05-31 | 2023-01-16 | サンスター株式会社 | コラーゲン分解阻害能を測定する方法及びその利用 |
JP7297979B1 (ja) | 2022-05-31 | 2023-06-26 | サンスター株式会社 | 歯周病菌プロテアーゼ活性を測定する方法及びその利用 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3492105A4 (en) | 2016-07-26 | 2020-02-26 | Nihon University | THERAPEUTIC AGENT FOR PERIODONTITIS. |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006298913A (ja) * | 2005-03-25 | 2006-11-02 | Lion Corp | 歯周組織破壊の抑制・改善剤及びスクリーニング方法 |
-
2009
- 2009-03-24 JP JP2009072185A patent/JP5679140B2/ja active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006298913A (ja) * | 2005-03-25 | 2006-11-02 | Lion Corp | 歯周組織破壊の抑制・改善剤及びスクリーニング方法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
JPN6013062041; 日本歯周病学会誌 Vol.50, 秋季特別号, 2008, p.118 * |
JPN6013062042; Cancer Science Vol.94, No.7, 2003, p.644-649 * |
JPN6013062043; Endocrinology Vol.144, No.12, 2003, p.5339-5346 * |
JPN6013062045; The Journal of Neuroscience Vol.25, No.14, 2005, p.3701-3711 * |
JPN6013062047; Genes to Cells Vol.12, 2007, p.197-207 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7204983B1 (ja) | 2022-05-31 | 2023-01-16 | サンスター株式会社 | コラーゲン分解阻害能を測定する方法及びその利用 |
JP7297979B1 (ja) | 2022-05-31 | 2023-06-26 | サンスター株式会社 | 歯周病菌プロテアーゼ活性を測定する方法及びその利用 |
JP2023176122A (ja) * | 2022-05-31 | 2023-12-13 | サンスター株式会社 | 歯周病菌プロテアーゼ活性を測定する方法及びその利用 |
JP2023176119A (ja) * | 2022-05-31 | 2023-12-13 | サンスター株式会社 | コラーゲン分解阻害能を測定する方法及びその利用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5679140B2 (ja) | 2015-03-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Owen et al. | In vitro models of bone remodelling and associated disorders | |
Vinatier et al. | A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes | |
Chen et al. | In vitro cellular responses to scaffolds containing two microencapulated growth factors | |
Li et al. | Investigating the potential of amnion-based scaffolds as a barrier membrane for guided bone regeneration | |
FR2828206A1 (fr) | Utilisation d'inhibiteurs des lysyl oxydases pour la culture cellulaire et le genie tissulaire | |
JP2004512031A (ja) | 生体内、生体外および試験管内での軟骨及びコラーゲンの修復及び再生並びに骨再形成方法 | |
JP2009249344A (ja) | 歯髄及び/又は象牙質形成促進のための薬剤及びその利用 | |
Isaac et al. | Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine | |
Shimizu et al. | Bone resorption by isolated osteoclasts in living versus devitalized bone: differences in mode and extent and the effects of human recombinant tissue inhibitor of metalloproteinases | |
Zhao et al. | The spatial form periosteal-bone complex promotes bone regeneration by coordinating macrophage polarization and osteogenic-angiogenic events | |
Hong et al. | Combination therapy using kartogenin-based chondrogenesis and complex polymer scaffold for cartilage defect regeneration | |
CA2710206A1 (en) | Method and kit for delivering regenerative endodontic treatment | |
JP5679140B2 (ja) | コラーゲン分解阻害剤のスクリーニング方法 | |
WO2007104242A1 (fr) | Composés capables d'inhiber les métalloprotéinases à ion de zinc | |
US11969487B2 (en) | Non-cellular root canal filling material and non-cellular dental tissue regeneration promoting kit | |
Sun et al. | Bioactive composite hydrogel with effects of robust promoting osteogenesis and immunomodulation for osteoporotic bone regeneration | |
Accorsi-Mendonca et al. | Expression of metalloproteinase 2 in the cell response to porous demineralized bovine bone matrix | |
EP3949991A1 (en) | Acellular root canal filler and acellular dental tissue regeneration promoting kit | |
Zebrowitz et al. | Prolyl-hydroxylase inhibitor-induced regeneration of alveolar bone and soft tissue in a mouse model of periodontitis through metabolic reprogramming | |
US20120213826A1 (en) | Use of Pro-Inflammatory Compounds for Promoting Bone Formation | |
Agrawal et al. | Dentin matrix metalloproteinases: a futuristic approach toward dentin repair and regeneration | |
Waddington et al. | Assessing the potential of mesenchymal stem cells in craniofacial bone repair and regeneration | |
RU2812019C2 (ru) | Неклеточный наполнитель корневого канала и неклеточный набор, стимулирующий регенерацию тканей зуба | |
Nio et al. | Three-dimensional ultrastructure of synoviocytes in the knee joint of rabbits and morphological changes in osteoarthritis model | |
Gu et al. | Mg-Cross-Linked Alginate Hydrogel Induces BMSC/Macrophage Crosstalk to Enhance Bone Tissue Regeneration via Dual Promotion of the Ligand–Receptor Pairing of the OSM/miR-370-3p-gp130 Signaling Pathway |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120319 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131217 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140212 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20140819 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141105 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20141126 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20141218 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20141224 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5679140 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |