JPH1045632A - 腸管免疫系に対して免疫応答誘導能を有 する蛋白質由来ペプチド類の検索方法 - Google Patents
腸管免疫系に対して免疫応答誘導能を有 する蛋白質由来ペプチド類の検索方法Info
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- JPH1045632A JPH1045632A JP8214129A JP21412996A JPH1045632A JP H1045632 A JPH1045632 A JP H1045632A JP 8214129 A JP8214129 A JP 8214129A JP 21412996 A JP21412996 A JP 21412996A JP H1045632 A JPH1045632 A JP H1045632A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 腸管免疫系に対して免疫応答誘導能を有
する蛋白質由来ペプチド類の検索方法において、当該蛋
白質由来ペプチド類を経口摂取させた実験動物から得ら
れたパイエル板細胞のＩＬ−２（又はＩｇＡ抗体）に対
する応答性を各々測定し、未分解の元の蛋白質を摂取さ
せた場合のパイエル板細胞のＩＬ−２（又はＩｇＡ抗
体）に対する応答性と比較して、該検索を行う。 【効果】 経口摂取後に非経口免疫処理することなく、
効率的に該検索を実施できる。
する蛋白質由来ペプチド類の検索方法において、当該蛋
白質由来ペプチド類を経口摂取させた実験動物から得ら
れたパイエル板細胞のＩＬ−２（又はＩｇＡ抗体）に対
する応答性を各々測定し、未分解の元の蛋白質を摂取さ
せた場合のパイエル板細胞のＩＬ−２（又はＩｇＡ抗
体）に対する応答性と比較して、該検索を行う。 【効果】 経口摂取後に非経口免疫処理することなく、
効率的に該検索を実施できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、腸管免疫系に対す
る蛋白質および蛋白質由来ペプチド類の免疫応答誘導能
を、それらを経口摂取させて得られたパイエル板細胞の
インターロイキン２（以下、ＩＬ−２）に対する応答性
およびＩｇＡ抗体応答性を指標として選別する方法に関
する。本発明によれば、経口摂取後に非経口免疫処理す
ることなく、きわめて効率的に、低アレルギー性ペプチ
ド類の選別等が可能となり、例えば食物アレルギーをひ
き起すことのない乳幼児用の調製粉乳や病弱者向けの栄
養食品の製造に利用することができる。
る蛋白質および蛋白質由来ペプチド類の免疫応答誘導能
を、それらを経口摂取させて得られたパイエル板細胞の
インターロイキン２（以下、ＩＬ−２）に対する応答性
およびＩｇＡ抗体応答性を指標として選別する方法に関
する。本発明によれば、経口摂取後に非経口免疫処理す
ることなく、きわめて効率的に、低アレルギー性ペプチ
ド類の選別等が可能となり、例えば食物アレルギーをひ
き起すことのない乳幼児用の調製粉乳や病弱者向けの栄
養食品の製造に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】食物アレルギーの予防および治療の観点
から、乳蛋白質を代表として各種食品蛋白質の酵素分解
物が乳幼児用食品に今日数多く用いられるようになって
いる。この酵素分解物は風味、溶解性、熱・酸安定性等
も考慮して設計されているために分子量が多様であり、
食物アレルギーの予防および治療といった本来の目的に
合致したものであることは通常抗原性および免疫原性を
指標として判定されている。しかし、Taylorらの言うよ
うに、抗原性のあるものすべてに免疫原性があるわけで
なく、また免疫原性のあるものすべてにアレルゲン性が
あるわけでもない（Food Tech．、第４６巻、１４６〜
１５２頁、１９９２年）。
から、乳蛋白質を代表として各種食品蛋白質の酵素分解
物が乳幼児用食品に今日数多く用いられるようになって
いる。この酵素分解物は風味、溶解性、熱・酸安定性等
も考慮して設計されているために分子量が多様であり、
食物アレルギーの予防および治療といった本来の目的に
合致したものであることは通常抗原性および免疫原性を
指標として判定されている。しかし、Taylorらの言うよ
うに、抗原性のあるものすべてに免疫原性があるわけで
なく、また免疫原性のあるものすべてにアレルゲン性が
あるわけでもない（Food Tech．、第４６巻、１４６〜
１５２頁、１９９２年）。
【０００３】食品蛋白質を食物アレルギーの予防および
治療食に応用するには、理想的にはアレルゲン性を有す
る蛋白質の構造部位だけを酵素分解で破壊すれば十分で
あり、抗原性および免疫原性を過剰に低下させる必要は
ない。逆に言うならば、抗原性および免疫原性を指標と
して蛋白質の酵素分解度を決定すると必要以上に分解度
が高くなることが予想される。これは酵素分解物の風味
および浸透圧等を適正に保つ上では好ましくない。
治療食に応用するには、理想的にはアレルゲン性を有す
る蛋白質の構造部位だけを酵素分解で破壊すれば十分で
あり、抗原性および免疫原性を過剰に低下させる必要は
ない。逆に言うならば、抗原性および免疫原性を指標と
して蛋白質の酵素分解度を決定すると必要以上に分解度
が高くなることが予想される。これは酵素分解物の風味
および浸透圧等を適正に保つ上では好ましくない。
【０００４】さらに根本的には、抗原性および免疫原性
といった指標が一般に食品蛋白質を非経口免疫した場合
の現象を基にしているという大きな問題がある。すなわ
ち、抗原性は通常、未分解の食品蛋白質をウサギやマウ
ス等の実験動物に腹腔投与や皮下投与等の方法で非経口
免疫して得られる、食品蛋白質に特異的な血清抗体と検
討対象物質の反応性が指標となっている。また、免疫原
性は通常、検討対象物質をウサギやマウス等の実験動物
に腹腔投与や皮下投与等の方法で非経口免疫した場合に
検討対象物質に対して産生される特異的な血清抗体の抗
体価が指標となっている。実際、Ｃｏｒｄｌｅらはこの
二つの方法で市販されているいくつかの蛋白分解調製粉
乳を比較し、これらの調製粉乳の抗原性および免疫原性
と投与時の臨床的な症状の発生状況が相関することを示
している（Pediatr.Allergy Immunol．、第５巻、１４
〜１９頁、１９９４年）。
といった指標が一般に食品蛋白質を非経口免疫した場合
の現象を基にしているという大きな問題がある。すなわ
ち、抗原性は通常、未分解の食品蛋白質をウサギやマウ
ス等の実験動物に腹腔投与や皮下投与等の方法で非経口
免疫して得られる、食品蛋白質に特異的な血清抗体と検
討対象物質の反応性が指標となっている。また、免疫原
性は通常、検討対象物質をウサギやマウス等の実験動物
に腹腔投与や皮下投与等の方法で非経口免疫した場合に
検討対象物質に対して産生される特異的な血清抗体の抗
体価が指標となっている。実際、Ｃｏｒｄｌｅらはこの
二つの方法で市販されているいくつかの蛋白分解調製粉
乳を比較し、これらの調製粉乳の抗原性および免疫原性
と投与時の臨床的な症状の発生状況が相関することを示
している（Pediatr.Allergy Immunol．、第５巻、１４
〜１９頁、１９９４年）。
【０００５】しかし、この文献の考察でも述べられてい
るように、抗原性および免疫原性を指標とした低アレル
ゲン性調製粉乳のスクリーニング結果は、モルモットに
検討対象物質を経口投与して行うアナフィラキシーテス
トの結果とは必ずしも一致していない。以下に述べるよ
うな経口投与抗原に対する粘膜免疫応答の研究の進展か
ら判断しても、抗原性と免疫原性だけから経口投与抗原
の生体免疫応答誘導能、特に経口免疫寛容等の腸管免疫
系に対する免疫応答誘導能あるいは食物アレルギーの誘
導能を予想すること自体にもはや現在大きな問題があ
る。
るように、抗原性および免疫原性を指標とした低アレル
ゲン性調製粉乳のスクリーニング結果は、モルモットに
検討対象物質を経口投与して行うアナフィラキシーテス
トの結果とは必ずしも一致していない。以下に述べるよ
うな経口投与抗原に対する粘膜免疫応答の研究の進展か
ら判断しても、抗原性と免疫原性だけから経口投与抗原
の生体免疫応答誘導能、特に経口免疫寛容等の腸管免疫
系に対する免疫応答誘導能あるいは食物アレルギーの誘
導能を予想すること自体にもはや現在大きな問題があ
る。
【０００６】近年、経口摂取された蛋白抗原に対しては
全身性の免疫応答とは別に粘膜免疫応答（消化管免疫応
答）が成立することが明らかにされており、特に粘膜面
におけるＩｇＡ抗体を中心とする免疫応答と、全身系に
おける免疫不応答が誘導されているという経口免疫寛容
現象が大きな注目を集めている。これは経口摂取された
蛋白抗原に対する食物アレルギーの発症が経口免疫寛容
が正常に誘導されていない場合に生じることが示唆され
ているからである（清野 宏ら、BIOmedica、第７巻、
４７〜５２頁、１９９２年）。したがって、粘膜免疫応
答を上述したような抗原性や免疫原性の代わりの指標と
して用いることができれば、経口摂取蛋白質が生体免疫
系に与える影響をより的確に判断できるものと思われ
る。
全身性の免疫応答とは別に粘膜免疫応答（消化管免疫応
答）が成立することが明らかにされており、特に粘膜面
におけるＩｇＡ抗体を中心とする免疫応答と、全身系に
おける免疫不応答が誘導されているという経口免疫寛容
現象が大きな注目を集めている。これは経口摂取された
蛋白抗原に対する食物アレルギーの発症が経口免疫寛容
が正常に誘導されていない場合に生じることが示唆され
ているからである（清野 宏ら、BIOmedica、第７巻、
４７〜５２頁、１９９２年）。したがって、粘膜免疫応
答を上述したような抗原性や免疫原性の代わりの指標と
して用いることができれば、経口摂取蛋白質が生体免疫
系に与える影響をより的確に判断できるものと思われ
る。
【０００７】しかしながら、これまでの研究報告では蛋
白抗原の経口投与が生体免疫系に与える影響を見る場合
でも、一度蛋白抗原を経口投与した後、同一蛋白抗原を
腹腔や皮下免疫した場合の免疫応答（血清抗体応答ある
いは非粘膜系のリンパ細胞の増殖応答等）を調べている
場合が多く、蛋白抗原の経口投与が粘膜免疫応答に与え
る影響、特に酵素処理等で低分子化した蛋白質抗原の経
口投与が粘膜免疫応答に与える影響をこうした非経口の
追加免疫なしに検討した例はほとんどないのが実状であ
る。
白抗原の経口投与が生体免疫系に与える影響を見る場合
でも、一度蛋白抗原を経口投与した後、同一蛋白抗原を
腹腔や皮下免疫した場合の免疫応答（血清抗体応答ある
いは非粘膜系のリンパ細胞の増殖応答等）を調べている
場合が多く、蛋白抗原の経口投与が粘膜免疫応答に与え
る影響、特に酵素処理等で低分子化した蛋白質抗原の経
口投与が粘膜免疫応答に与える影響をこうした非経口の
追加免疫なしに検討した例はほとんどないのが実状であ
る。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した技
術の現状に鑑み、従来の抗原性や免疫原性の代わりの指
標となりうる粘膜免疫応答を見出す目的でなされたもの
である。
術の現状に鑑み、従来の抗原性や免疫原性の代わりの指
標となりうる粘膜免疫応答を見出す目的でなされたもの
である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来の抗
原性や免疫原性の代わりの指標となりうる粘膜免疫応答
を見出すべく検討を行ったところ、酵素分解ペプチドま
たは元の未分解蛋白質を自由摂取させた実験動物（マウ
ス）から得られるパイエル板リンパ細胞のＩＬ−２応答
性およびＩｇＡ産生能が異なることを見出し、本発明を
なすに至った。すなわち、本発明は抗原性や免疫原性の
代替指標となる粘膜免疫応答を提供し、その指標を使っ
て腸管免疫系に対して免疫応答誘導能を有する蛋白質由
来ペプチド類を検索する方法を提供するものである。以
下、本発明について詳しく述べる。
原性や免疫原性の代わりの指標となりうる粘膜免疫応答
を見出すべく検討を行ったところ、酵素分解ペプチドま
たは元の未分解蛋白質を自由摂取させた実験動物（マウ
ス）から得られるパイエル板リンパ細胞のＩＬ−２応答
性およびＩｇＡ産生能が異なることを見出し、本発明を
なすに至った。すなわち、本発明は抗原性や免疫原性の
代替指標となる粘膜免疫応答を提供し、その指標を使っ
て腸管免疫系に対して免疫応答誘導能を有する蛋白質由
来ペプチド類を検索する方法を提供するものである。以
下、本発明について詳しく述べる。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明では、蛋白抗原および蛋白
抗原由来ペプチド類を摂取したときの粘膜免疫応答の指
標として、パイエル板リンパ細胞の免疫応答に注目し
た。パイエル板は代表的な腸管隣接リンパ組織の一つで
あり、そこで誘導される免疫応答はいわゆるホーミング
現象によって全身に分布する粘膜および腺組織に伝播さ
れることが知られている。パイエル板リンパ細胞は腸管
粘膜固有層や腸管上皮細胞間リンパ細胞等の他の腸管隣
接リンパ組織に比べて回収が容易である。パイエル板か
らのリンパ細胞の回収は物理的な方法でも良いし、ディ
スパーゼなどの酵素を用いる方法でも良い。
抗原由来ペプチド類を摂取したときの粘膜免疫応答の指
標として、パイエル板リンパ細胞の免疫応答に注目し
た。パイエル板は代表的な腸管隣接リンパ組織の一つで
あり、そこで誘導される免疫応答はいわゆるホーミング
現象によって全身に分布する粘膜および腺組織に伝播さ
れることが知られている。パイエル板リンパ細胞は腸管
粘膜固有層や腸管上皮細胞間リンパ細胞等の他の腸管隣
接リンパ組織に比べて回収が容易である。パイエル板か
らのリンパ細胞の回収は物理的な方法でも良いし、ディ
スパーゼなどの酵素を用いる方法でも良い。
【００１１】次に、回収したパイエル板リンパ細胞を無
菌的に各種濃度のＩＬ−２およびリポ多糖（以下、ＬＰ
Ｓ）存在下で所定の期間培養し、所定期間培養後の個々
の条件下でのパイエル板リンパ細胞のＩＬ−２応答性お
よびＩｇＡ産生能を評価した。ＩＬ−２応答性は培養終
了の一定時間（約６〜２４時間）前にトリチウムラベル
したチミジンを培養液に添加し、そのリンパ細胞への取
り込みで調べても良いし、プロメガ（株）などから販売
されているＭＴＴ反応を応用した試薬キットを用いて調
べても良い。ＩｇＡ産生能は所定期間培養後の各々の培
養液中のＩｇＡ含量をsandwich-ELISAで測定した。
菌的に各種濃度のＩＬ−２およびリポ多糖（以下、ＬＰ
Ｓ）存在下で所定の期間培養し、所定期間培養後の個々
の条件下でのパイエル板リンパ細胞のＩＬ−２応答性お
よびＩｇＡ産生能を評価した。ＩＬ−２応答性は培養終
了の一定時間（約６〜２４時間）前にトリチウムラベル
したチミジンを培養液に添加し、そのリンパ細胞への取
り込みで調べても良いし、プロメガ（株）などから販売
されているＭＴＴ反応を応用した試薬キットを用いて調
べても良い。ＩｇＡ産生能は所定期間培養後の各々の培
養液中のＩｇＡ含量をsandwich-ELISAで測定した。
【００１２】以下に試験例および実施例をあげて本発明
を具体的に説明する。比較のために試験例には従来の技
術を示し、実施例には本発明の技術を示した。
を具体的に説明する。比較のために試験例には従来の技
術を示し、実施例には本発明の技術を示した。
【００１３】
【試験例１】ここでは、乳清蛋白分離物（以下、ＷＰ
Ｉ）とその酵素分解物（以下、ＷＰＨ）を従来の生体感
作性（アレルゲン性）評価法の一つである抗原性で比較
した。なお、ＷＰＩおよびＷＰＨは、それぞれ、Le Sue
ur Isolates社およびDanmark Protein社より購入したも
のである。先ず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに市販のβ−ラク
トグロブリン（Sigma社製、以下、β−ＬＧ）１００μ
ｇをフロイントの完全アジュバントとともに免疫し、２
週間後に同量のβ−ＬＧをフロイントの不完全アジュバ
ントとともに免疫した。その１週間後にマウスより血清
を採取し、抗β−ＬＧ抗体として競合ＥＬＩＳＡに用い
た。競合ＥＬＩＳＡは次のように行った。すなわち、β
−ＬＧをｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（以下、ＰＢＳ）に０．０１％の濃度に溶解し、イムノ
プレート（Nunc社製）の各穴に１００μｌ添加し、４℃
で一晩静置した。Ｔｗｅｅｎ２０（Bio Rad社製）を
０．０５％含むＰＢＳ（洗浄液）で３回洗浄した後、Ｗ
ＰＩあるいはＷＰＨと抗β−ＬＧ抗体を洗浄液に加え、
その液を各穴に１００μｌ添加した。１００μｌ中のＷ
ＰＩあるいはＷＰＨの含量は０から２．５ｍｇまで変化
させた。室温で２時間反応後、プレートを洗浄し、アル
カリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇ（ＩｇＡ＋
ＩｇＧ＋ＩｇＭ）（Cappel社製）を各穴に１００μｌ添
加した。室温で２時間反応後、プレートを洗浄し、基質
溶液（１００ｍｌのジエタノールアミン−塩酸緩衝液ｐ
Ｈ９．８に０．１ｇのｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリ
ウムを溶解したもの）を各穴に１００μｌ添加した。室
温で３０分反応後、５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を各穴に
２０μｌ添加して各穴の４０５ｎｍでの吸光度を測定し
た。
Ｉ）とその酵素分解物（以下、ＷＰＨ）を従来の生体感
作性（アレルゲン性）評価法の一つである抗原性で比較
した。なお、ＷＰＩおよびＷＰＨは、それぞれ、Le Sue
ur Isolates社およびDanmark Protein社より購入したも
のである。先ず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに市販のβ−ラク
トグロブリン（Sigma社製、以下、β−ＬＧ）１００μ
ｇをフロイントの完全アジュバントとともに免疫し、２
週間後に同量のβ−ＬＧをフロイントの不完全アジュバ
ントとともに免疫した。その１週間後にマウスより血清
を採取し、抗β−ＬＧ抗体として競合ＥＬＩＳＡに用い
た。競合ＥＬＩＳＡは次のように行った。すなわち、β
−ＬＧをｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（以下、ＰＢＳ）に０．０１％の濃度に溶解し、イムノ
プレート（Nunc社製）の各穴に１００μｌ添加し、４℃
で一晩静置した。Ｔｗｅｅｎ２０（Bio Rad社製）を
０．０５％含むＰＢＳ（洗浄液）で３回洗浄した後、Ｗ
ＰＩあるいはＷＰＨと抗β−ＬＧ抗体を洗浄液に加え、
その液を各穴に１００μｌ添加した。１００μｌ中のＷ
ＰＩあるいはＷＰＨの含量は０から２．５ｍｇまで変化
させた。室温で２時間反応後、プレートを洗浄し、アル
カリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇ（ＩｇＡ＋
ＩｇＧ＋ＩｇＭ）（Cappel社製）を各穴に１００μｌ添
加した。室温で２時間反応後、プレートを洗浄し、基質
溶液（１００ｍｌのジエタノールアミン−塩酸緩衝液ｐ
Ｈ９．８に０．１ｇのｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリ
ウムを溶解したもの）を各穴に１００μｌ添加した。室
温で３０分反応後、５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を各穴に
２０μｌ添加して各穴の４０５ｎｍでの吸光度を測定し
た。
【００１４】最初にプレートにコーティングしたβ−Ｌ
Ｇと抗β−ＬＧ抗体の結合に対する阻害率を吸光度比Ｂ
／Ｂ0（Ｂ：競合抗原ＷＰＩあるいはＷＰＨが存在する
場合の吸光度、Ｂ0：競合抗原非存在下での吸光度）で
表し、競合抗原濃度に対してプロットした結果が図１で
ある。抗原性が残っていると、濃度を上げるにつれて抗
体が吸収されて吸光度Ｂ／Ｂ0が低下することが知られ
ているが、ＷＰＩでは濃度が上かるにつれてこの比が低
下し、ＷＰＩ中の主要抗原であるβ−ＬＧの抗体が残っ
ていると判断された。これに対して、ＷＰＨではほとん
ど変化せず、β−ＬＧに対する抗原性はＷＰＨでは消失
していると判断された。
Ｇと抗β−ＬＧ抗体の結合に対する阻害率を吸光度比Ｂ
／Ｂ0（Ｂ：競合抗原ＷＰＩあるいはＷＰＨが存在する
場合の吸光度、Ｂ0：競合抗原非存在下での吸光度）で
表し、競合抗原濃度に対してプロットした結果が図１で
ある。抗原性が残っていると、濃度を上げるにつれて抗
体が吸収されて吸光度Ｂ／Ｂ0が低下することが知られ
ているが、ＷＰＩでは濃度が上かるにつれてこの比が低
下し、ＷＰＩ中の主要抗原であるβ−ＬＧの抗体が残っ
ていると判断された。これに対して、ＷＰＨではほとん
ど変化せず、β−ＬＧに対する抗原性はＷＰＨでは消失
していると判断された。
【００１５】
【試験例２】試験例１で用いたＷＰＩおよびＷＰＨの経
口投与が生体免疫系に与える影響をβ−ＬＧに対する経
口寛容状態で比較した。すなわちＷＰＩあるいはＷＰＨ
をそれぞれ唯一の蛋白質源とするＡＩＮ−７６準拠の飼
料を１週間マウスに自由摂取させた（５匹／群）。な
お、乳蛋白質を含まない市販の固型飼料（ＭＦ飼料、オ
リエンタル酵母社製）を投与する群をこれら二つの飼料
投与群の対照としてさらに設けた。１週間後ＷＰＩおよ
びＷＰＨ飼料群の飼料をＭＦに変えるとともに、試験例
１と同様な方法で２回β−ＬＧを免疫した。最後の免疫
から１週間目に採血を行い、抗β−ＬＧ抗体価をＥＬＩ
ＳＡで測定した。すなわち、試験例１と同様にβ−ＬＧ
をイムノプレートにコーティングした後、洗浄液でプレ
ートを洗浄した。次に、卵白アルブミン（以下、ＯＶ
Ａ、生化学工業社製）を１％含むＰＢＳを１２５μｌ／
穴添加し、室温で２時間静置してブロッキング処理をし
た。洗浄液で洗浄後、プレートの各穴に各マウスの血清
のＰＢＳ希釈液（二千および一万倍）を１００μｌ添加
した。室温で２時間反応液、プレートを洗浄し、以後、
試験例１と全く同様の手順で酵素標識二次抗体および基
質溶液を添加して各穴の４０５ｎｍでの吸光度を測定し
た。
口投与が生体免疫系に与える影響をβ−ＬＧに対する経
口寛容状態で比較した。すなわちＷＰＩあるいはＷＰＨ
をそれぞれ唯一の蛋白質源とするＡＩＮ−７６準拠の飼
料を１週間マウスに自由摂取させた（５匹／群）。な
お、乳蛋白質を含まない市販の固型飼料（ＭＦ飼料、オ
リエンタル酵母社製）を投与する群をこれら二つの飼料
投与群の対照としてさらに設けた。１週間後ＷＰＩおよ
びＷＰＨ飼料群の飼料をＭＦに変えるとともに、試験例
１と同様な方法で２回β−ＬＧを免疫した。最後の免疫
から１週間目に採血を行い、抗β−ＬＧ抗体価をＥＬＩ
ＳＡで測定した。すなわち、試験例１と同様にβ−ＬＧ
をイムノプレートにコーティングした後、洗浄液でプレ
ートを洗浄した。次に、卵白アルブミン（以下、ＯＶ
Ａ、生化学工業社製）を１％含むＰＢＳを１２５μｌ／
穴添加し、室温で２時間静置してブロッキング処理をし
た。洗浄液で洗浄後、プレートの各穴に各マウスの血清
のＰＢＳ希釈液（二千および一万倍）を１００μｌ添加
した。室温で２時間反応液、プレートを洗浄し、以後、
試験例１と全く同様の手順で酵素標識二次抗体および基
質溶液を添加して各穴の４０５ｎｍでの吸光度を測定し
た。
【００１６】その結果図２に示したように、いずれの血
清の希釈水準でもＷＰＩ投与で特異β−ＬＧ抗体価の著
しい減少が見られ、β−ＬＧに対する経口寛容の成立が
認められた。これに対して、ＷＰＨ投与の場合は若干特
異β−ＬＧ抗体価の減少が認められるものの、ＭＦ投与
の場合と有意差を全く認めず、β−ＬＧに対する経口寛
容は不成立であった。
清の希釈水準でもＷＰＩ投与で特異β−ＬＧ抗体価の著
しい減少が見られ、β−ＬＧに対する経口寛容の成立が
認められた。これに対して、ＷＰＨ投与の場合は若干特
異β−ＬＧ抗体価の減少が認められるものの、ＭＦ投与
の場合と有意差を全く認めず、β−ＬＧに対する経口寛
容は不成立であった。
【００１７】
【試験例３】前記試験例２に示された経口寛容成立の違
いをリンパ細胞の増殖応答から検討した。すなわち、試
験例２の各群のマウスを採血１週間後に解剖して脾臓を
摘出した。脾臓を各群ごとにプールして、Suzukiらの方
法（I. Suzuki et al., Bifidobacteria Microflora,
第９巻、８７〜９８頁、１９９０年）でリンパ細胞を調
製した。リンパ細胞は１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Gi
bco社製)、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Gi
bco社製)、５×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノール、
および１％の同系マウス血清を含むＲＰＭＩ１６４０培
地（Gibco社製）に分散させ、９６穴の培養プレート（F
alcon社製)に一穴当たり５×１０5個ずつ加え、各種濃
度のβ−ＬＧおよびＯＶＡ存在下で培養した（５％ＣＯ
2インキュベーター中）。３日後にトリチウムラベルし
たチミジン（NEN社製）を一穴当たり１μＣｉ添加し、
２０時間後にリンパ細胞を濾紙上に回収した。トリチウ
ムラベルしたチミジンの取り込みは液体シンチレーショ
ンカウンター（アロカ社製）で測定した。
いをリンパ細胞の増殖応答から検討した。すなわち、試
験例２の各群のマウスを採血１週間後に解剖して脾臓を
摘出した。脾臓を各群ごとにプールして、Suzukiらの方
法（I. Suzuki et al., Bifidobacteria Microflora,
第９巻、８７〜９８頁、１９９０年）でリンパ細胞を調
製した。リンパ細胞は１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Gi
bco社製)、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Gi
bco社製)、５×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノール、
および１％の同系マウス血清を含むＲＰＭＩ１６４０培
地（Gibco社製）に分散させ、９６穴の培養プレート（F
alcon社製)に一穴当たり５×１０5個ずつ加え、各種濃
度のβ−ＬＧおよびＯＶＡ存在下で培養した（５％ＣＯ
2インキュベーター中）。３日後にトリチウムラベルし
たチミジン（NEN社製）を一穴当たり１μＣｉ添加し、
２０時間後にリンパ細胞を濾紙上に回収した。トリチウ
ムラベルしたチミジンの取り込みは液体シンチレーショ
ンカウンター（アロカ社製）で測定した。
【００１８】図３に示したように、ＷＰＨ投与群ではＭ
Ｆ投与群と同様にβ−ＬＧ存在下で濃度依存的な増殖応
答が起こっているのに対し、ＷＰＩ投与群ではこういう
応答は認められなかった。一方、ＯＶＡ存在下ではこれ
ら３群とも応答はほとんど同じで、低応答であった。し
たがって、ＷＰＩ投与群ではβ−ＬＧに対する経口寛容
が成立し、ＷＰＨ投与群ではβ−ＬＧに対する経口寛容
が不成立であることがリンパ細胞のレベルでも確認され
た。
Ｆ投与群と同様にβ−ＬＧ存在下で濃度依存的な増殖応
答が起こっているのに対し、ＷＰＩ投与群ではこういう
応答は認められなかった。一方、ＯＶＡ存在下ではこれ
ら３群とも応答はほとんど同じで、低応答であった。し
たがって、ＷＰＩ投与群ではβ−ＬＧに対する経口寛容
が成立し、ＷＰＨ投与群ではβ−ＬＧに対する経口寛容
が不成立であることがリンパ細胞のレベルでも確認され
た。
【００１９】
【実施例１】試験例２と同様にＷＰＩあるいはＷＰＨを
それぞれ唯一の蛋白質源とするＡＩＮ−７６準拠の飼料
を１週間マウスに自由摂取させた（５匹／群）。１週間
後に解剖してパイエル板を摘出した。パイエル板を各群
ごとにプールして、Suzukiらの方法（I. Suzuki et a
l., Bifidobacteria Microflora, 第９巻、８７〜９８
頁、１９９０年）でリンパ細胞を調製した。試験例３と
同じ組成のＲＰＭＩ１６４０培地を用い、各種濃度のマ
ウスＩＬ−２（Genzyme社製)およびＣｏｎＡ（Sigma社
製）存在下でリンパ細胞を９６穴の培養プレート（Falc
on社製）にて培養した。以下、試験例３と同様な方法で
リンパ細胞の増殖応答を測定した。
それぞれ唯一の蛋白質源とするＡＩＮ−７６準拠の飼料
を１週間マウスに自由摂取させた（５匹／群）。１週間
後に解剖してパイエル板を摘出した。パイエル板を各群
ごとにプールして、Suzukiらの方法（I. Suzuki et a
l., Bifidobacteria Microflora, 第９巻、８７〜９８
頁、１９９０年）でリンパ細胞を調製した。試験例３と
同じ組成のＲＰＭＩ１６４０培地を用い、各種濃度のマ
ウスＩＬ−２（Genzyme社製)およびＣｏｎＡ（Sigma社
製）存在下でリンパ細胞を９６穴の培養プレート（Falc
on社製）にて培養した。以下、試験例３と同様な方法で
リンパ細胞の増殖応答を測定した。
【００２０】図４に示したように、ＩＬ−２存在下の濃
度依存的な増殖応答はＷＰＩ投与群に比べて、ＷＰＨ投
与群の方が明らかに低かった。一方、ＣｏｎＡ存在下で
はこれら２群とも応答はほとんど同じであった。Ｔ細胞
レセプターを介した抗原刺激を受けていない未感作Ｔ細
胞はＩＬ−２には応答できないが、ＣｏｎＡには応答で
きることを考えると、このＩＬ−２応答の違いはＷＰＩ
とＷＰＨの腸管免疫系に対する免疫応答誘導能の違いで
あることが明らかになった。
度依存的な増殖応答はＷＰＩ投与群に比べて、ＷＰＨ投
与群の方が明らかに低かった。一方、ＣｏｎＡ存在下で
はこれら２群とも応答はほとんど同じであった。Ｔ細胞
レセプターを介した抗原刺激を受けていない未感作Ｔ細
胞はＩＬ−２には応答できないが、ＣｏｎＡには応答で
きることを考えると、このＩＬ−２応答の違いはＷＰＩ
とＷＰＨの腸管免疫系に対する免疫応答誘導能の違いで
あることが明らかになった。
【００２１】
【実施例２】実施例１と同様にＷＰＩあるいはＷＰＨを
それぞれ唯一の蛋白質源とするＡＩＮ−７６準拠の飼料
を１週間マウスに自由摂取させた（５匹／群）。１週間
後に解剖して脾臓を摘出した。脾臓を各群ごとにプール
して、実施例１と同様にリンパ細胞の増殖応答をＩＬ−
２およびＣｏｎＡ存在下で比較した。
それぞれ唯一の蛋白質源とするＡＩＮ−７６準拠の飼料
を１週間マウスに自由摂取させた（５匹／群）。１週間
後に解剖して脾臓を摘出した。脾臓を各群ごとにプール
して、実施例１と同様にリンパ細胞の増殖応答をＩＬ−
２およびＣｏｎＡ存在下で比較した。
【００２２】図５に示したように、ＣｏｎＡに対する応
答はもちろん、ＩＬ−２に対する応答も両者でほとんど
同じになったことから、飼料の違いが投与される生体の
免疫応答全般を一様に変化させているのではなく、食物
蛋白抗原が生体免疫系と最初に遭遇する粘膜免疫系リン
パ組織の免疫応答を特に大きく変化させることが示され
た。
答はもちろん、ＩＬ−２に対する応答も両者でほとんど
同じになったことから、飼料の違いが投与される生体の
免疫応答全般を一様に変化させているのではなく、食物
蛋白抗原が生体免疫系と最初に遭遇する粘膜免疫系リン
パ組織の免疫応答を特に大きく変化させることが示され
た。
【００２３】
【実施例３】実施例１と同様にＷＰＩおよびＷＰＨ飼料
投与マウスからパイエル板リンパ細胞を回収し、各種濃
度のＬＰＳ存在下で９６穴の培養プレートにて培養した
（１０6個／穴）。培養５日後に各穴から培養上清を回
収し、そのＩｇＡ含量をSandwich-ELISAで測定した。Sa
ndwich-ELISAはイムノプレートのコーティングにヒツジ
抗マウスＩｇＡ抗体（Binding Site社製）を、酵素標識
二次抗体にアルカリフォスファターゼ標識ラット抗マウ
スＩｇＡモノクローナル抗体（関東化学社製）を用いる
以外、試験例２と同様の方法で行った。ＩｇＡ含量の算
出はスタンダードＩｇＡ（マウスＩｇＡ（ICN Immuno B
iologicals社製））を用いて作成した濃度対吸光度の検
量線から行った。
投与マウスからパイエル板リンパ細胞を回収し、各種濃
度のＬＰＳ存在下で９６穴の培養プレートにて培養した
（１０6個／穴）。培養５日後に各穴から培養上清を回
収し、そのＩｇＡ含量をSandwich-ELISAで測定した。Sa
ndwich-ELISAはイムノプレートのコーティングにヒツジ
抗マウスＩｇＡ抗体（Binding Site社製）を、酵素標識
二次抗体にアルカリフォスファターゼ標識ラット抗マウ
スＩｇＡモノクローナル抗体（関東化学社製）を用いる
以外、試験例２と同様の方法で行った。ＩｇＡ含量の算
出はスタンダードＩｇＡ（マウスＩｇＡ（ICN Immuno B
iologicals社製））を用いて作成した濃度対吸光度の検
量線から行った。
【００２４】図６に示したように、パイエル板リンパ細
胞のＬＰＳ存在下でのＩｇＡ抗体応答はＷＰＩ飼料を投
与した場合の方がＷＰＨ飼料投与時に比べて高くなるこ
とが明らかになった。この結果は実施例１と同様、ＷＰ
ＩとＷＰＨの腸管免疫系に対する免疫応答誘導能（経口
寛容誘導能）の違いを反映していた。
胞のＬＰＳ存在下でのＩｇＡ抗体応答はＷＰＩ飼料を投
与した場合の方がＷＰＨ飼料投与時に比べて高くなるこ
とが明らかになった。この結果は実施例１と同様、ＷＰ
ＩとＷＰＨの腸管免疫系に対する免疫応答誘導能（経口
寛容誘導能）の違いを反映していた。
【００２５】以上、本発明により、従来の経口寛容誘導
能の評価時のように経口投与後の非経口免疫処理を要し
た操作が、経口投与の処理だけで済むようになり、非経
口免疫で実験動物に抗体産生させるのに必要な時間が短
縮できる。これまで蛋白質抗原の酵素分解物の中に経口
寛容誘導能を有するものがあることはすでに知られてい
る（特開平５−５０００号公報）。しかし、経口寛容誘
導能を有する蛋白質由来ペプチド類を効率的に検索する
方法は知られていなかった。
能の評価時のように経口投与後の非経口免疫処理を要し
た操作が、経口投与の処理だけで済むようになり、非経
口免疫で実験動物に抗体産生させるのに必要な時間が短
縮できる。これまで蛋白質抗原の酵素分解物の中に経口
寛容誘導能を有するものがあることはすでに知られてい
る（特開平５−５０００号公報）。しかし、経口寛容誘
導能を有する蛋白質由来ペプチド類を効率的に検索する
方法は知られていなかった。
【００２６】一方、クローン病やセリアック病のように
食餌による腸管免疫系に対する免疫応答の誘導が生体に
とって有害な場合、中心静脈栄養剤や成分栄養剤等の投
与により腸管内からの抗原刺激を避ける栄養方法が取ら
れる。しかし、これらの栄養剤（特に成分栄養剤）は浸
透圧が高いことが多く、風味も良くないことが多い。こ
うした栄養剤に食品蛋白抗原の酵素分解を応用すること
ができれば浸透圧および風味等の改良につながることが
期待されているが、蛋白抗原の酵素分解物の腸管免疫系
に対する感作性を効率的に選別する方法は知られていな
かった。
食餌による腸管免疫系に対する免疫応答の誘導が生体に
とって有害な場合、中心静脈栄養剤や成分栄養剤等の投
与により腸管内からの抗原刺激を避ける栄養方法が取ら
れる。しかし、これらの栄養剤（特に成分栄養剤）は浸
透圧が高いことが多く、風味も良くないことが多い。こ
うした栄養剤に食品蛋白抗原の酵素分解を応用すること
ができれば浸透圧および風味等の改良につながることが
期待されているが、蛋白抗原の酵素分解物の腸管免疫系
に対する感作性を効率的に選別する方法は知られていな
かった。
【００２７】したがって、本発明は近年開発が進む蛋白
質の各種酵素分解物を経口摂取時に最も問題となる経口
寛容誘導能等の腸管免疫系に対する免疫応答誘導能で選
別することを容易にするものと考えられる。
質の各種酵素分解物を経口摂取時に最も問題となる経口
寛容誘導能等の腸管免疫系に対する免疫応答誘導能で選
別することを容易にするものと考えられる。
【００２８】
【発明の効果】本発明の方法により、蛋白質抗原の腸管
免疫系に対する免疫応答誘導能に関して従来の抗原性や
免疫原性よりもさらに有用な評価指標を提供でき、この
方法を用いて複数の蛋白質および蛋白質由来ペプチド類
の中から最適の物質を選別することができる。しかもそ
の際、本発明によれば、経口摂取後に非経口免疫処理を
する必要がないので、きわめて効率的に本方法を実施す
ることができる。
免疫系に対する免疫応答誘導能に関して従来の抗原性や
免疫原性よりもさらに有用な評価指標を提供でき、この
方法を用いて複数の蛋白質および蛋白質由来ペプチド類
の中から最適の物質を選別することができる。しかもそ
の際、本発明によれば、経口摂取後に非経口免疫処理を
する必要がないので、きわめて効率的に本方法を実施す
ることができる。
【図１】試験例１で行ったＷＰＩとＷＰＨの抗原性の比
較結果を示す。
較結果を示す。
【図２】試験例２の測定で得られたマウス血清中のβ−
ＬＧに対する特異抗体価（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）を
示す。
ＬＧに対する特異抗体価（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）を
示す。
【図３】試験例３の測定で得られたマウス脾臓リンパ細
胞の増殖応答を示す。
胞の増殖応答を示す。
【図４】実施例１の測定で得られたマウスパイエル板リ
ンパ細胞の増殖反応（＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊：
Ｐ＜０．０１）を示す。
ンパ細胞の増殖反応（＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊：
Ｐ＜０．０１）を示す。
【図５】実施例２の測定で得られたマウス脾臓細胞の増
殖応答を示す。
殖応答を示す。
【図６】実施例３の測定で得られたマウスパイエル板リ
ンパ細胞のＩｇＡ産生能（＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊
＊：Ｐ＜０．０１；＊：Ｐ＜０．０５）を示す。
ンパ細胞のＩｇＡ産生能（＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊
＊：Ｐ＜０．０１；＊：Ｐ＜０．０５）を示す。
Claims (4)
- 【請求項１】 腸管免疫系に対して免疫応答誘導能を有
する蛋白質由来ペプチド類の検索方法において、当該蛋
白質由来ペプチド類を経口摂取させた実験動物から得ら
れたパイエル板細胞のインターロイキン２に対する応答
性又はＩｇＡ抗体応答性を指標として選別することを特
徴とする、経口摂取後に非経口免疫処理することなく、
ペプチド類の腸管免疫系に対する免疫応答誘導能を検索
する方法。 - 【請求項２】 腸管免疫系に対して免疫応答誘導能を有
する蛋白質由来ペプチド類の検索方法において、当該蛋
白質由来ペプチド類を経口摂取させた実験動物から得ら
れたパイエル板細胞のインターロイキン２に対する応答
性を各々測定し、未分解の元の蛋白質を摂取させた場合
のパイエル板細胞のインターロイキン２に対する応答性
と比較すること、を特徴とする請求項１に記載のペプチ
ド類の腸管免疫系に対する免疫応答誘導能を検索する方
法。 - 【請求項３】 腸管免疫系に対して免疫応答誘導能を有
する蛋白質由来ペプチド類の検索方法において、当該蛋
白質由来ペプチド類を経口摂取させた実験動物から得ら
れたパイエル板細胞のＩｇＡ抗体応答性を各々測定し、
未分解の元の蛋白質を摂取させた場合のパイエル板細胞
のＩｇＡ抗体応答性と比較すること、を特徴とする請求
項１に記載のペプチド類の腸管免疫系に対する免疫応答
誘導能を検索する方法。 - 【請求項４】 請求項１〜請求項３のいずれか１項に記
載の方法にしたがって、経口寛容誘導能を有する蛋白質
由来ペプチド類を検索する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8214129A JPH1045632A (ja) | 1996-07-26 | 1996-07-26 | 腸管免疫系に対して免疫応答誘導能を有 する蛋白質由来ペプチド類の検索方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8214129A JPH1045632A (ja) | 1996-07-26 | 1996-07-26 | 腸管免疫系に対して免疫応答誘導能を有 する蛋白質由来ペプチド類の検索方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1045632A true JPH1045632A (ja) | 1998-02-17 |
Family
ID=16650711
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8214129A Pending JPH1045632A (ja) | 1996-07-26 | 1996-07-26 | 腸管免疫系に対して免疫応答誘導能を有 する蛋白質由来ペプチド類の検索方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1045632A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000071167A1 (fr) * | 1999-05-24 | 2000-11-30 | Shionogi & Co., Ltd. | Methode d'evaluation de l'activite inhibitrice de la metalloprotease matricielle |
-
1996
- 1996-07-26 JP JP8214129A patent/JPH1045632A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000071167A1 (fr) * | 1999-05-24 | 2000-11-30 | Shionogi & Co., Ltd. | Methode d'evaluation de l'activite inhibitrice de la metalloprotease matricielle |
| US6627411B2 (en) | 1999-05-24 | 2003-09-30 | Shionogi & Co., Ltd. | Method for evaluating matrix metalloprotease inhibitory activity |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071113 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080111 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20080111 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090526 |