ES2265345T3 - Metodo de evaluacion de la actividad inhibidora de metaloproteinasa de la matriz in vivo. - Google Patents
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Abstract
Un método para evaluar un compuesto que muestra actividad inhibidora de metaloproteinasa de la matriz para una actividad inhibidora de metaloproteinasa de la matriz in vivo desplegada por el compuesto, que comprende someter a cimografía in situ un espécimen aislado de un mamífero, que ha recibido el compuesto y comparar el espécimen con un control, al que no se ha administrado ningún inhibidor de metaloproteinasa.
Description
Método de evaluación de la actividad inhibidora
de metaloproteinasa de la matriz in vivo.
La presente invención se refiere a un método
para la evaluación de un compuesto que exhibe actividad inhibidora
de metaloproteinasa de la matriz para una actividad inhibidora de
metaloproteinasa de la matriz in vivo desplegada por el
compuesto, y especialmente a un método para el mismo que comprende
utilizan cimografía in situ.
Metaloproteinasa de la matriz [MM] es un nombre
común de enzimas que son secretadas por células de cáncer o células
normales que rodean a cánceres, y que degradan las proteínas
extracelulares de la matriz tales como colágeno de una manera
dependiente de iones metálicos divalentes. En particular, se ha
informado con frecuencia que las colagenasas de tipo IV
(MMP-2, MMP-9) son responsables de
la vascularización acompañada por proliferación de tumor, y de la
invasión de tumor y metástasis.
Como un sistema de ensayo para medir la
metaloproteinasa de la matriz, se conoce un método de cimografía de
gelatina, en la que las actividades de enzima se determinan sobre la
base del grado de degradación de un substrato. El método requiere
electroforesis conductora y, por lo tanto, es laborioso en los
procedimientos y requiere mucho tiempo en la detección.
Como un sistema de ensayo sin electroforesis,
The FASEB Journal, vol. 9 Julio de 1995, páginas
974-980, ha propuesto un método de determinación
basado en el principio de cimografía, que comprende incorporar, en
agarosa, caseína o gelatina ligada a un compuesto fluorescente útil
como un substrato para proteasa, formando la mezcla en una membrana
fina sobre vidrio deslizante, luego colocando una sección de tejido
sobre la superficie de una membrana fina, incubando la membrana, y
observando la digestión del substrato por una microscopia
fluorescente. No obstante, el sistema, encuentra un inconveniente en
la reducción de la capacidad de reproducción, puesto que la agarosa
afecta a la digestión del substrato debido a la proteasa.
Recientemente, los solicitantes de la presente
solicitud han propuesto un método conveniente y exacto para medir
proteasas, que comprende poner en contacto una muestra que contiene
proteasa con una membrana fina formada sobre la superficie de un
soporte, comprendiendo dicha membrana fina un substrato de proteasa
y un agente de endurecimiento (WO97/32035), que han recibido algunos
signos de confianza. Por ejemplo, Proceedings of 5th Conference of
the Japanese Association for Metastasis Research (1996) describe que
la cimografía in situ basada en nuestro método ha sido
utilizada para detectar la actividad de geletinasa en el tejido y
las células, observando de esta manera que la proteasa destruía
tejidos de tumor. La cimografía in situ se describe en The
FASEB Journal, vol. 9 Julio de 1995, páginas
974-980 o similar.
Además, H. Nakamura y col. Cancer Research
59, 467-473 (1999) describe que la cimografía
in situ ha revelado de una manera similar que los inhibidores
MMP han mostrado la actividad de MMP en el cáncer de tiroides
humano.
humano.
Como se ha descrito anteriormente, se cree que
las MMPs, en particular la colagenasa de tipo IV, son responsables
de la vascularización acompañada por proliferación de tumor y por
invasión de tumor y metástasis. De acuerdo con ello, los inhibidores
de MMPs han sido un foco de atención a la vista del desarrollo de
agentes anti-cáncer y, de hecho, algunos de ellos
han sido ensayados clínicamente por algunas compañías
farmacéuticas.
La farmacoterapia se consigue sobre la condición
previa de que un fármaco utilizado en la terapia es efectivo y
seguro, y la condición previa es confirmada por evaluación de
fármaco, que está clasificada en sentido amplio en dos ensayos,
ensayo no clínico, tal como experimentación animal, y ensayo
clínico, en el que se ensayas seres humanos. Incluso agentes que son
efectivos en el ensayo no clínico, o tienen un mecanismo de acción
excelente no serían fármacos cuando los agentes no son efectivos en
pacientes. Ésta es la razón por la que se requiere el ensayo clínico
para evaluar la eficacia del fármaco en humanos.
En la evaluación de fármacos de inhibidores de
MMP por el ensayo clínico es difícil determinar con exactitud la
actividad in vivo de los inhibidores de MMP debido a que la
MMP está controlada inherentemente in vivo por inhibidores
endógenos, tales como RIMP-1 y -2 [Woesnner, J. F.
Jr., FASEB J. 5, 2145.54 (1991)]. Se sabe que el método de
inmunotintado, en el que se utiliza un anticuerpo específico de MMP,
es un método para detectar MMP (Int. J. Cancer, 56m
500-505 (1994)). No obstante, puesto que el
anticuerpo utilizado aquí reconoce a MMP de una manera en la que MMP
es meramente una proteína antígena, este método no permite
determinar si una proteína antígena reconocida por el anticuerpo
posee la actividad MMP o está inactivada por los inhibidores. La
cimografía de gelatina convencional disocia MMP de inhibidores
durante la electroforesis y, por lo tanto, el método no permite
tampoco la determinación exacta de la actividad inhibidora de
inhibidores MMP.
\newpage
A la vista de lo anterior, los presentes
inventores han investigado un método de verificación de la actividad
in vivo de inhibidores MMP y han encontrado que la cimografía
in situ hace posible determinar de una manera conveniente y
rápida la actividad inhibidora de MMP in vivo de inhibidores
de MMP.
En el primer aspecto, la presente invención se
refiere a un método para evaluar un compuesto que muestra actividad
inhibidora de metaloproteinasa de la matriz para una actividad
inhibidora de metaloproteinasa de la matriz in vivo
desplegada por el compuesto, que comprende someter a cimografía
in situ un espécimen aislado de un mamífero que ha recibido
el compuesto y comparar el espécimen con un control, al que no se ha
administrado ningún inhibidor de metaloproteinasa.
Específicamente, la presente invención se
refiere al método, en el que la cimografía in situ es
realizada utilizando una membrana fina que comprende gelatina o
colágeno junto con un agente de endurecimiento, y que tiene un
espesor entre 1 \mum y 20 \mum. Más específicamente, la
cimografía in situ se realiza
- (1)
- poniendo en contacto el espécimen aislado sobre la membrana fina que comprende un substrato de metaloproteinasa de la matriz;
- (2)
- incubando la muestra de membrana fina de espécimen;
- (3)
- tintando y luego decolorando la membrana fina; y
- (4)
- verificando el tono desarrollado sobre la membrana fina, y comparando el tono con el del control.
En el método de evaluación de la presente
invención, se prefiere que el substrato de metaloproteinasa de la
matriz sea gelatina o colágeno; que la membrana fina comprenda un
agente de endurecimiento; que la membrana fina tenga un espesor
entre 1 \mum y 20 \mum; y/o que el espécimen sea una sección de
tejido, con preferencia una sección de tejido liofilizado, que tiene
un espesor entre 2 \mum y 10 \mum, y la incubación se realiza
entre 20ºC y 50ºC, con preferencia entre 36ºC y 38ºC durante 2 a 18
horas.
En el segundo aspecto, la presente invención se
refiere a un método para evaluar un compuesto que muestra actividad
inhibidora de metaloproteinasa de la matriz para una actividad
inhibidora de metaloproteinasa de la matriz in vivo
desplegada por el compuesto, que comprende:
(1) poner en contacto un espécimen de un tejido
o un fluido aislado de un mamífero, al que se había administrado un
compuesto que muestra actividad inhibidora de metaloproteinasa de la
matriz, sobre una membrana fina que comprende un substrato de
metaloproteinasa de la matriz; (2) incubar la muestra de membrana
fina del espécimen; (3) tintar y luego decolorar la membrana fina; y
(4) verificar el tono desarrollado sobre la membrana fina.
En el tercer aspecto, la presente invención se
refiere a un método para evaluar un agente
anti-cáncer que muestra actividad inhibidora de
metaloproteinasa de la matriz para su actividad
anti-cáncer, que comprende someter a cimografía
in situ un espécimen aislado de un mamífero que ha recibido
el agente anti-cáncer, y evaluar una actividad
inhibidora de metaloproteinasa de la matriz in vivo
desplegada por el agente como un indicador de la actividad
anti-cáncer. En el método de la presente invención,
se prefiere que el substrato de metaloproteinasa de la matriz es
gelatina o colágeno; que la membrana fina comprenda un agente de
endurecimiento; que la membrana fina tenga un espesor de 1 \mum a
20 \mum; y/o que el espécimen sea una sección de tejido, con
preferencia una sección de tejido liofilizado, que tiene un espesor
entre 2 \mum y 10 \mum, y la incubación se realiza a 20ºC a
50ºC, con preferencia entre 36 y 38ºC, durante 2 a 18 horas.
En el cuarto aspecto, la presente invención se
refiere a un método para determinar cuantitativamente una actividad
inhibidora de metaloproteinasa de la matriz in vivo
desplegada por un compuesto que muestra actividad inhibidora de
metaloproteinasa de la matriz, que comprende someter a cimografía
in situ un espécimen aislado de un mamífero, cuyo mamífero ha
recibido el compuesto y comparar el tono del espécimen con el de un
espécimen de control aislado de un mamífero, al que no ha sido
administrado ningún inhibidor de metaloproteinasa.
Se ha conocido que no sólo MMP, sino también
muchas enzimas que degradan gelatina tal como tripsina, existen en
el cuerpo vivo. Por esta razón, ha sido difícil determinar de una
manera selectiva la actividad de inhibidores de MMP por medio de
cimografía in situ utilizando substratos de MMP, tal como
gelatina, como se utiliza en la presente invención. No se ha
conocido ningún método para determinar una actividad inhibidora de
metaloproteinasa de la matriz in vivo de inhibidores de
MMP.
Como se utiliza aquí "cimografía in
situ" significa un método in vitro útil para la
determinación de actividades de una proteasa, que no está implicada
en electroforesis. En la presente invención, esto se realiza
contactando sobre una membrana fina que comprende un substrato de
metaloproteinasa de la matriz con un espécimen aislado de un
mamífero que recibe un compuesto que muestra actividad inhibidora de
metaloproteinasa de la matriz (inhibidor MMP), y observar el
substrato MMP después de la expiración de un periodo de tiempo
definido, de manera que el inhibidor es evaluado para "actividad
inhibidora de MMP in vivo".
El término "mamífero" en la frase
"espécimen aislado desde un mamífero" significa un vertebrado
superior, con preferencia un ser humano, que ha sido administrado
con un inhibidor de MMP. El objeto del ensayo en este método es un
espécimen aislado del cuerpo vivo, que proporciona un resultado que
corresponde exactamente a una actividad inhibidora de MMP in
vivo de un inhibidor de MMP, que el inhibidor ejerce in
vivo.
El "Espécimen aislado" puede derivarse de
varios tejidos y fluidos y se varía en función de la eficacia o
indicación de inhibidores de MMP que deben administrarse a un
mamífero. Cuando, por ejemplo, un inhibidor de MMP está destinado
para un agente anti-cáncer, un espécimen es derivado
de muestras de tejido canceroso y tomado por operación quirúrgica o
examen histológico a partir de tejidos cancerosos, tales como cáncer
de mama, endometrioma, cáncer de cavidad bucal, cáncer de pulmón,
cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer epitelial del tracto
urinario, cáncer de colon, cáncer escamoso, cáncer de tiroides. Para
un agente anti-reumático, se utilizan membranas o
fluidos sinoviales, o tejidos óseos derivados de pacientes con
artritis reumatoide o artritis, mientras que para un agente para el
tratamiento de fallo cardíaco, se utilizarían tejidos cardíacos o
efusiones de los mismos derivados de pacientes con fallo cardíaco.
De esta manera, la presente invención se puede utilizar como métodos
para evaluar agentes anti-cáncer, agentes
anti-reumáticos, y agentes para el tratamiento de
fallo cardíaco.
La figura 1 es una imagen sustitutiva de dibujos
que muestra las micrografías bajo microscopio de luz (superior) del
carcinoma tintado con H. E. en el ratón que recibe un vehículo (A),
el ratón que recibe (-)BPHA (B), y el ratón que recibe BPHA (C) así
como la cimografía in situ relacionada con degradación de
gelatina (inferior).
La figura 2 es una imagen sustitutiva de dibujos
que muestra las micrografías bajo microscopio de luz (inferior) del
carcinoma tintado con H. E. en el ratón que recibe un vehículo (a),
y los ratones que reciben MMI-166
(b-e) así como la cimografía in situ
relacionada con degradación de gelatina (superior).
"Cimografía in situ" en la presente
invención comprende específicamente las etapas de:
- (1)
- poner en contacto el espécimen aislado sobre la membrana fina que comprende un substrato de metaloproteinasa de la matriz;
- (2)
- incubar la muestra de membrana fina del espécimen;
- (3)
- tintar y luego decolorar la membrana fina; y
- (4)
- verificar el tono desarrollado sobre la membrana fina.
A continuación se describe en detalle cada una
de las etapas.
"Poner en contacto el espécimen aislado sobre
la membrana fina que comprende un substrato de metaloproteinasa de
la matriz".
"Poner en contacto el espécimen aislado sobre
la membrana fina" significa que el retiro retirado es colocado o
fijado sobre la membrana fina, o el fluido tomado es goteado sobre
la membrana fina.
"Espécimen aislado" incluye secciones
congeladas que tienen un espesor entre 2 \mum y 10 \mum, con
preferencia entre 4 \mum a 8 \mum, que se preparan a partir de
muestras de tejidos que se congelan rápidamente, por ejemplo,
mediante el uso de nitrógeno líquido con un aparato para preparar
secciones congeladas. De una manera alternativa, se pueden utilizar
fluidos corporales, tales como sangre, saliva, fluido sinovial y
similar. En el caso de uso de fluido sinovial tomado de pacientes
con artritis reumatoide como un espécimen, se gotean aproximadamente
entre 5 y 50 \mul, con preferencia aproximadamente 20 \mul de
fluido sinovial sobre la membrana fina.
"Substrato ``MMP'' es un compuesto
macromolecular que es degradable por MMP, e incluye, por ejemplo,
gelatina, colágeno, proteoglicano, fibronectina, laminina, elastina
y caseína. Se prefiere gelatina, colágeno, fibronectina, elastina o
caseína, y más preferentemente gelatina o colágeno. MMP se describe,
por ejemplo, en Takashi Tsuruo ed.,""Molecular Mecanismo for
cancer metastasis", páginas 92-107 (1993) Medical
View Publusher e incluyen, pero no están limitados a proteasas,
tales como colagenaza intersticial (MMP-1),
gelatinasa A (MMP-2) y gelatinasa B
(MMP-9).
(MMP-9).
"Membrana fina que comprende un substrato de
MMP" significa aquéllas que están preparadas a partir de una
monocapa o una capa múltiple del substrato MMP como se ha descrito
anteriormente, que se forma sobre la superficie de un soporte. Los
detalles se describen en el documento WO97/32035. En resumen, la
membrana fina es una monocapa o una capa múltiple que tiene un
espesor entre 6 \mum y 20 \mum, en particular entre 8 \mum y
10 \mum, cuya capa se encuentra sobre un soporte, y la membrana
fina tiene con preferencia la superficie homogénea.
La membrana fina utilizada en el método de la
presente invención comprende con preferencia un agente de
endurecimiento. El agente de endurecimiento favorece el
endurecimiento de la membrana fina del substrato de MMP y/o previene
que se hinche la membrana fina formada. Los detalles del agente de
endurecimiento se describen en el documento WO97/32035. Los agentes
de endurecimiento comprenden agentes de endurecimiento de tipo vinil
sulfonilo. En el caso de gelatina, por ejemplo, es ventajoso mezclar
entre 0,1 y 20 mmol, con preferencia aproximadamente entre 0,3 y 10
mmol, de un agente de endurecimiento a 100 g de gelatina a la vista
de la capacidad de detección, aunque la cantidad de agentes de
endurecimiento no está particularmente limitada.
Además de los agentes que se muestran
anteriormente, otros componentes tales como tintes, pigmentos,
conservantes, estabilizadores o similares se pueden considerar
adecuados para preparar las membranas finas.
El "soporte" es con preferencia
transparente o semitransparente para permitir la observación de la
presencia de MMP en tejidos bajo un microscopio. Estos soportes
transparentes o semitransparentes incluyen un cristal, y una
película de plástico transparente o semitransparente compuesta por
tereftalato de polietileno o similar. Aunque el espesor del soporte
no está particularmente limitado, se prefiere un soporte de vidrio
que tiene un espesor similar al vidrio de deslizamiento (por ejemplo
entre 2 y 3 mm aproximadamente), mientras que se puede utilizar un
soporte de tereftalato de polietileno que tiene un espesor entre
aproximadamente 100 y 250 \mum.
Para preparar una "membrana fina y
soporte", se distribuye un substrato de MMP disperso en agua o un
disolvente orgánico, tal como acetona, metanol, etanol o una mezcla
de ellos, por ejemplo, sobre la superficie de un soporte, y luego se
seca. Como procedimientos para la dispersión, se pueden utilizar un
método de revestimiento por inmersión, un método de revestimiento
con rodillo, un método de revestimiento con cortina, un método de
revestimiento por extrusión, y similares, todos los cuales son
conocidos en la técnica. En el caso de que se utilice gelatina como
un substrato de MMP, la gelatina no está limitada a ninguna especie
particular, y se puede utilizar, por ejemplo, una gelatina ósea
bovina tratada con álcali, una gelatina de piel de cerdo tratada
con ácido, o
similar.
similar.
La "muestra de membrana fina del espécimen"
es una muestra que se obtiene después de fijar la sección de tejido
sobre la membrana fina, o goteando espécimen líquido sobre la
membrana fina, para poner en contacto un espécimen que contiene MMP
con la membrana fina.
"Incubar" significa que se deja estar una
muestra entre 20ºC y 50ºC, con preferencia entre 36ºC y 38ºC en un
baño con termostato, y la incubación se realiza con preferencia en
un baño húmedo con el fin de prevenir que se seque la membrana fina.
Por ejemplo, se incuban secciones de tejido a 37ºC durante 1 a 24
horas, con preferencia entre 2 y 18 horas, más preferentemente entre
4 y 8 horas aproximadamente, mientras que se incuban muestras de
líquido durante 0,5 a 12 horas, con preferencia entre 1 y 6
horas.
Cuando un espécimen contiene cualquier MMP que
se inactiva precisamente por inhibidores MMP, la proteasa degrada el
substrato de MMP en la membrana fina para formar la traza de
digestión allí.
La muestra de membrana fina del espécimen
obtenida en la etapa (2) se tinta con preferencia con una solución
de tinte. Las soluciones de tinte son aquéllas que tintan el
substrato de enzima, e incluyen Amido Black, Coomassie Blue, Ponceau
(Wako Pure Chemical Industries), Biebrich Acarlet (Aldrich). Se
prefiere utilizar una solución entre 0,5 y 2% de Amido Black.
Posteriormente, la membrana fina tintada es
decolorada con un agente decolorante adecuado, por ejemplo una
solución de metanol al 70% y ácido acético al 10% y agua.
La membrana fina tratada por las etapas que se
muestran anteriormente desarrollará tonos de coloraciones oscuras y
claras (gradiente) en función del rango de degradación del substrato
de MMP, puesto que no debería tintarse una zona en la que el
substrato de MMP se degrada. Tal tono es verificado por la
observación a simple vista o bajo un microscopio, o por análisis
cuantitativo utilizando un escáner de corredera, un microscopio
láser, o similar. El hecho de que la zona esté tintada muestra que
se está inactivando MMP por la acción de un inhibidor de MMP
administrado o por otras razones. La determinación de si la
inactivación es causada por la acción inhibidora de MMP o por otras
razones se realiza comparándola con un control, donde no se
administra inhibidor de MMP.
La presente invención se refiere a un método
para evaluar un inhibidor de MMP para una actividad inhibidora de
MMP in vivo desplegada por el compuesto. En primer lugar,
debe administrarse un inhibidor de MMP a un mamífero. Esto hace
posible evaluar una actividad in vivo de un inhibidor de MMP
en el momento en el que se administra el inhibidor a un paciente
durante el ensayo clínico. Las etapas siguientes se realizan
usualmente ajustando un intervalo de tiempo de 30 minutos a cuatro
horas después de la administración del inhibidor de MMP.
La presente invención comprende, además, un
método un agente anti-cáncer que muestra actividad
inhibidora de metaloproteinasa de la matriz para su actividad
anti-cáncer, que comprende someter a cimografía
in situ un espécimen aislado de un mamífero, cuyo mamífero ha
recibido el agente anti-cáncer, y evaluar una
actividad inhibidora de metaloproteinasa de la matriz in vivo
desplegada por el agente como un indicador de la actividad
anti-cáncer. La evaluación del fármaco para agentes
anti-cáncer en el ensayo clínico ha sido realizada
principalmente sobre la base de una efectividad de extensión de la
vida del paciente o síntomas subjetivos de pacientes, la presencia
o ausencia de regresión / metástasis de tumos, cantidad de
marcadores de tumor, o similar. No obstante, es difícil que esos
índices muestren si la transición de fármacos a la lesión es buena o
mala, y también proporcionan una selección fina de la dosis de
fármacos. Por otra parte, el método de evaluación para actividad
anti-cáncer de la presente invención, en el ensayo
clínico, permite determinar la dosis de agentes o el programa de
administración, determinar si el agente alcanza el tejido de cáncer
y proporciona un medio útil para seleccionar tipos de cáncer a
tratar.
Dicho método de este aspecto de la presente
invención se realiza también por cada una de las etapas descritas
anteriormente.
De acuerdo con los métodos de la presente
invención, se puede verificar si un cáncer a verificar es
dependiente de MMP, proporcionando de esta manera un método más
adecuado para el tratamiento de cánceres.
La presente invención se ilustra, además, por
los siguientes ejemplos, pero no está restringida por estos ejemplos
de ninguna manera.
En este ensayo, se utilizó el compuesto BPHA de
fórmula (I) que muestra la actividad inhibidora de MMP, y el
compuesto (-)BPHA de fórmula (II) que no muestra ninguna actividad
inhibidora MMP como compuestos de ensayo para inhibidores MMP.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| \hskip-1.5cm IC50 (nM) | |||
| Enzimas | BPHA | (-)BPHA | |
| MMP-1 | 974 | >1000 | |
| MMP-2 | 12 | >1000 | |
| MMP-3 | >1000 | >1000 | |
| MMP-4 | 975 | >1000 | |
| MMP-9 | 16 | >1000 | |
| MMP-14 | 17 | >1000 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron quince grados de piel de cerdo
tratada con ácido en 123 g de agua pura, y se añadieron a la
solución 1,2 ml de 1,2-bis(vinilsulfonil
acetamido)etano (4%) como un agente de endurecimiento. La
solución fue aplicada uniformemente a una película de tereftalato de
polietileno provista por debajo con una capa de gelatina para
obtener una membrana seca que tiene un espesor de aproximadamente 7
\mum, y la membrana se secó para obtener una membrana fina de
gelatina. La membrana fina de gelatina fue almacenada a temperatura
ambiente hasta el uso.
Se utilizó una línea de células de cáncer de
pulmón humano Ma44 (CANCER RESEARCH 59, 1231-35
(1999)), que se conocía que producía MMP-2 en una
cantidad grande. Se transplantaron intraperitonealmente ratones
desnudos (de seis semanas de edad, hembras, CLEA Japan, Inc.) con 1
x 105 Ma44 células, y 14 días más tarde, se administró BPHA o
(-)BPHA oralmente a los animales a 200 mg/kg. Como control se
administró de una manera similar un vehículo (una solución salina
fisiológica que contenía 0,4% de Tween80, 0,5% de carboximetil
celulosa y 0,9% de alcohol bencílico). Dos horas después de la
administración, se realizo la autopsia de los ratones portadores de
cáncer para retirar la masa de cáncer formada en la pared abdominal
y el mesenterio, y la masa fue sometida al experimento de cimografía
in situ.
La masa de tumor fue incrustada en compuesto OCT
(SAKURA), y se utilizó entonces Microtone / Cryostat TISSUE TEK II
(Miles-Sankyo) para preparar secciones liofilizadas
que tienen un espesor de 8 \mum. Las secciones liofilizadas fueron
colocadas lentamente sobre la membrana fina de gelatina previamente
preparada para dar muestras, y luego las membranas fueron colocadas
en un balo húmedo para prevenir que se secaran, seguido por dejar
las membranas en reposo en una incubadora a 37ºC. Después de
reaccionar durante 3,5 horas, las membranas finas fueron extraídas,
y tintadas con una solución Amido Black al 1% (Wako Pure Chemical
Industries) durante 15 minutos. Posteriormente, las membranas
fueron tratadas con una solución decolorante (70% de metanol, 10% de
ácido acético) durante 10 minutos.
El tejido canceroso sobre la membrana fina fue
observado bajo microscopio de luz para determinar la zona en la que
se ha reconocido la degradación de la gelatina. Adicionalmente, se
utilizó el escáner de corredera (escáner de película Nikon de 35 mm:
COOLSAN II) para analizar cuantitativamente el tono con el software
Optimas Ver. 6 (Optimas Corporation).
Las micrografías bajo microscopio de luz de los
tejidos de cáncer tintados con H.E. (hematoxilina y eosina) en el
ratón que recibe un vehículo, el ratón que recibe (-)BPHA, y el
ratón que recibe BPHA, se muestran en (A), (B), y (C) sobre la parte
superior de la figura 1, respectivamente. Los resultados muestran
que los tejidos observados contienen las células de cáncer.
Adicionalmente, los resultados obtenidos en la
observación por el escáner de corredera se muestran también en (A),
(B), y (C) sobre la parte inferior de la figura 1. Se muestra que se
observó degradación de la gelatina en el ratón que recibió un
vehículo y en el ratón que recibió (-) BPHA (el compuesto sin
actividad inhibidora MMP), mientras que se observó poca degradación
de gelatina en el ratón que recibió BPHA. El análisis cuantitativo
utilizando el software Optimas Ver.6 (brillo en cada tejido / tamaño
en cada tejido) fue estimado en 49,2, 40,1 y 8,6 en el ratón que
recibió un vehículo, en el ratón que recibió (-)BPHA y en el ratón
que recibió BPHA, respectivamente.
Los resultados no son inconsistentes con los que
describen que BPHA muestra la actividad anti-cáncer,
mientras que (-)BPHA no la muestra en una experimentación animal
(CANCER RESEARCH 59, 1231-35 (1999)).
De acuerdo con una manera similar a la del
Ejemplo 1, excepto que se administró oralmente
MMI-166 de la fórmula
en dosis de 0,2 2,0, 20,0 y 200,0
mg/kg en lugar de las administraciones de BPHA y (-)BPHA, se
realizaron tratamientos para cimografía in
situ.
La micrografía bajo microscopio de luz y el
análisis del escáner de corredera con relación a la degradación de
la gelatina de los tejidos de cáncer en el ratón que recibió un
vehículo y los ratones que recibieron MMI-166 se
muestran en la parte inferior y en la parte superior de la figura 2,
respectivamente. En la figura 2, cada (a), (b), (c), (d) y (e)
resulta del ratón que recibió el vehículo, del ratón que recibió 0,2
mg/kg, del ratón que recibió 2,0 mg/kg, del ratón que recibió 20,0
mg/kg, y del ratón que recibió 200,0 mg/kg. En el tejido de cáncer
del ratón que recibió el vehículo, la degradación de la gelatina fue
reconocida de una manera coincidente en la zona de cáncer (figura
2aa). Por otra parte, los resultados en los ratones que recibieron
MMI-166 fueron que se proporciona inhibición
completa de la degradación de la gelatina en la dosis más alta de
200,0 mg/kg, que la inhibición se redujo en la secuencia de 20,0 a
2,0 mg/kg y que se reconoció la inhibición meramente parcial en la
dosis de 0,2 mg/kg (figura 2e-b). De acuerdo con
estos resultados, se ha encontrado que la inhibición de la actividad
de degradación de la gelatina observada e el tejido de cáncer era
dependiente de la dosis de MMI-166. El análisis
cuantitativo utilizando el software Optimas Ver.6 fue estimado
también en 53,4, 41,3, 28,6, 13,7 y 5,3, respectivamente.
Los resultados que se muestran anteriormente
sugieren que el método de la presente invención es útil para
determinar la dosis o el programa para la administración de
compuestos que muestran actividad inhibidora de MMP requerida para
inhibir la actividad de degradación real de la gelatina reconocida
en la zona de cáncer.
La presente invención hace posible una
determinación in vitro de una actividad in vivo de
inhibidores de MMP. La invención es útil para realizar la evaluación
del fármaco en ensayo clínico para agentes
anti-cáncer, agentes
anti-reumáticos, y agentes para el tratamiento de
fallo cardíaco, así como elucidación de su mecanismo de acción,
específicamente para determinar la dosis o el programa de
administración de los agentes.
Claims (18)
1. Un método para evaluar un compuesto que
muestra actividad inhibidora de metaloproteinasa de la matriz para
una actividad inhibidora de metaloproteinasa de la matriz in
vivo desplegada por el compuesto, que comprende someter a
cimografía in situ un espécimen aislado de un mamífero, que
ha recibido el compuesto y comparar el espécimen con un control, al
que no se ha administrado ningún inhibidor de metaloproteinasa.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la cimografía in situ es realizada utilizando una membrana
fina que comprende gelatina o colágeno junto con un agente de
endurecimiento, y que tiene un espesor entre 1 \mum y 20
\mum.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
la cimografía in situ se realiza:
- (1)
- poniendo en contacto el espécimen aislado sobre la membrana fina que comprende un substrato de metaloproteinasa de la matriz;
- (2)
- incubando la muestra de membrana fina de espécimen;
- (3)
- tintando y luego decolorando la membrana fina; y
- (4)
- verificando el tono desarrollado sobre la membrana fina, y comparando el tono con el del control.
4. El método de la reivindicación 3, en el que
el substrato de metaloproteinasa de la matriz es gelatina o
colágeno.
5. El método de la reivindicación 3 ó 4, en el
que la membrana fina comprende un agente de endurecimiento.
6. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en el que la membrana fina tiene un espesor
entre
1 \mum y 20 \mum.
1 \mum y 20 \mum.
7. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, en el que el espécimen es una sección de
tejido que tiene un espesor entre 2 \mum y 10 \mum y la
incubación se realiza entre 20ºC y 50ºC durante 2 a 18 horas.
8. Un método para evaluar un agente
anti-cáncer que muestra actividad inhibidora de
metaloproteinasa de la matriz para su actividad
anti-cáncer, que comprende someter a cimografía
in situ un espécimen aislado de un mamífero, cuyo mamífero ha
recibido el agente anti-cáncer, y evaluar una
actividad inhibidora de metaloproteinasa de la matriz in vivo
desplegada por el agente como un indicador y comparar el espécimen
con un espécimen de control aislado de un mamífero, a cuyo mamífero
no ha sido administrado ningún inhibidor de metaloproteinasa.
9. Un método para determinar cuantitativamente
una actividad inhibidora de metaloproteinasa de la matriz in
vivo desplegada por un compuesto que muestra actividad
inhibidora de metaloproteinasa de la matriz, que comprende someter a
cimografía in situ un espécimen aislado de un mamífero, cuyo
mamífero ha recibido el compuesto y comparar el tono del espécimen
con el de un espécimen de control aislado de un mamífero, al que no
ha sido administrado ningún inhibidor de metaloproteinasa.
10. El método de la reivindicación 9, en el que
la cimografía in situ se realiza utilizando una membrana fina
que comprende gelatina o colágeno junto con un agente de
endurecimiento, y que tiene un espesor entre 1 \mum y 20
\mum.
11. El método de la reivindicación 9, en el que
la cimografía in situ se realiza:
- (1)
- poniendo en contacto el espécimen aislado sobre la membrana fina que comprende un substrato de metaloproteinasa de la matriz;
- (2)
- incubando la muestra de membrana fina de espécimen;
- (3)
- tintando y luego decolorando la membrana fina; y
- (4)
- verificando el tono desarrollado sobre la membrana fina, y comparando el tono con el del control.
12. El método de la reivindicación 11, en el que
el substrato de metaloproteinasa de la matriz es gelatina o
colágeno.
13. El método de la reivindicación 11, en el que
la membrana fina comprende un agente de endurecimiento.
14. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, en el que la membrana fina tiene un
espesor entre 1 \mum y 20 \mum.
15. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14, en el que el espécimen es una sección de
tejido que tiene un espesor entre 2 \mum y 10 \mum y la
incubación se realiza entre 20ºC y 50ºC durante 2 a 18 horas.
16. El método de la reivindicación 9, que
comprende:
- (1)
- poner en contacto un espécimen de un tejido o un fluido aislado de un mamífero, a cuyo mamífero había sido administrado un compuesto que muestra actividad inhibidora de metaloproteinasa de la matriz, sobre una membrana fina que comprende un substrato de metaloproteinasa de la matriz;
- (2)
- incubar la muestra de membrana fina del espécimen;
- (3)
- tintar y luego decolorar la membrana fina; y
- (4)
- verificar el tono desarrollado sobre la membrana fina, y comparar el tono con el del control.
17. El método de la reivindicación 16, en el que
el espécimen que debe prepararse tiene un espesor entre 4 \mum
y
8 \mum y la incubación se realiza entre 36ºC y 38ºC durante 4 a 8 horas.
8 \mum y la incubación se realiza entre 36ºC y 38ºC durante 4 a 8 horas.
18. Un método para determinar cuantitativamente
una actividad anti-cáncer de un agente
anti-cáncer que muestra actividad inhibidora de
metaloproteinasa de la matriz, que comprende someter a cimografía
in situ a un espécimen aislado de un mamífero, cuyo mamífero
ha recibido el agente anti-cáncer y evaluar una
actividad inhibidora de metaloproteinasa de la matriz in vivo
desplegada por el agente como un indicador de la actividad
anti-cáncer, y comparar el tono del espécimen con el
de un espécimen de control aislado de un mamífero, al que no ha sido
administrado ningún inhibidor de metaloproteinasa.
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