CN101180067A - 组织或细胞固定剂与一种或多种光活性醌族化合物，尤其是金丝桃素、竹红菌甲素和竹红菌乙素，的组合 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及组织或细胞固定液和一种或多种光活性醌族化合物(尤其是金丝桃素、竹红菌甲素和/或竹红菌乙素)的溶液组合或试剂盒组合。本发明还涉及采用一种或多种光活性醌族化合物对细胞或组织进行标记的方法，其中，细胞或组织与组织或细胞固定液接触的同时或随后被光活性醌族化合物标记。
Description
技术领域
本发明涉及组织或细胞固定剂和一种或多种光活性醌族化合物的溶液组合或试剂盒组合。
本发明还涉及一种细胞或组织的标记方法，该方法使用一种或多种光活性醌族化合物，其中，所述细胞或组织与组织或细胞固定剂接触的同时或随后被所述光活性醌族化合物标记。
背景技术
光活性醌族化合物尤其包括多环醌，例如金丝桃素(hypericin)、竹红菌甲素(hypocrellin A)、竹红菌乙素(hypocrellin B)或它们的衍生物。
“衍生物”是指化学修饰的化合物，其中，修饰被认为是化学领域的技术人员的常规手段，如酸的酯化或酰胺化；引入保护基团，如对醇或硫醇引入苄基，对胺引入叔丁氧基羰基。
竹红菌甲素(1H-环庚[ghi]苝-5，11-二酮，1-乙酰基-2，3-二氢-2，6，12-三羟基-4，8，9，13-四甲氧基-2-甲基-，顺式)和竹红菌乙素(1H-环庚[ghi]苝-5，12-二酮，3-乙酰基-6，11-二羟基-4，8，9，13-四甲氧基-2-甲基)是从真菌竹小肉座菌(Hypocrella bambusae)和竹黄菌(Shiraia bambusicola)分离的醌。
竹红菌甲素 竹红菌乙素
这些色素与光线疗法结合使用以治疗各种皮肤疾病。最近，已确定它们的抗病毒的特性，并发现在光动力治疗癌症中，这些醌是很强的光敏剂(Hirayama等，1997；Zhang等，1998)。
在甲醇中检测荧光最大吸收波长和最大发射波长，竹红菌甲素的分别是463nm和600nm，竹红菌乙素的分别是459nm和616nm。
金丝桃素的化学式是1，3，4，6，8，13-六羟基-10，11-二甲基菲并(1，10，9，8，opqra)苝-7，14-二酮：
金丝桃素是从金丝桃属(Hypericum genus)植物中分离出的天然色素，它是很强的蛋白激酶C的选择性抑制剂。
金丝桃素具有广泛的药物特性，它具有抗菌或抗病毒活性，抗肿瘤活性和诱导凋亡。金丝桃素的光敏性很早就为人所知，并被用作抗抑郁药(金丝桃属植物)组合物的一部分。
金丝桃素是荧光分子，在乙醇中测定的最大吸收波长和最大发射波长分别为591nm和594nm。
已表明灌注在膀胱中的金丝桃素选择性地积聚在膀胱上皮癌细胞中。这个特性与其光敏性和荧光特性相关，并使许多研究组提出了采用体外(ex vivo)荧光细胞诊断癌症(Olivo等，2003a；Olivo等，2003b；Pytel和Schmeller，2002)。还提出了使用金丝桃素对膀胱癌损伤进行光动力治疗(Kamuhabwa等，2004)。这些方法涉及在患者的膀胱中体内注入金丝桃素。
众所周知金丝桃素是能结合到细胞膜脂双层中的亲脂分子。该结合的精确机制还不清楚，但是推测该结合涉及主动运输。因此，到目前为止，金丝桃素仅用于活细胞中。
到目前为止，人们认为必需在活细胞中才能用金丝桃素进行标记，例如，在含金丝桃素的溶液中对细胞进行体外培养或者将金丝桃素与分离不久的细胞或组织临时接触，以便金丝桃素能被活细胞结合。
发明内容
与所有的预料相反的是，本发明人发现与固定剂混合的金丝桃素能被悬浮在固定剂和金丝桃素的混合液中的肿瘤细胞非常迅速地结合，即使这些细胞通过与固定剂接触而被杀死。金丝桃素被活细胞或死细胞同等有效地固定的证据为使用金丝桃素和更普遍地使用光活性醌族化合物进行细胞或组织标记提供了新的可能性。
固定是意在杀死细胞以便最大可能地按照它们被发现时的活着的状态保存的操作。如果不进行固定，则存在自溶的风险。最好的固定剂是那些作用迅速且产生的次级修饰或作用最小的固定剂，所述的次级修饰或作用可能造成细胞内部形态的非常不真实的迹象。
因此，通过在用细胞或组织固定剂固定细胞的同时或之后采用一种或多种光活性醌族化合物尤其是金丝桃素进行标记，可以在任何时候对细胞或组织进行研究，而不必将细胞保持在活的状态。
此外还表明，当将肿瘤细胞悬浮在含微摩尔的金丝桃素的固定剂溶液中时，金丝桃素对细胞的亲和力使几乎所有的金丝桃素都被细胞结合。由于细胞悬浮液的液相实际上不再含金丝桃素，因此可以不洗涤细胞悬浮液而直接分析细胞(形态和/或荧光发射分析)。因此，这种特性使细胞/组织的制备和细胞的分析可以自动化。
因此，本发明涉及含有组织或细胞固定剂和一种或多种光活性醌族化合物的溶液。优选地，光活性醌族化合物选自由金丝桃素、竹红菌甲素和竹红菌乙素所组成的组中。更优选地，本发明组合物含有组织或细胞固定剂和金丝桃素，或者由组织或细胞固定剂和金丝桃素组成。
“组织或细胞固定剂”或“组织或细胞固定液”意指通常用于组织或细胞分析以对细胞或组织进行固定的溶液。细胞固定剂的实例包括基于乙醇、甲醇或聚乙二醇(PEG)的固定剂。组织固定剂的实例包括基于甲醛的固定剂，如10％的纯甲醛溶液(“纯甲醛”对应于40％的甲醛水溶液，一般为可以商购的“甲醛(formol)”)、甲醛/NaCl溶液(例如，通过将10ml的纯甲醛，0.9g的NaCl和90ml的水混合而组成)、甲醛/乙酸溶液(例如，100ml的纯甲醛，50ml冰醋酸和850ml的水)、醇布英防腐液(或Duboscq Brazil；例如，250ml纯甲醛，70ml冰醋酸，5g苦味酸和680ml 70°的乙醇)。固定剂的其它实例包括醇/甲醛/乙酸固定剂(20ml纯甲醛，50ml冰醋酸，750ml无水乙醇和180ml水)或基于氯化锌的固定剂(10％的甲醛，10-50g/l的氯化锌和5％的乙酸或9g/l的NaCl，并选择性地含有75％的无水醇)。
根据本发明的溶液有利地含有1-20微摩/毫升、优选1-15微摩/毫升、更优选1-10微摩/毫升和进一步优选1-2微摩/毫升的光活性醌族化合物。
本发明还涉及含有组织或细胞固定剂和一种或多种光活性醌族化合物的试剂盒。优选地，所述光活性醌族化合物选自由金丝桃素、竹红菌甲素和竹红菌乙素所组成的组中。根据本发明的试剂盒更优选含有组织或细胞固定剂和金丝桃素。本发明的试剂盒还可以选择性地含有合适的洗涤缓冲液、使用指南、或者任何其它溶液或合适的设备。
本发明还涉及一种对细胞或组织进行体外(ex vivo)标记的方法，该方法使用一种或多种光活性醌族化合物。该方法包括以下步骤：
a)将细胞或组织样品与组织或细胞固定液接触；
b)同时或随后将细胞或组织样品与含有一种或多种光活性醌族化合物的溶液接触，接触的时间足以使细胞或组织结合所述光活性醌族化合物；和
c)选择性地，对细胞或组织样品进行洗涤。
含有光活性醌族化合物的溶液优选为组织或细胞固定液。步骤a)和步骤b)同时进行。细胞悬浮液的固定时间非常短(大约几分钟)，组织样品的固定时间大约为一小时。光活性醌族化合物尤其是金丝桃素被悬浮液中的细胞结合，一般需要1到2小时。根据本发明的方法，光活性醌族化合物的结合时间和细胞或组织的固定时间的不同确保，在细胞已经被固定也就是说细胞已经死亡时，光活性醌族化合物被结合。
优选地，所述光活性醌族化合物选自由金丝桃素、竹红菌甲素和竹红菌乙素所组成的组中。本发明的方法更优选用金丝桃素对细胞或组织进行体外标记。
所述细胞或组织优选为肿瘤细胞或疑似肿瘤细胞。因此，所述细胞或组织样品可通过从被怀疑患有癌症并需要表明存在肿瘤细胞的患者身上分离或活组织切片而获得。所述样品也可以是从已经被诊断为癌症并通过检测被癌细胞结合的金丝桃素在一段时间内的进展而评价治疗效果的患者获取。
所述细胞或组织可来源于任何器官，例如，子宫、肝脏、胃、肺、食管、膀胱、前列腺和乳房等。细胞样品可以是，例如液体样品，如尿、腹水、胸膜液或胸包液(pericardic liquid)；涂片，例如子宫颈的涂片、阴道的涂片、外阴的(vulvar)涂片或食道的涂片；乳腺的分泌物或器官穿刺，例如，浅腺如乳房、甲状腺和腮腺，或者深层器官，例如肾、肝脏、卵巢等。组织样品可以是活组织切片或者全部或部分切除的任何器官。
患者可以是动物，优选哺乳动物，例如人、啮齿动物、狗或猫。患者优选是人。
本发明还涉及含有组织或细胞固定剂和一种或多种光活性醌族化合物的溶液在诊断癌症或发育异常或者监控治疗或癌症的治疗效果中的应用。
更具体地，本发明提供了一种诊断癌症或发育不良的方法，其中，按照上述方法用一种或多种光活性醌族化合物对细胞或组织进行标记，其中存在被光活性醌族化合物标记的细胞或组织则表明存在肿瘤细胞或发育不良的细胞。优选地，所述光活性醌族化合物选自由金丝桃素、竹红菌甲素和竹红菌乙素所组成的组中。
根据一个实施方案，诊断癌症或发育不良的方法包括以下步骤：
a)将细胞或组织样品与组织或细胞固定液接触；
b)同时或随后将细胞或组织样品与含有金丝桃素的溶液接触，接触的时间足以使细胞或组织结合金丝桃素；
c)选择性地，对细胞或组织样品进行洗涤；和
d)检测是否存在被金丝桃素标记的细胞或组织；其中，存在被金丝桃素标记的细胞或组织则表明存在肿瘤细胞或发育不良。
使用光活性醌族化合物标记细胞或组织的检测可以通过测定细胞或组织发射的荧光而容易地进行，尤其是在金丝桃素、竹红菌甲素和竹红菌乙素的600nm区域。
结果表明金丝桃素对特定的肿瘤细胞具有高亲和力，所述肿瘤细胞具有优先核周定位，而对正常细胞对细胞膜区域内的核周定位的亲和力很低。
因此，根据本发明的实施方案，至少步骤d)且优选所有步骤自动进行，以便实现样品的自动筛选。
优选地检测细胞的核周标记。
具体实施方式
在下述非限制性的实施例中将更详细地说明本发明。
实施例
实施例1
在陪替氏培养皿中培养人成胶质细胞瘤(glioblastoma)细胞。
在实验前4小时，将2微摩/毫升金丝桃素悬浮在Sakomano细胞固定剂溶液中。含有金丝桃素的该固定剂溶液避光放置。
将所述成胶质细胞瘤细胞置于以金丝桃素为基础而制得的固定剂溶液中，直接固定一小时。
采用显微分光光度计进行比较试验，以比较相同的活的成胶质细胞瘤细胞和固定的成胶质细胞瘤细胞的荧光强度水平和荧光光谱质量，所述活的成胶质细胞瘤细胞以相同的浓度在含金丝桃素的Sakomano细胞固定剂溶液中孵育一小时。
结果表明活细胞和固定的细胞的荧光光谱能完全重合，荧光强度是相同的。
实施例2
将子宫颈的表皮马氏(malphigian)肿瘤细胞系(海拉细胞)培养在陪替氏培养皿中。然后用Sakomano细胞固定剂固定细胞，其中，Sakomano细胞固定剂中含有来源于子宫颈涂片的正常上皮细胞，以证明在含有几种正常细胞和肿瘤细胞的细胞悬浮液中，金丝桃素对肿瘤细胞的亲和力。
将2μm/ml金丝桃素悬浮在已固定的细胞悬浮液中，避光放置一小时。
采用显微分光光度计进行试验，以比较悬浮液中的不同细胞的荧光强度水平和荧光光谱质量，所述不同细胞以相同的浓度在含金丝桃素的Sakomano细胞固定剂溶液中孵育一小时。
结果表明金丝桃素对具有特定优先核周定位的肿瘤海拉细胞具有高亲和力，而正常细胞只在细胞膜区域内表现出很低的核周定位亲和力。
因此，具有特定标记的细胞可以采用自动识别装置进行检测。因此，可以设想自动筛选细胞样品和尤其是子宫颈涂片以仅仅选择病理细胞分布。
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Claims (16)
1.一种用于对细胞或组织进行标记的溶液，该溶液含有组织或细胞固定剂和一种或多种光活性醌族化合物，所述光活性醌族化合物选自由金丝桃素、竹红菌甲素和竹红菌乙素所组成的组中。
2.根据权利要求1所述的溶液，该溶液含有1-20μmol/ml的所述光活性醌族化合物。
3.根据之前任意一项权利要求所述的溶液，该溶液含有组织或细胞固定剂和金丝桃素。
4.一种试剂盒，该试剂盒含有组织或细胞固定剂和一种或多种光活性醌族化合物，所述光活性醌族化合物选自由金丝桃素、竹红菌甲素和竹红菌乙素所组成的组中。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，该试剂盒含有组织或细胞固定剂和金丝桃素。
6.一种细胞或组织的体外标记方法，该方法使用一种或多种光活性醌族化合物，该方法包括以下步骤：
a)将细胞或组织样品与组织或细胞固定液接触；
b)同时或随后将细胞或组织样品与含有一种或多种光活性醌族化合物的溶液接触，接触的时间足以使细胞或组织结合所述光活性醌族化合物，所述光活性醌族化合物选自由金丝桃素、竹红菌甲素和竹红菌乙素所组成的组中；和
c)选择性地，对细胞或组织样品进行洗涤。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述含有一种或多种光活性醌族化合物的溶液为组织或细胞固定液，步骤a)和b)同时进行。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述细胞或组织由金丝桃素标记。
9.根据权利要求6至8中任意一项所述的方法，其中，所述细胞或组织样品来源于被怀疑患有癌症的患者。
10.根据权利要求6至9中任意一项所述的方法，其中，所述细胞样品为液体样品、涂片、乳腺分泌物或器官穿刺。
11.根据权利要求6至10中任意一项所述的方法，其中，所述组织样品为活组织切片、或者全部或部分切除的器官。
12.权利要求1-3中任意一项所述的溶液在体外诊断癌症或发育不良、或者监控癌症治疗的治疗效果中的应用。
13.一种体外诊断癌症或发育不良的方法，该方法包括以下步骤：
a)将细胞或组织样品与组织或细胞固定液接触；
b)同时或随后将所述细胞或组织样品与含有一种或多种光活性醌族化合物的溶液接触，接触的时间足以使细胞或组织结合所述光活性醌族化合物，所述光活性醌族化合物选自由金丝桃素、竹红菌甲素和竹红菌乙素所组成的组中；
c)选择性地，对所述细胞或组织样品进行洗涤；和
d)检测是否存在由所述光活性醌族化合物标记的细胞或组织；
其中，存在由光活性醌族化合物标记的细胞或组织则表明存在癌症或发育不良。
14.根据权利要求13所述的体外诊断癌症或发育不良的方法，该方法包括以下步骤：
a)将细胞或组织样品与组织或细胞固定液接触；
b)同时或随后将所述细胞或组织样品与含有金丝桃素的溶液接触，接触的时间足以使细胞或组织结合金丝桃素；
c)选择性地，对所述细胞或组织样品进行洗涤；和
d)检测是否存在由金丝桃素标记的细胞或组织；
其中，存在由金丝桃素标记的细胞或组织则表明存在癌症或发育不良。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，至少步骤d)自动进行。
16.根据权利要求13-15中任意一项所述的方法，其中，检测核周标记。
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