TWI223599B - Evaluation method of matrix metalloprotease inhibitory activity - Google Patents

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223599 A7 B7 五、發明說明（1) 發明所屬之技術領域 本發明係關於具有基質金屬蛋白酶抑制活性之化合 物，在活體内評估該活性的方法。詳言之，本發明係關於 藉由使用原位酶譜法，評估該活性之方法。 發明背景 基質金屬蛋白酶（MMP)為腫瘤細胞本身具有之由腫 瘤周圍之正常細胞分泌的依賴二價金屬離子的分解膠原蛋 白等細胞外基質蛋白之酶的總稱。在許多報告中指出特殊 之IV型膠原蛋白酶(MMP-2、MMP-9)係與伴隨癌之增殖的 血管新生或浸潤、轉移有關。 就基質金屬蛋白酶的測定方法而言，已知由基質之分 解性程度測定酶活性的明膠酶譜法，此方法因為必須進行 電泳，手法煩雜，檢測需要長時間。 就不必進行電泳的手法而言，FASEB Journal，第9卷， 7月號，第974-980頁，1995中，含有藉由結合螢光性化合 物之酪蛋白或明膠作為蛋白酶基質的瓊脂糖，在載玻片上 形成薄膜，接著在此薄膜上放置組織切片，在培養箱中培 養，在螢光顯微鏡下觀察基質之分解。然而，此種方法因 為瓊脂糖之存在影響蛋白酶對基質之分解性，具有缺乏再 現性的問題。 最近，本專利申請案之發明人提出簡便且正確之蛋白 酶測定方法，其中包含在含有蛋白酶基質及硬化劑之相對 於與含有蛋白酶之試料接觸的載體表面形成薄膜的步驟， 獲得一定的評價（WO 97/32035 )。例如在第5屆癌轉移 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -4- ------------—ί—訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1223599 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（2) 研究會總會（1996年）的講演要旨集中，記載使用以此方 法為基礎的原位酶譜法，檢測組織細胞的明膠酶觀察利用 蛋白酶形成之癌細胞組織破壞的形態。再者，就原位酶譜 法而言，係記載於FEBS J0urnal，第974-980頁，第9卷（1995) 中。 且 ’ H· Nakamura等人於Cancer Research 59，467_473 (1999)中記載’同樣地使用原位酶譜法在人甲狀腺癌處原 位放置之MMP抑制劑對MMp活性的抑制作用。 習知技術 上述之MMP，因為考慮到特殊IV型膠原蛋白酶係與伴 隨癌之增瘦的金管新生或浸潤、轉移有關，以抗癌劑開發 為目的的MMP抑制劑受到注目，目前數個相關的製 藥製造 商無法進行臨床實驗。 藥物治療係以使用之藥物本身為有效且安全為前提成 立，進行此藥物之有效性的藥效評估，藥效評估大致可區 分成動物實驗等非臨床試驗及以人為對象之臨床試驗二大 部分。具有非臨床試驗之效果，及作用機制極佳之藥物， 並非意謂其可能對患者有治療效果。在此處，對人的藥物 效果評估需進行臨床試驗。 就瞻抑制劑之臨床試驗的藥效評估的情況中，因為 MMP於活體内，係由TIMIM、TI脈2等内因性抑制試料 所控制[Woe嶋er，j.f. Jr” _B j 5, 2⑷御99⑶， 活體内瞻抑制劑之活性的確評估有困難。就MMp之檢出 方法而s ’已知使用對MMP有專—性之抗體的免疫染色法 尺度適用中國國家標準「CNS)A4規格⑽χ 297公$ -------,---------------訂---------線^|^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1223599 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（3) (Int. J· Cancer·，56, 500-505 (1994))，依據此方法，若抗體 認識作為單一抗原蛋白之MMP的話，由於抗體認識的抗原 蛋白為有活性的MMP，若作為抑制試料之活性失活的話， 無法進行判斷。再者，習知之酶圖法，因為在電泳中自MMP 分離抑制試料，此方法亦無法對MMP抑制劑之抑制活性進 行正確的評估。 發明欲蛘決的課題 有鑑於上述問題，本案發明人對MMP抑制劑之活體内 活性確認之方法的研究結果，藉由使用原位酶譜法，提出 可簡便且迅速評估MMP抑制劑之活體内MMP抑制活性的 方法。 為了解決盡 換言之，本發明之第一態樣係關於將自經過具有基質 金屬蛋白酶抑制活性之化合物投藥的哺乳動物分離的試 料，進行原位酶譜法，在活體外評估該化合物顯示之活體 内基質金屬蛋白酶之抑制活性的方法。 詳言之，本發明之方法係關於利用由含有硬化劑之明 膠或膠原蛋白所形成薄膜來進行之原位酶譜法，該薄膜之 厚度為〜20//m。具體而言，原位酶譜法包含下述步 驟： ⑴使經分離之試料與含有㈣金屬蛋自酶基質的薄 膜上方接觸； (2) 將所得之試料-薄膜檢體置於培養箱； (3) 將經染色之薄膜脫色；以及 ---l·---:,--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線，

1223599 A7 B7 五、發明說明（4) (4)判定薄膜的色調。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 就本發明之評估方法而言，較佳係在下述條件下進 行：基質金屬蛋白酶的基質為明膠或膠原蛋白；薄膜含有 硬化劑；薄膜的厚度為1/zm〜20//m;及/或試料為厚度2 /zm〜10/zm的組織切片；較佳為冷凍組織切片，培養箱之 溫度為20°C〜50°C，較佳為在36〜38°C下進行2-18小時。 本發明之第二態樣為評估具有基質金屬蛋白酶之抑制 活性之化合物顯示之活體内基質金屬蛋白酶抑制活性的方 法，包含下述步驟： (1)對哺乳動物投與具有基質金屬蛋白酶活性的化合 物；（2)分離該哺乳動物之組織或體液作成試料；（3)將經分 離之試料與含有基質金屬蛋白酶基質的薄膜上方接觸；（4) 將所得到的試料-薄膜檢體放置在培養箱中；（5)將經染色 之薄膜脫色；及（6)判定薄膜的色調。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 就第三態樣而言，對自經過具有基質金屬蛋白酶抑制 活性之抗癌劑投藥的哺乳動物分離的試料，進行原位酶譜 法，評估該化合物顯示之活體内基質金屬蛋白酶之抑制活 性作為該抗癌劑之抗癌活性指標的方法。關於本發明，較 佳之方法為，基質金屬蛋白酶基質為明膠或膠原蛋白；薄 膜含有硬化劑；薄膜的厚度為1/zm〜20//m;及/或試料 為厚度2 # m〜10 // m的組織切片；較佳為冷凍組織切片， 培養箱之溫度為20°C〜50°C，較佳為在36〜38°C下進行2-18 小時。 活體内不僅是MMP，已知存在多種胰蛋白酶等明膠分 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1223599 A7 B7 五、發明說明（5) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 解酶。因此，如本發明之藉由原位酶譜法，於基質處使用 明膠等MMP基質，選擇性地測定MMP抑制劑的活性是有困 難的。再者，MMP抑制劑的活體内基質金屬蛋白酶抑制活 性的測定方法係屬未知。 於本說明書中，“原位酶譜法”意指以未伴隨電泳之 蛋白酶活性評估為目的之活體外測定方法，本發明係將自 經過具有基質金屬蛋白酶抑制活性之化合物（MMP抑制 劑）投藥的哺乳動物分離的試料與薄膜上方接觸，經過一 定時間後，判定該MMP基質，藉此評估有關「活體内MMP 抑制活性」。 「自哺乳動物分離之試料」中的哺乳動物為經過MMP 投藥之高等脊椎動物，較佳為人。若藉由此方法，被檢測 之對象物質為自此類生物分離出來的試料，可充分反映出 生物體内MMP抑制劑顯示之活體内MMP抑制活性。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 「經分離之試料」較佳為來自哺乳動物之各種組織或 體液的物質，其係依賴投藥至哺乳動物之MMP抑制劑之目 的效能。例如以MMP抑制劑作為抗癌劑的話，試料係來自 乳癌、子宮内膜癌、口腔癌、肺癌、胃癌、食道癌、尿道 上皮癌、大腸癌、尿道上皮癌、大腸癌、扁平上皮癌、腦 瘤、曱狀腺癌等之癌組織，由利用手術或組織檢查分離、 採取之癌組織所形成。投藥抗風濕病劑的話，試料係使用 慢性關節風濕病或關節炎處的滑膜、滑液或骨組織；投藥 抗心不全劑的話，利用心不全處之心臟組織或滲出液作為 試料。因此，本發明可用於作為抗癌劑、抗風濕病劑或抗 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1223599 A7 B7 五、發明說明（6) 心不全劑之評估。 圖式之簡箪說明 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第1圖係顯示經載劑投藥之老鼠（A)、經（-)BPHA投藥 之老鼠（B)及經BPHA投藥之老鼠（C)之腫瘤部位的Η· E.染 色生物體組織的光學顯微鏡觀察結果（上方列之圖）及關於 明膠分解性之原位酶譜圖之結果（下方列之圖），為取代圖 式之照片。 第2圖為經載劑投藥之老鼠（a)、各自以MMI-166投藥 之老鼠（b-e)之腫瘤部位的Η· E.染色生物體組織的光學顯 微鏡觀察結果（下方列之圖）及關於明膠分解性之原位酶譜 圖之結果（上方列之圖），為取代圖式之照片。 發明之實施態樣 詳言之，本發明方法之「原位酶譜法」係包含下述步 驟· (1) 將上述經分離之試料與含有MMP基質之薄膜上方 接觸； (2) 將所得之試料-薄膜檢體置於培養箱； (3) 使所得之經染色的薄膜脫色；以及 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (4) 判定薄膜的色調。 在下文中，將更進一步地詳細說明各步驟： (1)上述將經分離之試料與含有MMP基質之薄膜上方 接觸， 「試粒與薄膜上方接觸」意指將取出之組織放置在薄 膜上、貼附，或將取得之體液滴至薄膜上。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223599 A7 B7 五、發明說明（7) 「經分離之試料」係來自上述組織，例如將來自經過 液態氮急速冷凍之試料，利用凍結切片製造裝置製成例如 厚度2/zm〜10/zm之物質，較佳為4/zm〜8/zm。又，亦可 使用體液（例如血液、唾液、滑膜液等）。再者，在以自 慢性關節風濕病患者採樣之滑膜液作為試料之情況中，滴 至薄膜上的滑膜液量約5〜50//1，較佳為20//1。 「MMP基質」為藉由MMP分解之聚合物，例如明膠、 膠原蛋白、蛋白多醣、纖維網蛋白、昆布寧、彈性蛋白或 酪蛋白等。較佳為膠原蛋白、纖維網蛋白、彈性蛋白或酪 蛋白，更佳為明膠或膠原蛋白。另，MMP係例如鹤尾隆編 「癌轉移之分子機構」，第92-107頁（夕夕力少匕'二一社， 1993年發行）中詳述者，例如間質型膠原蛋白酶(MMP-1)、 明膠酶A(MMP_2)、及明膠酶B(MMP-9)等，但並不限於此 等蛋白酶。 「含有MMP基質之薄膜」意指載體表面上由上述MMP 基質形成單層或多層物質。詳細内容係記載於WO 97/32035。若簡單地說明的話，例如薄膜厚度為6/zm〜20 // m，特別是載體上調製8 μ m〜10 // m之單層或多層的薄膜， 該薄膜較佳具有均一的表面。 本發明之方法較佳係使用含有硬化劑的薄膜。硬化劑 係用於促進薄膜之MMP基質的硬化，及/或防止形成後之 薄膜膨潤。硬化劑之細節係描述於WO 97/32035中。就硬 化劑而言，例如乙烯基磺醯基型硬化劑。硬化劑之使用量 未特別限制，例如在使用明膠的情況中，自檢出性能之點 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -10- -----------------„----訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223599 A7 —--------B7 一_ -- 五、發明說明（8) 開始，較佳之配合量係相對於100克明膠為0.1〜20毫莫耳， 再者，較佳為0.3〜1〇毫莫耳。 再者，當製造薄膜時，除了添加上述成分，染料、顏 料、防腐劑、安定化劑等成分亦可適當地配合添加。 「载體」較佳為當在顯微鏡下觀察組織内之MMP存在 時呈透明或半透明者。關於此種透明或半透明之載體，例 如由玻璃或聚對苯二甲酸乙二醇酯等形成之透明或半透明 塑膠膜。載體之厚度無特別限制，在使用玻璃之情況下， 較佳為具有載玻片程度之厚度（例如2〜3mm)，又，在使 用I對本二甲酸乙二醇酯之情況下，可使用約100〜250 /Z m 之程度。 「薄臈及载體之調製」係將分散於例如水、或丙酮、 甲醇、乙醇或者其混合溶劑等形成之有機溶劑中的MMP基 質塗布在栽體表面並乾燥。關於塗布之方法，可採用熟習 疋項技術者周知之帶式塗布法、滾筒塗布法、簾流塗布法、 擠壓塗布法等。在使用明膠作為MMP基質之情況中，明膠 之種類未特別限制，可使用例如牛骨之鹼處理明膠、豬皮 膚之酸處理明膠等。 (2)將所得之試料_薄膜檢體置於培養箱中； 「試料-薄膜檢體」係指藉由例如將組織切片貼附在薄 膜上，或將液體試料滴至薄膜上，所得之使薄膜與含有 MMP之試料接觸後的檢體。 。「。培養箱」意指靜置於20°C〜5(TC恆溫槽，較佳為36 °C〜38C，較佳係在不使薄膜乾燥之濕潤容器内進行。 本紙張尺度適用帽國家標準（CNS)A4規格⑽x 297公髮） -----1---,----------*----tx---------線· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -11- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223599 A7 B7 五、發明說明（9) 組織切片而言係在37°C下例如進行約1〜24小時，較佳為 2〜18小時，更佳為4〜8小時，就液態試料而言，在培養箱 中之時間為0.5〜12小時，較佳為1〜6小時。 在試料中，在含有未藉由MMP抑制劑而失活之蛋白酶 的情況中，薄膜内的MMP基質係經由MMP分解，在薄膜上 形成分解痕跡。 (3) 使所得之染色薄膜脫色； 步驟(2)之試料較佳係使用染色液來染色。染色劑為可 使酶之基質染色的染色劑，例如阿米多黑、科麥西藍、麗 春紅（和光純藥）、比布里希猩紅（Biebrich Scarlet)。 較佳為使用0.5〜2%阿米多黑溶液。 接著，將經染色之薄膜利用適當之脫色劑脫色，例如 70%甲醇-10%乙酸溶液、水。 (4) 判定薄膜的色調； 經由上述步驟之薄膜，因為MMP基質之分解為無法染 色之可見部分，MMP基質之分解程度係對應產生染色度之 濃淡（階調度）。此等色調之變化可藉由肉眼或光學顯微鏡 觀察，藉由利用載玻片掃瞄器之定量分析，利用電射顯微 鏡之定量分析等進行判定。染色部分顯示MMP受到被投藥 之MMP抑制劑的作用，或因其他理由而造成失活狀態。失 活狀態係因為MMP抑制劑之作用，或因為其他理由，藉由 未投藥MMP抑制劑之對照組的對比可容易地區分。 本發明係揭露一種評估MMP抑制劑之活體内MMP抑 制活性之方法，本發明之方法亦包含以對哺乳動物投藥 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -12- -----------------..—訂---------線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 1223599 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（10) MMP抑制劑之步驟作為最初步驟。因此，在臨床試驗時， 可用於汗估投藥至文試者之MMp抑制劑的活體内活性。投 藥MMP抑制劑，下-步驟之進行一般係設計在投藥後間隔 30分鐘至4小時後。 再者，本發明之特徵在於自經過具有基質金屬蛋白酶 抑制活性之抗癌劑投藥的哺乳動物分離的試料，進 酶評估該化合物顯示之MMP抑制活 癌 之抗癌活性指標的方法。抗癌劑之臨床試驗的藥效評= 要係以患者之生命延長效果或患者之自 ’、、 少/轉移之有無、腫瘤標記之量為考量基準。妙癌、、、田胞減 依據藥物向病巢部之移行性良好與否進二而」在此處， 有困難。因此，本發明之抗癌活性評估方〉c選定是 驗中的藥劑投藥量，投藥之時間表、藥:可提供臨床試 之決定，或癌種類之適用對象的選擇到癌組織與否 依據本發明之法，可提供較適當之方方法 試驗之癌症是否對MMP之存在有依賴性。u供確認進行 下述之實施例係例示說明本發明之進〜 意圖限制本發明之範圍。 〜步細節，並非 實施例1 利用原位酶譜法之MMP抑制劑的活性坪估 MMP抑制劑： 利用下式（I)表示之具有MMP抑制活性 及式（H)表示之具有MMP抑制活性之化合物（）^物61>^八 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） -----1---：----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} ----ί----訂----I--! . 、13 ~ 1223599 A7 B7 五、發明說明（U) MMP抑制劑之受檢測化合物。

BPHA

Η CONHOH (I)

H ⑼ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表1 I C5 Ο (nM)

BPHA (-) BPHA MMP — 1 MMP — 2 MMP-3 MMP-7 > 4 2 0 5 7 10 9 9 0 7 ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο 111 X 7777 MMP — 9 MMP-14 1 6 1 7 ο ο ο ο ο ο 11 > > 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用於蛋白酶活性測定之明膠薄膜之製造 將15克豬皮膚之酸處理明膠溶於123克水中，添加1.2 ml作為硬化劑之2-雙（乙烯基磺醯基乙醯胺基）乙烷（4%)。 將此溶液塗布至厚度約7 // m聚對苯二甲酸乙二醇酯之乾 燥膜上，乾燥所製成之明膠薄膜。將所得之薄膜保存在室 溫下直至使用時。 使用已知可產生許多MMP-2的人類肺癌細胞株Ma44 已知[CANCER RESEARCH 59, 1231-35 (1999)]。將 lx 105 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -14- 1223599 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（12) 個Ma44細胞移殖至裸鼠（6週，雌，日本）之腹腔内，14日後， 以經口投藥200毫克/公斤之BPHA或㈠BPHA。接著以同樣 方式’將載劑（含有0.4%吐溫8〇，0.5%羧甲基纖維素，0.9% 苯曱醇之生理食鹽水)投藥至對照組。於投藥2小時後，解 剔罹患癌症之老鼠之腹壁及腸間膜，取出形成之腫瘤塊， 以供進行原位酶譜法實驗。 將腫瘤塊包埋在OCT化合物（SAKURA)中後，利用

Micortone/Cryostat Tissue TEK II ( 少只、三共），製 作8//m厚之凍結切片。將此凍結切片放置在先前調製之明 膠薄膜上’置入不會乾燥的濕潤容器内，靜置於約37°c之 培養箱中。於反應3.5小時後，取出薄膜，以1%阿米多黑 溶液(和光純藥）染色15分鐘。接著置於脫色液（70%甲醇， 10%乙酸）中脫色1〇分鐘。 在光學顯微鏡下觀察薄膜上的腫瘤組織，調整以確認 明膠分解之位置。接著為了定量地測定濃淡，利用載玻片 掃瞒器（二3 >35 mm薄膜掃瞄器：COOLSCAN II)，利用 軟體 Optimas Ver. 6 (Optimas Corporation)解析。 經載劑投藥之老鼠，將（_)BPHA投藥之老鼠或BPHA投 藥之老鼠的腫瘤組織經H.E.(蘇木精及伊紅）染色後，於光 學顯微鏡下觀察，結果第1圖之上方列之圖（A)、（B)及（c) 所示。由該等圖可知，所觀察之組織具有癌細胞存在。 接著，同樣地將藉由載玻片掃瞄器觀察到的結果以 (A)、（B)及（C)顯示於第1圖之下方列之圖中。由該等圖可 看出，經載劑投藥之老鼠及經㈠BPHA(無MMP抑制作用之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------------*----訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -15- 1223599 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（13) 化合物）投藥之老鼠可確認到明膠之分解，經BPHA投藥之 老鼠則未見到明膠之分解。再者，利用軟體Optimas Ver· 6 進行之定量測定（各組織之輝度/各組織之面積）結果顯 不’經載劑投藥之老鼠、經(-)BPHA投藥之老鼠及經BPHA 投藥之老鼠的值分別為49.2、40.1及8.6。 由此結果可知，動物實驗顯示出BPHA之抗癌作用， 其他㈠BPHA則未料抗癌作用 ’相關結果以符號表示。 實施例2 利用原位崎譜法確認MMP抑制劑之用量依賴性 除了將下式所示之MMI_166， MM1-166

=Λ實具有—抑制活性之化合物取代BPHA及 ，以0.2、2.0、2〇.〇、2〇〇〇毫克/公斤之投藥 其餘處理步驟與實施例1同，以進行原位酶 組二之老鼠及經纖^166投藥之老鼠的腫瘤 解析結^ 光學顯微鏡觀察結果及載破片掃猫器 2圖中，(a)為：1 第2圖之下方列之圖及上方列之圖中。於第 之老鼠，= 之老鼠’峨經G_2切公斤投藥 ()為經2.〇毫克/公斤投藥之老鼠，⑷為經2〇.〇毫 ^尺度適用中國國· -----------------^----訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -16 - 1223599 Α7 Β7 i、發明說明（14) 克/公斤投藥之老鼠，及(e)為經200.0毫克/公斤投藥之老鼠 的結果。確認經載劑投藥之老鼠的腫瘤部分與明膠之分解 一致（第2a圖）。一方面，經MMI-16投藥之老鼠，最大投藥 量200.0毫克/公斤可完全抑制明膠之分解，20.0毫克/公 斤、2.0毫克/公斤之抑制程度較輕，經〇·2毫克/公斤投藥僅 見到部分的抑制作用。亦利用軟體Optimas Ver. 6進行之定 量測定，結果顯示分別為53.4、41 ·3、28.6、13.7及5.3。 由以上之結果可知，本發明之方法係有利地教示，關 於具有ΜΜΡ抑制活性之化合物在實際腫瘤部位對明膠分 解活性之抑制的必要投藥量及投藥時間表的決定。 發明之效果 利用本發明之方法，可在活體外確認ΜΜΡ抑制劑之活 體内活性。本發明可說明抗癌劑、抗風濕病劑或抗心不全 劑之臨床試驗的藥效評估或作用機制，特別是可用於決定 藥劑投藥量或投藥時間表。 ----------tx---------線 (請先閱讀背面之注咅3事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -17- 申請曰期 案 號 '(。仲3 類 別 M(K^v〇. ooQ/ιΊ (以上各欄由本局填註） A4 C4 第 89109933 號 專利申請案

專利説明書 1223599 說明書修正頁 93年7月5日 中 文 基質金屬蛋白酶活性抑制能力之評估方法

,名稱 英 文

EVALUATION METHOD OF MATRIX METALLOPROTEASE 工INHIBITORY ACTIVITY 姓 名 國 籍 (1)前川隆司 吉岡貴# (3) 根守良一 (4) 田村裕 曰本 發明 住、居所 tu tu 號號 4 4 is 2 2 11 lx 目目地地 丁 丁番番 5500 洲洲2121 f鷺沼沼 區區中中 ^^島市市 福福柄柄 市市足足 阪阪南南 大大縣縣 府府川川 阪阪奈奈 大大神神 國國國國 本本本本 曰曰曰曰 12 3 4 經濟部tu工消贽合作社印焚 三、申請人 姓 名 (名稱） 國 籍 住 、居所 (事務所） 代 表人 姓 名 曰商•鹽野義製藥股份有限公司 曰本 日本國大阪府大阪市中央區道修町三丁目1番8號 鹽野元三 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

Claims (1)

1. 、申請專利範圍 第麵9933號專利申請案申請專利範圍修正本年7月5日 1. 一種基質金屬蛋㈣活性抑難力之評財法，立特 徵在於將自經過具有基質金屬蛋白酵抑制活性之化合 物投藥的哺乳動物分離的試料，進行原位酶譜法，而 2該化合物在活體内之基質金屬蛋白酶抑制活性作評 前述原位酶譜法之進行包含下述步驟： ⑴使經分離之試料與含有明膠或膠原蛋白的薄 膜上方接觸； (2) 將所得之試料一薄膜檢體置於培養箱； (3) 將經染色之薄膜脫色；以及 (4) 判定薄膜的色調。 2. 如申請專利範圍第Μ之方法，其中該薄膜中含有硬 化劑。 3. 如申請專利範圍第項之方法，其中該薄膜厚度 為 1 // m〜20 // m。 4. 如申請專利範圍第lst2項之方法，其係將具有厚度 2_〜1〇/^之組織切片，在抓〜5(TC之培養箱内 放置2〜18小時。 5. -種抗癌劑活性之評估方法，其特徵在於對自經過具 有基質金屬蛋白酶抑制活性之抗癌劑投藥的哺乳動物 分離的試料，進行原位酶譜法，而以該抗癌劑顯示之 活體内基質金屬蛋白酶之抑制活性作為指標而評估該 抗癌劑之抗癌活性， Λ 1223599 申請專利範圍 則述原位酶譜法之進行包含下述步驟·· (1) 使經分離之試料與含有明膠或膠 膜上方接觸； 的缚 (2) 將所得之試料_薄膜檢體置於培養箱； (3) 將經染色之薄膜脫色；以及 (4) 判定薄膜的色調。 6. 一種基質金屬纟白酶活性抑制能力之定量方法，其特 徵在於將自經過具有基質金屬蛋白酶抑制活性之;匕合 物投藥的哺乳動物分離的試料，進行原位酶譜法，= 對該化合物在活體内之基質金屬蛋白酶抑制活性作評 估， 别述原位酶譜法之進行包含下述步驟·· (1) 使經分離之試料與含有明膠或膠原蛋白的薄 膜上方接觸； ' (2) 將所得之試料-薄膜檢體置於培養箱； (3) 將經染色之薄膜脫色；以及 (4) 判疋、對照、及比較薄膜的色調。 如申請專利範圍第6項之方法，其中該薄膜中含有硬 化劑。 8. 如申請專利範圍第6或7項之方法，其中該薄膜厚度 為 1 // m〜20 # m 〇 9. 如申請專利範圍第6或7項之方法，其係將具有厚度 〜10#m之組織切片，在2〇t〜5〇它之培養箱内 放置2〜18小時。 本紙張尺度適用屮l^ai^cNS) Α4^ (2Ι〇Χ2^ΓΓ -19- 10. 如申清專利範圍第9項之 M之方法，其中作成之試料的厚 度為4 /z m〜8 xz m，拉差々々‘ > , 、 μ 培養相内溫度為36〜38它且培養時 間為4〜8小時。 11. 一種定量抗癌劑活性之評估方法，其特徵在於對自經 過具有基質金屬蛋白酶抑制活性之抗癌劑投藥的哺乳 動物分離的簡，進行原位酶譜法，而以該抗癌劑顯 不之活體内基質金屬蛋白酶之抑制活性作為指標而評 估該抗癌劑之抗癌活性， 前述原位酶譜法之進行包含下述步驟： (1)使經分離之試料與含有明膠或膠原 ^ 曰的 膜上方接觸； (2) 將所得之試料-薄膜檢體置於培養箱； (3) 將經染色之薄膜脫色；以及 (4) 判定、對照、及比較薄膜的色調。 本紙張尺度適用屮國國家標準（CNS) A4規格（21 0X297公釐）