DE69733963T2 - Identifizierung von blastischen zellen in einer leukozytenzubereitung - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Zelluläre Enzyme sind ein Schlüssel für metabolische Diversität, Differenzierung und Zytopathologie unter Zellen. Jedoch sind zelluläre Enzyme extrem verschieden. Ihre Funktionen schließen Wirtsverteidigung, Transport von Molekülen durch Membranen, Herstellung von Energie und Synthese der zellulären Bestandteile ein. Bis zu eintausend verschiedene Enzyme können in einer gegebenen Zelle wirksam sein, aber nur einige wenige Dutzend können die Funktion irgendeines Zelltyps definieren. Zusätzlich können Enzymmengen um Faktoren von zehn bis hundert in Abhängigkeit des funktionellen und differenziellen Zustandes der Zelle variieren. Darüber hinaus können dieselben Enzyme nicht nachweisbar in ruhenden Zellen desselben funktionellen Phänotyps und in Zellen, welche verschiedene Funktionen erfüllen, sein.
  • Die morphologische Klassifizierung von chemischen Bestandteilen innerhalb von Zellen wurde durch die Verwendung von zytochemischen Färbungen unterstützt. Diese verwendeten Verfahren waren enzymatische Techniken, und im Allgemeinen waren alle Assays für enzymatische Aktivität des Standes der Technik zytochemische kolorimetrische Assays. Beispiele der Messungen von Enzymaktivität im Stand der Technik sind:
    • 1) Acetatesterase Aktivität, gemessen mit α-Naphthylacetat, wurde zusammen mit anderen Esterase Aktivitäten verwendet, um Leukozytenzelltypen zu identifizieren, und sie ist im Allgemeinen hoch in normalen Monozyten und Megakaryozyten und in Blastzellen von akuter myelomonozytischer Leukämie, akuter monozytischer Leukämie und akuter Erythroleukämie.
    • 2) Chloracetatesterase Aktivität, gemessen mit Naphthol-AS-D Chloracetat, ist im Allgemeinen hoch in normalen Promyelozyten und Neutrophilen und in Blastzellen von akuter myeloblastischer Leukämie mit Reifung, akuter promyelozytischer Leukämie und akuter myelomonozytischer Leukämie.
    • 3) Butyrylesterase Aktivität, gemessen mit 1-Naphthylbutyrat, wurde verwendet, um verschiedene Zelltypen zu identifizieren und ist im Allgemeinen hoch in normalen Monozyten und in Blastzellen von akuter myelomonozytischer Leukämie und akuter monozytischer Leukämie. Butyrylfluorescein ist auch ein Substrat für Phospholipase A2, einem früheren Enzym in der biochemischen Kaskade, die zu der Herstellung von Prostaglandinen und Leukotrienen führt.
    • 4) Assays von saurer Phosphatase Aktivität wurden zusammen mit Assays für Esterase Aktivität verwendet, um viele verschiedene Zelltypen zu identifizieren. Monozyten, Neutrophile und T-Lymphozyten weisen eine relativ hohe saure Phosphataseaktivität auf, während B-Lymphozyten eine relativ niedrige saure Phosphatase Aktivität aufweisen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Blastzellen von akuter promyelozytischer Leukämie und akuter myelomonozytischer Leukämie eine relativ hohe saure Phosphatase Aktivität aufweisen.
    • 5) Ein Derivat von β-Glucuronidase wurde verwendet, um die Degranulierung in polymorphonukleären Lymphozyten (PMN) in einem Test zu messen, der die Fähigkeit von verschiedenen nicht-steroidalen, anti-entzündlichen Arzneimitteln (NSAIDS) untersucht, die PMN Funktionen zu inhibieren. Periphere Blut T-Lymphozyten zeigen höhere β-Glucuronidase Aktivität als periphere Blut B-Lymphozyten. Fluorescein-di-glucuronid ist eine negativ geladene Verbindung. Um anderen Zuckerderivaten zu helfen, durch Zellmembranen in Assays von β-Glucosidase zu wandern, wurde ein lysomonotropes Detergenz (N-Dodecylimidazol) verwendet.
  • Die Untersuchung von Enzymen von Flusszytometrie könnte ihre Anfänge 1957 gehabt haben, wenn Lowry (J. Biol. Chem., 224: 1047–1067 (1957)) Dehydrogena sen durch Fluoreszenzmikroskopie in Zellen unter Verwendung von NADP untersuchte. Rotman (J. Immunology, Vol. 120, Nr. 8, S. 1460–1464 (1978); PNAS USA, Vol. 75, Nr. 2, S. 720–724 (1978); und PNAS, Vol. 60, S. 660–667 (1968)) studierte ϑ-Galactosidase in Ribosomen. 1969 stellte Hulett (Science, 166: 747–749 (1969)) Esteraseverbindungen mit Fluorescein her. Naphthylamin, Naphthol und Coumarin Derivate wurden von Dolbeare und Smith (Clin. Chem. 23/8, 1485–1491 (1977)) untersucht. Funktionelle Zellassays für ionisiertes Calcium, intrazellulären pH-Wert, Glutathion und Membranpotenzial wurden von Rabinovitch (NYAS, 667: 252 (1990) untersucht, und Valet (NYAS, 677: 233 (1993)) beschrieb Phagozytose, respiratorischen Ausbruch, Aktivierung von Antigenen und Protease Aktivität in Leukozyten.
  • Dichlorfluoresceindiacetat (2',7'-Dichlorfluoresceindiacetat, im Folgenden als DCFH-DA bezeichnet) als ein zelluläres Substrat für oxidativen Ausbruch wurde als erstes von Bass, et al., J. Immunology, Vol. 130, Nr. 4, S. 1910–1917 (1983) vorgeschlagen. Es ist gegenüber dem Sauerstoffradikal sensitiv. Die Verwendung von DCFH-DA wurde verwendet, um den oxidativen Ausbruch zu bestimmen, der von Peroxidase oder Katalase in neutrophilen Zellen resultiert. Das Konzept war, dass eine Reaktion mit DCFH-DA einen funktionellen Test einer neutrophilen Zelle lieferte, um zu bestimmen, ob genügend Sauerstoffradikal anwesend war, um Bakterien zu neutralisieren oder nicht. Deshalb war es der Test der neutrophilen Funktionalität zur Bestimmung seiner Wirksamkeit in der Bekämpfung von Krankheiten.
  • Bass et al. überwachten als Erste den oxidativen Ausbruch in Neutrophilen unter Verwendung von DCFH-DA im Jahr 1983. Bass et al. schlugen vor, dass die Umwandlung von nicht-fluoreszierendem Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) in die hoch fluoreszierende Verbindung 2',7'-Dichlorfluorescein (DCF) in einigen Schritten stattfindet. Zuerst wird DCFH-DA über die Zellmembran transportiert und durch Esterasen deacetyliert, um die nicht-fluoreszierende Verbindung 2',7'-Dichlorfluorescein (DCFH) zu bilden. Diese Verbindung ist innerhalb von Zellen gefangen. Als nächstes wird DCFH in DCF durch die Wirkung von Peroxid (H2O2) umgewandelt.
  • Figure 00040001
  • Die Messung der Fluoreszenz des DCF ist deshalb eine Messung der Herstellung von H2O2.
  • Der Beitrag von Peroxidase zu der Oxidation von DCFH ist unbekannt. In Lösung wird die Oxidation von DCFH merklich durch Peroxidase gesteigert. Jedoch steigert auch Azid, das ein Inihibitor von Myeloperoxidase ist, die intrazelluläre Oxidation von DCFH. Bass et al. spekulierte, dass dieser Anstieg in der Azid vermittelten Inhibierung von Katalase begründet sein könnte, einem Enzym, das mit DCFH um die Wechselwirkung mit Peroxid, das durch die Zelle gebildet wird, konkurriert.
  • Rothe, Oser und Valet, Naturwissenschaften, 75, 354–355 (1988) führten Dihydrorhodamin 123 (DHR 123) als einen flusszytometrischen Indikator für oxidative Ausbruchsaktivität in Neutrophilen im Jahr 1988 als eine sensitivere Sonde für oxidative Ausbruchsaktivität als DCFH-DA ein. Rothe, Oser und Valet fanden, dass DHR 123 den relativ kleinen oxidativen Ausbruchsanstieg detektieren könnte, der durch Stimuli, wie dem chemotaktischen Peptid f-Met-Leu-Phe gebildet wurde; dieser Anstieg war nur knapp mit DCFH-DA messbar.
  • Sowohl DCFH-DA als auch DHR 123 werden verwendet, um Produkte des oxidativen Ausbruchs von polymorphonukleären Leukozyten zu messen. Während des oxidativen Ausbruchs bilden die zellulären Enzyme NADPH Oxidase und Superoxiddismutase as Superoxidanion (O2–) und Wasserstoffperoxid (H2O2) in den folgenden Reaktionen:
  • Figure 00040002
  • Figure 00050001
  • Wenn Myeloperoxidase anwesend ist, spaltet es das Wasserstoffperoxid:
  • Figure 00050002
  • Royall und Ischiropoulos, Arch. Biochem. & Biophys., Vol. 302, Nr. 2, 348–355 (1993) führten einige Experimente an der Permeabilität der Zellmembranen von kultivierten endothelialen Zellen gegenüber DCFH-DA, DCFH und DCF durch. In ihren Experimenten inkubierten Royall und Ischiropoulos Zellen in Medium mit DCFH-DA, und anschließend wuschen sie die Zellen mit Medium ohne DCFH-DA. Anschließend maßen sie die intrazellulären und extrazellulären Konzentrationen von DCFH-DA, DCFH und DCF. Sie fanden, dass es einen größer als 90% Verlust von DCFH und DCF aus den Zellen nach einer Stunde gab, was zeigte, dass DCFH und DCF nicht innerhalb der endothelialen Zellen gefangen waren.
  • In ihren Experimenten an der Diffusion der Sonden über die Zellmembranen fanden Royall und Ischiropoulos, dass intrazelluläre DHR 123 Konzentrationen, wie DCFH und DCF Konzentrationen um 90% abfielen nachdem die Zellen für eine Stunde in Medium inkubiert wurden, das kein DHR 123 enthielten. Jedoch fiel das Produkt der Reaktion, intrazelluläres Rhodamin 123, nur um 15% nach 1 Stunde. Deshalb wurde gefunden, das Rhodamin 123 besser von der Zelle zurückgehalten wird als DCF.
  • In ihren Experimenten an der Sensitivität der Sonden fanden Vowells et al., J. Imm. Methods, 178, S. 89–97 (1995), dass das Fluoreszenzsignal, das in normalen Granulozyten, die mit PMA stimuliert wurden, gemessen wurde, siebenmal höher war für DHR 123 als für DCFH-DA. Das Zugeben von 0,017% Azid steigerte das Signal von DCFH-DA um 140% und das Signal von DHR 123 um 25%. Vowells et al. untersuchten auch Gemische von normalen Granulozyten und Gra nulozyten von Patienten mit chronischer granulomatöser Erkrankung (CGD), einer seltenen genetischen Störung, die durch Defekte in dem NADPH Oxidaseenzymkomplex verursacht wird. Vowells et al. fanden, dass DHR 123, aber nicht DCFH-DA normale Subpopulationen bis zu 0,1% in Gemischen von normalen/CGD Granulozyten detektieren konnte.
  • Drewinko, et al., Brit. J. Haematol., Vol. 66, Nr. 1, S. 27–36 (1987) offenbaren ein Verfahren zum Erhalten von flusszytochemischen Mustern von weißen Blutzellen in menschlichen hämatopoetischen bösartigen Erkrankungen.
  • Die Notwendigkeit, Blastzellen in einer Patientenprobe zu detektieren, um ein Behandlungsschema für Leukämie zu bestimmen, wird seit langem gewünscht. Um folglich Blastzellen akkurat zu bestimmen wird eine Wright Färbung verwendet, die eine klassische Färbetechnik ist, um die Anwesenheit von Blastzellen zu bestätigen und Zellen durch ihr Lipidprotein und ihre Nukleinsäurekonzentration zu identifizieren. Anschließend verwendet man eine kolorimetische Peroxidasefärbung auf einer Mikroskopobjektträgerpräparation, um die Anwesenheit oder Abwesenheit der Peroxidase in der Blastzelle anzuzeigen. Eine Reihe von zytochemischen Färbungen werden verwendet, um diese bösartigen Zelltypen mikroskopisch zu identifizieren. Die Verwendung dieser spezifischen Färbetechniken kann anschließend verwendet werden, um die betroffene Zelllinie zu etablieren. In diesen Techniken sind die Zellen nicht metabolisch aktiv.
  • Über die Jahre wurde die mikroskopische Untersuchung von Leukozyten, Erythrozyten und Plättchen in einem Blutfilm, bekannt als die manuelle differenzielle Zählung, als die Grundlage für die Diagnose von hämatologischen Abnormalitäten erkannt. Jedoch hat das manuelle Verfahren den Ruf, teuer und langwierig zu sein, es benötigt einen hoch befähigten Technologen und hat eine relativ hohe inhärente Fehlerrate. Die hohe Variabilität des manuellen Verfahrens steht mit den Präparationstechniken, der Probengröße und der Subjektivität des Durchführenden in Verbindung.
  • Zusätzlich werden akute Leukämiepatienten häufig mit Arzneimitteln behandelt, die Wirkungen auf die Rollen der Knochenmarkszellproduktion haben und welche die Morphologie von Blutzellen verändern können, was es schwierig macht, diese Zellen korrekt zu identifizieren. Die Ergebnisse basieren auf subjektiven Interpretationen.
  • Die klinische Praxis würde es bevorzugen, Blastzellen bei weniger als 1% zu bestimmen. Eine frühe Detektion ist am meisten bevorzugt, weil Behandlungen, die aus Chemotherapie oder anderen aggressiven Behandlungen bestehen, die normale Zellen ebenso töten wie abnormale Zellen, verabreicht werden könnten, um die nachteiligen Folgen der Behandlung zu minimieren, und eine niedrigere Nachweismenge wird auch das Überwachen der Wirksamkeit von Arzneimitteltherapien erlauben.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren von Blastzellen in einer Flüssigkeitsprobe umfassend das Verwenden einer Körperflüssigkeits-Probe von einem Individuum, wobei die Probe metabolisch aktive Zellen enthält, um mindestens eine Testprobe herzustellen, wobei die Testprobe metabolisch aktive Zellen enthält; das Zugeben eines Assay-Reagenzes zu jeder hergestellten Testprobe, wobei das Assay-Reagenz eine fluorogene Indikatorgruppe enthält, welche aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt ist, einen nicht-fluoreszierenden ersten Zustand aufzuweisen, bevor das Assay-Reagenz mit einem Enzym innerhalb der Zellen reagiert, und einen fluoreszierenden zweiten Zustand aufweist, welcher bei einer Wellenlänge von oberhalb 450 nm anregbar ist, nachdem das erste Assay-Reagenz mit dem Enzym innerhalb der Zelle reagiert, wobei das erste Assay-Reagenz eine geringere Fluoreszenz als die Auto- bzw. Eigenfluoreszenz einer metabolisch aktiven Zelle vor dem Reagieren mit dem Enzym innerhalb der Zelle aufweist; das Detektieren der Fluoreszenz und zweier Kanäle von Lichtstreuung der Zellen in der Testprobe in einem Instrument, das zu einem solchen Detektieren fähig ist; und das Analysieren des Fluoreszenzproduktes und der Lichtstreu ung der Zellen, um Blastzellen, die in der Probe enthalten sind, zu identifizieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Assay-Verbindung aus 3',6'-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA), Dihydrorhodamin 123 (DHR 123) und Nitroblue Tetrazolium ausgewählt ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren in dem eine Flüssigkeitsprobe verwendet wird, um mindestens zwei Testproben herzustellen, wobei eine erste Testprobe zu einem ersten Assay-Reagenz wie oben zugegeben wird, das mit Oxidoreduktaseenzymen reagiert, und eine zweite Testprobe wird zu einem Assay-Reagenz zugegeben, das mit einem Esteraseenzym reagiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren in dem eine Flüssigkeitsprobe verwendet wird, um mindestens drei Testproben herzustellen, wobei eine erste Testprobe zu einem ersten Assay-Reagenz wie oben zugegeben wird, das mit Oxidoreduktaseenzymen reagiert, eine zweite Testprobe zu einem zweiten Assay-Reagenz zugegeben wird, das mit einem Esteraseenzym reagiert, eine dritte Testprobe zu einem dritten Assay-Reagenz zugegeben wird, das mit einem Phosphataseenzym reagiert und eine vierte Testprobe zu einem vierten Assay-Reagenz zugegeben wird, das mit einem Glucuronidaseenzym reagiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren in dem eine Flüssigkeitsprobe verwendet wird, um mindestens vier Testproben herzustellen, wobei eine erste Testprobe zu einem ersten Assay-Reagenz wie oben zugegeben wird, das mit Oxidoreduktaseenzymen reagiert, eine zweite Testprobe zu einem zweiten Assay-Reagenz zugegeben wird, das mit einem Esteraseenzym reagiert, eine dritte Testprobe zu einem dritten Assay-Reagenz zugegeben wird, das mit einem Phosphataseenzym reagiert und eine vierte Testprobe zu einem vierten Assay-Reagenz zugegeben wird, das mit einem Glucoronidaseenzym reagiert.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • In den Zeichnungen sind Ausführungsformen gezeigt, die gegenwärtig bevorzugt sind, es wird jedoch verstanden, dass die Erfindung nicht auf die exakt gezeigten Vorrichtungen und Anordnungen beschränkt ist, wobei:
  • die 1A, 1B, 1C und 1D Flussdiagramme von vier Assay-Protokollen gemäß der Erfindung sind;
  • 2 zeigt eine Korrelation der Bestimmung von Prozent Blastzellen, die durch Flusszytometrie unter Verwendung dieses Verfahrens erhalten wurden im Vergleich zu Prozent Blastzellen, die durch das Wright Färbeverfahren erhalten wurden.
  • Die 3A und 3B zeigen Histogramme, welche die Verwendung eines Assay-Reagenzes gemäß dieser Erfindung darstellt, um eine Anzeige von Myoblastzellen bereitzustellen.
  • Die 4A und 4B zeigen Histogramme von Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten und Blastzellen, welche die Verwendung eines Assay-Reagenzes gemäß dieser Erfindung darstellen, um eine Anzeige bereitzustellen, dass Blastzellen keine Myeloblastzellen sind.
  • Die 5A und 5B zeigen Histogramme von Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten und Blastzellen, welche die Verwendung eines Assay-Reagenzes gemäß dieser Erfindung darstellen, um eine Anzeige bereitzustellen, dass die Blastzellen lymphozytische Zellen sind.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die folgende Gliederung wird verwendet, um die bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung zu beschreiben:
    • I. Assay-Typen
    • II. Herstellung von metabolisch aktiven Gesamtzellen
    • III. Assay-Verbindung
    • IV. Herstellung eines Assay-Reagenzes, das eine Assay-Verbindung enthält
    • V. Assay-Bedingungen
    • VI. Assay-Protokoll
    • VII. Datenanalyse
  • I. Assay-Typen
  • Es wurde entdeckt, dass ein Assay-Reagenz in einem Verfahren verwendet werden kann, um enzymatische Aktivität von metabolisch aktiven Gesamtzellen zu bestimmen, um eine Anzeige der Anwesenheit einer Erkrankung, dem Verlauf einer Erkrankung, der Wirksamkeit eines Arzneimittels und der Zelldifferenzierung bereitzustellen. Insbesondere können Veränderungen in der Aktivität von einem oder mehreren Enzymen untersucht werden, um eine Anzeige der Anwesenheit und des Verlaufs einer Erkrankung wie Leukämie bereitzustellen. Zusätzlich kann die Messung der Aktivität von Enzymen eine Anzeige der Antwort gegenüber gewissen Arzneimitteln oder Behandlungen bereitstellen, weil sich die Aktivität der Enzyme ändern wird, wenn ein Arzneimittel erfolgreich die Erkrankung bekämpft, moduliert oder behandelt. Ferner wurde außerdem bestimmt, dass die Differenzierung von leukämischen Zellen durch die Anwesenheit von Oxidoreduktase und einem oder mehreren ausgewählten Enzymen bestimmt werden kann.
  • II. Herstellung einer metabolisch aktiven Gesamtzellprobe
  • Das Assay-Reagenz wird mit einem metabolisch aktiven Gesamtzellanalyten umgesetzt. Die metabolisch aktiven Gesamtzellen sind in Gewebe, Blut, Zellkulturen oder anderen zellenthaltenden Bestandteilen, wie in Rückenmarksflüssigkeit, peritoneal- oder einer Gewebezellsuspension, die von Knochenmarkspülungen oder Lymphknoten, wie von einer Biopsie hergestellt werden, enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die metabolisch aktiven Gesamtzellen aus Ge samtblut oder Knochenmarksspülungen erhalten. Vorzugsweise werden die metabolisch aktiven Gesamtzellen in Zelltypen getrennt. Die zu analysierende metabolisch aktiven Zellen werden durch bekannte Techniken, wie differenzielle Lyse, differenzielle Zentrifugation und Affinitätssäulen isoliert. Jedoch ist die Trennung der zu untersuchenden Zellen von anderen Zellen nicht immer essentiell.
  • Die Zellen werden für gewöhnlich gewaschen, um irgendwelche extrazelluläre Enzyme zu entfernen, gegebenenfalls mit Lyse oder physikalischer Trennung von ungewünschten Zellen. Einige bevorzugte Techniken um dies zu erreichen sind in den 1A–1D zusammengefasst.
  • Die Analyse der segretierten metabolisch aktiven Zellen liefert eine Spezifität für eine bestimmte Enzymanalyse. Wenn zum Beispiel die metabolisch aktive Zelle eine Leukozytenblutzelle ist, umfasst das Verfahren das Trennen der Leukozytenzelle von dem Zellanalyten, Waschen der verbleibenden Leukozytenzelle, um irgendwelche Serum- oder Plasmaenzyme zu entfernen, in Kontakt bringen einer Assay-Reagenzverbindung mit der Leukozytenzelle und Bestimmen der Fluoreszenz von der Leukozytenzelle (siehe 1B). Eine Modifikation dieses Verfahrens umfasst Waschen des Zellanalyten, um irgendwelche Serum- oder Plasmaenzyme zu entfernen, in Kontakt bringen einer Assay-Verbindung mit dem Zellanalyten, Trennen der Leukozytenblutzellen von dem Zellanalyten und Bestimmen der Fluoreszenz von den Leukozytenzellen (siehe 1A). Zusätzlich kann ein anderes Verfahren für Zellanalyten von Leukozytenblutzellen, kernhaltigen Erythrozytenblutzellen und Plättchenanalyten verwendet werden, das Waschen des Zellanalyten, um irgendwelche Serum- oder Plasmaenzyme zu entfernen, in Kontakt bringen einer Assay-Verbindung mit dem Analyten und Bestimmen der Fluoreszenz von dem Analyten umfasst (siehe 1C).
  • Um zu bestätigen, dass Zellen metabolisch aktiv sind zum Zeitpunkt des Assays, ist es wünschenswert, dass die Lebensfähigkeit der Zellen zum Zeitpunkt des Assays überprüft wird. Einige Tests sind geeignet, um die Lebensfähigkeit von Zellen zu bestimmen. Trypan Blau ist blaue Färbung, die in die Zelle diffundiert und von Zellen entfernt wird, wenn die Zellen lebensfähig sind. Tote Zellen werden den Farbstoff nicht entfernen und werden die blaue Farbe annehmen. Propidiumiodid ist eine DNA-RNA Färbung, die, wenn die Zelle tot ist und Membranen beschädigt sind, in die Zelle eindringt und die DNA-RNA färbt. Fluoresceindiacetat-Propidiumiodid bewirkt, dass lebende Zellen eine grüne Farbe fluoreszieren, weil das Fluoresceindiacetat hydrolysiert wird, während tote Zellen eine rote Farbe von dem Propidiumiodid fluoreszieren. Reife rote Blutzellen unterlaufen keine Zellteilung, und deshalb ist ein Test hinsichtlich der Anwesenheit von 2,3-Diphosphoglucosedehydrogenase (der ein Indikator für Zellteilung ist) ein geeigneter Test für Lebensfähigkeit.
  • Der Assay der vorliegenden Erfindung ist insbesondere geeignet zum Messen intrazellulärer Konzentrationen von Enzymen in Säugetierzellen, wie menschlichen Zellen. Jedoch sollte der Assay auch geeignet sein in verschiedenen oder anderen Typen von Zellen, die eine metabolische Aktivität besitzen.
  • III. Assay-Verbindung
  • Ein Assay-Reagenz wird zum Bestimmen der Aktivität eines Enzyms in einer metabolisch aktiven Gesamtzelle hergestellt. Das Assay-Reagenz muss mit der Zelle verträglich sein, so dass die Zelle für mindestens die Dauer des Assays metabolisch aktiv bleibt. Das Assay-Reagenz umfasst mindestens eine Assay-Verbindung, die befähigt ist, durch die Zellwand zu wandern. Die Assay-Verbindung muss klein genug sein, so dass sie in die Zelle aufgenommen werden kann. Eine Assay-Verbindung mit einem Molekulargewicht von weniger als ungefähr 5.000 ist gegenwärtig bevorzugt.
  • Die Assay-Verbindung wird einen ersten Zustand vor dem Reagieren mit einem Enzym aufweisen, das in der metabolisch aktiven Gesamtzelle enthalten ist, und einen zweiten Zustand, wenn sie mit dem Enzym innerhalb der Zelle reagiert hat. Nach dem Reagieren mit dem Enzym ist die Assay-Verbindung anregbar (sie wird veranlasst zu fluoreszieren) bei einer Wellenlänge ungefähr im sichtbaren Bereich, zum Beispiel vorzugsweise bei einer Wellenlänge zwischen ungefähr 450 und 500 Nanometern (nm). Die Assay-Verbindung wird für gewöhnlich im Bereich von ungefähr 480 bis 620 nm, vorzugsweise 500 bis 600 nm und weiter bevorzugt 500 bis 550 nm emittieren. Die Auto- bzw. Eigenfluoreszenz der Zelle ist am meisten vorherrschend unter ungefähr 500 nm. Geeignete Assay-Verbindungen schließen DCFH-DA, Dihydrorhodamin 123 und Nitroblue Tetrazolium ein. Diese drei Assay-Verbindungen reagieren mit den Oxidoreduktaseenzymen.
  • Vorzugsweise wird die Assay-Verbindung eine Abgangsgruppe und eine Indikatorgruppe enthalten. Die Abgangsgruppe ist zur Spaltung durch das Enzym ausgewählt. Die Indikatorgruppe ist hinsichtlich ihrer Fähigkeit ausgewählt, einen ersten Zustand aufzuweisen, wenn sie mit der Abgangsgruppe verbunden ist, und einen zweiten Zustand, wenn die Abgangsgruppe von der Indikatorgruppe durch das Enzym abgespalten ist. Die Indikatorgruppe ist vorzugsweise von fluorogenen oder chemilumineszenten Verbindungen abgeleitet. Die Indikatorgruppe sollte gequenscht sein wenn sie mit der Abgangsgruppe verbunden ist. Der Begriff gequenscht bedeutet, dass die Indikatorgruppe fast keine Fluoreszenz oder Chemilumineszenz aufweist, wenn sie mit der Abgangsgruppe verbunden ist. Wenn die Abgangsgruppe von der Indikatorgruppe getrennt wird, wird die resultierende Indikator-Verbindung eine Fluoreszenz aufweisen. Geeignete fluorogene Indikator-Verbindungen schließen Xanthinverbindungen ein. Vorzugsweise ist die Indikator-Verbindung Fluorescein.
  • Abgangsgruppen für ein Esteraseenzym werden vorzugsweise durch die Synthese von Carbonsäuren mit zwischen 2 und 30 Kohlenstoffatomen hergestellt. Die Carbonsäuren können gesättigt oder ungesättigt sein. Die Carbonsäure enthält vorzugsweise 2 bis 24 Kohlenstoffe und weiter bevorzugt 4 bis 24 Kohlenstoffatome. Analoga dieser Carbonsäuren können ebenfalls verwendet werden. Die Carbonsäuren können natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Beispiele sind Butter-, Capron-, Palmitin-, Stearin-, Öl-, Linol- und Linolensäure. Für die vorliegende Erfindung würde die bevorzugte Abgangsgruppe unter Acetat und Chloracetat und Butyrat ausgewählt werden.
  • Bevorzugte Assay-Verbindungen für Esteraseenzyme werden ausgewählt unter FDA (3',6'-Fluoresceindiacetat), FDCIAc (3',6'-Fluoresceindichloracetat), FDB (3',6'-Fluoresceindibutyrat). FDA, FDCIAc und FDB sind Substrate für viele verschiedene Esterasen in menschlichen Geweben. Es wurde gefunden, dass FDA (3',6'-Fluoresceindiacetat), wenn es mit Natriumfluorid kombiniert wird, Enzymaktivität für Zellen der monozytischen Abstammung inhibiert. In dem Assay-Reagenz, FDA-NaF, wird die Konzentration von Natriumfluorid von ungefähr 300 bis 1500 Milligramm pro Liter, vorzugsweise 500 bis 1000 Milligramm pro Liter reichen.
  • Abgangsgruppe für Phosphatasen werden vorzugsweise durch die Synthese von Phosphaten, phosphatischen Säuren, Phospholipiden und Phosphoproteinen hergestellt. Analoga dieser Verbindungen können ebenfalls verwendet werden. Beispiele sind ATP, ADP, AMP und cyclisches AMP (c-AMP). Für die vorliegende Erfindung wäre die bevorzugte Abgangsgruppe Phosphat. Die bevorzugte Assay-Verbindung für Phosphatasen ist 3',6'-Fluoresceindiphosphat, 4'(5')-Carboxyfluoresceindiphenylphosphat und Fluoresceindiphenylphosphat. Vorzugsweise ist die Assay-Verbindung 3',6'-Fluoresceindiphosphat (FDP). Wenn FDP verwendet wird, ist das bevorzugte Assay-Reagenz das 3',6'-Fluoresceindiphosphatammoniumsalz (FDP-AS), welches durch das Enzym saure Phosphatase hydrolysiert werden kann.
  • Abgangsgruppen für Saccharidasen werden durch die Synthese von Kohlenhydraten, Zuckern, Glykoproteinen und Glykolipiden hergestellt. Die bevorzugte Assay-Verbindung für β-Glucuronidaseenzym ist Fluorescein-ϑ-D-diglucoronid. Fluorescein-ϑ-D-diglucoronid wird durch das lysosomale Enzym β-Glucuronidase hydrolysiert.
  • Die Assay-Verbindung wird auf verträgliche Mengen für den Assay gereinigt. Es ist sehr wichtig, dass die Nebenreaktionsprodukte, Nebenprodukte und Ausgangsmaterialien von der Synthese der Assay-Verbindung entfernt werden, welche die Nützlichkeit des Assays verringern würde. Nicht physiologisch verträgliche Verun reinigungen sollten entfernt werden. Zusätzlich sollte das Hintergrundrauschen, das von Verunreinigungen gebildet wird, weniger als die Auto- bzw. Eigenfluoreszenz einer metabolisch aktiven Zelle sein.
  • Es wurde gefunden, dass, falls Verunreinigungen anwesend sind, die Verunreinigungen ein Inhibitor für die Enzymaktivität sein können. Ferner können metallische Verunreinigungen in irgendeinem der Ausgangsmaterialien außerdem die Enzyme vergiften, die Hydrolyse der Assay-Verbindung verhindern und die Genauigkeit des Enzym-Assays stören.
  • Zusätzlich können Verunreinigungen Hintergrundfluoreszenz bewirken, die sich zu der natürlichen Fluoreszenz der Zelle addiert, was eine Menge an Hintergrundrauschen bewirkt, welche die Detektion der Enzym erzeugten Fluoreszenz stört. Fluoreszenzverunreinigungen können durch die Zelle aufgenommen werden, und eine Ratenmessung von Fluoreszenz gegenüber der Zeit wird eine falsche Rate von gesteigerter Fluoreszenz zeigen, die nur zurückgeht auf diese zelluläre Aufnahme von fluoreszierenden Verunreinigungen. Dies ist ein besonderes Problem, wenn der Assay durchgeführt wird, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Enzyms zu bestimmen, weil diese Verunreinigung eine Fluoreszenzrate anzeigen wird, die fälschlicherweise der enzymatischen Aktivität zugeordnet werden könnte.
  • Die Fluoreszenzverunreinigungen sollten bis zu einer Menge entfernt werden, dass sie die Grundliniendetektion des Enzyms in der Zelle nicht verdeckt. Die Grundliniendetektion kann durch Analysieren von Logverdünnungen einer Indikatorgruppe festgestellt werden. Vorzugsweise sollten die Verunreinigungen entfernt werden, so dass die Fluoreszenz der Verunreinigungen weniger als die Auto- bzw. Eigenfluoreszenz der metabolisch aktiven Zelle beträgt.
  • Deshalb ist es bevorzugt, dass die Verunreinigungen in dem Assay-Reagenz bis zu einer Konzentration von weniger als der gebildeten Fluoreszenz bei ungefähr 1 × 10–6 M und vorzugsweise weniger als die gebildete Fluoreszenz bei ungefähr 1 × 10–7 molar freier Indikatorgruppe entfernt werden. Dies entspricht einer 100.000 Photonenzählung unter Verwendung von Rhodamin 110 als einem Standard bei 1 × 10–7–10–8 M, vorzugsweise 5 × 10–8 M in einer 1 cm Weglängenküvette, wenn sie über 10 Minuten in einem Photonenzählspektrofluorometer gemessen wird, das von der SLM Company in Chicago, Illinois hergestellt wurde. Dies entspricht einer Benutzungsmenge in dem Flusszytometer, wenn keine der zellulären falsch Positiven in einem 10 Minuten Zeitraum bei der höchsten Sensitivitätsstufe detektiert werden kann. Es wurde gefunden, dass dies eine Konzentration von Verunreinigungen von weniger als einem Teil pro Einhunderttausend benötigt, und weiter bevorzugt weniger als ein Teil pro Fünfhunderttausend, am meisten bevorzugt weniger als ein Teil pro Million.
  • Die Anwesenheit von Verunreinigungen bewirkt einen Abfall in der Lagerungsstabilität der Verbindung, was zu einer gesteigerten Autohydrolyse führt, welche zu gesteigerter Hintergrundfluoreszenz führt. Eine Verbindung sollte frei von Verunreinigungen sein, so dass, wenn die Verbindung (oder das Reagenz, welches die Verbindung enthält) bei 4°C für 30 Tage, vorzugsweise 90 Tage, weiter bevorzugt 180 Tage, am meisten bevorzugt ein Jahr, gelagert wird, die Hintergrundfluoreszenz weniger als 10%, vorzugsweise weniger als 5%, am meisten bevorzugt weniger als 1% jeweils über diese Zeiträume ansteigt. Die gereinigte Assay-Verbindung kann in einem verschlossenen Gefäß über trockenem Stickstoff unter atmosphärischem Druck gelagert werden, oder sie kann lyophilisiert und in einem verschlossenen Röhrchen gelagert werden. Der Startpunkt in der Zeit zum Messen der Stabilität ist für gewöhnlich unmittelbar nachdem die Reinigung der Assay-Verbindung abgeschlossen ist, aber es kann irgendein Zeitpunkt sein, wie unmittelbar nachdem die Herstellung des Assay-Reagenzes abgeschlossen ist.
  • IV. Herstellung eines Assay-Reagenzes, das eine Assay-Verbindung enthält
  • Das Assay-Reagenz muss mit der metabolisch aktiven Zelle verträglich sein. Das Assay-Reagenz sollte eine Osmolalität von ungefähr 250 Milliosmol bis 350 Milliosmol, vorzugsweise von ungefähr 275 Milliosmol bis 320 Milliosmol aufweisen. Ferner wird der pH-Wert des Assay-Reagenzes zwischen ungefähr 4 und 7, vor zugsweise zwischen ungefähr 5,0 und 6,5 sein. Es wurde gefunden, dass die Assay-Verbindungen bei einem pH-Wert über 7 autohydrolysieren, was die Lagerungsstabilität, die rekonstituierte Stabilität eines lyophilisierten Assay-Reagenzes verringert und den Assay durch das Erhalten falsch Positiver beeinflusst.
  • Zusätzlich ist die Wirksamkeit eines intrazellulären Assays wesentlich verbessert durch das Zugeben von einem oder mehreren Bestandteilen in das Assay-Reagenz. Beispiele von Verbesserungen schließen eine Reduktion von Reaktionszeit, gesteigerte Selektivität für das abgezielte Enzym, Reduktion von kompetitierenden Enzymreaktionen, Steigerung des Signals der Enzymreaktion, Steigerung der Reaktivität des untersuchten Enzyms bezüglich anderen nicht abgezielten Enzymen, Steigerung der Retentionszeit der Indikatorgruppe innerhalb der Zelle und andere ähnliche vorteilhafte Ergebnisse, ein.
  • Zusätzliche Bestandteile schließen Puffer, Cofaktoren, Modulatoren, Inhibitoren, Aktivatoren für gesteigerte Aktivität der abgezielten Enzyme über andere nicht abgezielte Enzyme, ein; lösende Bestandteile und Retentionsbestandteile können in das Assay-Reagenz eingeschlossen werden, um die Enzym-Assayergebnisse zu verbessern. Diese Bestandteile sind physiologisch verträglich in der metabolisch aktiven Gesamtzelle, die untersucht werden soll.
  • Die chemische Natur des Puffers ist wichtig für die Reaktivität der Assay-Verbindung mit dem zellulären Enzym. Pufferbestandteile, die keine inhibitorische Wirkung auf die Zellen zeigen, können verwendet werden. Geeignete Pufferbestandteile sind N-tris(Hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (TES), Hanks gepufferte Salzlösung (HBSS), 2-N-Morpholinethansulfonsäure (MES) und HEPES. Zusätzlich kann ein metabolische Energiequelle, wie Zucker (Glucose) zugegeben werden, wenn HBSS verwendet wird. Die bevorzugten Pufferbestandteile sind MES für saure Lösungen.
  • Die Assay-Verbindung muss in dem wässrigen Medium löslich sein. Die Löslichkeit wird durch Streulicht unter Verwendung der Prozentdurchläsigkeit von Licht (oder Absorption) durch das Gemisch der Mediums und der Assay-Verbindung gemessen. Wie in einem Spektrophotometer gemessen, sollte die Assay-Verbindung eine Hintergrundfarbe bei einer Konzentration, die in einem Assay verwendet werden soll, von weniger als 1000, vorzugsweise weniger als 800 und am meisten bevorzugt weniger als 500 Milliabsorptionseinheiten bei 340 Nanometern (25°C), abgeglichen gegen destilliertes oder deionisiertes Wasser, aufweisen. Die Assay-Verbindung wird für gewöhnlich in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mM verwendet werden. Eine geeignete Konzentration zum Bestimmen von Löslichkeit ist 5 mM.
  • Vorzugsweise muss eine zweifache Überschussmenge der Assay-Verbindung, die mit dem Enzym während der Zeit des Assays reagieren wird, in den wässrigen Medien löslich sein. Ein Überschuss an Assay-Verbindung ist bevorzugt. Wenn eine ungenügende Menge der Assay-Verbindung bereitgestellt wird, wird die Enzymreaktion die Assay-Verbindung vollständig hydrolysieren und der dynamische Bereich des Assays wird begrenzt sein. Die resultierende Indikator-Verbindung wird eine begrenzte Fluoreszenzdauer aufweisen. Wenn jedoch ein Überschuss der Assay-Verbindung verwendet wird, wird die Enzymreaktion kontinuierlich die Assay-Verbindung hydrolysieren und die Fluoreszenzdauer wird während der Enzymreaktion andauern. Dies liefert den Vorteil, dass ein längerer Zeitraum zur Verfügung steht, in dem hinsichtlich einem oder mehreren Reaktionszuständen der Assay-Verbindung abgetastet werden kann.
  • Zusätzlich kann ein lösender Bestandteil mit der Assay-Verbindung verwendet werden, um beim Transfer der Assay-Verbindung in eine metabolisch aktive Zelle zu helfen. Der lösende Bestandteil ist in einer Menge anwesend, die wirksam ist, der Assay-Verbindung zu erlauben, durch die Zelllipid Doppelschicht ohne die Zelle nachteilig zu beeinflussen, zu wandern. Der lösende Bestandteil sollte vorsichtig ausgewählt werden, weil der falsche lösende Bestandteil Lyse oder Zelltod verursachen kann.
  • Wenn die Assay-Verbindung eine Hintergrundfarbe (bei der Konzentration, die in einem Assay verwendet werden soll) von größer als 1000, größer als 800 und größer als 500 Milliabsorptionseinheiten aufweist, kann ein Lösungsbestandteil verwendet werden, um die Hintergrundfarbe auf weniger als 1000, weniger als 800 oder weniger als 500 Milliabsorptionseinheiten zu erniedrigen. Jedoch ist die Konzentration des Lösungsbestandteils beschränkt. Wenn eine hohe Konzentration des Lösungsbestandteils verwendet wird, werden die metabolisch aktiven Zellen lysiert. Wenn eine niedrige Konzentration des Lösungsbestandteils verwendet wird, wird keine ausreichende Löslichkeit der Assay-Verbindung erreicht. Die wirksame Menge des Lösungsbestandteils kann empirisch bestimmt werden, aber sie ist typischerweise geringer als 10,0 Gew.-% der Assay-Verbindung.
  • Geeignete Lösungsbestandteile schließen nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, Polyethylenglykol, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Mannitol ein. Kommerziell erhältliche Lösungsprodukte schließen BRIJ 35 (Polyoxyethylenlaurylether) und TWEEN 20 (Ethylenoxid mit hydrophober Base von Propylenoxid und Propylenglykol), die erhältlich sind von ICI Americas, Inc., und PLURONIC 25 R8 (Ethylenoxid mit hydrophober Base von Propylenoxid und Propylenglykol), das von BASF Wyandotte erhältlich ist, und TRITON X100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol), das von Rohm und Haas Company erhältlich ist, ein. Der bevorzugte Lösungsbestandteil ist DMSO.
  • Das Medium, in dem die Assay-Verbindung gelöst wird, muss mit der Zelle verträglich sein, so dass die Zelle in dem Medium für mindestens die Dauer des Assays metabolisch aktiv bleiben kann. Das Medium ist vorzugsweise steril und frei von Endotoxin und Chemikalien, welche die Physiologie der Zelle negativ beeinflussen. Die Assay-Verbindung ist vorzugsweise vollständig in dem Medium bei der Konzentration, in der es verwendet wird, löslich. Die Assay-Verbindung wird vorzugsweise in Konzentrationen bis zu der Sättigung oder der Suspensionsmenge oder bevor Trübung auftritt, verwendet. Das Medium kann physiologische Salzlösung oder eine gepufferte Lösung (Phosphat gepufferte Salzlösung) sein, in dem die Assay-Verbindung und andere Zusatzstoffe gelöst sind. Das Medium sollte vorzugsweise ein Puffermittel einschließen, so dass der pH-Wert des Assay-Gemisches von metabolisch aktiven Zellen und Assay-Verbindung an einem Punkt aufrechterhalten wird, der für die Enzymhydrolyse geeignet ist.
  • Zum Zwecke der Lagerung kann die Verbindungs- und Mediummischung gefroren oder lyophilisiert sein, aber vorzugsweise ist sie lyophilisiert. Die Lyophilisierung sollte unter Bedingungen stattfinden, an denen die Sublimation des Lösungsmittels nach dem Anlegen eines Vakuums auftritt. Das Anlegen eines Vakuums an die Probe bei einer Temperatur, an der sich eine Flüssigkeit auf dem Feststoff vor dem Übergang in eine Gasphase bildet, als "Zurückschmelzen" bezeichnet, kann die Degradation der Verbindung bewirken. Geeignete Temperaturen sollten für jede Verbindung bestimmt werden, und bevorzugte Temperaturen sind für gewöhnlich –5°C bis –35°C für vorwiegend wässrige Lösungen. Während des thermischen Zyklus der Lyophilisierung kann Hitze nach der Sublimation angewendet werden, um irgendwelche zusätzliche Feuchtigkeit zu vertreiben. Die Produkttemperatur sollte nie die angelegte Hitze überschreiten, und das Produkt sollte auf Raumtemperatur für über 15 bis 72 Stunden gebracht werden. Das Vakuum sollte auf atmosphärische Bedingungen durch Ausströmen in trockenem Stickstoff zurückgeführt werden. Das Produkt wird bei atmosphärischem Druck und Temperatur verschlossen. Die lyophilisierte Verbindung wird bei 4°C bis 8°C gelagert und kann unter Verwendung von Endotoxin freiem deionisiertem Wasser rekonstituiert werden.
  • Die Autohydrolyse, die eine nicht-spezifische Hydrolyse des Substrats ist, führt zu zellulärer Fluoreszenz, die nicht von dem Zielenzym stammt. Es wurde gezeigt, dass die Stabilität der Substrat-Verbindung ein Schlüsselfaktor in der Verhinderung von Autohydrolyse ist.
  • Die Assay-Verbindung und/oder das Assay-Reagenz sollte ausreichend stabil sein, so dass keine Auto- bzw. Eigenfluoreszenz oder Chemilumineszenz durch die Degradation der Assay-Verbindung vor der Spaltung durch das Enzym erzeugt wird. Vorzugsweise, wenn die Assay-Verbindung oder das Assay-Reagenz bei 20°C für 30 Tage, vorzugsweise 90 Tage, weiter bevorzugt 180 Tage und am meisten bevorzugt ein Jahr gelagert wird, zeigt das Assay-Reagenz eine Photonenzählung von 100.000 oder weniger. Photonen können unter Verwendung einer 2 Millimolar Lösung an Assay-Verbindung in deionisiertem Wasser und einer Weglänge von 1 cm gegenüber einem Rhodamin 110 Standard, wie zuvor beschrieben, gemessen werden. Fluoreszenzverunreinigungen sollten weniger als 10% der Fluoreszenz, die während des Assays erzeugt wird, beitragen.
  • Ein akzeptables Assay-Reagenz sollte die folgenden drei Eigenschafen aufweisen: (1) es sollte eine niedrige Menge von nativer freier Fluoreszenz geben, die nicht-spezifisch durch die Zellen absorbiert wird. Somit sollte es eine niedrige Menge an Fluoreszenzverunreinigungen geben. Die akzeptierten und bevorzugten Mengen dieser Verunreinigungen wurden bereits beschrieben. (2) Das Reagenz sollte über die Zeit stabil sein, so dass es nicht kurz nachdem es hergestellt wurde, verwendet werden muss. Gewisse Verunreinigungen und gewisse Zusatzstoffe können die Rate von Autolyse steigern, welche die Fluoreszenz des Reagenzes erhöht. Akzeptable und bevorzugte Stabilitäten wurden bereits diskutiert. (3) Das Reagenz sollte eine ausreichend hohe Reaktionsgeschwindigkeit mit dem zu messenden Enzym besitzen, so dass die Fluoreszenz, die als ein Ergebnis der Reaktion zwischen dem Enzym und dem Reagenz erzeugt wird, einfach gemessen werden kann. In einem Aspekt sollte die Reaktionsgeschwindigkeit ausreichend hoch sein, so dass die Fluoreszenz, die als ein Ergebnis der Reaktion des Assay-Reagenzes und des abgezielten Enzyms innerhalb der Zelle gebildet wird, mindestens 2-fach, vorzugsweise mindestens 10-fach, weiter bevorzugt mindestens 50-fach und am meisten bevorzugt mindestens 100-fach größer ist als die nicht-spezifische Fluoreszenz, die in dem Assay erzeugt wird.
  • V. Assay-Bedingungen
  • Die Konzentration an Zellen, die analysiert werden sollen, die in einem Medium enthalten sind, sollte hoch genug sein, um ein Auslesen der gewünschten Zellzahl innerhalb des gewünschten Zeitraums zu erlauben, wobei die Geschwindigkeit des verwendeten Instruments berücksichtigt wird. Für gegenwärtige Flusszytometrietechniken ist eine Konzentration von ungefähr drei Millionen Zellen pro Milliliter geeignet, um eine Messung von ungefähr 10.000–15.000 Zellen in ungefähr 1–2 Minuten zu erreichen.
  • Die Assay-Verbindung wird im Allgemeinen in Konzentrationen in einer überschüssigen Menge eingesetzt, die durch die Menge des Enzyms innerhalb der Zeit des Assays vollständig hydrolysiert werden kann. Eine Assay-Verbindungskonzentration, die zu hoch ist, kann eine negative Wirkung auf die Enzymaktivität haben.
  • Die Assay-Verbindungskonzentration in einer zellulären Optimierung wird unter Verwendung von Km (eine bekannte Geschwindigkeitskonstante) und VMAX (Maximalgeschwindigkeit) Berechnungen bestimmt. Die Assay-Verbindung ist vorzugsweise in einer Menge von ungefähr 2 bis ungefähr 100 × VMAX und am meisten bevorzugt von ungefähr 2- bis ungefähr 10-fach der Menge anwesend, die durch das Enzym innerhalb der Dauer des Assay-Zeitraums vollständig hydrolysiert werden kann.
  • Der Assay kann entweder als eine Geschwindigkeitsbestimmung oder als eine Endpunktbestimmung durchgeführt werden. Geschwindigkeitsbestimmungen sind bevorzugt, weil sie im Allgemeinen weniger durch Auto- bzw. Eigenfluoreszenz beeinflusst sind. Folglich ist ein Geschwindigkeitsbestimmungs-Assay sensitiver und genauer. In einer Geschwindigkeitsbestimmung kann die Fluoreszenz der Assay-Verbindung/des Zellanalytengemisches sofort nachdem der Zellanalyt mit der Assay-Verbindung in Kontakt gebracht wurde, bestimmt werden. Die Fähigkeit, ein Signal zu sehen und es vom Hintergrundrauschen zu unterscheiden, bestimmt den anfänglichen Startpunkt der Datensammlung, und der Enddatenpunkt wird vorzugsweise bestimmt als der Punkt, wenn sich die Steigung der Reaktionsgeschwindigkeit ändert, typischerweise mehr als 2%.
  • Die meisten zellulären Reaktionen folgen nicht streng Kinetiken mit nullter Ordnung. Die meisten zellulären Enzyme zeigen eine Verzögerung zwischen der Zeit des Aussetzens der Zelle gegenüber der Assay-Verbindung, und der Fähigkeit, ein Signal zu detektieren, das größer ist als das Hintergrundrauschen. Zelluläre enzymatische Reaktionen, die nicht Kinetiken mit nullter Ordnung folgen, sind immer noch geeignete Messungen als erste Ordnung, pseudoerste Ordnung oder anfängliche Geschwindigkeitsmessungen. Mehrere Enzyme in einer Reaktion (gemischte Reaktionen) werden durch Steigungsveränderungen während des überwachten Zeitraums angezeigt.
  • In einer Endpunktbestimmung schreitet die Enzymhydrolysereaktion für eine vorbestimmte Zeitlänge, für gewöhnlich bei VMAX fort. Die Reaktionszeit kann darauf basierend berechnet werden, ob die Reaktion eine Kinetik nullter Ordnung oder erster Ordnung unter Verwendung von Michaelis-Menton Methodik ist. Alternativ dazu kann die Reaktionszeit auch durch eine unterschiedliche Verzögerungszeit für Reaktionen pseudoerster Ordnung eingestellt werden.
  • Es wurde bestimmt, dass eine Anzahl von Faktoren die Verlässlichkeit des Assays verringern kann und zu falsch Positiven oder fehlerhaften Anzeigen der enzymatischen Aktivität führen kann. Diese schließen ein (i) verlängerte Reaktion zwischen dem Zellanalyten und der Assay-Verbindung; (ii) ein anderes, nicht abgezieltes Enzym, das die Abgangsgruppe abspaltet; (iii) Auto- bzw. Eigenhydrolyse der Assay-Verbindung; (iv) Inhibitoren oder Stimulatoren, die anwesend sind und nicht detektiert werden; (v) Zellen, die nicht mehr metabolisch aktiv oder tot sind; (vi) gemischte Populationen von Zellen; (vii) eine Transfusion des Patienten vor der Probe; (viii) nicht-spezifische Farbstoffaufnahme durch negative Zellen; und (ix) Hintergrundfluoreszenz. Die Bildung von falsch Negativen, oder falschen Anzeigen eines Mangels an enzymatischer Aktivität, können bewirkt werden durch (i) unzureichende Reaktion zwischen dem Zellanalyten und der Assay-Verbindung, (ii) einem hypoosmotischen Medium, das zu einer Verringerung in der Zellaktivität führt; (iii) eine Zelle, die nicht mehr metabolisch aktiv ist; (iv) ausgebrochene Zellen; und (v) die Anwesenheit von Inhibitoren für das Zielenzym.
  • Es wurde ferner bestimmt, dass Assays signifikant verbessert werden, wenn die Reaktionsbedingungen derart eingestellt sind, die Aktivität des untersuchten Enzyms relativ zu anderen nicht untersuchten Enzymen zu maximieren, die sonst hinsichtlich der Abgangsgruppe konkurrieren. Insbesondere kann das abgezielte Enzym in einer Kettenkaskadenreaktion von Enzymen, die aufeinanderfolgend mit anderen Enzymen gekoppelt sind, wie in einer Multienzymreaktionskaskade eingeschlossen sein.
  • Die Reaktionsbedingungen können eingestellt werden, um die Wirksamkeit des Reaktionsweges zu maximieren, oder die Wirksamkeit der konkurrierenden Reaktionswege zu verringern. Solche Bedingungen schließen vorzugsweise mindestens einen pH-Wert, die Wahl der Form der Assay-Verbindung, der Temperatur, des osmotischen Drucks, der Ionenstärke und der Reaktionszeit ein.
  • Der pH-Wert, an dem ein Enzym am wirksamsten ist, wird für gewöhnlich zwischen ungefähr 4 und 7,5 liegen. Vorzugsweise wird der pH-Wert der Assay-Verbindung pH 4,5 bis 7,0 und am meisten bevorzugt von 4,7 bis 6,7 sein. Der pH-Wert des Assay-Gemisches wird durch Lösen des Zellanalyten und der Assay-Verbindung in einem geeigneten Puffer kontrolliert.
  • Ein Reaktionslauf unter Verwendung desselben Fensters der Datensammlung ohne die Enzymquelle wird die Auto- bzw. Eigenhydrolyse des Substrates bestimmen und damit das Potenzial für negative Zellen, den Farbstoff nicht-spezifisch zu absorbieren, was zu falsch Positiven führt.
  • Die Zeit des Assays ist typischerweise weniger als 30 Minuten, vorzugsweise weniger als 20 Minuten, für gewöhnlich zwischen 5 Sekunden und 20 Minuten, und am meisten bevorzugt zwischen ungefähr 10 Sekunden und ungefähr 5 Minuten. Eine Enzymsysteme, wie Esterasen, können mit der Assay-Verbindung in kürzeren Zeiträumen aufgrund der Konzentrationen von Enzymen, die in der Zelle ge funden werden, reagieren. Die Reaktionszeit sollte begrenzt sein, so dass die Wirkungen von zellulärer Expulsion auf die Indikator-Verbindung vermieden wird.
  • Die Temperatur, bei der der Assay durchgeführt wird, muss für die Zelle physiologisch verträglich sein. Die Temperatur muss hoch genug sein, um die Lebensfähigkeit zu erhalten und die Enzymaktivität sicherzustellen, aber nicht so hoch, dass sie Degradation oder andere nachteilige Reaktionen bewirkt, welche die Abgangsgruppe, das Enzym oder andere Bestandteile des Gemisches betreffen. Besondere Enzyme, oder Enzyme mit besonderen Reaktionswegen, sind reaktiver bei bestimmten Temperaturen. Die Temperatur wird vorzugsweise zwischen ungefähr 30°C und ungefähr 40°C, weiter bevorzugt zwischen ungefähr 35°C und ungefähr 38°C, und am meisten bevorzugt zwischen ungefähr 36°C und ungefähr 38°C aufrechterhalten.
  • Der osmotische Druck des Assaygemisches wird kontrolliert, so dass er innerhalb physiologischer Bereiche von ungefähr 250 Milliosmol bis 350 Milliosmol, vorzugsweise von ungefähr 275 Milliosmol bis 320 Milliosmol liegt. Der osmotische Druck muss ausgewählt werden, um die Lebensfähigkeit der metabolisch aktiven Gesamtzelle aufrechtzuerhalten. Schwankungen in den osmotischen Drücken führen zur Lyse der Zelle, schwerem Schrumpfen oder Vertrocknen (Einkerbung), oder, wenn sie zu niedrig sind, zum Anschwellen oder Platzen (Stomatolyse) der Zelle, wenn sie zu hoch sind.
  • Das Fluoreszenzauslesen wird durchgeführt, nachdem die Reaktion stattgefunden hat oder nach einem bestimmten Zeitraum. Typischerweise wird die Reaktion durch Untertauchen des Reaktionsgefäßes in Eis und Wasser abgestoppt, das die Zellen auf ungefähr 0°C abkühlt. Das Abtasten für einen oder mehrere Reaktionszustände durch Fluoreszenzbestimmungen bestätigt die Spaltung der Indikatorgruppe durch das Enzym.
  • Die Fluoreszenzbestimmungen können auf einem Image Analysis System (IAS) oder Flusszytometer (FC) oder solchen anderen Instrumenten durchgeführt wer den, welche zu Fluoreszenzbestimmungen in der Lage sind. Das IAS ist ein Mikroskop basiertes System, das Fluoreszenz mischt, das dem Fachmann bekannt ist. Ein repräsentatives Beispiel eines IAS ist das MetamorphTM von Universal Imaging Corporation, West Chester, Pennsylvania. Die Struktur und der Betrieb von Flusszytometern ist ebenfalls in der Literatur gut dokumentiert. Alternativen zu herkömmlichen FC schließen Slit-Scan FC und Stopped-Flow FC ein. Die Art des Instruments, das zur Durchführung der hier beschriebenen Experimente in den Beispielen verwendet wurde, war ein Flusszytometer (zum Beispiel ein Coulter Profile® Flusszytometer, hergestellt von Couter Corporation Miami, Florida). Dieses Flusszytometer misst die Fluoreszenz über die gesamte Zelle. Flusszytometrische Verfahren, welche die Fluoreszenz in nur einem Teil der Zelle messen, wie Slit-Scan Flusszytometrie, haben eine signifikante Nützlichkeit in der Erfindung, weil die Hintergrundfluoreszenz signifikant reduziert ist, wenn Messungen auf die Region der Zelle fokussiert sind, wo das Enzym lokalisiert ist.
  • Die Fluoreszenzbestimmungen können auch durch ein Spektrofluorometer aufgenommen werden, welches die Fähigkeit besitzt, die sehr niedrigen Fluoreszenzmengen, die durch den Assay erzeugt werden, zu messen. Das Spektrofluorometer wird auf die Anregungs- und Emissionswellenlängen eines bestimmten verwendeten Indikators eingestellt. Bevorzugte Verbindungen, wie Rhodamin 110 und Fluorescein haben Anregungs- und Emissionswellenlängen jeweils von ungefähr 495 bis 498 nm (Anregung) und 520 bis 525 nm. Das Modell 8000C Photonzählspektrofluorometer, das durch die SLM Company, einem Tochterunternehmen von Milton Roy (Chicago, Illinois) hergestellt wurde, wurde verwendet.
  • Das Flusszytometer kann zusätzliche Messungen zusätzlich zu einer Einzelwellenlängen Fluoreszenzmessung durchführen. Die Flusszytometer können ausgestattet sein, um Fluoreszenz bei zwei oder mehr getrennten Wellenlängen zu messen. Solche Auslesungen sind nützlich, um erfindungsgemäße Assays durchzuführen, wenn mehr als eine Assay-Verbindung verwendet wird, oder für die Verwendung von Zelloberflächenmarkern, wie monoklonalen Antikörpern, um den Zellphänotyp zu bestimmen.
  • VI. Assay-Protokolle
  • Bevorzugte Probenpräparationen, durch die Enzyme unter Verwendung der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Reagenzien untersucht werden können, wurden entwickelt. Die Beispiele dieser Probenpräparationen können verändert werden, und sie sind hier eingeschlossen, um jene Verfahren zu offenbaren, die gegenwärtig bevorzugt sind. Probenpräparationen können in vier verschiedene Verfahren aufgeteilt werden, die durch die Beispiele 1, 2, 3 und 4 dargestellt sind, die jeweils in den 1A, 1B, 1C und 1D gezeigt sind. Die Wahl der Probenpräparation ist abhängig von dem Benutzer und dem Analyten. Die vier Verfahren sind:
  • Beispiel 1
  • Untersuchung von Leukozyten oder Gewebezellen mit Erythrozytenkontamination mit Postlysieren
  • Eine Probe, die aus Gesamtblut (in EDTA, Heparin oder ACD) oder dissoziiertem Gewebe oder Körperflüssigkeiten (Synovialflüssigkeit) oder Zellkulturmedium besteht, wird erhalten und in einer Weise gelagert, so dass sie nicht die Lebensfähigkeit verringert. Die Probe wird ausreichend gewaschen, um Plasma, Medium, Körperflüssigkeit, Zelltrümmer und extrazelluläre Enzyme zu entfernen. Das Waschmedium besteht aus einer physiologisch balancierten gepufferten Salzlösung. Die gewaschenen Zellen werden bei 37°C inkubiert. 50 ml der Probe und 25 ml des Substratmediums werden miteinander gemischt und bei 37°C für einen vorgegebenen Zeitraum inkubiert. Am Ende des Inkubationszeitraums werden ungewünschte Zellen mit einem lytischen Reagenz lysiert, d.h. Erythrozyten werden entfernt. Geeignete lytische Systeme sind Q-PrepTM, eine saure Lyse (Ameisensäure/Quench), ErythrolyseTM (saure Lyse/Detergenz/Quench) oder hypotonisches Ammoniumchlorid. Die Probe wird anschließend hinsichtlich Fluoreszenz gemessen. Die genannten lytischen Systeme sind kommerziell von Coulter Corporation, Miami, Florida erhältlich.
  • Beispiel 2
  • Untersuchung von Leukozyten oder Gewebezellen mit Erythrozytenkontamination mit Prälysieren
  • Eine Probe, die aus Gesamtblut (in EDTA, Heparin oder ACD) oder dissoziiertem Gewebe oder Körperflüssigkeiten (Synovialflüssigkeit) oder Zellkulturmedium besteht, wird erhalten und in einer Weise gelagert, so dass sie nicht die Lebensfähigkeit verringert. Ungewünschte Zellen, d.h. Erythrozyten, werden mit einem lytischen Reagenz lysiert. Geeignete lytische Systeme sind saure Lyse (Ameisensäure/Quench), IVCS Lyse (quaternäre Ammoniumsalze)/Quench oder hypotonisches Ammoniumchlorid. Die Probe wird ausreichend gewaschen, um Plasma, Medium, Körperflüssigkeit, Zelltrümmer und extrazelluläre Enzyme zu entfernen. Das Waschmedium besteht aus einer physiologisch balancierten gepufferten Salzlösung. Die gewaschenen Zellen werden bei 37°C inkubiert. 50 ml Probe und 25 ml Substratmedium werden miteinander gemischt und bei 37°C für einen vorgegebenen Zeitraum inkubiert. Am Ende des Inkubationszeitraums wird die Probe dann hinsichtlich Fluoreszenz gemessen.
  • Beispiel 3
  • Untersuchung von Plättchen, Erythrozyten, Leukozyten, dissoziiertem Gewebe, Körperflüssigkeiten und Zellkulturmedium
  • Eine Probe, die aus Gesamtblut (in EDTA, Heparin oder ACD) oder dissoziiertem Gewebe oder Körperflüssigkeiten (Synovialflüssigkeit) oder Zellkulturmedium besteht, wird erhalten und in einer Weise gelagert, so dass sie nicht die Lebensfähigkeit verringert. Die Probe wird ausreichend gewaschen, um Plasma, Medium, Körpenlüssigkeit, Zelltrümmer und extrazelluläre Enzyme zu entfernen. Das Waschmedium besteht aus einer physiologisch balancierten gepufferten Salzlösung. Die gewaschenen Zellen werden bei 37°C inkubiert. 50 ml Probe und 25 ml Substratmedium werden miteinander gemischt und bei 37°C für einen vorgegebe nen Zeitraum inkubiert. Am Ende des Inkubationszeitraums wird die Probe dann hinsichtlich Fluoreszenz gemessen.
  • Beispiel 4
  • Untersuchung von Plättchen, Erythrozyten, Leukozyten, dissoziiertem Gewebe, Körperflüssigkeiten und Zellkulturmedium unter Verwendung einer mechanischen Trennung um eine Zellpopulation zu isolieren
  • Eine Probe, die aus Gesamtblut (in EDTA, Heparin oder ACD) oder dissoziiertem Gewebe oder Körperflüssigkeiten (Synovialflüssigkeit) oder Zellkulturmedium besteht, wird erhalten und in einer Weise gelagert, so dass sie nicht die Lebensfähigkeit verringert. Eine mechanische Trennung, um eine spezifische Zellpopulation zu isolieren, wird durchgeführt, d.h., Ficoll, differenzielle Zentrifugation, differenzielle Präzipitation. Die Probe wird ausreichend gewaschen, um Plasma, Medium, Körperflüssigkeit, Zelltrümmer und extrazelluläre Enzyme zu entfernen. Die gewaschenen Zellen werden bei 37°C inkubiert. 50 ml Probe und 25 ml Substratmedium werden miteinander gemischt und bei 37°C für einen vorgegebenen Zeitraum inkubiert. Am Ende des Inkubationszeitraums wird die Probe dann hinsichtlich Fluoreszenz gemessen.
  • Die Instrumente, die verwendet werden, um Fluoreszenz zu detektieren, sind das Flusszytometer oder Fluoreszenzmikroskop. Es gibt vier verschiedene Instrumentkonfigurationen für das Flusszytometer A, B, C und D. Irgendeine der vier Konfigurationen kann mit irgendeiner der Probenpräparationen, die oben beschrieben sind, verwendet werden. Die Wahl, welche Konfiguration gewählt wird, hängt von dem Nutzer und der gewünschten Information, die erhalten werden soll, ab. Die vier Konfigurationen sind:
  • Konfiguration A:
  • Die Konfiguration A analysiert die Zellen nach Größe, Granularität und Einzelfarbe. In der ersten Konfiguration trennt das Flusszytometer die Zellen nach Größe und Granularität. Die Aktivität eines Enzyms wird dann unter Verwendung der Reagenzverbindung untersucht. Zwei Proben werden zu verschiedenen Zeiten verarbeitet, und die Reaktion wird abgestoppt. Die Differenz in der Fluoreszenz erlaubt die Berechnung einer Rate. Bevorzugte Gesamtpopulationszahlen sind 500 bis 500.000 Zellen. Die Verwendung von Lichtstreuung oder Hämatologieparametern liefert die Größen- und Granularitätstrennung. Intensitätsbitmap von gewünschten Populationen und die Bestimmung von Fluoreszenzaktivität durch Einzelmesspunkt oder Mehrfachpunktmessung kann verwendet werden. Das Bestimmen der Zahl, des Prozentsatzes und der Fluoreszenzintensität einer vielfach modalen Population stellen die enzymatische Aktivität dar.
  • Konfiguration B:
  • Die Konfiguration B analysiert die Zellen nach Größe, Granularität und zwei Farben. In der zweiten Konfiguration trennt das Flusszytometer die Zellen nach Größe und Granularität. Die Zellmorphologie wird durch einen Fluoreszenz-Assay mit einem monoklonalen Antikörpermarker bestimmt. Die Rate der Hydrolyse der Assay-Verbindung wird dann bestimmt. Die bevorzugten Gesamtpopulationszahlen sind 500 bis 500.000 Zellen. Die Verwendung von Streulicht oder Hämatologieparametern liefert eine Größen- und Granularitätstrennung. Intensitätsbitmap von gewünschten Populationen und Bestimmung von Fluoreszenzaktivität durch Einzelmessung oder Mehrfachpunktmessung kann verwendet werden. Das Bestimmen der Zahl, des Prozentsatzes und der Fluoreszenzintensität einer vielfach modalen Population stellt die enzymatische Aktivität dar. Die Analyse ist eine 2-Farbenanalysenmessung der enzymatischen Aktivität in einer Farbe und der Oberflächenmarker Antikörperzellmorphologie in der anderen Farbe.
  • Konfiguration C:
  • Die Konfiguration C analysiert die Zellen nach Größe, Granularität, zwei Farben und Hintergrundfluoreszenz. Die Konfiguration 3 ist eine Modifikation des Duque Verfahrens. Duque, R. E. "Flow Cytometric Analysis of Lymphomas and Acute Leukemias", Annals of the New York Academy of Sciences, Clinical Flow Cytometry, 677, S. 309–325 (20. März 1993). Die Größe und Granularität der Zelle werden durch ein Flusszytometer unter Verwendung von Streulicht und/oder mit Oberflächenmarkern, wie monoklonalen Antikörpern getrennt. Eine Reihe von Zellpopulationen werden bestimmt, mit Rearranagement des Histogramms, um die erkrankten und normalen Zellen zu identifizieren. Die Aktivität des Enzyms wird dann untersucht. Die bevorzugten Gesamtpopulationszahlen sind 500 bis 500.000 Zellen. Die Verwendung von Streulicht oder Hämatologieparametern liefert die Größen- und Granularitätstrennung. Intensitätsbitmap von gewünschten Populationen und die Bestimmung von Fluoreszenzaktivität durch Einzelmesspunkt oder Mehrfachpunktmessung kann verwendet werden. Das Bestimmen der Zahl, des Prozentsatzes und der Fluoreszenzintensität einer vielfach modalen Population stellt die enzymatische Aktivität dar. Die Analyse ist eine 2-Farbenanalyse, welche die enzymatische Aktivität in einer Farbe und die Oberflächenmarker Antikörperzellmorphologie in der anderen Farbe misst. Hintergrundfluoreszenzdaten über die Größe und Granularität, um die Zahl und den Prozentsatz der erkrankten Zellen zu bestimmen.
  • Konfiguration D:
  • Die Konfiguration D analysiert die Aktivität einer Population von Zellen über die Zeit. Bevorzugte Gesamtpopulationszahlen sind 500 bis 500.000. Die Verwendung von Streulicht oder Hämatologieparametern liefert eine Größen- und Granularitätstrennung. Intensitätsbitmap von gewünschten Populationen und die Bestimmung von Fluoreszenzaktivität durch Einzelmesspunkt oder Mehrfachpunktmessung kann verwendet werden. Die Bestimmung der Zahl, des Prozentsatzes und der Fluoreszenzintensität einer vielfach modalen Population stellt die enzymatische Aktivität dar. Die Analyse ist eine 2-Farbenanalyse, welche die enzymatische Aktivität in einer Farbe und die Oberflächenmarker Antikörperzellmorphologie in der anderen Farbe misst.
  • VII. Datenanalyse
  • Das Untersuchen von Blastzellpositionen in einem Histogramm unter Verwendung von Vorwärts- und Seitwärtsstreulichtstreuung zeigt, dass ein Großteil der Blastzellen mit Lymphozyten- und Monozytenzellen colokalisiert, aber hauptsächlich mit den Lymphozytenzellen.
  • Es wurde weiterhin gefunden, dass normale Lymphozyten enzymatische Mengen unterschiedlich sind, wenn sie mit Blastzellen verglichen werden, was die Möglichkeit liefert, normale lymphatische Zellen von Blastzellen durch diese Erfindung zu trennen. Zusätzlich wurde bestimmt, dass eine Reihe von Enzymen verwendet werden kann, um die Blastzelllinie zu bestimmen.
  • Blastzellen können von lymphozytischem, monozytischem oder granulozytischem Ursprung sein. Zum Beispiel haben jene, die von granulozytischem und monozytischem Ursprung sind, große Mengen an Oxidoreduktase Enzymaktivität, die von NADPH Oxidase und Myeloperoxidase innerhalb der Zelle stammt. Deshalb führt das Aussetzen der Zellprobe gegenüber einem Assay-Reagenz, um die Oxidoreduktase Enzymaktivität zu identifizieren und das Bitmapping des lymphozytischen Bereichs zu einem Fluoreszenzhistogramm, das bimodal ist, wenn sowohl normale Lymphozyten als auch ein Blast von granulozytischer oder monozytischer Abstammung anwesend ist.
  • Weiterhin führt das Aussetzen der Zellprobe gegenüber Assay-Reagenzien, die verwendet werden, um Esterase Enzymaktivität zu messen, zu Fluoreszenzhistogrammen, welche die Bestimmung von Monoblast oder Myeloblasten erlauben. Insbesondere wenn die Ergebnisse der zwei Assay-Reagenzien, die für das Messen von Esteraseaktivität verwendet werden, zu Fluoreszenzhistogrammen mit Fluoreszenz Hauptkanalbereichen führen, die verschiedene Intensitäten auf weisen, zeigt dies die Anwesenheit von Monoblastzellen. Wenn jedoch die Ergebnisse der zwei Assay-Reagenzien, die zum Messen der Esteraseaktivität verwendet werden zu Fluoreszenzhistogrammen mit Fluoreszenz Hauptkanalbereichen führt, die den gleichen Fluoreszenz Hauptkanalbereich aufweisen, zeigt dies die Anwesenheit von Myeloblastzellen.
  • Mindestens drei Datenmuster können auftreten; alle Zellen besitzen eine niedrige Intensität an Fluoreszenz in dem Histogramm, alle Zellen besitzen eine hohe Intensität an Fluoreszenz in dem Histogramm, oder eine bimodale Verteilung wird in dem Fluoreszenzhistogramm anwesend sein. In einem bimodalen Histogramm kann der Prozentsatz der Blastzellen bestimmt werden durch Verwenden der Fluoreszenzzahl in einer gewählten Region, in der sich die Blastzellen aufhalten und Teilen durch eine Gesamtzahl der Leukozyten in der Leukozyten Bitmapregion von den FS und SS Histogrammzeiten 100. Die Bestimmung des Prozentsatzes der Blastzellen, die durch Flusszytometrie mit der Assay-Verbindung erhalten werden, korreliert mit dem Prozentsatz der Blastzellen, die durch das Wright Färbeverfahren erhalten werden. Dies ist in 2 gezeigt, die eine Korrelation zwischen Wright Färbung gegenüber dem erfindungsgemäßen Verfahren zeigt. In einer ähnlichen Weise können Lichtstreuungseigenschaften verwendet werden, und die Assay-Reagenzien 3',6'-Fluoresceindibutyrat (FDB), 3',6'-Fluoresceindichloracetat (FDCIAc), Flurescein-ϑ-D-diglucoronid, 3',6'-Fluoresceindiacetat (FDA), 3',6'-Fluoresceindiacetatnatriumfluorid (FDA-NaF) und 3',6'-Fluoresceindiphosphatammoniumsalz (FDP-AS) können verwendet werden, um Blastzellen durch Fluoreszenzenzymaktivität durch Vergleichen mit der Reihe zu unterscheiden, um bösartige Zellen weiter zu differenzieren.
  • Die gemessene Fluoreszenzintensität kann von dem Fluoreszenzhautkanal (im Peak oder integrierten Modus) zu MESF (Moleküle von äquivalentem löslichen Fluorochrom, Flow Cytometry Standards Corp., San Juan, Puerto Rico) oder Internationalen Einheiten von Hydrolyse pro Zelle umgerechnet werden.
  • Die folgenden detaillierten Beispiele beabsichtigen, diese Erfindung darzustellen, aber nicht ihren Schutzbereich zu beschränken.
  • Beispiel 5
  • Bestimmung von Monoblastzellen
  • A. BENÖTIGTE MATERIALIEN
    • 1) 1X Hanks balancierte Salzlösung (HBSS) (siehe INTERFERIERENDE SUBSTANZEN Nr. 1), pH 7,40–7,55, kein Natriumbicarbonat
    • 2) Phosphat gepufferte Salzlösung* (PBS), pH 7,00–7,55, pyrogenfrei
    • 3) Pipetten
    • 4) Pipettenspitzen
    • 5) Glassröhrchen (12 × 75 mm Borsilicat)
    • 6) 37°C Wasserbad
    • 7) zerstoßenes Eis
    • 8) Q-Prep und Reagenzien (Coulter Corporation)
    • 9) pyrogenfreies Wasser
    • 10) COULTER EPICS® Flusszytometriesystem
    • 11) Zentrifuge
    • 12) Assay-Reagenzien, die verwendet wurden, um Esterase Enzymaktivität zu identifizieren
    • a. DCFH-DA (3',6'-Fluoresceindichloracetat)
    • b. FDA (3',6'-Fluoresceindiacetat)
    • c. FDA-NaF (3',6'-Fluoresceindiacetatnatriumfluorid)
    • d. FDCIAc (3',6'-Fluoresceindichloracetat)
    • e. FDB (3',6'-Fluoresceindibutyrat)
  • B. VERFAHREN
    • 1) Instrumentenvorbereitung: Verifizieren der flüssigen Integrität des EPICS XL Flusszytometriesystems (oder eines Äquivalents) unter Verwendung von Flow-CheckTM Fluorosphären (Coulter Corporation). Für gleichbleibende Ergebnisse muss die Hochspannung täglich unter Verwendung eines Fluorosphärenstandards angelegt werden. Zum Beispiel: Analyse einer gewaschenen Gesamtblutprobe, Einstellen der LFL1 Hochspannung, um die Flow-SetTM Fluorosphären (Coulter Corporation) in den Zielhauptkanal 22,7 ± 0,30 des Fluoreszenzhistogramms zu setzen. Verwenden dieser Hochspannung, um die Assay-Reagenzien zu analysieren, welche den gleichen Zielhauptkanal benötigen. Für FDCIAc und FDB wird Hochspannung verwendet, um die Flow-Set Fluorosphären in den Zielhauptkanal 6,0 ± 0,1 zu setzen. Die benötigte Hochspannung wird täglich erneut etabliert, um die Standardfluorosphäre in denselben Zielkanal zu setzen. Wenn auf eine neue Charge von Flow-Set Fluorosphären gewechselt wird, wird die gegenwärtige Charge mit der neuen Charge verglichen, um neue durchschnittliche Zielwerte aufzunehmen.
    • 2) Probenherstellung: tägliches Überprüfen des pH-Werts der HBSS und der PBS. Die Puffer werden bei einem pH-Wert von 7,40–7,55 eingestellt. Die Proben werden in entweder HBSS oder PBS (10:1) gewaschen. Die Proben werden bei 200 g für 10 Minuten zentrifugiert. Das Waschverfahren wird zweimal wiederholt. Das zweite und dritte Waschen für Gesamtblutproben kann bei 500 ± 200 g für 5 Minuten zentrifugiert werden.
    • 3) Das Zellpellet wird sanft in entweder HBSS oder PBS zu einer Zellkonzentration von 3,0 ± 0,5 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Nicht vortexen.
    • 4) Markieren des/der 12 × 75 mm Glasteströhrchen mit dem entsprechenden Namen des Assay-Reagenzes. Markieren eines Leerröhrchens pro Probe. Hinzufügen von 50 μl der gewaschenen Probe zu jedem der markierten Röhrchen.
    • 5) Verfahren: die Röhrchen werden in ein 37°C Wasserbad für 5–10 Minuten gesetzt. Sobald die Proben aufgewärmt sind, müssen sie die Analyse durch laufen. Vorbereitete Röhrchen müssen innerhalb von 30 Minuten der Inkubation mit dem Assay-Reagenz, wie in Schritt 7 definiert, analysiert werden.
    • 6) Unmittelbar vor der Verwendung wird das Assay-Reagenz rekonstituiert, wenn es in lyophilisierter Form vorliegt.
    • 7) Eine 37°C Reaktionstemperatur wird aufrechterhalten, indem das/die Probenröhrchen in dem Wasserbad stehen bleiben während des Hinzufügens des Assay-Reagenzes. 25 μl HBSS oder PBS werden zu dem Leerröhrchen hinzugefügt. 25 μl des Assay-Reagenzes werden zu dem/den markierten Röhrchen hinzugefügt.
    • • Anmerkung: Das/die Assay-Reagenzien sollten zu den Röhrchen in dem Wasserbad in Intervallen von ungefähr 15 Sekunden hinzugefügt werden, um die exakten Inkubationszeiten für jedes Röhrchen aufrechtzuerhalten.
    • • Es wird nach jedem Hinzufügen schnell mit der Hand gemischt. Das Röhrchen wird in das Wasserbad zurückgestellt und DCFH-DA, FDA und FDA-NaF werden bei 37°C für einen gleichen Zeitraum für jedes Assay-Reagenz inkubiert. Der Zeitraum für diese Assay-Reagenzien kann von 2 bis 10 Minuten betragen, vorzugsweise für 4 bis 6 Minuten. In diesem Beispiel wurde jedes Assay-Reagenz für 5 Minuten inkubiert. Die FDCIAc und FDB Assay-Reagenzien werden bei 37°C für einen gleichen Zeitraum für jedes Assay-Reagenz inkubiert. Der Zeitraum für diese Assay-Reagenzien kann von 15 Sekunden bis 2 Minuten betragen, vorzugsweise von 30 bis 90 Sekunden. In diesem Beispiel wurde jedes Assay-Reagenz für 60 Sekunden inkubiert.
    • • Jedes Röhrchen wird nach dem Ende seiner Inkubationszeit herausgenommen und auf zerstoßenes Eis für ein Minimum von 3 Minuten gestellt. Die Röhrchen sollten auf Eis verbleiben bis mit den Schritten 8 und 9 fortgefahren wird. Diese Röhrchen können für bis zu 20 Minuten auf Eis gehalten werden.
    • • Es wird unmittelbar von dem gestoßenen Eis zu den Schritten 8 und 9 für jedes Röhrchen fortgefahren. (Zur Übereinstimmung sollte jedes Röhrchen zu denselben Zeitintervallen wie das Hinzufügen des Assay-Reagenzes in sowohl 37°C als auch bei den Eisinkubationsschritten herausgenommen werden.)
    • 8) Für eine gewaschene Gesamtblutprobe werden die Röhrchen auf einem Q-Prep Arbeitsstationen Instrument (Coulter Corporation) verarbeitet. Die Q-Prep Verfahren und Richtlinien zum Herstellen von Gesamtblutproben werden beachtet. Bei Proben, die kein Gesamtblut sind, werden die Zellen in 1 ml kaltem HBSS oder PBS resuspendiert.
    • 9) Hergestellte Röhrchen sollten unverzüglich bis sie analysiert werden auf Eis gestellt werden.
    • 10) Zur Analyse wird ein Streumuster etabliert [vorwärts gerichtete Streuung (FS) vs. seitwärts gerichtete Streuung (SS)], und Teilen der interessierenden Population(en). Es wird überprüft, ob das Streumuster repräsentativ ist für die zu analysierende Probe. Zum Beispiel sollte das Erhalten eines typischen drei Populationsstreumusters für eine normale Gesamtblutprobenpräparation erwartet werden. Die Grenze, die vorwärts gerichtete Streuzunahme und die seitwärts gerichtete Streuhochspannung werden eingestellt, um die drei Teile differenziell zu zeigen. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der interessierenden Populationen wird bestimmt unter Verwendung der im Schritt 1 etablierten Hochspannung. Der Leerwert wird nur als eine Richtlinie verwendet, um sicherzustellen, dass eine positive Fluoreszenz höher in dem Durchschnittskanal erscheint als der Leerwert.
  • C. ERGEBNISSE
  • In diesem Beispiel colokalisieren die Monoblastzellen innerhalb des Lymphozyten Bitmap und zeigen einen höheren Fluoreszenz Durchschnittskanalbereich als die Lymphozyten mit dem DCFH-DA Assay-Reagenz. Wenn die Ergebnisse der FDA und FDA-NaF Assay-Reagenzien miteinander verglichen werden, wird ein Abfall des Fluoreszenz Durchschnittskanalbereichs in dem FDA-NaF Esterase-Assay gezeigt. Die FDCIAc und FDB Esterase-Assays zeigen einen Fluoreszenz Durchschnittskanalbereich, der proportional zu der Enzymaktivität ist. Wenn die Probe Monoblasten aufweist, dann wird der FDB-Assay einen Fluoreszenz Durchschnittskanalbereich aufweisen, der größer ist als der Fluoreszenz Durchschnittskanalbereich der Lymphozytenzellen in der Zellprobe. Der FDCIAc-Assay wird einen Fluoreszenz Durchschnittskanalbereich aufweisen, der niedriger oder gleich ist zu den Lymphozytenzellen in der Zellprobe.
  • Unter Verwendung der Wright Färbung und eines 400 Zahldifferenzial zeigt, dass Blastzellen anwesend sind.
  • D. INTERFERIERENDE SUBSTANZEN
    • 1) Pyrogene, die in destilliertem Wasser gefunden werden, können Zellen des Immunsystems aktivieren, was zu veränderter Enzymaktivität führt. Es müssen immer pyrogenfreies Wasser, Puffer und Materialien verwendet werden.
    • 2) Zellsondenreagenzien sind derart formuliert, dass sie durch spezifische Enzyme hydrolysiert werden. Jedoch enthalten Zellen andere Enzyme, die hinsichtlich Hydrolyse des Enzymsubstrats konkurrieren. Es können Inhibitoren zugegeben werden, um die Spezifität weiter zu steigern. Rote Zelllysate und Plättchen können die Enzymaktivität von WBC Populationen beeinflussen.
    • 3) Gesamtblutproben können in Heparin, EDTA oder ACD gesammelt werden und sollten innerhalb von 6 Stunden nach dem Sammeln verarbeitet werden. Die Wahl eines Antikoagulanz sollte in Enzym-Assays in Betracht gezogen werden. Zum Beispiel chelatiert EDTA Metallionen, wie Zink, Calcium und Magnesium, welche die proteolytische Aktivität von einigen Enzymen beeinflussen können.
    • 4) Mononukleäre Trennungen und Gewebepräparationstechniken können zelluläre Enzyme aktivieren und die erhaltenen Ergebnisse verändern. Die Verwendung von enzymatischer Spaltung sollte in festen Gewebepräparationen vermieden werden.
    • 5) Zellpräparationen von lebenden Zellen liefern die genaueste Messung von zellulärer Enzymaktivität. Zellpopulationen von nicht lebenden Zellen können analysiert werden, aber sie können unterschiedliche Mengen an Aktivität gegenüber lebenden Zellen liefern. Gemischte Populationen von lebenden und nicht lebenden Zellen sind nicht empfohlen, weil sie die Endergebnisse verfälschen.
  • Beispiel 6
  • Bestimmung von Myeloblastzellen
  • Das Material und das Verfahren von Beispiel 5 wird wiederholt. Jedoch sind die Ergebnisse unterschiedlich. In diesem Beispiel colokalisieren die Myeloblastzellen innerhalb des Lymphozyten Bitmap und zeigen einen höheren Fluoreszenz Durchschnittskanalbereich als die Lymphozyten mit DCFH-DA Assay-Reagenz. Wenn FDA und FDA-NaF Assay-Reagenzien miteinander verglichen werden, wird der gleiche oder ungefähr der gleiche Fluoreszenz Durchschnittskanalbereich gezeigt. Die FDCIAc- und FDB-Esterase-Assays zeigen einen Fluoreszenz Durchschnittskanalbereich, der proportional zu der Enzymaktivität ist. Wenn die Probe Myeloblasten aufweist, dann wird der FDB-Assay einen Fluoreszenz Durchschnittskanalbereich von weniger oder gleich dem Fluoreszenz Durchschnittskanalbereich der Lymphozytenzellen in der Zellprobe aufweisen. Der FDCIAc-Assay wird einen Fluoreszenz Durchschnittskanalbereich aufweisen, der größer wäre als die Lymphozytenzellen in der Zellprobe.
  • 3A enthält Bitmap 1, der die FS, SS Region von Lymphozyten und Blastzellen ist. 3B ist ein Fluoreszenzhistogramm von Bitmap 1, das eine bimodale Fluoreszenzverteilung mit dem DCFH-DA Assay-Reagenz zeigt. Die Verwendung von Wright Färbung und ein 400 Zahldifferenzial zeigt, dass 17% Blastzellen anwesend sind. Durch Verwenden dieser Erfindung und Zählen von ungefähr 5000 Leukozyten, wurde bestimmt, dass 21,6% Blastzellen anwesend waren. 2 stellt die Identifizierung des Prozentsatzes der Myeloblastzellen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und eine Korrelation zu einer Wright Färbungsbestimmung des Prozentsatzes der Blastzellen dar.
  • Beispiel 7
  • Bestimmung von Lymphoblastzellen
  • Die Materialien von Beispiel 5 werden wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Assay-Reagenzien, die in diesem Beispiel verwendet wurden, DCFH-DA, FDB, FDP-AS und Fluorescein-ϑ-D-diglucoronid aufweisen. Das Verfahren von Beispiel 5 wird wiederholt, mit der Ausnahme, dass bei Verwendung von FDP-AS und Fluorescein-ϑ-D-diglucoronid eine Hochspannung verwendet werden sollte, um die Flow-Set Fluorosphären in den Zieldurchschnittkanal 22,7 ± 0,30 zu setzen, und in Schritt 7 sollte die Inkubationszeit für jedes Assay-Reagenz gleich lang sein. Die Zeiträume für diese Assay-Reagenzien können von 5 bis 15 Minuten, vorzugsweise von 8 bis 12 Minuten reichen. In diesem Beispiel wurde jedes Assay-Reagenz für 10 Minuten inkubiert.
  • In diesem Beispiel colokalisieren die Lymphoblastzellen innerhalb des Lymphozyten Bitmap und zeigen einen Fluoreszenz Hauptkanalbereich, der ungefähr gleich ist zu dem Fluoreszenz Hauptkanalbereich der Lymphozyten mit dem DCFH-DA Assay-Reagenz. Die FBS- und Fluorescein-ϑ-D-diglucoronid-Assays, wenn sie mit Lymphozyten verglichen wurden, zeigen eine bimodale Verteilung, in der die Blastzellen einen Fluoreszenz Durchschnittskanalbereich aufweisen, der niedriger ist als der Fluoreszenz Durchschnittskanalbereich der Lymphozytenzellen in der Zellprobe. Der FDP-AS Esterase-Assay zeigt einen Fluoreszenz Hauptkanalbereich, der proportional ist zu der Enzymaktivität. Wenn die Probe Lymphoblasten aufweist und wenn der FDP-AS Assay einen Fluoreszenz Hauptkanalbereich auf weist, der niedriger ist als der Fluoreszenz Hauptkanalbereich der Lymphozytenzellen in der Zellprobe, dann ist es keine T-Zelle.
  • 4A enthält Bitmap 1, der die FS, SS Region von Lymphozyten und Blastzellen ist. 4B ist ein Fluoreszenzhistogramm von Bitmap 1, das eine unimodale Fluoreszenzverteilung mit dem DCFH-DA Assay-Reagenz zeigt. Das unimodale Fluoreszenzhistogramm zeigt, dass die Blastzellen keine Myeloblasten sind. 5A enthält Bitmap 1, der die FS, SS Region von Lymphozyten und Blastzellen ist. 5B ist ein Fluoreszenzhistogramm von Bitmap 1, das eine bimodale Fluoreszenzverteilung mit der FDB-Assayverbindung zeigt. Das bimodale Fluoreszenzhistogramm zeigt, dass die Blastzellen lymphozytische Blastzellen sind.
  • Die Identität der Lymphoblastzellen wurde durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. Die Verwendung der Wright Färbung und ein 400 Zahldifferenzial zeigt, dass 34% Blastzellen anwesend sind. Unter Verwendung dieser Erfindung und durch Zählen von ungefähr 5000 Leukozyten wurde bestimmt, dass 38% Blastzellen anwesend waren.
  • Die Ergebnisse dieser Erfindung zeigen die Möglichkeit, Zelltypen basierend auf ihrer enzymatischen Aktivität aufzulösen.
  • Die Erfindung wurde unter Bezugnahme auf die bevorzugten Ausführungsformen beschrieben. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die Erfindung nicht beschränkt ist und der Schutzbereich der Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden Ansprüche anstelle der vorausgegangenen Beschreibung bestimmt werden sollten.

Claims (18)

  1. Verfahren zum Identifizieren von Leukozyten-verwandten Blastzellen in einer Körperflüssigkeits-Testprobe, welche von einem Individuum isoliert wurde, und welche metabolisch aktive Leukozytenzellen enthält, umfassend: (a) das Mischen eines ersten Assay-Reagenzes mit der Testprobe, welche die metabolisch aktiven Zellen enthält, um ein erstes Testzellengemisch zu bilden, wobei das erste Assay-Reagenz eine Assay-Verbindung umfasst, welche eine fluorogene Indikatorgruppe enthält, welche auf Grund ihrer Fähigkeit ausgewählt ist, einen nicht-fluoreszierenden ersten Zustand aufzuweisen, bevor das erste Assay-Reagenz mit einem Enzym innerhalb der Zellen reagiert, und einen fluoreszierenden zweiten Zustand aufzuweisen, welcher bei einer Wellenlänge von oberhalb 450 nm anregbar ist, nachdem das erste Assay-Reagenz mit dem Enzym innerhalb der Zelle reagiert, wobei das erste Assay-Reagenz eine geringere Fluoreszenz als die Auto- bzw. Eigenfluoreszenz einer metabolisch aktiven Zelle vor dem Reagieren mit dem Enzym innerhalb der Zelle aufweist, (b) das Beleuchten und das Anregen des ersten Testzellengemisches mit einem Lichtstrahl mit einer Wellenlänge von oberhalb von 450 nm, um zu bewirken, dass das Licht gestreut wird und das erste Testzellengemisch einen fluoreszierenden zweiten Zustand aufweist, (c) das Detektieren der Fluoreszenz und zweier Kanäle von Lichtstreuung der Zellen in dem ersten Testzellengemisch, und (d) das Korrelieren der Fluoreszenz und der Lichtstreuung der Zellen, um Leukozyten-verwandte Blastzellen zu identifizieren, welche in dem ersten Testzellengemisch enthalten sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Assay-Verbindung aus 3',6'-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA), Dihydrorhodamin 123 (DHR 123) und Nitroblue Tetrazolium ausgewählt ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Assay-Verbindung 3',6'-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, welches mindestens zwei Testproben verwendet, wobei eine zweite Testprobe zu einem zweiten Assay-Reagenz gegeben wird, um ein zweites Testzellengemisch zu bilden, wobei das zweite Assay-Reagenz mit einem Esteraseenzym reagiert und eine Assay-Verbindung umfasst, welche eine fluorogene Indikatorgruppe enthält, welche aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt ist, einen nicht-fluoreszierenden ersten Zustand aufzuweisen, bevor das zweite Assay-Reagenz mit einem Enzym innerhalb der Zellen reagiert, und einen fluoreszierenden zweiten Zustand aufzuweisen, welcher bei einer Wellenlänge von oberhalb 450 nm anregbar ist, nachdem das zweite Assay-Reagenz mit dem Enzym innerhalb der Zelle reagiert, wobei das zweite Assay-Reagenz eine geringere Fluoreszenz als die Eigenfluoreszenz einer metabolisch aktiven Zelle vor dem Reagieren mit dem Enzym innerhalb der Zelle aufweist, und wobei das zweite Testzellengemisch die in Anspruch 1 definierten Schritte (b) bis (d) durchläuft.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das zweite Assay-Reagenz 3',6'-Fluoresceindibutyrat (FDB) umfasst.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Blastzellen lymphoblastische Zellen sind.
  6. Verfahren nach Anspruch 3, welches mindestens drei Testproben verwendet, wobei eine dritte Testprobe zu einem dritten Assay-Reagenz gegeben wird, um ein drittes Testzellengemisch zu bilden, wobei das dritte Assay-Reagenz mit dem Esteraseenzym reagiert und einen Inhibitor enthält, welcher die Enzymaktivität von Zellen monozytischer Abstammung inhibiert, und wobei das dritte Assay-Reagenz eine Assay-Verbindung umfasst, welche eine fluorogene Indika torgruppe enthält, welche aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt ist, einen nichtfluoreszierenden ersten Zustand aufzuweisen, bevor das dritte Assay-Reagenz mit einem Enzym innerhalb der Zellen reagiert, und einen fluoreszierenden zweiten Zustand aufzuweisen, welcher bei einer Wellenlänge von oberhalb 450 nm anregbar ist, nachdem das dritte Assay-Reagenz mit dem Enzym innerhalb der Zelle reagiert, wobei das dritte Assay-Reagenz eine geringere Fluoreszenz als die Eigenfluoreszenz einer metabolisch aktiven Zelle vor dem Reagieren mit dem Enzym innerhalb der Zelle aufweist, und wobei das dritte Testzellengemisch die in Anspruch 1 definierten Schritte (b) bis (d) durchläuft.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das zweite und dritte Assay-Reagenz 3',6'-Fluoresceindiacetat (FDA) umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der in dem dritten Assay-Reagenz enthaltene Inhibitor Natriumfluorid ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Identität der Blastzellen monoblastische Zellen sind.
  10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Identität der Blastzellen myeloblastische Zellen sind.
  11. Verfahren nach Anspruch 3, welches mindestens vier Testproben verwendet, wobei eine dritte Testprobe zu einem dritten Assay-Reagenz gegeben wird, um ein drittes Testzellengemisch zu bilden, wobei das dritte Assay-Reagenz mit einem Phosphataseenzym reagiert, und eine vierte Testprobe zu einem vierten Assay-Reagenz gegeben wird, um ein viertes Testzellengemisch zu bilden, wobei das vierte Assay-Reagenz mit einem Glucuronidaseenzym reagiert, und wobei jedes des dritten und vierten Assay-Reagenzes eine Assay-Verbindung umfasst, welche eine fluorogene Indikatorgruppe enthält, welche aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt ist, einen nicht-fluoreszierenden ersten Zustand aufzuweisen, bevor das Assay-Reagenz mit einem Enzym innerhalb der Zellen rea giert, und einen fluoreszierenden zweiten Zustand aufzuweisen, welcher bei einer Wellenlänge von oberhalb 450 nm anregbar ist, nachdem das Assay-Reagenz mit dem Enzym innerhalb der Zelle reagiert, wobei das Assay-Reagenz eine geringere Fluoreszenz als die Eigenfluoreszenz einer metabolisch aktiven Zelle vor dem Reagieren mit dem Enzym innerhalb der Zelle aufweist, und wobei jedes des dritten und vierten Testzellengemisches die in Anspruch 1 definierten Schritte (b) bis (d) durchläuft.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das zweite Assay-Reagenz ein Material umfasst, welches aus 3',6'-Fluoresceindiacetat (FDA), 3',6'-Fluoresceindiacetat Natriumfluorid (FDA-NaF), 3',6'-Fluoresceindichloracetat (FDCLAc) und 3',6'-Fluoresceindibutyrat (FDB) ausgewählt ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 6 und 11, wobei das Streulicht Vorwärtsstreulicht und Seitwärtsstreulicht umfasst.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 6 und 11, wobei das Detektieren der Fluoreszenz weniger als 20 Minuten nach Zugeben des Assay-Reagenzes zu der Testprobe erfolgt.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 6 und 11, welches ferner das Lysieren der Erythrozyten von der Körperflüssigkeits-Testprobe umfasst.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 6 und 11, wobei die Zellen Lymphozyten- und Monozytenzellen umfassen.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 6 und 11, wobei die Körperflüssigkeits-Testprobe aus einer Zellsuspension, welche aus Lymphknoten, Knochenmark und Blut hergestellt ist, ausgewählt ist.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 6 und 11, wobei jedes Assay-Reagenz einen pH von ungefähr 4 bis 7,5 aufweist.
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